CN112795563A - 生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC-seq产物中的用途及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学、基因组学以及生物技术领域,特别是涉及生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC‑seq产物中的用途及方法,所述生物素化的转座体选自携带有转座酶的融合蛋白与能和转座酶结合的生物素化接头‑末端复合体形成的生物素化的转座体,和/或,转座酶与生物素化接头‑末端复合体结合形成的生物素化的转座体;所述携带有转座酶的融合蛋白包括转座酶和具有结合抗体Fc段功能的蛋白。生物素化的转座体可用于回收CUT&Tag或ATAC‑seq产物。本申请提供的回收方法在便捷快速、具有更高的产物回收效率,没有明显底物损失,特别适用于少量细胞的表观遗传学和染色质状态研究。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学、基因组学以及生物技术领域,特别是涉及生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC-seq产物中的用途及方法。
背景技术
染色质靶向切割和标签化(Cleavage under target and tagment, CUT&Tag)是近年兴起的一种新型蛋白质-染色质相互作用研究方法,该方法结合了转座-可及染色质实验(Assay for Targeting Accessible-Chromatin with high-throughout sequencing,ATAC-seq)和染色质核酸酶靶向切割和释放策略(Cleavage under target and releaseunder nuclease, CUT&RUN)的特点,利用protein A/protein G融合Tn5的融合蛋白,通过protein A/G-抗体相互作用将转座体栓系在靶抗体周围的区域,从而实现目标特异性的片段化反应。相比于传统的ChIP-seq,CUT&Tag操作相对简单、无需甲醛交联、信噪比较高、所需测序量少且适用于极低起始量和单细胞的应用场景。CUT&Tag和ATAC-seq所使用的转座体需要加入SDS失活,体系中存在的SDS会干扰后续的PCR反应,因此必须进行DNA提取或利用其他方法消除SDS的干扰。现有的CUT&Tag/ATAC-seq产物回收或后续处理方法主要包括酚氯仿抽提-乙醇沉淀法,片段分选(Solid-phase reversible immobilization, SPRI)磁珠回收法、离心柱回收法和直接PCR法,其中酚氯仿抽提-乙醇沉淀法操作繁琐、耗时长、效率相对低下;SPRI beads回收法会损失小于150bp的片段,从而造成信号的损失;离心柱回收法需要高质量的离心柱,增加了耗材成本;而直接PCR法则在部分抗体上会损失大于300bp的片段,并且建库效果受到扩增酶和延伸时间的影响较大。现有的CUT&Tag产物回收/后续处理方法均存在各自的缺陷,影响了CUT&Tag技术更广泛的应用,所以建立一种通用型的便捷、快速、无底物损失的CUT&Tag/ATAC-seq产物回收方法就显得非常必要。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC-seq产物中的用途及方法,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC-seq产物中的用途,所述生物素化的转座体选自携带有转座酶的融合蛋白与能和转座酶结合的生物素化接头-末端复合体形成的生物素化的转座体,和/或,转座酶与生物素化接头-末端复合体结合形成的生物素化的转座体;所述携带有转座酶的融合蛋白中还包括具有结合抗体Fc段功能的蛋白,所述具有结合抗体Fc段功能的蛋白选自Protein A、Protein G或Protein L中的两种以上。
本发明还提供一种与靶蛋白结合的片段化核酸产物的回收方法,所述回收方法包括以下步骤:
1)选自以下任一:
1a)将细胞核或透化的细胞与抗体和生物素化的转座体共同孵育;通过抗体引导的生物素化的转座体进行酶切反应并产生含有接头序列的片段;
1b) 将细胞核或透化的细胞与生物素化的转座体共同孵育;通过生物素化的转座体直接进行酶切反应并产生含有接头序列的片段;
2)将步骤1)中所加入的生物素化的转座体失活,使得生物素化的片段被释放至溶液上清中;
3)再加入链霉亲和素磁珠,回收得到与靶蛋白结合的片段化核酸产物。
如上所述,本发明的生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC-seq产物中的用途及方法,具有以下有益效果:本申请通过对CUT&Tag或ATAC-seq中转座体的接头序列生物素化,产生的生物素化的核酸产物能够被链霉亲和素磁珠结合,链霉亲和素磁珠回收仅仅需要20分钟的室温孵育时间就能和全部生物素化DNA结合,洗涤后可直接PCR制备NGS文库。通过对回收效率和文库分布的检测,发现本申请提供的回收方法在便捷快速的同时具有更高的产物回收效率,并且没有明显因为片段偏好性带来的底物损失。降低了操作难度,提高了回收效率,特别适用于少量细胞微量DNA产出的回收场景。
附图说明
图1显示为CUT&Tag产物回收方法示意图。
图2显示为普通pAG-Tn5与生物素化的pAG-Tn5标签化反应对比。
图3显示为生物素化的片段化产物在孵育链霉亲和素磁珠后上清无核酸条带。
图4显示为生物素化的pAG-Tn5的CUT&Tag可以得到和普通转座体类似的效果。
图5显示为不同回收方法得到的CUT&Tag产物的片段分布图。
图6显示为SPRI beads回收CUT&Tag产物和biotin adaptor-pAG-Tn5(即SAbeads)回收CUT&Tag产物在HPRT1基因上的分布,以及biotin adaptor-pAG-Tn5回收CUT&Tag产物中不同大小片段对结果的贡献。
图7显示为SPRI beads、乙醇沉淀-酚氯仿抽提(即ET)、直接PCR法(即D-PCR)回收CUT&Tag产物和biotin adaptor-pAG-Tn5(即SA beads)回收CUT&Tag产物在KRAS基因上的分布贡献以及不同SPRI beads回收数据量对结果的影响。
图8显示为四种不同回收方法在所产生的文库规模大小对比。
图9显示为不同回收方法得到的ATAC-seq产物的片段分布图。
图10显示为不同回收方法得到的ATAC-seq产物在一段代表性区域上的效果图。
具体实施方式
本发明提供生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC-seq产物中的用途,所述生物素化的转座体选自携带有转座酶的融合蛋白与能和转座酶结合的生物素化接头-末端复合体形成的生物素化的转座体,和/或,转座酶与生物素化接头-末端复合体结合形成的生物素化的转座体;所述携带有转座酶的融合蛋白中还包括具有结合抗体Fc段功能的蛋白,所述具有结合抗体Fc段功能的蛋白选自Protein A、Protein G或Protein L中的两种以上。
上述生物素化的转座体可称为携带有转座酶的融合蛋白与生物素化接头-末端复合体形成的生物素化的转座体。
在一种实施方式中,所述携带有转座酶的融合蛋白包括转座酶和具有结合抗体Fc段功能的蛋白。
所述转座酶选自Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn8、Tn9或Tn10。优选的,所述转座酶选自Tn5。
优选的,所述结合抗体Fc段功能是指结合IgG分子中Fc段功能。
所述具有结合抗体Fc段功能的蛋白选自金黄色葡萄球菌A蛋白(Protein A)、链球菌G蛋白(Protein G)或链球菌L蛋白(Protein L)中的一种或几种。在一较佳实施方式中,选自Protein A、Protein G或Protein L中的两种以上。在一更佳实施方式中,所述具有结合抗体Fc段功能的蛋白选自Protein A和Protein G。
在一种实施方式中,所述携带有转座酶的融合蛋白为Protein A、Protein G和Tn5融合而成的蛋白,即pAG-Tn5。pAG-Tn5可从市场购得,例如CUTANA™ pAG-Tn5 for ChIC/CUT&Tag (厂家:epicypher,货号15-1017)。使用pAG-Tn5可提高CUT&Tag和ATAC-seq的实验效率,获得的文库产量比现有技术中pA-Tn5的多,去除了抗体选择的限制性,降低实验对二抗的要求。
进一步的,所述单链接头A和单链接头B为经生物素修饰后的接头。更进一步的,所述单链接头A和单链接头B的5’端经生物素修饰。所述接头为测序接头。本发明实施例中,接头可以根据各个测序平台的具体情况选用,例如可以是建库中常用的长短接头、鼓泡接头或Y型接头等。
在一种实施方式中,所述生物素化接头-末端复合体中的末端选自Mosaic末端。
所述生物素化接头-末端复合体由如SEQ ID NO.1所示的单链接头A-Mosaic末端正向寡核苷酸和如SEQ ID NO.3所示的Mosaic末端正向寡核苷酸的反向寡核苷酸退火后形成的双链产物,或,由如SEQ ID NO.2所示的单链接头B-Mosaic末端和如SEQ ID NO.3所示的Mosaic末端的反向寡核苷酸退火后形成的双链产物。
所述转座酶与生物素化接头-末端复合体结合形成的生物素化的转座体与携带有转座酶的融合蛋白与生物素化接头-末端复合体形成的生物素化的转座体的区别在于前者不含有融合蛋白。两种生物素化的转座体除融合蛋白外,其余的特征均相同,例如二者的转座酶均选自Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn8、Tn9或Tn10。优选的,所述转座酶选自Tn5。
本发明还提供所述生物素化的转座体制备方法:将生物素化接头-末端复合体与携带有转座酶的融合蛋白孵育,得到生物素化的转座体。
本发明提供一种与靶蛋白结合的片段化核酸产物的回收方法,如图1所示,所述回收方法包括以下步骤:
1)将细胞核或透化的细胞与抗体和/或生物素化的转座体共同孵育;通过抗体引导的生物素化转座体或生物素化转座体直接进行酶切反应并产生含有接头序列的片段;
2)将步骤1)中所加入的生物素化的转座体失活,使得生物素化的片段被释放至溶液上清中;
3)再加入链霉亲和素磁珠,回收得到与靶蛋白结合的片段化核酸产物。
在一种实施方式中,所述回收方法可用于CUT&Tag或ATAC-seq实验中。CUT&Tag中,步骤1)通过抗体和生物素化的转座体进行酶切反应;ATAC-seq中生物素化转座体直接进行酶切反应。
所述细胞为表达靶蛋白和靶基因的细胞。在一种实施方式中,所述靶蛋白和靶基因是指在蛋白质-染色质互作研究中确定的靶蛋白和靶基因。
在一种实施方式中,细胞膜用洋地黄皂苷透化。透化的细胞便于抗体进入胞核,在胞核抗体会结合组蛋白、转录因子或目标辅因子。
在一种实施方式中,步骤1)中用到磁珠固定细胞。所述磁珠能结合细胞膜或细胞核表面的糖蛋白,使用磁力架可将细胞或者细胞核沉淀下来。
在一种实施方式中,所述磁珠选自伴刀豆球蛋白A(ConA)磁珠。所述ConA磁珠可通过市购获得,例如NovoNGS® Concanavalin A-coated Magnetic Beads。
在一种实施方式中,所述抗体为ChIP-seq抗体。例如靶向组蛋白甲基化修饰,RNA聚合酶II以及不同转录因子的抗体。所述抗体包括一抗和二抗。
在一种实施方式中,步骤1)中转座体与抗体结合形成复合体,转座酶发挥转座功能,切割下与靶蛋白结合的DNA位点临近的序列。
在一种实施方式中,步骤2)中加入SDS使生物素化的转座体失活。
在一种实施方式中,步骤3)中加入链霉亲和素磁珠后孵育温度为20~27℃。
在一种实施方式中,步骤3)中加入链霉亲和素磁珠后孵育时间为20~30分钟。
本发明还提供一种核酸文库的构建方法,所述方法包括将与靶蛋白结合的片段化核酸产物进行PCR扩增获得DNA文库。
通过对上述构建方法获得的核酸文库高通量测序可研究蛋白质-染色质互作。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实例一:biotin adaptor-pAG-Tn5转座体的制备
1.携带有转座酶的融合蛋白和生物素化接头的孵育
在Annealing buffer(10mM Tris、50mM NaCl,1mM EDTA, pH 8.0)中稀释以下寡核苷酸至200 µM,将生物素化的单链接头A-Mosaic末端正向寡核苷酸(即ME-A,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和单链接头B-Mosaic末端正向寡核苷酸(即ME-B,核苷酸序列如SEQID NO.2所示)分别与Mosaic末端的反向寡核苷酸(ME-Reverse)退火,Mosaic末端的反向寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3(5’-pCTGTCTCTTATACACATCT-NH2-3’)所示。
将含有ME-A + ME-Reverse和ME-B + ME-Reverse的试管放置在90-95°C的热块中3-5分钟,然后将热块从热源中取出,使其缓慢冷却至室温(约45分钟),得到100 µM退火产物。将8 µL 100 µM退火形成的ME-A和ME-Reverse的双链产物、8 µL 100 µM退火形成的ME-B和ME-Reverse的双链产物与100 µL 5.5 µM pAG-Tn5混合。将混合物在旋转混合仪上于室温孵育1小时,然后在-20°C下保存。
2. 生物素化转座体的标签化和回收反应
转座酶反应体系共20μL,体系中包括如下试剂:大肠杆菌DNA 1μL(共200ng)、Tn5转座酶[NovoNGS CUT&Tag 2.0 High-Sensitivity Kit (for Illumina)中含有的试剂] 1μL、5× Tn5反应液4μL、超纯水14μL。
在Tn5反应液(10mM Tris,10mM MgCl2,PH8.0)中以大肠杆菌DNA为底物进行片段化反应。55℃片段化5分钟,加入1μL 2%SDS,55℃热失活5分钟。生物素化的转座体产生的产物利用1μL链霉亲和素磁珠回收。图2为普通pAG-Tn5与生物素化的pAG-Tn5标签化反应对比,结果显示含有生物化接头的转座体与普通转座体片段化基因组的效果相同。图3可以清楚的看到生物素化的片段化产物在孵育链霉亲和素磁珠后上清无核酸条带。说明其产生的片段化DNA完全被链霉亲和素磁珠回收,即含有生物化接头的转座体片段化基因组的产物可以被链霉亲和素磁珠从体系中提取出来。
实例二:利用biotin adaptor-pAG-Tn5转座体进行CUT&Tag
1.细胞的准备
K562细胞复苏于10mL含有10% FBS的RPMI 1640培养基后,放入37℃、5%CO2浓度的细胞培养箱中。隔天按照1:2进行传代培养,细胞浓度稳定在0.5×106-1.0×106/mL。以保持实验细胞状态的稳定。
室温下600g离心收集新鲜细胞并计数,取所需数量的细胞于新的1.5ml EP 管中,室温下600g 离心5分钟后移去上清,加入等体积Wash Buffer 重悬洗涤细胞清洗细胞一遍,重悬细胞根据需要使得每个反应的细胞浓度为102-105/100μL。
2. 细胞与磁珠的结合
涡旋混匀ConA磁珠,根据样本数量吸取混匀后的ConA磁珠,加入10 倍原磁珠体积的ConA Binding Buffer清洗磁珠两遍,向每个样品中加入10μL ConA磁珠,轻柔吹打混匀后置于旋转混合仪,室温孵育10分钟后准备进行一抗孵育。
3.抗体的孵育
将上一步中准备的样品管置于磁力架上静置,移去上清,按50μL/样本加入预冷的Primary Antibody Buffer[厂家:NovoNGS CUT&Tag 2.0 High-Sensitivity Kit (forIllumina),货号:N259。下述步骤中的buffer均为本试剂盒中的试剂],向每管样品中加入0.5μL RNAPII一抗{Anti-RNA polymerase II[CTD 4H8], Ab00832-AbsoluteAntibody)},混匀后在旋转混合仪上室温孵育2h。
孵育完后于磁力架上静置,移去上清,将二抗(山羊抗鼠IgG抗体,B103,购自启泰生物)1:200稀释于Secondary Antibody Buffer中,向样品中加入100μL稀释后的二抗,混匀后在旋转混合仪上室温孵育1h。孵育完后于磁力架上静置,移去上清用500μL AntibodyBuffer重悬洗涤磁珠,重复洗涤3遍。
4.转座体的孵育和标签化
将实例一中孵育的转座体和标准的ChiTag™转座体NovoNGS® ChiTag™ 2.0Transposome(厂家:上海近岸科技有限公司,Cat#: M058)1:100稀释于ChiTag Buffer中。步骤3中洗涤后的底物移去上清,向每管样品中加入100μL稀释后的ChiTag™转座体,混匀后在旋转混合仪上室温孵育1h。将孵育完后于磁力架上静置,移去上清用500μL AntibodyBuffer重悬洗涤磁珠,重复洗涤3遍。
洗涤后的底物移去上清,待磁珠与液体完全分离后吸去上清,从磁力架上取下样品管;向每管样品中加入100μL Tagmentation Buffer,混匀后在旋转混合仪上37℃孵育1h,此标签化体系中含有CUT&Tag产物。
5.反应结果的检测:
向100μL标签化体系中加入2μL 10%SDS,55℃热失活10分钟,取1μL作为底物进行PCR检测,反应体系共50μL,体系中包括如下试剂:含CUT&Tag产物的标签化体系1μL、Nextra建库引物F/R(F序列见SEQ ID NO.4- SEQ ID NO.7,R序列见SEQ ID NO.8- SEQ ID NO.11)分别1.5μL、5 × Amplification Mix 10μL、超纯水37μL。
图4显示了生物素化的pAG-Tn5进行CUT&Tag可以得到和普通转座体类似的效果,生物化的转座体与普通转座体实施CUT&Tag结果相同。
实例三:利用biotin adaptor-pAG-Tn5转座体体系回收CUT&Tag产物
1.biotin adaptor-pAG-Tn5转座体体系回收CUT&Tag产物
biotin adaptor-pAG-Tn5转座体体系回收:对于biotin adaptor-pAG-Tn5转座体回收的样品,向每份含CUT&Tag产物的标签化体系(100μL)中加入2μL 10% SDS,55ºC加热10分钟,然后向每管中加入1μL洗涤后的链霉亲和素磁珠,吹打混匀,室温静置20分钟,磁珠结合后置于磁力架上静置2分钟,移去上清,Wash buffer洗2遍,室温晾干。35μL TE buffer复溶,回收后的CUT&Tag产物在-20℃下储存或直接进行下一步PCR扩增。回收方法示意图如图1所示。
2.其他方法回收CUT&Tag产物
酚氯仿抽提-乙醇沉淀:对于乙醇沉淀回收的样品,向每份CUT&Tag产物中加入3μL10% SDS,10μL 0.5M EDTA和2.5μL 20mg/ml Proteinase K,涡旋振荡混匀后,50ºC消化1h;每管样品中加入300μL 酚氯仿混合物,涡旋振荡充分混匀后移至锁相管中,16,000g 室温离心5分钟。向每管样品中加入100μL氯仿,涡旋振荡充分混匀后,16,000g 室温离心5分钟,吸取水相至新的1.5ml EP 管,加入1ml 100%乙醇,用移液器吹打混匀;将样品管置于-20℃静置1h,4℃离心20分钟,离心产物小心地倒出液体并在纸巾上沥干,向每管样品中分别加入1ml 80%乙醇漂洗,4℃下16,000g 离心1分钟,小心地倒出液体并在纸巾上沥干,自然干燥。干燥后,向每管样品中加入35μL TE Buffer,吹打重悬溶解DNA沉淀
SPRI beads回收:对于SPRI beads和PEG-SPRI beads回收的样品, 向每份CUT&Tag产物中加入2μL 10% SDS, 55ºC加热10分钟,然后向每管中加入200μL在室温平衡后的磁珠,吹打混匀,室温静置5分钟,磁珠结合后置于磁力架上静置5分钟,移去上清,无水乙醇洗涤2遍,室温晾干。用35μL TE buffer洗脱,回收后的CUT&Tag产物在-20℃下储存或直接进行下一步PCR扩增。
直接PCR法处理:对于直接PCR的样品,在CUT&Tag实验结束后移去片段化溶液上清,利用100μL TAPs Wash buffer清洗样品,加入5μL 0.2%SDS,70ºC加热1h。失活后的体系加入15μL %Triton-X-100中和SDS。直接进行下一步PCR扩增。
3.PCR建库扩增
PCR反应程序如下:
72℃ 1分钟
95℃
95℃ 15s 、60℃ 15s、72℃ 10s 15个循环
72℃ 10min
PCR反应体系共50μL,其中包括CUT&Tag产物1μL、Nextra建库引物F/R(F序列见SEQID NO.4- SEQ ID NO.7,R序列见SEQ ID NO.8- SEQ ID NO.11)分别1.5μL、5 ×Amplification Mix 10μL、超纯水37μL。
向每管PCR产物中加入65μL在室温平衡后的SPRI beads,吹打混匀,室温静置5分钟,磁珠结合后置于磁力架上静置5分钟,移去上清,无水乙醇洗涤2遍,室温晾干。20-40μLTE buffer洗脱,回收后的文库在-20℃下储存至进行二代测序。
4.2100文库检测和二代测序
对产物进行2100毛细管电泳检测,记录产出的qPCR文库摩尔浓度和2100电泳曲线。测序仪器为NovaSeq 6000,每个样品测序量大致为每个样3-10G。
5.回收方法所得到的结果的数据分析
图5为不同回收方法得到的CUT&Tag产物的片段分布图,不同回收方法得到的片段分布的对比:SA beads(即链霉亲和素磁珠),SPRI beads(即片段分选磁珠),Ethanolcapitation(即酚氯仿抽提-乙醇沉淀,或简写为ET),Direct PCR(即直接PCR法,或简写为D-PCR),可以看到主流的SPRI beads提取造成明显的<150bp 小片段的损失。
图6为SPRI beads回收CUT&Tag产物和biotin adaptor-pAG-Tn5体系(即SAbeads)回收CUT&Tag产物在HPRT1基因上的分布,以及SA beads回收CUT&Tag产物中不同大小片段对结果的贡献。
图7为SPRI beads、乙醇沉淀-酚氯仿抽提(即ET)、直接PCR法(即D-PCR)回收CUT&Tag产物和biotin adaptor-pAG-Tn5(即SA beads)回收CUT&Tag产物在KRAS基因上的分布贡献,以及不同SPRI beads回收数据量对结果的影响,结果显示SPRI beads与链霉亲和素磁珠对RNAPII CUT&Tag产物回收效果中,SPRI beads造成的<150bp片段的损失导致其损失了在低数据起始量的情况下损失了KRAS基因启动子上的信号。
图8为四种不同回收方法所产生的文库规模大小对比,结果显示四种不同回收/处理方法在四种不同CUT&Tag结果上回收效率的对比,链霉亲和素磁珠(即SA beads)回收整体上占明显优势。
实例四:利用biotin adaptor- Tn5-SA Beads体系回收ATAC-seq产物
1.ATAC-seq实验
按照常规的ATAC-seq流程实施ATAC-seq实验。5×104 K562细胞在预冷的Lysisbuffer(10mM Tris-HCl,pH7.4,10mM NaCl,3mM MgCl2,0.1% NP40,0.1% Tween 20,0.01%Digitonin)中冰浴裂胞5min,低温离心后获得细胞核。利用含有生物素化Tn5转座酶的片段化Mix重悬细胞核,PCR仪上37℃反应30min, 50μL反应体系构成如下:ddH2O 17μL、3×PBS5μL、10% Tween 20 0.5μL、0.1% Digitonin 0.5μL、2×TD buffer 25μL、生物素化Tn5转座酶2μL。其中,2×TD Buffer:20mM Tris-HCl,10mM MgCl2,10%DMF,pH7.4。
片段化结束后,向片段化产物加入2μL 10%SDS,吹打混匀,55℃反应5min终止反应。
2.ATAC-seq产物回收
SPRI beads回收:向每管中加入104μL(样品体积的2倍)室温平衡后的磁珠,吹打混匀,室温静置5分钟,磁珠结合后置于磁力架上静置5分钟,移去上清,无水乙醇洗涤2遍,室温晾干(5-10分钟),加入35μL 无菌水洗脱DNA,用磁力架去除磁珠后,获得的ATAC-seq片段化产物在-20℃下储存或直接进行下一步PCR扩增建库。
biotin adaptor-Tn5--SA Beads体系回收:向每管中加入1μL洗涤后的链霉亲和素磁珠,吹打混匀,室温静置20分钟,磁珠结合后置于磁力架上静置2分钟,移去上清,加入100 μL PBS漂洗两次,移去上清后,加入35μL 无菌水复溶磁珠,回收后的ATAC-seq产物在-20℃下储存或直接进行下一步PCR扩增建库。
3.2100文库检测和二代测序
对实验文库进行2100毛细管电泳检测,记录产出的qPCR文库摩尔浓度和2100电泳曲线。测序仪器为NovaSeq 6000,每个样品测序量大致为每个样3-10G。
4.回收方法所得到的结果的数据分析
图9为不同回收方法得到的ATAC-seq产物的片段分布的对比图。可以看到主流的SPRI 磁珠(即SPRI beads)提取造成明显的<150bp 小片段的损失。
图10为不同回收方法得到的ATAC-seq产物在一段代表性区域上的效果图,可以看到biotin adaptor-Tn5--SA Beads回收的ATAC-seq产物相比于SPRI beads回收产物有显的额外信号。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案,并不能理解为对本发明的限制。此外,本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化,在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述,但应当理解,本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上,各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海欣百诺生物科技有限公司
吴江近岸蛋白质科技有限公司
<120> 生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC-seq产物中的用途及方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgtctctta tacacatct 19
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agatcgctcg tcggcagcgt cagatgt 57
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctctattcg tcggcagcgt cagatgt 57
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atcctcttcg tcggcagcgt cagatgt 57
<210> 7
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca gagtagatcg tcggcagcgt cagatgt 57
<210> 8
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtctcgtg ggctcggaga tg 52
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caagcagaag acggcatacg agatctagta cggtctcgtg ggctcggaga tg 52
<210> 10
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caagcagaag acggcatacg agatttctgc ctgtctcgtg ggctcggaga tg 52
<210> 11
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caagcagaag acggcatacg agatgctcag gagtctcgtg ggctcggaga tg 52
Claims (10)
1.生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC-seq产物中的用途,所述生物素化的转座体选自携带有转座酶的融合蛋白与能和转座酶结合的生物素化接头-末端复合体形成的生物素化的转座体,和/或,转座酶与生物素化接头-末端复合体结合形成的生物素化的转座体;所述携带有转座酶的融合蛋白中还包括具有结合抗体Fc段功能的蛋白,所述具有结合抗体Fc段功能的蛋白选自Protein A、Protein G或Protein L中的两种以上。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述转座酶选自Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn8、Tn9或Tn10。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述携带有转座酶的融合蛋白为pAG-Tn5。
4.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述末端选自Mosaic末端。
5.根据权利要求4所述的用途,其特征在于,所述生物素化接头-末端复合体为生物素化的接头A-末端复合体和/或生物素化的接头B-末端复合体。
6.根据权利要求4所述的用途,其特征在于,所述生物素化接头-末端复合体由单链接头A-Mosaic末端正向寡核苷酸和Mosaic末端的反向寡核苷酸退火后形成。
7.根据权利要求4所述的用途,其特征在于,所述生物素化接头-末端复合体由单链接头B-Mosaic末端正向寡核苷酸和Mosaic末端的反向寡核苷酸退火后形成。
8.一种与靶蛋白结合的片段化核酸产物的回收方法,其特征在于,所述回收方法包括以下步骤:
1)选自以下任一:
1a)将细胞核或透化的细胞与抗体和生物素化的转座体共同孵育;通过抗体引导的生物素化的转座体进行酶切反应并产生含有接头序列的片段;
1b)将细胞核或透化的细胞与生物素化的转座体共同孵育;通过生物素化的转座体直接进行酶切反应并产生含有接头序列的片段;
2)将步骤1)中所加入的生物素化的转座体失活,使得生物素化的片段被释放至溶液上清中;
3)再加入链霉亲和素磁珠,回收得到与靶蛋白结合的片段化核酸产物。
9.根据权利要求8所述的回收方法,其特征在于,所述回收方法还包括以下特征中的一项或几项:
a)所述抗体包括ChIP-seq抗体;
b)所述回收方法能用于CUT&Tag或ATAC-seq实验中;CUT&Tag中,步骤1)通过抗体和生物素化的转座体进行酶切反应;ATAC-seq中生物素化转座体直接进行酶切反应;
c)步骤2)中加入SDS使生物素化的转座体失活。
10.一种核酸文库的构建方法,其特征在于,所述方法包括将利用权利要求8或9所述的回收方法回收的与靶蛋白结合的片段化核酸产物进行PCR扩增获得核酸文库。
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