CN110205330B

CN110205330B - 烟草热激蛋白hsp22及其应用

Info

Publication number: CN110205330B
Application number: CN201910533362.XA
Authority: CN
Inventors: 陈千思; 王晨; 周会娜; 刘萍萍; 李泽锋; 郑庆霞; 金静静; 徐国云; 魏攀
Original assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Current assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2039-06-19
Also published as: CN110205330A

Abstract

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及烟草热激蛋白HSP 22基因及其应用专利申请。该基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示。烟草热激蛋白HSP 22由192个氨基酸残基组成，其中第68‑159位氨基酸保守的SHSP结构域。该蛋白与植物叶片中色素类物质含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中色素类物质含量明显降低，所述色素类物质为：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β‑胡萝卜素。本发明通过对特定烟草热激蛋白HSP 22的初步研究，发现其与烟草色素类物质含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中色素类物质含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟草新品种培育一定的应用基础和参考借鉴。

Description

烟草热激蛋白HSP22及其应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及烟草热激蛋白HSP 22及其应用专利申请。

背景技术

人们通常所吸食的烟草属双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物，烟草属(Nicotiana) 有60 多个种，而用于制备所吸食的烟草主要为两个栽培种，分别为普通烟草( 又称红花烟草，Nicotiana tabacum)和黄花烟草(Nicotiana rustica)，其中前者占据主要面积，而后者的栽培面积相对较小。

栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等特点可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是栽培最广的普通烟草。我国烤烟种植面积和总产量均居世界第一位。作为一种叶用经济作物，烤烟的栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。烟叶品质决定烟叶的可用性，直接影响卷烟商品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。为使在未来的国内外市场竞争中立于不败之地，满足国内外卷烟企业对优质烟叶不断增长的需求，必须提高烟叶品质和安全性。

植物色素是烟草中一类重要的化合物，主要包括叶绿素和类胡罗卜素类物质。叶绿素在烟草成熟和烟叶调制过程中大量降解消失，它在干烟叶中是一种不利的化学成分，往往带有青杂气，是烟叶分级中被严格控制的指标之一。如果叶绿素在调制处理过程中没有充分降解就把烟叶烤干，就会烤出不同程度的“青黄烟”。“青黄烟”不仅外观品质不良，燃烧时还会产生有害物质，进而影响烟草等级和品质。

烟叶发酵醇化过程中，叶绿素卟啉环一方面会降解产生吡咯类化合物，从而增加烟叶陈化香，降低青杂气；另一方面，叶绿素水解产生的植醇可进一步降解成新植二烯，并再降解成植物呋喃，进而转化成烟叶的清甜成分。因此，叶绿素是重要的香气前体物，充分降解后对烟质较为有利。

烟草黄色素主要是类胡萝卜素，烟叶类胡萝卜素含量与烟叶品质存在正相关关系，一方面是烟叶外观品质与该类成分含量直接相关；另一方面类胡萝卜素是烟草香气成分的重要前体物质，对烟草的香气量和香气品质是正相关关系。烟叶中的香味成分很大一部分是类胡萝卜素的降解产物，其中不少化合物是烟草中关键的致香成分，如紫罗兰酮、大马酮和异佛尔酮等。

基于上述烟叶中色素的重要作用，对烟草色素类物质调控基因进行深入研究，利用基因工程构建新的烟草品种，可为改善烟草品种奠定良好应用基础。

发明内容

基于烟草色素类物质含量调控基因的研究，本发明目的在于提供一种烟草热激蛋白HSP 22基因及其在烟草色素物质含量调节方面的应用，从而为烟草新品种培育奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草热激蛋白HSP22的编码基因HSP22，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其中特异性核酸片段为202-477位碱基。

所述编码HSP22基因在叶片色素类物质含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草HSP22蛋白表达量，来调节控制烟叶中色素类物质含量情况，所述色素类物质为：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素。

烟草热激蛋白HSP22，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其由192个氨基酸残基组成，其中第68-159位氨基酸保守的SHSP结构域。

所述烟草热激蛋白HSP22在叶片色素类物质含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中色素类物质含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中色素类物质含量明显降低，所述色素类物质为：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素。

利用所述编码基因HSP22的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有HSP22基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得色素含量变化的烟草新品种；

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰HSP22基因的表达使其沉默，HSP22基因沉默植株中色素类物质含量显著下降，进而获得色素含量下降的植物新品种。

本发明通过对特定烟草热激蛋白HSP 22的初步研究，发现其与烟草色素类物质含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中色素类物质含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟草新品种培育一定的应用基础和参考借鉴。

附图说明

图1为本发明烟草TRV2-PDS、TRV2-GFP及TRV2-NtHSP22载体转化组的表型对比图；

图2为与对照植株相比NtHSP22基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图3为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的主要色素含量比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。

生物材料：

本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等；

下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobaccorattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2由郑州烟草研究院基因中心保存，其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；

实验试剂：

LB液体培养基，1L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；

YEB液体培养基，1L含量中含有：5g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL1M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH₂O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；

200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用；

MMA（100 mL）：1 mL（1 M）MgCl₂；1 mL（1 M，pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As。

实施例1

本实施例就烟草NtHSP22基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

（1）烟草NtHSP22基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关HSP22基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtHSP22-F：5’-ACCGAATTCGCTCAGACTGGAAGGAAACA- 3’，

NtHSP22-R：5’-ACCGGATCCGCTTTAATGTCCTCACCACC- 3’；

以烟草K326叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtHSP22基因；

PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸 5min；

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

（2）构建重组TRV2-NtHSP22载体

将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，在37℃过培养夜；

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2-NtHSP22。

需要说明的是：

烟草NtHSP22基因，包括579个碱基，具体碱基序列为：

ATGGTGAAAACAACTGTTAGTCTTTTGAGCTTTCTAGTGTTAGCAATGGCTGTAGTCTTATTTCTTCCATCACAAACTGAAGCACTAATGCCATACACACGCCCTTTTTGGGACTTAACGTTCCCACCAGAAGATCCTTTCAAGATTCTTGAACAAATCCCACTAACCATCCCAAAAGGGGTCGATTCAATCGCCTTAGCTCGCTCAGACTGGAAGGAAACAGGAACAGAGCACGTAATTACCCTCGACATACCAGGGATGAAAAGGGATGACATCAAGATCGAGGTGGAAGAGAACAGGGTGTTGAGAATCATTGGGGAAAGGAAAATAGAGGAAGAAGTTGAAGGAGAAAAGTGGCACAGAGCTGAGAGGACTTCTGGAAAATTCTGGAGACAGTTTAGGTTACCTGGGAATGCAGATTTGGAACACATAAAGGCTCATTTGGAAAATGGTGTCTTGAAGATTACTGTGCCAAAGTTGGCTGAAGAGAAGAAGAAACAGACAAAGGTGATTAATATTGCTGAGGATGGTAACTCTGCTGGTGGTGAGGACATTAAAGCTACCAAAGCTGAGATGT；

烟草热激蛋白HSP22，包括192个氨基酸，具体氨基酸序列为：

MVKTTVSLLSFLVLAMAVVLFLPSQTEALMPYTRPFWDLTFPPEDPFKILEQIPLTIPKGVDSIALARSDWKETGTEHVITLDIPGMKRDDIKIEVEENRVLRIIGERKIEEEVEGEKWHRAERTSGKFWRQFRLPGNADLEHIKAHLENGVLKITVPKLAEEKKKQTKVINIAEDGNSAGGEDIKATKAEM。

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，发明人进一步将所构建的重组TRV2-NtHSP22载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

（1）转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了TRV2-GFP、TRV2-PDS重组载体作为对照，具体转化过程为：

将TRV2-GFP（载体对照）、TRV2-PDS（VIGS效率对照）及TRV2-NtHSP22的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan 和50mg/L Rif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

（2）制备转染用菌液

将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif）中，28℃、250 rpm条件下培养过夜；

取50uL 过夜培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD₆₀₀ =1.0 ~ 1.5左右，然后4000g 离心5 min，收集菌体，再用MMA(1 mL（1 M）MgCl₂；1 mL（1 M，pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As)重悬，调节OD₆₀₀=1.0 左右；

最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。

（3）瞬时转化

以3~4 w苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1 mL规格注射器，将步骤（2）中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

注射3周后的烟草表型变化情况如图1所示。可以看出，含TRV2-PDS的农杆菌浸染植株新生叶有漂白现象，说明侵染成功；而TRV2-GFP组则无明显变化，相对应的TRV2-NtHSP22组烟草叶片颜色则有明显变化，表明NtHSP22基因与烟草叶片中色素含量高度相关。

进一步通过qRT-PCR对NtHSP22基因表达情况进行了检测，结果如图2所示，可以看出，TRV2- NtHSP22的侵染植株中，NtHSP22的表达量显著降低。

进一步地，发明人对实验组（TRV2- NtHSP22浸染植株）和对照组（TRV2-GFP浸染植株）中的植物色素（新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素）含量情况进行了检测（根据中华人民共和国烟草行业标准YC/T 382-2010“烟草及烟草制品质体色素的测定高效液相色谱法”进行检测），结果如图3及下表所示。

表1，新鲜烟叶样品中植物色素含量下降百分比

。

从上表结果可以看出，实验组中新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β胡萝卜素等各种色素含量与对照组相比均有显著下降，这进一步表明，通过沉默NtHSP22基因，可对烟草叶片中植物色素的含量进行调控，进而可为烟叶品质调控奠定一定技术基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 烟草热激蛋白HSP22及其应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 577

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atggtgaaaa caactgttag tcttttgagc tttctagtgt tagcaatggc tgtagtctta 60

tttcttccat cacaaactga agcactaatg ccatacacac gccctttttg ggacttaacg 120

ttcccaccag aagatccttt caagattctt gaacaaatcc cactaaccat cccaaaaggg 180

gtcgattcaa tcgccttagc tcgctcagac tggaaggaaa caggaacaga gcacgtaatt 240

accctcgaca taccagggat gaaaagggat gacatcaaga tcgaggtgga agagaacagg 300

gtgttgagaa tcattgggga aaggaaaata gaggaagaag ttgaaggaga aaagtggcac 360

agagctgaga ggacttctgg aaaattctgg agacagttta ggttacctgg gaatgcagat 420

ttggaacaca taaaggctca tttggaaaat ggtgtcttga agattactgt gccaaagttg 480

gctgaagaga agaagaaaca gacaaaggtg attaatattg ctgaggatgg taactctgct 540

ggtggtgagg acattaaagc taccaaagct gagatgt 577

<210> 2

<211> 192

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Met Val Lys Thr Thr Val Ser Leu Leu Ser Phe Leu Val Leu Ala Met

1 5 10 15

Ala Val Val Leu Phe Leu Pro Ser Gln Thr Glu Ala Leu Met Pro Tyr

20 25 30

Thr Arg Pro Phe Trp Asp Leu Thr Phe Pro Pro Glu Asp Pro Phe Lys

35 40 45

Ile Leu Glu Gln Ile Pro Leu Thr Ile Pro Lys Gly Val Asp Ser Ile

50 55 60

Ala Leu Ala Arg Ser Asp Trp Lys Glu Thr Gly Thr Glu His Val Ile

65 70 75 80

Thr Leu Asp Ile Pro Gly Met Lys Arg Asp Asp Ile Lys Ile Glu Val

85 90 95

Glu Glu Asn Arg Val Leu Arg Ile Ile Gly Glu Arg Lys Ile Glu Glu

100 105 110

Glu Val Glu Gly Glu Lys Trp His Arg Ala Glu Arg Thr Ser Gly Lys

115 120 125

Phe Trp Arg Gln Phe Arg Leu Pro Gly Asn Ala Asp Leu Glu His Ile

130 135 140

Lys Ala His Leu Glu Asn Gly Val Leu Lys Ile Thr Val Pro Lys Leu

145 150 155 160

Ala Glu Glu Lys Lys Lys Gln Thr Lys Val Ile Asn Ile Ala Glu Asp

165 170 175

Gly Asn Ser Ala Gly Gly Glu Asp Ile Lys Ala Thr Lys Ala Glu Met

180 185 190

Claims

1.烟草热激蛋白HSP22的编码基因HSP22在烟草叶片色素类物质含量调控中的应用，其特征在于，利用基因沉默技术，通过下调编码基因HSP22的表达量，来降低烟叶中色素类物质含量；

所述色素类物质指：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素；

所述烟草热激蛋白HSP22的编码基因HSP22，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述烟草热激蛋白HSP22的编码基因HSP22在烟草叶片色素类物质含量调控中的应用，其特征在于，PCR扩增制备烟草热激蛋白HSP22的编码基因HSP22时，以烟草K326的cDNA为模板，以NtHSP22-F、NtHSP22-R为引物，进行PCR扩增；

所述NtHSP22-F、NtHSP22-R引物，具体设计为：

NtHSP22-F：5’-ACCGAATTCGCTCAGACTGGAAGGAAACA- 3’，

NtHSP22-R：5’-ACCGGATCCGCTTTAATGTCCTCACCACC- 3’。

3.烟草热激蛋白HSP22在烟草叶片色素类物质含量调控中的应用，其特征在于，该蛋白与烟草叶片中色素类物质含量相关，降低该蛋白表达量后，烟草叶片中色素类物质含量明显降低；

所述色素类物质为：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素；

所述烟草热激蛋白HSP22，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.利用烟草热激蛋白HSP22的编码基因HSP22的烟草新品种培育方法，其特征在于，利用病毒诱导的基因沉默技术，干扰HSP22基因的表达使其沉默，筛选获得色素含量下调的烟草新品种；

所述烟草热激蛋白HSP22的编码基因HSP22，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述色素指：新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素。