CN110819640B

CN110819640B - 烟草NtNRP1基因其应用

Info

Publication number: CN110819640B
Application number: CN201911317969.0A
Authority: CN
Inventors: 刘萍萍; 周会娜; 郑庆霞; 翟妞; 张慧; 李泽锋; 陈千思; 徐国云; 王晨; 金立锋; 曹培健
Original assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Current assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN110819640A

Abstract

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及烟草NtNRP1基因及其应用专利申请。NtNRP1基因由981个碱基组成，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。NtNRP1蛋白由326个氨基酸组成，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本申请中，发明人通过对特定烟草NtNRP1基因的初步研究，发现其与烟草硝酸根物质含量高度相关，进一步功能性验证过程中，在将该基因沉默后，烟草中硝酸根物质含量发生了明显上升。基于这一特性，可为烟草生长过程中营养调节、烟草新品种培育奠定一定的应用基础和参考借鉴。

Description

烟草NtNRP1基因其应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及烟草NtNRP1基因及其应用专利申请。

背景技术

人们通常所吸食的烟草属双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物，烟草属(Nicotiana) 有60 多个种，而用于制备吸食的主要为两个栽培种，分别为普通烟草(又称红花烟草，Nicotiana tabacum)和黄花烟草(Nicotiana rustica)，其中前者占据主要栽培面积。栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等特点，可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是我国栽培最广的普通烟草。

植物生长和发育所必需的矿质元素中，氮素(N)是需求量最大并对植物生长起着重要制约作用的一种化学元素。同时，氮素也是合成蛋白质、核苷酸、细胞结构物质、植物激素、生物碱等的必需元素，在植物细胞的生长、分化和代谢过程中起着蕈要的作用。氮在土壤中以铵、硝酸盐、氨基酸、寡肽、不溶性氮复合物等多种形式存在。植物生长发育过程中，主要是通过根部以无机盐的形式吸收土壤中的氮营养。

现有研究认为，植物有一个复杂的运输体系来完成含氮物质的吸收及在体内的再分配，包括硝酸根、铵根、寡肽、氨基酸等运输体。无机氮化合物主要是通过木质部运输到叶片，而有机氮主要通过韧皮部、以氨基酸或者寡肽的形式完成从叶片到其他需氮器官的再分配，再分配对于不能进行氮素同化作用的器官至关重要。

而烟草基因工程深入，通过对与氮元素转运相关基因的深入研究，可为烟草生长发育调控、以及烟草新品种培育奠定一定技术基础。

发明内容

基于烟草中营养物质、尤其是氮素物质含量调控基因的研究，本发明目的在于提供一个烟草NtNRP1基因及其在烟草硝酸根含量调节中的作用，从而为烟草生长发育调控、以及新品种培育奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草NtNRP1蛋白的编码基因NtNRP1，由984个碱基组成，具体碱基序列如SEQ IDNO.1所示。

所述编码基因NtNRP1在叶片硝酸根物质含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草NtNRP1基因表达量，来调节控制烟叶中硝酸根物质含量情况。

所述编码基因NtNRP1的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：

（1）提取（具体例如以烟草K326叶片为样品）基因组，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtNRP1-F：5’- ACAACTCCTTACTCGTTGCC - 3’，

NtNRP1-R：5’- ATCTCCACACCCTGTTGTTT - 3’。

烟草NtNRP1蛋白，由327个氨基酸组成，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述烟草NtNRP1蛋白在叶片硝酸根物质含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中硝酸根含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中硝酸根类物质含量明显增加。

利用所述编码基因NtNRP1的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtNRP1基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得硝酸根类物质含量变化的烟草新品种；

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtNRP1基因的表达使其沉默，NtNRP1基因沉默植株中硝酸根类物质含量明显上升，进而获得硝酸根含量上升的植物新品种。

换言之，一种培育高硝酸根含量烟草新品种培育方法，利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtNRP1基因的表达使其沉默，NtNRP1基因沉默的新烟草品种植株中硝酸根类物质含量明显上升。

本申请中，发明人通过对特定烟草NtNRP1基因的初步研究，发现其与烟草硝酸根物质含量高度相关，进一步功能性验证过程中，在将该基因沉默后，烟草中硝酸根物质含量发生了明显上升。基于这一特性，可为烟草生长过程中营养调节、烟草新品种培育奠定一定的应用基础和参考借鉴。

附图说明

图1为与对照植株相比NtNRP1基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图2为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的硝酸根含量比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。

生物材料：

本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等；

下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobaccorattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2（一种常用载体），其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；

实验试剂：

LB液体培养基，1L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；

YEB液体培养基，1L含量中含有：5g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL1M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH₂O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；

200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用。

实施例1

本实施例就烟草NtNRP1基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

（1）烟草NtNRP1基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关NtNRP1基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtNRP1-F：5’- ACAACTCCTTACTCGTTGCC - 3’，

NtNRP1-R：5’- ATCTCCACACCCTGTTGTTT - 3’。

以烟草K326叶片（先提取基因组，再反转录为cDNA）的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtHSP22基因；

PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸 5min；

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

（2）构建重组TRV2- NtNRP1载体

将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，37℃过培养夜；

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2- Nt NRP1。

需要说明的是，

烟草NtNRP1基因，包括981个碱基，具体碱基序列为：

ATGGGTGGTTGGGCTATAGCGGTGCACGGCGGCGCTGGTGTGGACCCAAATCTCCCAGCGGAGCGTCAAGAAAAAGCCAAACAACTCCTTACTCGTTGCCTTAACATTGGCATCTCTGCTCTTCGCTCTTCTCTTCCTGCTATTGATGTCGTTGAACTCGTCGTGAGGGAACTGGAAACCGATCCGATATTCAACTCAGGCCGTGGATCTGCATTAACCGCGAATGGAACAGTGGAAATGGAGGCGAGCATCATGGACGGCGATGGGAGACGATGCGGCGCCGTCTCGGGTATCACCACCGTGAAAAACCCAATCTCTCTTGCTCGCCTCGTCATGGAAAAGTCACCTCATTCCTACCTGGCTTTCTCCGGCGCTGAAGAATTCGCCAAACAACAGGGTGTGGAGATGGCGGACAATGATTATTTCATCACCGAAGACAACGTCGGAATGCTGAAACTAGCGAAAGAGGCCAACACCATTCTGTACGATTACAGAATTCCAGCAGTGGGATTGGAATCCTGCGCGGCGGCTGTGGAGAGCCCAATTCACATGAATGGGCTACCAATAAGCGTATACGCGCCGGAGACAGTTGGATGTGTGGTGGTGGACAGCCAAGGTAGGTGCGCCGCCGCCACATCAACCGGTGGTCTGATGAACAAAATGACCGGTCGTATCGGTGACTCGCCGCTGATTGGTGCTGGGACCTACGCTGGTGAGCGTTGTGGGGTCTCTTGTACTGGTGAAGGAGAGGCCATCATACGTGGAACCCTAGCACGTGACGTGGCAGCTGTTATGGAATACAAGGAATTGGGCCTACAAGATGCAGTGGACTATGTGATTAAGAAAAGACTGGACAAAGGTTTTGCTGGGCTTATTGCTGTGTCAAATAAAGGAGAAGTGGCCTATGGGTTTAATTGTAATGGAATGTTTAGAGGTTGTGCTACTGAAGATGGATTTATGGAAGTTGGTATTTGGGAATAG。

烟草NtNRP1蛋白，包括326个氨基酸，具体氨基酸序列为：

MGGWAIAVHGGAGVDPNLPAERQEKAKQLLTRCLNIGISALRSSLPAIDVVELVVRELETDPIFNSGRGSALTANGTVEMEASIMDGDGRRCGAVSGITTVKNPISLARLVMEKSPHSYLAFSGAEEFAKQQGVEMADNDYFITEDNVGMLKLAKEANTILYDYRIPAVGLESCAAAVESPIHMNGLPISVYAPETVGCVVVDSQGRCAAATSTGGLMNKMTGRIGDSPLIGAGTYAGERCGVSCTGEGEAIIRGTLARDVAAVMEYKELGLQDAVDYVIKKRLDKGFAGLIAVSNKGEVAYGFNCNGMFRGCATEDGFMEVGIWE。

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，发明人进一步将所构建的重组TRV2-NtNPR1载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

（1）转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了TRV2、TRV2-PDS重组载体作为对照，具体转化过程为：

将TRV2（载体对照）、TRV2-PDS（VIGS效率对照）及TRV2-NtNPR1的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan 和50mg/LRif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

（2）制备转染用菌液

将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif）中，28℃、250 rpm条件下培养过夜；

取50uL 过夜培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD₆₀₀ =1.0 ~ 1.5左右，然后4000g 离心5 min，收集菌体，再用MMA重悬，调节OD₆₀₀=1.0 左右；

最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。

（3）瞬时转化

以3~4 w（周）苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1 mL规格注射器，将步骤（2）中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

注射3周后的烟草表型变化情况表明，含TRV2-PDS的农杆菌浸染植株新生叶有漂白现象，说明侵染成功；而TRV2组、TRV2- NtNPR1组则无明显变化。

进一步通过qRT-PCR对NtNPR1基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，TRV2- NtNPR1的侵染植株中，NtNPR1的表达量显著降低。

进一步地，发明人对实验组（TRV2- NtNPR1浸染植株）和对照组（TRV2浸染植株）叶片中的硝酸根含量情况进行了检测，结果如图2所示：可以明显看出，随着NtNPR1基因的沉默，叶片中硝酸根含量得到了明显提升（升高了1.43倍）。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 烟草NtNRP1基因其应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 981

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atgggtggtt gggctatagc ggtgcacggc ggcgctggtg tggacccaaa tctcccagcg 60

gagcgtcaag aaaaagccaa acaactcctt actcgttgcc ttaacattgg catctctgct 120

cttcgctctt ctcttcctgc tattgatgtc gttgaactcg tcgtgaggga actggaaacc 180

gatccgatat tcaactcagg ccgtggatct gcattaaccg cgaatggaac agtggaaatg 240

gaggcgagca tcatggacgg cgatgggaga cgatgcggcg ccgtctcggg tatcaccacc 300

gtgaaaaacc caatctctct tgctcgcctc gtcatggaaa agtcacctca ttcctacctg 360

gctttctccg gcgctgaaga attcgccaaa caacagggtg tggagatggc ggacaatgat 420

tatttcatca ccgaagacaa cgtcggaatg ctgaaactag cgaaagaggc caacaccatt 480

ctgtacgatt acagaattcc agcagtggga ttggaatcct gcgcggcggc tgtggagagc 540

ccaattcaca tgaatgggct accaataagc gtatacgcgc cggagacagt tggatgtgtg 600

gtggtggaca gccaaggtag gtgcgccgcc gccacatcaa ccggtggtct gatgaacaaa 660

atgaccggtc gtatcggtga ctcgccgctg attggtgctg ggacctacgc tggtgagcgt 720

tgtggggtct cttgtactgg tgaaggagag gccatcatac gtggaaccct agcacgtgac 780

gtggcagctg ttatggaata caaggaattg ggcctacaag atgcagtgga ctatgtgatt 840

aagaaaagac tggacaaagg ttttgctggg cttattgctg tgtcaaataa aggagaagtg 900

gcctatgggt ttaattgtaa tggaatgttt agaggttgtg ctactgaaga tggatttatg 960

gaagttggta tttgggaata g 981

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Met Gly Gly Trp Ala Ile Ala Val His Gly Gly Ala Gly Val Asp Pro

1 5 10 15

Asn Leu Pro Ala Glu Arg Gln Glu Lys Ala Lys Gln Leu Leu Thr Arg

20 25 30

Cys Leu Asn Ile Gly Ile Ser Ala Leu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Ile

35 40 45

Asp Val Val Glu Leu Val Val Arg Glu Leu Glu Thr Asp Pro Ile Phe

50 55 60

Asn Ser Gly Arg Gly Ser Ala Leu Thr Ala Asn Gly Thr Val Glu Met

65 70 75 80

Glu Ala Ser Ile Met Asp Gly Asp Gly Arg Arg Cys Gly Ala Val Ser

85 90 95

Gly Ile Thr Thr Val Lys Asn Pro Ile Ser Leu Ala Arg Leu Val Met

100 105 110

Glu Lys Ser Pro His Ser Tyr Leu Ala Phe Ser Gly Ala Glu Glu Phe

115 120 125

Ala Lys Gln Gln Gly Val Glu Met Ala Asp Asn Asp Tyr Phe Ile Thr

130 135 140

Glu Asp Asn Val Gly Met Leu Lys Leu Ala Lys Glu Ala Asn Thr Ile

145 150 155 160

Leu Tyr Asp Tyr Arg Ile Pro Ala Val Gly Leu Glu Ser Cys Ala Ala

165 170 175

Ala Val Glu Ser Pro Ile His Met Asn Gly Leu Pro Ile Ser Val Tyr

180 185 190

Ala Pro Glu Thr Val Gly Cys Val Val Val Asp Ser Gln Gly Arg Cys

195 200 205

Ala Ala Ala Thr Ser Thr Gly Gly Leu Met Asn Lys Met Thr Gly Arg

210 215 220

Ile Gly Asp Ser Pro Leu Ile Gly Ala Gly Thr Tyr Ala Gly Glu Arg

225 230 235 240

Cys Gly Val Ser Cys Thr Gly Glu Gly Glu Ala Ile Ile Arg Gly Thr

245 250 255

Leu Ala Arg Asp Val Ala Ala Val Met Glu Tyr Lys Glu Leu Gly Leu

260 265 270

Gln Asp Ala Val Asp Tyr Val Ile Lys Lys Arg Leu Asp Lys Gly Phe

275 280 285

Ala Gly Leu Ile Ala Val Ser Asn Lys Gly Glu Val Ala Tyr Gly Phe

290 295 300

Asn Cys Asn Gly Met Phe Arg Gly Cys Ala Thr Glu Asp Gly Phe Met

305 310 315 320

Glu Val Gly Ile Trp Glu

325

Claims

1.烟草NtNRP1蛋白的编码基因NtNRP1在烟叶硝酸根含量调控中的应用，其特征在于，所述调控是利用基因沉默技术，通过下调烟草NtNRP1基因表达量，来提升烟叶中硝酸根含量；

所述烟草NtNRP1蛋白的编码基因NtNRP1，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.烟草NtNRP1蛋白在烟叶硝酸根含量调控中的应用，其特征在于，该蛋白与烟叶中硝酸根含量相关，所述调控是降低该蛋白表达，烟叶中硝酸根含量明显增加；

所述烟草NtNRP1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.利用烟草NtNRP1蛋白的编码基因NtNRP1的烟草品种培育方法，其特征在于，通过转基因技术，构建含有NtNRP1基因的病毒诱导沉默载体，转化烟草，筛选获得硝酸根含量升高的烟草品种；

4.如权利要求3所述烟草品种培育方法，其特征在于，构建含有NtNRP1基因的病毒诱导沉默载体过程中，PCR扩增获得编码基因NtNRP1时，通过如下步骤获得：

（1）提取基因组，并反转录为cDNA备用；

提取基因组时，以烟草K326叶片为样品；

NtNRP1-F：5’- ACAACTCCTTACTCGTTGCC - 3’，

NtNRP1-R：5’- ATCTCCACACCCTGTTGTTT - 3’。