CN112391397B - 一种烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2及其应用。一种烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其中特异性核酸片段为2~432位碱基。本发明通过对特定烟草黄酮单加氧酶CYP75B2的初步研究，发现其与烟草绿原酸含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中绿原酸含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟草低苯酚含量的烟叶新品种培育提供一定的应用基础和参考借鉴。

Description

一种烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2及其应用

技术领域

本发明涉及烟草基因工程技术领域，尤其是，本发明涉及一种烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2及其应用。

背景技术

苯酚被国家烟草专卖局列为重点控制的7种代表性有害成分之一，其随烟气吸入后会快速分布到所有组织中，具有显著的黏膜渗透性，导致组织坏死和腐蚀脱落。长期吸入含苯酚气体会导致上呼吸道哮鸣、呼吸窘迫甚至衰竭，另外还会导致头痛、晕眩、肾脏损伤和心脏***疾病、以及癌症等[1-7]。苯酚还具有致突变和基因毒性等毒性作用，被列入EPA有害成分名单(US.EPA, 2002)。目前，烟气苯酚的来源和前体物已经明确，因此，应用生物技术干扰相关前体物含量是有效降低烟气苯酚含量的策略。烟叶蛋白质(主要是Tyr)、游离Tyr和绿原酸(chlorogenic acid, CGA)是烟气苯酚的主要前体物。

CGA由苯并氨酸代谢途径合成，研究发现该代谢途径的多个酶都参与CGA的合成。苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanin ammonia-lyase，PAL）催化苯丙氨酸生成肉桂酸，然后经由肉桂酸和香豆素最终形成CGA。植物中CGA的生物合成路线尚未完全清楚，苯丙烷途径控制木质素、花绿原酸、信号分子的合成，以及与植物防御病原体和紫外光有关的大量化合物。在该途径中已经发现了超过15个P450依赖的反应，不同的P450s催化不同的反应。CYP75在整个途径的调控中发挥重要作用。

通过寻找CGA调控关键基因，研究基因对CGA积累规律的影响，选择对CGA含量代谢影响显著而对烟草其他生理过程没有明显影响的基因作为CGA调控潜在基因，通过改变CGA含量，可以实现从源头调控烟草CGA含量。中国专利CN201911325441.8公开了一个烟草绿原酸合成基因NtHQT及其应用，该基因全长4086 bp，包含1个内含子和2个外显子，其中编码区长1128 bp。烟草绿原酸合成基因NtHQT所编码的转移酶，含有375个氨基酸。在现有烟草基因工程基础上，发明人克隆获得了新的与绿原酸含量相关的烟草HQT基因（NtHQT）。进一步功能验证过程中，发明人对其进行了超表达，结果表明，将该基因超表达后，新的转基因植株中绿原酸含量得到了明显提高。这也进一步证明该基因确实与烟叶中绿原酸含量相关。而基于这一结果，可为烟草生长过程中品质调节、烟草新品种培育奠定一定的应用基础和参考借鉴。此外，中国专利CN201911317951.0公开了一个烟草多酚氧化酶NtPPO4基因及其应用，该基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示。烟草多酚氧化酶NtPPO4由588个氨基酸残基组成，具有3个典型的保守结构域。该蛋白与植物叶片绿原酸含量相关，降低该基因的表达后，叶片中绿原酸含量显著升高。本发明通过对烟草多酚氧化酶NtPPO4的初步研究，发现其与烟草绿原酸含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草叶片中绿原酸含量明显升高，基于这一特性，可为烟草新品种的培育提供应用基础和参考借鉴。

上述公开的专利都研究的是如何通过基因调控获得高绿原酸含量的烟草新品种，尚没有通过基因调控获得低绿原酸含量的烟草新品种的研究，进而可以实现从源头调控烟草CGA含量，实现降低苯酚前体物的目标，为低苯酚含量烟叶生产提供参考和基础。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2及其应用。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

一种烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其中特异性核酸片段为197~1565位碱基。

本发明还提供一种烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2在调控烟草的绿原酸含量上的应用。

优选地，利用基因沉默技术或者基因超表达方法，通过调节烟草CYP75B2蛋白表达量，来调节控制烟草的绿原酸含量。

本发明还提供一种烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2所编码的烟草黄酮单加氧酶CYP75B2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其由455个氨基酸残基组成，其中第2~432位氨基酸是保守的p450结构域。

本发明还提供一种烟草黄酮单加氧酶CYP75B2在调控烟草的绿原酸含量上的应用。

优选地，所述烟草黄酮单加氧酶CYP75B2与植物叶片中绿原酸含量相关，降低所述烟草黄酮单加氧酶CYP75B2蛋白表达后，烟草叶片中绿原酸含量明显降低。

本发明还提供一种培育烟草新品种的方法，包括以下步骤：

（1）设计引物序列，利用所述引物序列对烟草的cDNA模板进行PCR扩增获得烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2；

（2）利用所述烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2构建含有烟草黄酮单加氧酶CYP75B2的病毒诱导沉默载体TRV2- NtCYP75B2；

（3）利用构建的所述沉默载体TRV2- NtCYP75B2转化烟草，筛选获得绿原酸含量变化的烟草新品种。

优选地，所述引物序列为：

NtCYP75B2-F：5’-ACCGAATTCGCTCAGACTGGAAGGAAACA- 3’，

NtCYP75B2-R：5’-ACCGGATCCGCTTTAATGTCCTCACCACC- 3’。

与现有技术相比，本发明的技术效果体现在：

本发明通过对特定烟草黄酮单加氧酶CYP75B2的初步研究，发现其与烟草绿原酸含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中绿原酸含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟草低苯酚含量的烟叶新品种培育提供一定的应用基础和参考借鉴。

本发明的附加优点、目的以及特征将在下面的描述中将部分地加以阐述，且将对于本领域普通技术人员在研究下文后部分地变得明显，或者可以根据本发明的实践而获知。

本领域技术人员将会理解的是，能够用本发明实现的目的和优点不限于以上具体所述，并且根据以下详细说明将更清楚地理解本发明能够实现的上述和其他目的。

附图说明

图1为本发明实施例中烟草TRV2-PDS、TRV2-GFP及TRV2-NtCYP75B2载体转化组的表型对比图；

图2 为本发明实施例中与对照植株相比NtCYP75B2基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图3 为本发明实施例中病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的主要绿原酸含量比较。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以***其他方法步骤，除非另有说明；而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

生物材料：

烟草K326，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等。相关引物合成及测序工作由郑州擎科生物科技有限公司合成和提供。

下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobaccorattle virus，TRV)，具体利用的TRV2由郑州烟草研究院基因中心保存，其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因。

实验试剂：

LB液体培养基，1L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；

YEB液体培养基，1L含量中含有：5g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL1M硫酸镁（MgSO₄），高温高压灭菌；

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH₂O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；

200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用；

MMA（100 mL）：1 mL（1 M）MgCl₂；1 mL（1 M，pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As。

实施例1

本实施例就烟草NtCYP75B2基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

（1）烟草NtCYP75B2基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关CYP75B2基因研究，基于NCBI数据库以及现有HQT基因序列及相关BLAST分析结果，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtCYP75B2-F：5’-AATTACGTGTTCCCACCAGC- 3’，

NtCYP75B2-R：5’-CTTACCCGTCAAAGGCAAGA- 3’；

以烟草K326叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增获得烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2；其中，烟草K326叶片的cDNA的合成是采用现有植物RNA快速提取试剂盒提取RNA后通过反转录合成的。

PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸 5min；

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

（2）构建重组TRV2- NtCYP75B2沉默载体

将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，在37℃培养24h；

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组沉默载体TRV2- NtCYP75B2。

测序结果表明，烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2，包括1840个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

ATGGCAATCTTTTCCCTACTTCTCTACACTGTCATTTTCTCTTTCCTTCTACATTCCATTCTCACCTTATTTTTTCGCAAACGTTACCCGTTGCCACTACCACCAGGTCCAAAACCATGGCCAATAATCGGAAACCTAGTCCATATGGGTCCAAAGCCACACCAATCAACTGCAGCCTTAATGCACAAGGGTGGTCGATGGCTCGAACTTACGGTCCACTCATGCACCTTAAGATGGGATTCGTGGACGTGGTGGTTGTGGCGTCTGCATCGGTGGCGGCTCAGTTCTTAAAAACTCATGACGCTAACTTCTCGAGCCGCCCTCCGAACTCGGGTGCGAAACACTTGGCTTACAATTATCAAGATCTTGTTTTTGCACCCTACGGACCAAGGTGGCGTATGCTTAGGAAAATTTGCTCTGTTCATCTTTTCTCTGCCAAGGCTTTAGATGACTTCAGCCATGTCCGCCAGGATGAAGTAAAAACACTTACGCGCGCCCTAGCGAGTGCTGGGCAAAAGCCGGTCAAGTTAGGCCAACTGTTGAACGTGTGCACCACGAATGCACTTGCGCGAGTGATGCTAGGGAGGCGGGTGTTCGCTGACGCAAGTAGCGCTGATCCACAGGCGGAAGAGTTCAAGTCAATGGTGGTGGAAGCAATGGTGCTCGCCGGCAATTTCAATATTGGCGATTTTATTCCGGCACTTGATTGGTTGGACATACAAGGTGTAGCTGCAAAGATGAAAAAGCTCCACGCGCGTTTCGACGCGTTCTTGACCTCAATTCTAGAGGAACACAAAAGCAAGCAATTTGAAGAAACGAAAGAACATGAAGACTTGTTGAGTACGTTAATCTCTTTGAAAAAAGAAGAAGGCGATAATGAAGGAGGAAAGCTCACAGATTCAGAAATTAAAGCTTTACTTTTGAACTTGTTTATAGCTGGAACAGACACGTCCTCAAGCACAGTAGAATGGGCCATTGCGGAGCTTATTCGTAATCCAAGAATTCTGGCCCAAGCCCAACATGAGATTGACAAAGTGGTTGGAAAGAACCGGCTCGTGATGGAATCCGACCTAGCCCAATTAACTTATTTGGAAGCCATAGTCAAGGAAACCTTAAGGCTTCATCCATCCACCCCTCTCTCCCTCCCTAGAATTGCATCCGAGAGTTGTGAGATTAATGGCTATTTCATTCCAAAAGGCTCAACACTTCTCGTGAACGTTTGGGCCATCGCTCGTGATCCAAATGAATGGGTTAATCCATTGGAGTTTAGGCCCGAAAGATTTCTGCCTGGTGGTGAGAAGCCCAAAGTTGATGTGCGAGGAAATGACTTTGAAGTAATTCCATTTGGAGCTGGGCGTAGAATCTGTGCTGGAATGAATTTGGGCATACGAATGGTCCAGTTGATAACCGCAACTTTAATTCATGCATTTAACTGGGATTTGCCTATTGGACAATCGTCAGAGAAACTAAACATGGAGGAAGCATTTGGGCTGACCTTACAACGGGCTGATCCGTTAGTGGTGCACCCCGGTCTTCGCCTAGAAGCCCAAGCATACATTGGGTGAAGAACGGAAACTGCCCATTCCATACGAATGGTCCAGTTGATAACCGCAACTTTAATTCATGCATTTAACTGGGATTTGCCTATTGGACAATCGTCAGAGAAACTAAACATGGAGGAAGCATTTGGGCTGACCTTACAACGGGCTGATCCGTTAGTGGTGCACCCCGGTCTTCGCCTAGAAGCCCAAGCATACATTGGGTGA。

根据上述烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2所编码的烟草黄酮单加氧酶CYP75B2，包括455个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：

MARTYGPLMHLKMGFVDVVVVASASVAAQFLKTHDANFSSRPPNSGAKHLAYNYQDLVFAPYGPRWRMLRKICSVHLFSAKALDDFSHVRQDEVKTLTRALASAGQKPVKLGQLLNVCTTNALARVMLGRRVFADASSADPQAEEFKSMVVEAMVLAGNFNIGDFIPALDWLDIQGVAAKMKKLHARFDAFLTSILEEHKSKQFEETKEHEDLLSTLISLKKEEGDNEGGKLTDSEIKALLLNLFIAGTDTSSSTVEWAIAELIRNPRILAQAQHEIDKVVGKNRLVMESDLAQLTYLEAIVKETLRLHPSTPLSLPRIASESCEINGYFIPKGSTLLVNVWAIARDPNEWVNPLEFRPERFLPGGEKPKVDVRGNDFEVIPFGAGRRICAGMNLGIRMVQLITATLIHAFNWDLPIGQSSEKLNMEEAFGLTLQRADPLVVHPGLRLEAQAYIG。

实施例2

在实施例1的基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，发明人进一步将所构建的重组TRV2-NtCYP75B2载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

（1）转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了TRV2-GFP、TRV2-PDS重组载体作为转基因正负对照，具体转化过程为：

将TRV2-GFP（载体对照）、TRV2-PDS（VIGS效率对照）及TRV2-NtCYP75B2的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan 和50mg/L Rif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

（2）制备转染用菌液

将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif）中，28℃、250 rpm条件下培养24h；

取50uL培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD600 =1.0 ~ 1.5左右，然后4000r 离心5 min，收集菌体，再用MMA(1 mL（1 M）MgCl₂；1 mL（1 M，pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As)重悬，调节OD600 =1.0 左右；

最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。

（3）瞬时转化

以3~4 周苗龄的K326烟草叶片为实验材料，利用1 mL规格注射器，将步骤（2）中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

注射3周后的烟草表型变化情况如图1所示。可以看出，含TRV2-PDS的农杆菌浸染植株新生叶有漂白现象，说明侵染成功；而TRV2-GFP组则无明显变化，相对应的TRV2-NtCYP75B2组烟草植株无显著变化，表明NtCYP75B2基因对烟草其他基本生理状态无明显影响。

进一步通过qRT-PCR对NtCYP75B2基因表达情况进行了检测，结果如图2所示，可以看出，TRV2- NtCYP75B2的侵染植株中，NtCYP75B2的表达量显著降低。

进一步地，发明人对实验组（TRV2- NtCYP75B2浸染植株）和对照组（TRV2-GFP浸染植株）中的植物绿原酸含量情况进行了检测，检测结果如图3所示，从图3中可以看出，沉默植株的生长表型正常；基因表达量略有下降，不足15%；绿原酸含量降低为对照的60%左右，这一结果表明NtCYP75B2基因是一个很好调控绿原酸靶标基因，可以在不影响烟株表型的情况下有效降低烟叶中苯酚前体物绿原酸的含量。

其中，绿原酸含量的检测利用超高液相-三重四级杆串联质谱法测定，具体如下：取50mg 烟叶样品，转入1.5mL乙醇-水提取液（内标：伞形花内酯75 ng/mL），常温下超声1h，然后14000rpm离心后取上清液检测。采用的分析条件为：色谱条件为BEH Phenyl色谱柱（2.1×150mm，1.7um），流动相为0.1%甲酸水（A）和0.1%甲酸甲醇（B）；洗脱梯度：0~2min内B相由5%升至15%，2~10min B相保持15%，10.01~15min B相升到100%；流速为0.3mL/min，柱温为35℃，进样量为1uL；质谱条件为电喷雾电离源电离，正离子电离模式下毛细管电压为4KV，雾化气压力为40psi，干燥气流量为12L/min，干燥气温度为290℃，鞘气流量为11L/min，鞘气温度为200℃，采用实时多反映检测模式扫描。

本发明通过对特定烟草黄酮单加氧酶CYP75B2的初步研究，发现其与烟草绿原酸含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中绿原酸含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟草低苯酚含量的烟叶新品种培育提供一定的应用基础和参考借鉴。

本发明不局限于上述具体的实施方式，本发明可以有各种更改和变化。凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 一种烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1766

<212> DNA

<213> 烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2

<400> 1

atggcaatct tttccctact tctctacact gtcattttct ctttccttct acattccatt 60

ctcaccttat tttttcgcaa acgttacccg ttgccactac caccaggtcc aaaaccatgg 120

ccaataatcg gaaacctagt ccatatgggt ccaaagccac accaatcaac tgcagcctta 180

atgcacaagg gtggtcgatg gctcgaactt acggtccact catgcacctt aagatgggat 240

tcgtggacgt ggtggttgtg gcgtctgcat cggtggcggc tcagttctta aaaactcatg 300

acgctaactt ctcgagccgc cctccgaact cgggtgcgaa acacttggct tacaattatc 360

aagatcttgt ttttgcaccc tacggaccaa ggtggcgtat gcttaggaaa atttgctctg 420

ttcatctttt ctctgccaag gctttagatg acttcagcca tgtccgccag gatgaagtaa 480

aaacacttac gcgcgcccta gcgagtgctg ggcaaaagcc ggtcaagtta ggccaactgt 540

tgaacgtgtg caccacgaat gcacttgcgc gagtgatgct agggaggcgg gtgttcgctg 600

acgcaagtag cgctgatcca caggcggaag agttcaagtc aatggtggtg gaagcaatgg 660

tgctcgccgg caatttcaat attggcgatt ttattccggc acttgattgg ttggacatac 720

aaggtgtagc tgcaaagatg aaaaagctcc acgcgcgttt cgacgcgttc ttgacctcaa 780

ttctagagga acacaaaagc aagcaatttg aagaaacgaa agaacatgaa gacttgttga 840

gtacgttaat ctctttgaaa aaagaagaag gcgataatga aggaggaaag ctcacagatt 900

cagaaattaa agctttactt ttgaacttgt ttatagctgg aacagacacg tcctcaagca 960

cagtagaatg ggccattgcg gagcttattc gtaatccaag aattctggcc caagcccaac 1020

atgagattga caaagtggtt ggaaagaacc ggctcgtgat ggaatccgac ctagcccaat 1080

taacttattt ggaagccata gtcaaggaaa ccttaaggct tcatccatcc acccctctct 1140

ccctccctag aattgcatcc gagagttgtg agattaatgg ctatttcatt ccaaaaggct 1200

caacacttct cgtgaacgtt tgggccatcg ctcgtgatcc aaatgaatgg gttaatccat 1260

tggagtttag gcccgaaaga tttctgcctg gtggtgagaa gcccaaagtt gatgtgcgag 1320

gaaatgactt tgaagtaatt ccatttggag ctgggcgtag aatctgtgct ggaatgaatt 1380

tgggcatacg aatggtccag ttgataaccg caactttaat tcatgcattt aactgggatt 1440

tgcctattgg acaatcgtca gagaaactaa acatggagga agcatttggg ctgaccttac 1500

aacgggctga tccgttagtg gtgcaccccg gtcttcgcct agaagcccaa gcatacattg 1560

ggtgaagaac ggaaactgcc cattccatac gaatggtcca gttgataacc gcaactttaa 1620

ttcatgcatt taactgggat ttgcctattg gacaatcgtc agagaaacta aacatggagg 1680

aagcatttgg gctgacctta caacgggctg atccgttagt ggtgcacccc ggtcttcgcc 1740

tagaagccca agcatacatt gggtga 1766

<210> 2

<211> 455

<212> PRT

<213> 烟草黄酮单加氧酶CYP75B2

<400> 2

Met Ala Arg Thr Tyr Gly Pro Leu Met His Leu Lys Met Gly Phe Val

1 5 10 15

Asp Val Val Val Val Ala Ser Ala Ser Val Ala Ala Gln Phe Leu Lys

20 25 30

Thr His Asp Ala Asn Phe Ser Ser Arg Pro Pro Asn Ser Gly Ala Lys

35 40 45

His Leu Ala Tyr Asn Tyr Gln Asp Leu Val Phe Ala Pro Tyr Gly Pro

50 55 60

Arg Trp Arg Met Leu Arg Lys Ile Cys Ser Val His Leu Phe Ser Ala

65 70 75 80

Lys Ala Leu Asp Asp Phe Ser His Val Arg Gln Asp Glu Val Lys Thr

85 90 95

Leu Thr Arg Ala Leu Ala Ser Ala Gly Gln Lys Pro Val Lys Leu Gly

100 105 110

Gln Leu Leu Asn Val Cys Thr Thr Asn Ala Leu Ala Arg Val Met Leu

115 120 125

Gly Arg Arg Val Phe Ala Asp Ala Ser Ser Ala Asp Pro Gln Ala Glu

130 135 140

Glu Phe Lys Ser Met Val Val Glu Ala Met Val Leu Ala Gly Asn Phe

145 150 155 160

Asn Ile Gly Asp Phe Ile Pro Ala Leu Asp Trp Leu Asp Ile Gln Gly

165 170 175

Val Ala Ala Lys Met Lys Lys Leu His Ala Arg Phe Asp Ala Phe Leu

180 185 190

Thr Ser Ile Leu Glu Glu His Lys Ser Lys Gln Phe Glu Glu Thr Lys

195 200 205

Glu His Glu Asp Leu Leu Ser Thr Leu Ile Ser Leu Lys Lys Glu Glu

210 215 220

Gly Asp Asn Glu Gly Gly Lys Leu Thr Asp Ser Glu Ile Lys Ala Leu

225 230 235 240

Leu Leu Asn Leu Phe Ile Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val

245 250 255

Glu Trp Ala Ile Ala Glu Leu Ile Arg Asn Pro Arg Ile Leu Ala Gln

260 265 270

Ala Gln His Glu Ile Asp Lys Val Val Gly Lys Asn Arg Leu Val Met

275 280 285

Glu Ser Asp Leu Ala Gln Leu Thr Tyr Leu Glu Ala Ile Val Lys Glu

290 295 300

Thr Leu Arg Leu His Pro Ser Thr Pro Leu Ser Leu Pro Arg Ile Ala

305 310 315 320

Ser Glu Ser Cys Glu Ile Asn Gly Tyr Phe Ile Pro Lys Gly Ser Thr

325 330 335

Leu Leu Val Asn Val Trp Ala Ile Ala Arg Asp Pro Asn Glu Trp Val

340 345 350

Asn Pro Leu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Pro Gly Gly Glu Lys

355 360 365

Pro Lys Val Asp Val Arg Gly Asn Asp Phe Glu Val Ile Pro Phe Gly

370 375 380

Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Met Asn Leu Gly Ile Arg Met Val

385 390 395 400

Gln Leu Ile Thr Ala Thr Leu Ile His Ala Phe Asn Trp Asp Leu Pro

405 410 415

Ile Gly Gln Ser Ser Glu Lys Leu Asn Met Glu Glu Ala Phe Gly Leu

420 425 430

Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Leu Val Val His Pro Gly Leu Arg Leu

435 440 445

Glu Ala Gln Ala Tyr Ile Gly

450 455

Claims (6)

1.一种烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的一种烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2在调控烟草的绿原酸含量上的应用。

3.利用权利要求1所述的一种烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2调控烟草的绿原酸含量的方法，其特征在于，利用基因沉默技术或者基因超表达方法，通过调节烟草CYP75B2蛋白表达量，来调节控制烟草的绿原酸含量。

4.权利要求1所述的一种烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2所编码的烟草黄酮单加氧酶CYP75B2，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.权利要求4所述的烟草黄酮单加氧酶CYP75B2在调控烟草的绿原酸含量上的应用。

6.一种培育带有如权利要求1所述的烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2的烟草新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）设计引物序列，利用所述引物序列对烟草的cDNA模板进行PCR扩增获得烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2；

（2）利用所述烟草黄酮单加氧酶基因NtCYP75B2构建含有烟草黄酮单加氧酶CYP75B2的病毒诱导沉默载体TRV2- NtCYP75B2；

（3）利用构建的所述沉默载体TRV2- NtCYP75B2转化烟草，筛选获得绿原酸含量变化的烟草新品种。

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