CN111304212B - 烟草NtYcf45-like蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草NtYcf45‑like蛋白及其应用专利申请。编码基因NtYcf45‑like含有1968个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示;烟草NtYcf45‑like蛋白由655个氨基酸残基组成,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本申请中，发明人基于相关烟草基因工程研究进展，通过对特定烟草NtYcf45‑like蛋白的初步研究，发现其与烟草甘油酸物质含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中甘油酸物质含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础。

Description

烟草NtYcf45-like蛋白及其应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草NtYcf45-like蛋白及其应用专利申请。

背景技术

人们通常所吸食的烟草属双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物，烟草属(Nicotiana) 有60 多个种，而用于制备吸食的主要为两个栽培种，分别为普通烟草(又称红花烟草，Nicotiana tabacum)和黄花烟草(Nicotiana rustica)，其中前者占据主要栽培面积。栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等特点，可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是我国栽培最广的普通烟草。

作为一种叶用经济作物，烤烟的栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。烟叶品质决定烟叶的可用性，直接影响卷烟商品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。也因此，为满足国内外卷烟企业对优质烟叶不断增长的需求，必须不断提高烟叶品质和安全性。

有机酸是烟草化学组成中一个重要的组成部分。烟草中的有机酸主要是指除氨基酸以外的有机酸, 其种类繁多,含量差异大, 总含量一般为12%~16%，且大部分以与碱金属或有机碱合成盐或以酯类的形式存在。烟草中有机酸通常分为挥发酸、半挥发酸和非挥发酸。已有研究，普遍认为有机酸不仅在烟草生长发育过程中起着重要的作用,而且对烟叶和卷烟的质量有着重要的影响。一般而言，有机酸可以增加烟气酸性, 醇和烟气,并使烟味变得甜润舒适。尤其是挥发性有机酸, 尽管其含量很低（最多达0.1%~0.2%, 有的甚至只有0.01%~0.05%）, 但其对烟叶感官质量的影响却远远大于多元酸和高级脂肪酸。

总之，随着烟草基因工程深入，结合有机酸类物质组分对于烟叶品质的重要影响，对于与烟草中有机酸类物质相关编码基因的深入研究和开发，可为烟草品质调控奠定良好的技术基础。

发明内容

基于烟草甘油酸物质含量调控基因的研究，本发明目的在于提供一个烟草NtYcf45-like蛋白基因及其在烟草甘油酸物质含量调节方面的应用，从而为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草NtYcf45-like蛋白的编码基因NtYcf45-like，包括1968个碱基，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

所述NtYcf45-like基因在叶片中甘油酸物质含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节NtYcf45-like基因表达量，来调节控制叶片中甘油酸物质含量高低。

所述NtYcf45-like基因的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：

（1）提取（具体例如以烟草K326叶片为样品）基因组，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtYcf45-like-F：5’- TTATCAGGGACATAGCCAGG- 3’，

NtYcf45-like-R：5’- CAACCAGCATCTCTAAAGCA - 3’。

烟草NtYcf45-like蛋白，由655个氨基酸残基组成，具体氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

所述烟草NtYcf45-like蛋白在叶片甘油酸物质含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中甘油酸物质含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中甘油酸物质含量明显降低。

利用所述编码基因NtYcf45-like的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtYcf45-like基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得甘油酸含量变化的烟草新品种；

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtYcf45-like基因的表达使其沉默，NtYcf45-like基因沉默植株中甘油酸物质含量显著下降，进而获得甘油酸含量下降的植物新品种。

换言之，一种培育低甘油酸含量烟草新品种培育方法，利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtYcf45-like基因的表达使其沉默，NtYcf45-like基因沉默的新烟草品种植株中甘油酸物质含量显著下降。

一般而言，挥发性酸由于其挥发性在卷烟抽吸过程中可直接进入烟气, 对吃味和香气有良好的作用，因此作为挥发性的脂肪酸甘油酸对烟草的品质有重要影响。基于甘油酸的重要作用，对烟草甘油酸物质调控基因进行深入研究，利用基因工程构建新的烟草品种，可为改善烟草品种奠定良好应用基础。本申请中，发明人基于相关烟草基因工程研究进展，通过对特定烟草NtYcf45-like蛋白的初步研究，发现其与烟草甘油酸物质含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中甘油酸物质含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础。

附图说明

图1为与对照植株相比，NtYcf45-like基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图2 为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的甘油酸含量比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。

生物材料：

本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等栽培管理；

下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobaccorattle virus，TRV)， 所具体利用的TRV2（一种常用载体）带有卡那霉素筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；

实验试剂：

LB液体培养基，1L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；

YEB液体培养基，1L含量中含有：5g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL1M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH₂O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；

200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用。

实施例1

本实施例就烟草NtYcf45-like基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

（1）烟草NtYcf45-like基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关NtYcf45-like基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtYcf45-like-F：5’- TTATCAGGGACATAGCCAGG- 3’，

NtYcf45-like-R：5’- CAACCAGCATCTCTAAAGCA - 3’；

以烟草K326叶片（先提取基因组，再反转录为cDNA）的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtYcf45-like基因；

PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸 5min；

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

（2）构建重组TRV2- NtYcf45-like载体

将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，37℃过培养夜；

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2-NtYcf45-like。

需要说明的是，

烟草NtYcf45-like基因，包括1968个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体碱基序列为：

ATGCTCTCTTTTGCTTTACTCCATTCCTCTTCTTCACCAAAACCACAATTCCATTTTCACTACAAAAATCAAATCCCCAAACTCCCATTTCAATCCCTCCATTTTTCACCCTTTACGGTATTACCCATAAAATTACAGAGCAAACCCTCGTTCTTGAGCTTATCATCATGTTTTCCATCTTCTACTTCTTTGATTGGTGACGAGTTTGAGGTGGAATTGGGCCGATTACTGACGCTATTACCGGAGGAGATGCGGCGGAGCGTTAGCGAACATCCAGAGTTTTGCTACTTAATTGAAGTGGTTATGGACTTGGGTCGTAAGCCACTTGCTCGCTTCCCCTCCGGCGATTTTATCTTGTCCGATCATCCAATAACCCTAGATGATCTTCAACATGCTATATCCAAGGTTGGTGACTTTGCAGTTGATAATAGAGCTGGCATTAGCAGAACTTTACACCGAATTAGTGCTATTAGAAACCGGAAAGGTGCAATTATTGGATTAACTTGTCGAGTTGGTCGTGCACTATCTGGAAGTGCCAACGCATTGCGAGATCTAGTTAAAGATGGTGCTTCTCTGTTGCTCATTGGTCCTCCTGGAGTTGGAAAAACAACTATTATCAGGGACATAGCCAGGATGCTTGCAAATGATTATGGGAAGCGCGTAATGATTGTTGACACATCTAATGAAATTGGCGGGGATGGTGATATACCTCATGCAGGGATAGGTAATGCTCGCCGGATGCAAGTTCCACACTCTGATGTGCAACACAAGGTGCTGATAGAAGCAGTGGAAAATCATATGCCACAAGTGATTGTAATCGATGAGATTGGTACTAACCTTGAGGCAATGGCTGCTAGCACCATTGCACAACGAGGAATTCAGTTAGTTGCAACTGCTCATGGAGTAACAATAGATAATTTAGTGATGAATCCTGCTTTAGAGATGCTGGTTGGAGGAGTACAGAGTGTAACACTTGGCGATGAAGAGGCAAGCAGGAGAGGTGTTCAGAAAAGTGTGCTGGAGAGGAAGGGTCCATCAGCTTTTAGCTGTGGGGTTGAGATAATCTCCAAGGCAGAACTGAGAGTTCACCCTGATTTAGAAGCAACAGTAGATGCAATTCTTGCAGGCCGTTACCCAAGATATGAAACCCGCAAGATAAATCCAGGATCACAAGATGAAACAAGGGAAAGTTCATCCACCCAAGCACCATTTGATGAGAGGAATGAAGTTTTGGTTGAAGATATTATCCAGATGAATGGAGGTGTACCTGGTTCTACCGAGCTCATCTCGGAAACAGATCCAAGCATTGAAGGAGGGTCTGGTGAAAGTGAGAATGCCCTTTGCATTTTTCTTTATGGGATCTCAGAGGCGAGTGTGATACAAGGGATAAAACAGTTAAACATCGATGATGCCATTGAGTTTACTGATAATATCAGCGAAGCAGATGTGTTACTTGCTCTGCAGTCCAAGCTTAAGAAAAACTCTCGGATTCAAGCAGCTGCAAAATCTCACGGCATTCCGATTTATATGACAAAGACAAGCTCCTCAACGCAGTTGGCAAAGGCTATAGAGGCATTAATGGATGATTTTGCTGATGGCTTTGAGTTTCTCGAATCTGAAGCTAAGACGAATGAGTCTGAAAAGATTGATGCGTTGGAGGAGGCTAGAATAGGCATGGAGCGTGTAGTAATTCCAAAAGGGGAACCTGTTGAGCTACTCCCTCGGCCTTCAAATATTATATTGCTTCAGAAGGATCTTATTAGGAAGTACAAGCTAAAATCAGAGCGAATTGGAACAGGAACGGATGTAAGGCTTCGAATTCTCCCTTTCTCCGGTGCACCTGATGAAGACAGTCAGGATAGTGAAGGAGTTGATGATGAGAGCGAAGTTGATGAATTATTCAGCCCGAATGCTGAATCAAATGGATCTGCCTTCAGGGTGGATAGATTACCTCTACTACCTGAGTAG。

烟草NtYcf45-like蛋白，包括655个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体氨基酸序列为：

MLSFALLHSSSSPKPQFHFHYKNQIPKLPFQSLHFSPFTVLPIKLQSKPSFLSLSSCFPSSTSLIGDEFEVELGRLLTLLPEEMRRSVSEHPEFCYLIEVVMDLGRKPLARFPSGDFILSDHPITLDDLQHAISKVGDFAVDNRAGISRTLHRISAIRNRKGAIIGLTCRVGRALSGSANALRDLVKDGASLLLIGPPGVGKTTIIRDIARMLANDYGKRVMIVDTSNEIGGDGDIPHAGIGNARRMQVPHSDVQHKVLIEAVENHMPQVIVIDEIGTNLEAMAASTIAQRGIQLVATAHGVTIDNLVMNPALEMLVGGVQSVTLGDEEASRRGVQKSVLERKGPSAFSCGVEIISKAELRVHPDLEATVDAILAGRYPRYETRKINPGSQDETRESSSTQAPFDERNEVLVEDIIQMNGGVPGSTELISETDPSIEGGSGESENALCIFLYGISEASVIQGIKQLNIDDAIEFTDNISEADVLLALQSKLKKNSRIQAAAKSHGIPIYMTKTSSSTQLAKAIEALMDDFADGFEFLESEAKTNESEKIDALEEARIGMERVVIPKGEPVELLPRPSNIILLQKDLIRKYKLKSERIGTGTDVRLRILPFSGAPDEDSQDSEGVDDESEVDELFSPNAESNGSAFRVDRLPLLPE。

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，发明人进一步将所构建的重组TRV2- NtYcf45-like载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

（1）转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了TRV2-GFP重组载体作为对照，具体转化过程为：

将TRV2-GFP（载体对照）及TRV2-NtYcf45-like的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan 和50mg/L Rif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

（2）制备转染用菌液

将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif）中，28℃、250 rpm条件下培养过夜；

取50uL 过夜培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD₆₀₀ =1.0 ~ 1.5左右，然后4000g 离心5 min，收集菌体，再用MMA重悬，调节OD₆₀₀ =1.0 左右；

最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。

（3）瞬时转化

以3~4 w（周）苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1 mL规格注射器，将步骤（2）中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

进一步通过qRT-PCR对NtYcf45-like基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，TRV2- NtYcf45-like的侵染植株中，NtYcf45-like的表达量显著降低。

进一步地，发明人对实验组（TRV2- NtYcf45-like浸染植株）和对照组（TRV2-GFP浸染植株）中的植物甘油酸含量情况进行了检测（检测方法参照《基于气质和液质联用技术的烟草鲜烟叶代谢组学分析流程》（郑庆霞等，烟草科技，2019）），结果如图2所示。

从图2结果可以看出，实验组中甘油酸含量与对照组相比有显著下降，下降百分比可达60.17%。这进一步表明，通过沉默NtYcf45-like基因，可对烟草叶片中植物甘油酸的含量进行调控，进而可为烟叶品质调控奠定一定技术基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 烟草NtYcf45-like蛋白及其应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1968

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atgctctctt ttgctttact ccattcctct tcttcaccaa aaccacaatt ccattttcac 60

tacaaaaatc aaatccccaa actcccattt caatccctcc atttttcacc ctttacggta 120

ttacccataa aattacagag caaaccctcg ttcttgagct tatcatcatg ttttccatct 180

tctacttctt tgattggtga cgagtttgag gtggaattgg gccgattact gacgctatta 240

ccggaggaga tgcggcggag cgttagcgaa catccagagt tttgctactt aattgaagtg 300

gttatggact tgggtcgtaa gccacttgct cgcttcccct ccggcgattt tatcttgtcc 360

gatcatccaa taaccctaga tgatcttcaa catgctatat ccaaggttgg tgactttgca 420

gttgataata gagctggcat tagcagaact ttacaccgaa ttagtgctat tagaaaccgg 480

aaaggtgcaa ttattggatt aacttgtcga gttggtcgtg cactatctgg aagtgccaac 540

gcattgcgag atctagttaa agatggtgct tctctgttgc tcattggtcc tcctggagtt 600

ggaaaaacaa ctattatcag ggacatagcc aggatgcttg caaatgatta tgggaagcgc 660

gtaatgattg ttgacacatc taatgaaatt ggcggggatg gtgatatacc tcatgcaggg 720

ataggtaatg ctcgccggat gcaagttcca cactctgatg tgcaacacaa ggtgctgata 780

gaagcagtgg aaaatcatat gccacaagtg attgtaatcg atgagattgg tactaacctt 840

gaggcaatgg ctgctagcac cattgcacaa cgaggaattc agttagttgc aactgctcat 900

ggagtaacaa tagataattt agtgatgaat cctgctttag agatgctggt tggaggagta 960

cagagtgtaa cacttggcga tgaagaggca agcaggagag gtgttcagaa aagtgtgctg 1020

gagaggaagg gtccatcagc ttttagctgt ggggttgaga taatctccaa ggcagaactg 1080

agagttcacc ctgatttaga agcaacagta gatgcaattc ttgcaggccg ttacccaaga 1140

tatgaaaccc gcaagataaa tccaggatca caagatgaaa caagggaaag ttcatccacc 1200

caagcaccat ttgatgagag gaatgaagtt ttggttgaag atattatcca gatgaatgga 1260

ggtgtacctg gttctaccga gctcatctcg gaaacagatc caagcattga aggagggtct 1320

ggtgaaagtg agaatgccct ttgcattttt ctttatggga tctcagaggc gagtgtgata 1380

caagggataa aacagttaaa catcgatgat gccattgagt ttactgataa tatcagcgaa 1440

gcagatgtgt tacttgctct gcagtccaag cttaagaaaa actctcggat tcaagcagct 1500

gcaaaatctc acggcattcc gatttatatg acaaagacaa gctcctcaac gcagttggca 1560

aaggctatag aggcattaat ggatgatttt gctgatggct ttgagtttct cgaatctgaa 1620

gctaagacga atgagtctga aaagattgat gcgttggagg aggctagaat aggcatggag 1680

cgtgtagtaa ttccaaaagg ggaacctgtt gagctactcc ctcggccttc aaatattata 1740

ttgcttcaga aggatcttat taggaagtac aagctaaaat cagagcgaat tggaacagga 1800

acggatgtaa ggcttcgaat tctccctttc tccggtgcac ctgatgaaga cagtcaggat 1860

agtgaaggag ttgatgatga gagcgaagtt gatgaattat tcagcccgaa tgctgaatca 1920

aatggatctg ccttcagggt ggatagatta cctctactac ctgagtag 1968

<210> 2

<211> 655

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Met Leu Ser Phe Ala Leu Leu His Ser Ser Ser Ser Pro Lys Pro Gln

1 5 10 15

Phe His Phe His Tyr Lys Asn Gln Ile Pro Lys Leu Pro Phe Gln Ser

20 25 30

Leu His Phe Ser Pro Phe Thr Val Leu Pro Ile Lys Leu Gln Ser Lys

35 40 45

Pro Ser Phe Leu Ser Leu Ser Ser Cys Phe Pro Ser Ser Thr Ser Leu

50 55 60

Ile Gly Asp Glu Phe Glu Val Glu Leu Gly Arg Leu Leu Thr Leu Leu

65 70 75 80

Pro Glu Glu Met Arg Arg Ser Val Ser Glu His Pro Glu Phe Cys Tyr

85 90 95

Leu Ile Glu Val Val Met Asp Leu Gly Arg Lys Pro Leu Ala Arg Phe

100 105 110

Pro Ser Gly Asp Phe Ile Leu Ser Asp His Pro Ile Thr Leu Asp Asp

115 120 125

Leu Gln His Ala Ile Ser Lys Val Gly Asp Phe Ala Val Asp Asn Arg

130 135 140

Ala Gly Ile Ser Arg Thr Leu His Arg Ile Ser Ala Ile Arg Asn Arg

145 150 155 160

Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Thr Cys Arg Val Gly Arg Ala Leu Ser

165 170 175

Gly Ser Ala Asn Ala Leu Arg Asp Leu Val Lys Asp Gly Ala Ser Leu

180 185 190

Leu Leu Ile Gly Pro Pro Gly Val Gly Lys Thr Thr Ile Ile Arg Asp

195 200 205

Ile Ala Arg Met Leu Ala Asn Asp Tyr Gly Lys Arg Val Met Ile Val

210 215 220

Asp Thr Ser Asn Glu Ile Gly Gly Asp Gly Asp Ile Pro His Ala Gly

225 230 235 240

Ile Gly Asn Ala Arg Arg Met Gln Val Pro His Ser Asp Val Gln His

245 250 255

Lys Val Leu Ile Glu Ala Val Glu Asn His Met Pro Gln Val Ile Val

260 265 270

Ile Asp Glu Ile Gly Thr Asn Leu Glu Ala Met Ala Ala Ser Thr Ile

275 280 285

Ala Gln Arg Gly Ile Gln Leu Val Ala Thr Ala His Gly Val Thr Ile

290 295 300

Asp Asn Leu Val Met Asn Pro Ala Leu Glu Met Leu Val Gly Gly Val

305 310 315 320

Gln Ser Val Thr Leu Gly Asp Glu Glu Ala Ser Arg Arg Gly Val Gln

325 330 335

Lys Ser Val Leu Glu Arg Lys Gly Pro Ser Ala Phe Ser Cys Gly Val

340 345 350

Glu Ile Ile Ser Lys Ala Glu Leu Arg Val His Pro Asp Leu Glu Ala

355 360 365

Thr Val Asp Ala Ile Leu Ala Gly Arg Tyr Pro Arg Tyr Glu Thr Arg

370 375 380

Lys Ile Asn Pro Gly Ser Gln Asp Glu Thr Arg Glu Ser Ser Ser Thr

385 390 395 400

Gln Ala Pro Phe Asp Glu Arg Asn Glu Val Leu Val Glu Asp Ile Ile

405 410 415

Gln Met Asn Gly Gly Val Pro Gly Ser Thr Glu Leu Ile Ser Glu Thr

420 425 430

Asp Pro Ser Ile Glu Gly Gly Ser Gly Glu Ser Glu Asn Ala Leu Cys

435 440 445

Ile Phe Leu Tyr Gly Ile Ser Glu Ala Ser Val Ile Gln Gly Ile Lys

450 455 460

Gln Leu Asn Ile Asp Asp Ala Ile Glu Phe Thr Asp Asn Ile Ser Glu

465 470 475 480

Ala Asp Val Leu Leu Ala Leu Gln Ser Lys Leu Lys Lys Asn Ser Arg

485 490 495

Ile Gln Ala Ala Ala Lys Ser His Gly Ile Pro Ile Tyr Met Thr Lys

500 505 510

Thr Ser Ser Ser Thr Gln Leu Ala Lys Ala Ile Glu Ala Leu Met Asp

515 520 525

Asp Phe Ala Asp Gly Phe Glu Phe Leu Glu Ser Glu Ala Lys Thr Asn

530 535 540

Glu Ser Glu Lys Ile Asp Ala Leu Glu Glu Ala Arg Ile Gly Met Glu

545 550 555 560

Arg Val Val Ile Pro Lys Gly Glu Pro Val Glu Leu Leu Pro Arg Pro

565 570 575

Ser Asn Ile Ile Leu Leu Gln Lys Asp Leu Ile Arg Lys Tyr Lys Leu

580 585 590

Lys Ser Glu Arg Ile Gly Thr Gly Thr Asp Val Arg Leu Arg Ile Leu

595 600 605

Pro Phe Ser Gly Ala Pro Asp Glu Asp Ser Gln Asp Ser Glu Gly Val

610 615 620

Asp Asp Glu Ser Glu Val Asp Glu Leu Phe Ser Pro Asn Ala Glu Ser

625 630 635 640

Asn Gly Ser Ala Phe Arg Val Asp Arg Leu Pro Leu Leu Pro Glu

645 650 655

Claims (4)

1.烟草NtYcf45-like基因在烟草叶片甘油酸物质含量调控中的应用，其特征在于，利用基因沉默技术，通过下调NtYcf45-like基因表达量，来下调烟草叶片中甘油酸物质含量；

所述烟草NtYcf45-like基因，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.烟草NtYcf45-like蛋白在烟草叶片甘油酸物质含量调控中的应用，其特征在于，该蛋白与烟草叶片中甘油酸物质含量相关，降低该蛋白表达后，烟草叶片中甘油酸物质含量明显降低；

所述烟草NtYcf45-like蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.利用烟草NtYcf45-like基因的烟草新品种培育方法，其特征在于，利用病毒诱导的基因沉默VIGS的技术，构建含有NtYcf45-like 基因的病毒诱导沉默载体，干扰NtYcf45-like 基因的表达使其沉默，筛选获得甘油酸含量下调的烟草新品种；

所述NtYcf45-like基因，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求3所述利用烟草NtYcf45-like基因的烟草新品种培育方法，其特征在于，构建含有NtYcf45-like 基因的病毒诱导沉默载体过程中，PCR扩增获得制备NtYcf45-like基因时，按照如下步骤制备：

（1）提取烟草基因组，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtYcf45-like-F：5’- TTATCAGGGACATAGCCAGG- 3’，

NtYcf45-like-R：5’- CAACCAGCATCTCTAAAGCA - 3’。

Images