CN111004808B - 烟草蛋白NtVHA-a1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草蛋白NtVHA‑a1及其应用专利申请。该基因由2454个碱基构成，其中特异性核酸片段为1042‑1371位碱基，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。烟草蛋白NtVHA‑a1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由817个氨基酸残基组成。在对烟草中生物胺类物质含量相关调控基因的研究过程中，发明人通过对特定烟草蛋白NtVHA‑a1的研究，发现其与烟草生物胺类物质、尤其是精胺含量高度相关。进一步基因功能验证过程中，在将该基因沉默后，烟草中精胺含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础和提供一定参考借鉴。

Description

烟草蛋白NtVHA-a1及其应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草蛋白NtVHA-a1及其应用专利申请。

背景技术

烟草（Nicotiana tabacum L.）属于茄科（Solanaceae）烟草属（Nicotiana），一年生草本植物。烟草原产于美洲，经多条路线传入我国后，凭借我国优越的地理环境条件，使得我国成为烟草种植面积最大、产量最高的国家。而我国也是世界上最大的烟草生产国和消费国，产销量占世界的三分之一，由此也使得烟草的种植与产品加工业在国民经济的发展中占有十分重要的地位。

生物胺是一类具有生物活性的含氮的低分子量碱性有机化合物的总称，它们是生物体自身合成荷尔蒙、核苷酸和蛋白质的前体，可以看做是氨分子中1-3个氢原子被烷基或芳基取代后形成的低分子量生物碱。精胺（Spermine），是含有两个氨基和两个亚氨基的一种多胺类物质，在植物体内由丁二胺和S-腺苷蛋氨酸经一系列酶促反应后生成。作为生物胺中一种纯天然植物活性物质，精胺广泛存在于植物界，具有调节植物的生长发育和延缓植物细胞衰老等生理功能。当植物遭遇逆境胁迫时，植物体内多胺不仅可以通过双歧化反应直接清除活性氧，而且还可以通过提高抗氧化酶活性来减少活性氧的积累。

鉴于生物胺类物质对烟叶生长的重要作用，对其代谢途径进行深入分析显然具有十分重要的技术意义。而随着烟草基因工程深入，对于与烟草中生物胺类物质相关编码基因的深入研究和开发，则可为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定良好的技术基础。

发明内容

基于烟草中生物胺类物质含量相关调控基因的研究，本发明目的在于提供一个烟草蛋白NtVHA-a1基因及其在烟草生物胺类物质含量调节方面的应用，从而为烟叶品质调控、烟草抗性研究、新品种培育等工作开展奠定一定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草蛋白NtVHA-a1的编码基因NtVHA-a1，由2454个碱基构成，其中特异性核酸片段为1042-1371位碱基，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

所述编码基因NtVHA-a1在叶片生物胺类物质调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草NtVHA-a1基因表达量，来调节控制烟叶中生物胺类物质含量情况，所述生物胺类物质主要为精胺。

所述编码基因NtVHA-a1的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：

（1）提取（具体例如以烟草K326叶片为样品）基因组，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtVHA-a1-F：5’- TTTGCGAAGACCAAGATACA - 3’，

NtVHA-a1-R：5’- GCTGCCTAGTTTCTGAGAGC - 3’。

烟草蛋白NtVHA-a1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其由817个氨基酸残基组成。

所述烟草蛋白NtVHA-a1在叶片生物胺类物质含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中生物胺类物质含量相关，降低该蛋白表达含量后，叶片中精胺含量显著降低。

利用所述编码基因NtVHA-a1的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtVHA-a1基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得精胺含量变化的烟草新品种；

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtVHA-a1基因的表达使其沉默，NtVHA-a1基因沉默植株中精胺含量显著降低，进而获得精胺含量降低的植物新品种。

换言之，一种培育低生物胺含量烟草新品种培育方法，利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtVHA-a1基因的表达使其沉默，NtVHA-a1基因沉默的新烟草品种植株中生物胺、尤其是精胺含量显著下降。

在对烟草中生物胺类物质含量相关调控基因的研究过程中，发明人通过对特定烟草蛋白NtVHA-a1的研究，发现其与烟草生物胺类物质、尤其是精胺含量高度相关。进一步基因功能验证过程中，在将该基因沉默后，烟草中精胺含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础和提供一定参考借鉴。

附图说明

图1 为与对照植株相比，NtVHA-a1基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图2 为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的精胺含量比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。

生物材料：

本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等；

下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobaccorattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2（一种常用载体），其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；

实验试剂：

LB液体培养基，1L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；

YEB液体培养基，1L含量中含有：5g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL1M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH₂O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；

200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用；

MMA（100 mL）：1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M,pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As。

实施例1

本实施例就烟草NtVHA-a1基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

（1）烟草NtVHA-a1基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关NtVHA-a1基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtVHA-a1-F：5’- TTTGCGAAGACCAAGATACA - 3’，

NtVHA-a1-R：5’- GCTGCCTAGTTTCTGAGAGC - 3’；

以烟草K326叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtVHA-a1基因；

PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸 5min；

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

（2）构建重组TRV2- NtVHA-a1载体

将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，在37℃过培养夜；

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定， 并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2- NtVHA-a1。

需要说明的是，烟草NtVHA-a1基因，包括2454个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体碱基序列为：

ATGGAGTACATAGACAACATGCCGCCAATGGATCTGATGCGCTCGGAGAAGATGACTTTCGTTCAGCTTATTATTCCTTTTGAGTCCGCTCATCGTGCTGTCACTTACCTTGGCCAACTCGGACTTCTCCAATTCCGTGATCTAAATGCCGAAAAGAGCCCTTTCCAGAGAACATTTGTAAACCAGGTAAAAAGATGCGCCGAGATGTCAAGAAAACTACGATATTTCAAAGATCAGATACACAAAGCCGGTCTATTGCCTCCTCCTCTTCCTGCTTCCCAACCTGATATTGAATTAGAAGAATTGGAGATACAACTGGCAGAGCATGAACATGAGTTGATTGAAATGAATGCTAATAGTGAGAAATTGCGGCAATCATATAATGAGCTGCTTGAGTTTAAGATGGTATTGCAAAAGGCTAGTGGCTTCCTTGTTTCAAGTAGTCATACCACTGATCAGGAAACAGAACTGGTTGAAAATGTGTACTCCAATGATAACCATGCTGATACAGCATCATTACTTGAGCAGGAGATGCGTTCAGAACTGTCAAATCAGTCTGGAGTTAGATTTATGAGTGGCATTATCTGCAAGTCCAAGGTTGTTCAATTTGAAAGAATGCTGTTTCGTGCTACAAGGGGTAATATGCTTTTCAATCAGGCAGTTGCTGATGATGAGATACTGGATCCTTCCTCAAACGAAATGGTTGAGAAAGTAGTCTTTGTAGTATTCTTTTCAGGTGAGCAGGCGAGAACAAAAATACTGAAAATATGTGAGGCATTTGGTGCAAATTGCTATCCTGTTCCTGAAGACACGACAAAGAGAAGGCAGATAACTCAAGAAGTTTTGTTTCGGCTATCTGAATTAGAGACCACTCTGGATGCTGGACTGCGCCATAGAGATAAGGCTTTGACCTCCATAGGGTATCACCTTACAAAATGGATAAACATGGTTAAAACACAAAAGGCAGTGTATGACACGTTAAATATGCTAAATTTCGATGTTACAAAGAAGTGCCTTGTGGGTGAGGGCTGGTGTCCAATATTTGCGAAGACCAAGATACAAGAGGCTTTGCAGCGTGGAACATTTGATAGCAGTTCACAAGTGGGCATTATATTTCATGTGATGGATGCTGTGGAGTCACCTCCAACATACTTTAGGACAAACAGTTTCACAAATGCATTTCAAGAAATTGTTGATGCATATGGTGTTGCTAAATACCAGGAGGCAAATCCAGCTGTTTATACCATTGTTACATTTCCTTTCCTTTTTGCTGTGATGTTTGGGGACTGGGGTCATGGAATCTGCTTGCTGTTGGGAGCATTAGTTCTTATCGCAAGGGAAAGCAAACTTAGCTCTCAGAAACTAGGCAGCTTCATGGAGATGCTCTTTGGGGGTCGCTATGTACTCCTGTTGATGTCAATATTTTCAATTTACTGTGGCTTGATATATAATGAATTCTTCTCAGTTCCCTTTCACATATTTGGTGACTCAGCGTACAAATGCCGAGATGCTACATGCAGTGATGCACGGACAGTTGGTTTAGTAAAATACAATGATCCATATCCATTTGGTGTGGACCCAAGCTGGAGAGGCAGCCGTTCAGAGCTTCCTTTCTTGAATTCTCTTAAGATGAAGATGTCTATTTTGTTGGGTGTGGCCCAGATGAACCTCGGAATTATTTTAAGTTATTTCAATGCACGTTTCTTCAGCAGCTCAATTGATATTAAGTATCAGTTTATTCCACAAATAATCTTTCTCAACAGCCTCTTTGGATACCTTTCTCTTCTTATTCTTGTCAAATGGTGCACTGGTTCTCAAGCAGATCTATATCATGTTATGATTTATATGTTCTTAAGTCCTTTTGAGGCTCTTGGTGAAAATAGGTTGTTCTGGGGCCAGAGTGTGCTTCAGGTAATATTGCTGCTTTTGGCACTTGTTGCTGTCCCGTGGATGCTCTTCCCAAAACCTTTTATTTTGAAAAGTCTTCATATGGAGAGATTTCAAGGTCGTACATACGGGATACTTGGAACCTCCGAGATGGTTATTGACGAAGAACCAGGCTCTGCCAGTCAGCATGCTGAGGAGTTTAACTTTAGTGAGGTTTTTGTGCACCAAATGATACACTCTATTGAATTTGTTCTTGGTGCTGTTTCAAACACTGCATCGTATCTTCGGCTTTGGGCTTTGAGTTTGGCTCACTCTGAATTATCTACTGTGTTCTATGAGAAAGTTCTCCTCCTTGCCTGGGGGTATGATAACATCGTCATTCGGCTAGTGGGGCTGGCAGTTTTTGCCTTTGCGACAACTTTTATCCTACTTATGATGGAGACTCTTAGTGCATTCCTTCATGCATTGCGTCTTCATTGGGTGGAATTCCAGAACAAGTTTTATCATGGGGATGGTTATAAGTTCAAGCCATTCTCCTTTGCCTTGTTAGCAGATGATGACGATTAG。

烟草蛋白NtVHA-a1，包括817个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体氨基酸序列为：

MEYIDNMPPMDLMRSEKMTFVQLIIPFESAHRAVTYLGQLGLLQFRDLNAEKSPFQRTFVNQVKRCAEMSRKLRYFKDQIHKAGLLPPPLPASQPDIELEELEIQLAEHEHELIEMNANSEKLRQSYNELLEFKMVLQKASGFLVSSSHTTDQETELVENVYSNDNHADTASLLEQEMRSELSNQSGVRFMSGIICKSKVVQFERMLFRATRGNMLFNQAVADDEILDPSSNEMVEKVVFVVFFSGEQARTKILKICEAFGANCYPVPEDTTKRRQITQEVLFRLSELETTLDAGLRHRDKALTSIGYHLTKWINMVKTQKAVYDTLNMLNFDVTKKCLVGEGWCPIFAKTKIQEALQRGTFDSSSQVGIIFHVMDAVESPPTYFRTNSFTNAFQEIVDAYGVAKYQEANPAVYTIVTFPFLFAVMFGDWGHGICLLLGALVLIARESKLSSQKLGSFMEMLFGGRYVLLLMSIFSIYCGLIYNEFFSVPFHIFGDSAYKCRDATCSDARTVGLVKYNDPYPFGVDPSWRGSRSELPFLNSLKMKMSILLGVAQMNLGIILSYFNARFFSSSIDIKYQFIPQIIFLNSLFGYLSLLILVKWCTGSQADLYHVMIYMFLSPFEALGENRLFWGQSVLQVILLLLALVAVPWMLFPKPFILKSLHMERFQGRTYGILGTSEMVIDEEPGSASQHAEEFNFSEVFVHQMIHSIEFVLGAVSNTASYLRLWALSLAHSELSTVFYEKVLLLAWGYDNIVIRLVGLAVFAFATTFILLMMETLSAFLHALRLHWVEFQNKFYHGDGYKFKPFSFALLADDDD。

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，发明人进一步将所构建的重组TRV2- NtVHA-a1载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

（1）转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了TRV2-PDS重组载体作为对照，具体转化过程为：

将TRV2 （载体对照）、TRV2-PDS（VIGS效率对照）及TRV2-NtVHA-a1的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan 和50mg/L Rif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

（2）制备转染用菌液

将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif）中，28℃、250 rpm条件下培养过夜；

取50uL 过夜培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD₆₀₀ =1.0 ~ 1.5左右，然后4000g 离心5 min，收集菌体，再用MMA(1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M, pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As)重悬，调节OD₆₀₀ =1.0 左右；最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。

（3）瞬时转化

以3~4 w（周）苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1 mL规格注射器，将步骤（2）中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

进一步通过qRT-PCR对NtVHA-a1基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，TRV2- NtVHA-a1的侵染植株中，NtVHA-a1的表达量显著降低。

进一步地，发明人对实验组（TRV2- NtVHA-a1浸染植株）和对照组（TRV2-GFP浸染植株）中的精胺含量情况进行了检测，结果如图2所示：

从图2结果可以看出，实验组中精胺含量与对照组相比均有显著降低，这进一步表明，通过沉默NtVHA-a1基因，可对烟草叶片中生物胺类成分的含量进行调控，进而可为烟叶育种、品质调控奠定一定技术基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 烟草蛋白NtVHA-a1及其应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2454

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atggagtaca tagacaacat gccgccaatg gatctgatgc gctcggagaa gatgactttc 60

gttcagctta ttattccttt tgagtccgct catcgtgctg tcacttacct tggccaactc 120

ggacttctcc aattccgtga tctaaatgcc gaaaagagcc ctttccagag aacatttgta 180

aaccaggtaa aaagatgcgc cgagatgtca agaaaactac gatatttcaa agatcagata 240

cacaaagccg gtctattgcc tcctcctctt cctgcttccc aacctgatat tgaattagaa 300

gaattggaga tacaactggc agagcatgaa catgagttga ttgaaatgaa tgctaatagt 360

gagaaattgc ggcaatcata taatgagctg cttgagttta agatggtatt gcaaaaggct 420

agtggcttcc ttgtttcaag tagtcatacc actgatcagg aaacagaact ggttgaaaat 480

gtgtactcca atgataacca tgctgataca gcatcattac ttgagcagga gatgcgttca 540

gaactgtcaa atcagtctgg agttagattt atgagtggca ttatctgcaa gtccaaggtt 600

gttcaatttg aaagaatgct gtttcgtgct acaaggggta atatgctttt caatcaggca 660

gttgctgatg atgagatact ggatccttcc tcaaacgaaa tggttgagaa agtagtcttt 720

gtagtattct tttcaggtga gcaggcgaga acaaaaatac tgaaaatatg tgaggcattt 780

ggtgcaaatt gctatcctgt tcctgaagac acgacaaaga gaaggcagat aactcaagaa 840

gttttgtttc ggctatctga attagagacc actctggatg ctggactgcg ccatagagat 900

aaggctttga cctccatagg gtatcacctt acaaaatgga taaacatggt taaaacacaa 960

aaggcagtgt atgacacgtt aaatatgcta aatttcgatg ttacaaagaa gtgccttgtg 1020

ggtgagggct ggtgtccaat atttgcgaag accaagatac aagaggcttt gcagcgtgga 1080

acatttgata gcagttcaca agtgggcatt atatttcatg tgatggatgc tgtggagtca 1140

cctccaacat actttaggac aaacagtttc acaaatgcat ttcaagaaat tgttgatgca 1200

tatggtgttg ctaaatacca ggaggcaaat ccagctgttt ataccattgt tacatttcct 1260

ttcctttttg ctgtgatgtt tggggactgg ggtcatggaa tctgcttgct gttgggagca 1320

ttagttctta tcgcaaggga aagcaaactt agctctcaga aactaggcag cttcatggag 1380

atgctctttg ggggtcgcta tgtactcctg ttgatgtcaa tattttcaat ttactgtggc 1440

ttgatatata atgaattctt ctcagttccc tttcacatat ttggtgactc agcgtacaaa 1500

tgccgagatg ctacatgcag tgatgcacgg acagttggtt tagtaaaata caatgatcca 1560

tatccatttg gtgtggaccc aagctggaga ggcagccgtt cagagcttcc tttcttgaat 1620

tctcttaaga tgaagatgtc tattttgttg ggtgtggccc agatgaacct cggaattatt 1680

ttaagttatt tcaatgcacg tttcttcagc agctcaattg atattaagta tcagtttatt 1740

ccacaaataa tctttctcaa cagcctcttt ggataccttt ctcttcttat tcttgtcaaa 1800

tggtgcactg gttctcaagc agatctatat catgttatga tttatatgtt cttaagtcct 1860

tttgaggctc ttggtgaaaa taggttgttc tggggccaga gtgtgcttca ggtaatattg 1920

ctgcttttgg cacttgttgc tgtcccgtgg atgctcttcc caaaaccttt tattttgaaa 1980

agtcttcata tggagagatt tcaaggtcgt acatacggga tacttggaac ctccgagatg 2040

gttattgacg aagaaccagg ctctgccagt cagcatgctg aggagtttaa ctttagtgag 2100

gtttttgtgc accaaatgat acactctatt gaatttgttc ttggtgctgt ttcaaacact 2160

gcatcgtatc ttcggctttg ggctttgagt ttggctcact ctgaattatc tactgtgttc 2220

tatgagaaag ttctcctcct tgcctggggg tatgataaca tcgtcattcg gctagtgggg 2280

ctggcagttt ttgcctttgc gacaactttt atcctactta tgatggagac tcttagtgca 2340

ttccttcatg cattgcgtct tcattgggtg gaattccaga acaagtttta tcatggggat 2400

ggttataagt tcaagccatt ctcctttgcc ttgttagcag atgatgacga ttag 2454

<210> 2

<211> 817

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Met Glu Tyr Ile Asp Asn Met Pro Pro Met Asp Leu Met Arg Ser Glu

1 5 10 15

Lys Met Thr Phe Val Gln Leu Ile Ile Pro Phe Glu Ser Ala His Arg

20 25 30

Ala Val Thr Tyr Leu Gly Gln Leu Gly Leu Leu Gln Phe Arg Asp Leu

35 40 45

Asn Ala Glu Lys Ser Pro Phe Gln Arg Thr Phe Val Asn Gln Val Lys

50 55 60

Arg Cys Ala Glu Met Ser Arg Lys Leu Arg Tyr Phe Lys Asp Gln Ile

65 70 75 80

His Lys Ala Gly Leu Leu Pro Pro Pro Leu Pro Ala Ser Gln Pro Asp

85 90 95

Ile Glu Leu Glu Glu Leu Glu Ile Gln Leu Ala Glu His Glu His Glu

100 105 110

Leu Ile Glu Met Asn Ala Asn Ser Glu Lys Leu Arg Gln Ser Tyr Asn

115 120 125

Glu Leu Leu Glu Phe Lys Met Val Leu Gln Lys Ala Ser Gly Phe Leu

130 135 140

Val Ser Ser Ser His Thr Thr Asp Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Asn

145 150 155 160

Val Tyr Ser Asn Asp Asn His Ala Asp Thr Ala Ser Leu Leu Glu Gln

165 170 175

Glu Met Arg Ser Glu Leu Ser Asn Gln Ser Gly Val Arg Phe Met Ser

180 185 190

Gly Ile Ile Cys Lys Ser Lys Val Val Gln Phe Glu Arg Met Leu Phe

195 200 205

Arg Ala Thr Arg Gly Asn Met Leu Phe Asn Gln Ala Val Ala Asp Asp

210 215 220

Glu Ile Leu Asp Pro Ser Ser Asn Glu Met Val Glu Lys Val Val Phe

225 230 235 240

Val Val Phe Phe Ser Gly Glu Gln Ala Arg Thr Lys Ile Leu Lys Ile

245 250 255

Cys Glu Ala Phe Gly Ala Asn Cys Tyr Pro Val Pro Glu Asp Thr Thr

260 265 270

Lys Arg Arg Gln Ile Thr Gln Glu Val Leu Phe Arg Leu Ser Glu Leu

275 280 285

Glu Thr Thr Leu Asp Ala Gly Leu Arg His Arg Asp Lys Ala Leu Thr

290 295 300

Ser Ile Gly Tyr His Leu Thr Lys Trp Ile Asn Met Val Lys Thr Gln

305 310 315 320

Lys Ala Val Tyr Asp Thr Leu Asn Met Leu Asn Phe Asp Val Thr Lys

325 330 335

Lys Cys Leu Val Gly Glu Gly Trp Cys Pro Ile Phe Ala Lys Thr Lys

340 345 350

Ile Gln Glu Ala Leu Gln Arg Gly Thr Phe Asp Ser Ser Ser Gln Val

355 360 365

Gly Ile Ile Phe His Val Met Asp Ala Val Glu Ser Pro Pro Thr Tyr

370 375 380

Phe Arg Thr Asn Ser Phe Thr Asn Ala Phe Gln Glu Ile Val Asp Ala

385 390 395 400

Tyr Gly Val Ala Lys Tyr Gln Glu Ala Asn Pro Ala Val Tyr Thr Ile

405 410 415

Val Thr Phe Pro Phe Leu Phe Ala Val Met Phe Gly Asp Trp Gly His

420 425 430

Gly Ile Cys Leu Leu Leu Gly Ala Leu Val Leu Ile Ala Arg Glu Ser

435 440 445

Lys Leu Ser Ser Gln Lys Leu Gly Ser Phe Met Glu Met Leu Phe Gly

450 455 460

Gly Arg Tyr Val Leu Leu Leu Met Ser Ile Phe Ser Ile Tyr Cys Gly

465 470 475 480

Leu Ile Tyr Asn Glu Phe Phe Ser Val Pro Phe His Ile Phe Gly Asp

485 490 495

Ser Ala Tyr Lys Cys Arg Asp Ala Thr Cys Ser Asp Ala Arg Thr Val

500 505 510

Gly Leu Val Lys Tyr Asn Asp Pro Tyr Pro Phe Gly Val Asp Pro Ser

515 520 525

Trp Arg Gly Ser Arg Ser Glu Leu Pro Phe Leu Asn Ser Leu Lys Met

530 535 540

Lys Met Ser Ile Leu Leu Gly Val Ala Gln Met Asn Leu Gly Ile Ile

545 550 555 560

Leu Ser Tyr Phe Asn Ala Arg Phe Phe Ser Ser Ser Ile Asp Ile Lys

565 570 575

Tyr Gln Phe Ile Pro Gln Ile Ile Phe Leu Asn Ser Leu Phe Gly Tyr

580 585 590

Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Lys Trp Cys Thr Gly Ser Gln Ala Asp

595 600 605

Leu Tyr His Val Met Ile Tyr Met Phe Leu Ser Pro Phe Glu Ala Leu

610 615 620

Gly Glu Asn Arg Leu Phe Trp Gly Gln Ser Val Leu Gln Val Ile Leu

625 630 635 640

Leu Leu Leu Ala Leu Val Ala Val Pro Trp Met Leu Phe Pro Lys Pro

645 650 655

Phe Ile Leu Lys Ser Leu His Met Glu Arg Phe Gln Gly Arg Thr Tyr

660 665 670

Gly Ile Leu Gly Thr Ser Glu Met Val Ile Asp Glu Glu Pro Gly Ser

675 680 685

Ala Ser Gln His Ala Glu Glu Phe Asn Phe Ser Glu Val Phe Val His

690 695 700

Gln Met Ile His Ser Ile Glu Phe Val Leu Gly Ala Val Ser Asn Thr

705 710 715 720

Ala Ser Tyr Leu Arg Leu Trp Ala Leu Ser Leu Ala His Ser Glu Leu

725 730 735

Ser Thr Val Phe Tyr Glu Lys Val Leu Leu Leu Ala Trp Gly Tyr Asp

740 745 750

Asn Ile Val Ile Arg Leu Val Gly Leu Ala Val Phe Ala Phe Ala Thr

755 760 765

Thr Phe Ile Leu Leu Met Met Glu Thr Leu Ser Ala Phe Leu His Ala

770 775 780

Leu Arg Leu His Trp Val Glu Phe Gln Asn Lys Phe Tyr His Gly Asp

785 790 795 800

Gly Tyr Lys Phe Lys Pro Phe Ser Phe Ala Leu Leu Ala Asp Asp Asp

805 810 815

Asp

Claims (4)

1.烟草蛋白NtVHA-a1的编码基因NtVHA-a1在烟草叶片生物胺类物质调控中的应用，其特征在于，利用基因沉默技术，通过下调烟草NtVHA-a1基因表达量，来下调烟叶中生物胺类物质含量情况；

所述生物胺类物质为精胺；

所述烟草蛋白NtVHA-a1的编码基因NtVHA-a1，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.烟草蛋白NtVHA-a1在烟草叶片生物胺类物质含量调控中的应用，其特征在于，该蛋白与烟草叶片中生物胺类物质含量相关，降低该蛋白表达含量后，烟草叶片中生物胺类物质含量显著降低；

所述生物胺类物质为精胺；

所述烟草蛋白NtVHA-a1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.利用烟草蛋白NtVHA-a1的编码基因NtVHA-a1的烟草新品种培育方法，其特征在于，利用病毒诱导的基因沉默VIGS的技术，构建含有NtVHA-a1基因的病毒诱导沉默载体，转化烟草，筛选获得精胺含量下调的烟草新品种；

所述NtVHA-a1基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求3所述烟草新品种培育方法，其特征在于，构建含有NtVHA-a1基因的病毒诱导沉默载体过程中，PCR扩增制备NtVHA-a1基因时，按照如下步骤：

（1）提取基因组，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtVHA-a1-F：5’- TTTGCGAAGACCAAGATACA - 3’，

NtVHA-a1-R：5’- GCTGCCTAGTTTCTGAGAGC - 3’。

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