CN114805520B

CN114805520B - 胁迫抗性相关蛋白IbGT1及其编码基因及应用

Info

Publication number: CN114805520B
Application number: CN202210630287.0A
Authority: CN
Inventors: 张欢; 何绍贞; 刘庆昌; 翟红; 张铅; 贾礼聪; 高少培; 赵宁
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-06-06
Filing date: 2022-06-06
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2042-06-06
Also published as: CN114805520A

Abstract

本发明公开了植物胁迫抗性相关蛋白IbGT1及其编码基因与应用。本发明具体公开了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质来调控植物胁迫抗性。所述蛋白质IbGT1为如下任一所示蛋白质：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1所示的蛋白质；A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物胁迫抗性的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。实验证明，IbGT1基因具有正向调控植物胁迫抗性的能力，在甘薯中过表达IbGT1基因能够显著提高甘薯的胁迫抗性。

Description

胁迫抗性相关蛋白IbGT1及其编码基因及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及胁迫抗性相关蛋白IbGT1及其编码基因与应用。

背景技术

甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)是双子叶植物纲、管状花目、旋花科、番薯属植物，是重要粮食、饲料，工业原料及新型能源作物。甘薯蔓割病和软腐病已成为我国甘薯主要种植区的主要病害，造成甘薯的大面积的减少、品质下降，造成了严重的经济损失。甘薯蔓割病又称镰刀菌枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp batatas)，是一种真菌性病害，病菌由土壤通过秧苗基部或根部的伤口，或由带菌种薯通过导管侵入秧苗，在导管组织内繁殖，致使患病植株发生全株性枯萎和死亡，田间表现为地上部分叶片自下而上变黄脱落，茎维管束变成褐色，最后茎部开裂，整株死亡。植株受侵染后，根、茎蔓等不同部位均可见纵裂症状，且多发生在靠近土壤的茎部。

甘薯软腐病(Rhizopus soft rot)，由黑根霉菌(Rhizopus nigricans Ehrend.)引起，为甘薯贮藏期的主要病害之一，分布广泛且全国各甘薯生产区均有发生。发病后，病原菌分泌果胶酶，溶解细胞壁中的果胶质，使组织软腐，且蔓延迅速，常使全窑腐烂，造成严重的经挤损失。

种植抗病品种可以有效减轻病害，通常高抗品种在田间很难看到典型病株，即使在连作情况下也可以表现出持久的抗性。因此，选育高产、优质、高抗的甘薯新品种成为我国育种的主要目标。

运用基因工程技术改良甘薯品种能够克服常规育种中存在的生殖隔离和基因连锁等障碍，从分子水平上对甘薯的产量、品质和抗性进行定向改良。因此，克隆调控甘薯抗病相关的基因，创制高产优质高抗的甘薯新材料，对甘薯优质、高产、高抗育种工作具有非常重要的理论参考意义和应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的胁迫抗性和/或如何提高植物的抵抗胁迫性能。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或与所述蛋白质相关的生物材料，所述蛋白质名称为IbGT1，所述蛋白质IbGT1可为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物抗胁迫功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

上述所述蛋白质相关的生物材料可为下述任一种：

B1)编码所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质IbGT1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质IbGT1的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质IbGT1且具有蛋白质IbGT1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

进一步地，所述蛋白质IbGT1可来源于甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)。

本发明还提供了所述蛋白质IbGT1或调控所述蛋白质IbGT1活性和/或含量的物质，和/或，所述生物材料的下述任一种应用：

U1)所述蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物对胁迫的抗性中的应用，所述基因编码所述蛋白质；

U2)所述蛋白或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备调控植物抵抗胁迫的产品中的应用，所述基因编码所述蛋白质；

U3)所述蛋白或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在培育对胁迫的抗性改变的植物中的应用，所述基因编码所述蛋白质；

U4)所述蛋白或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备培育对胁迫的抗性改变的植物的产品中的应用，所述基因编码所述蛋白质；

U5)所述蛋白或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在植物育种中的应用，所述基因编码所述蛋白质。

本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质IbGT1。

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述蛋白或应用中，所述核酸分子可为下述任一种：

C1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

SEQ ID No.2所示的DNA分子(IbGT1基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质IbGT1。

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为蛋白质IbGT1编码基因(CDS)的核苷酸序列。

B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。

B1)所述核酸分子还可包括与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。

本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为载体pCAMBIA1300和/或载体pEASY-Blunt simple。

可用现有的植物表达载体构建含有IbGT1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用IbGT1基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的IbGT1基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得胁迫抗性(如耐盐性)提高的转基因细胞系及转基因植株。携带IbGT1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为根癌农杆菌EHA105。

所述重组载体具体可为重组载体pCAMBIA1300-IbGT1-GFP，所述重组载体pCAMBIA1300-IbGT1-GFP是将pCAMBIA1300-GFP载体的KpnI和SalI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pCAMBIA1300-GFP载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pCAMBIA1300-IbGT1-GFP表达序列表中SEQ IDNo.1所示的IbGT1蛋白。

所述重组微生物具体可为重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1300-IbGT1-GFP。

所述重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1300-IbGT1-GFP是将所述重组载体pCAMBIA1300-IbGT1-GFP导入根癌农杆菌EHA105得到的重组菌。

本发明还提供了一种提高植物抵抗胁迫的方法，所述方法包括增强或提高或上调目的植物中所述IbGT1蛋白的活性和/或含量，或/和，所述IbGT1蛋白的编码基因的表达量，来提高植物对胁迫的抗性。

上述方法中，所述增强或提高或上调目的植物中所述IbGT1蛋白的活性和/或含量，或/和，所述IbGT1蛋白的编码基因的表达量可通过向受体植物中导入IbGT1基因，得到植物对胁迫的抗性高于所述受体植物的目的植物。所述IbGT1基因编码所述IbGT1蛋白。

在本发明的一个实施方案中，所述培育胁迫抵抗的植物的方法包括如下步骤：

(1)构建包含SEQ ID NO.2所示DNA分子的重组表达载体；

(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入受体植物(如作物或甘薯)中；

(3)经筛选和鉴定获得胁迫抗性高于所述受体植物的胁迫抗性植物。

所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，等等导入。

上述应用或方法中，所述胁迫可为生物胁迫或非生物胁迫。

上述生物胁迫可为病害胁迫。所述病害具体可为蔓割病和/或软腐病。

上述非生物胁迫可为水分胁迫。所述水分胁迫具体可为盐胁迫和/或旱胁迫。

本发明中，所述调控可为上调或增强或提高。

本发明中，所述植物育种的目的包括培育抗胁迫的植物。本文中所述植物可为如下中的任一种：c1)双子叶植物或单子叶植物；c2)管状花目植物；c3)旋花科植物；c4)番薯属植物；c5)甘薯。

本发明提供了一种IbGT1蛋白及其编码基因，将该基因导入甘薯中，得到过表达IbGT1基因的甘薯植株。将转基因甘薯植株进行盐、旱胁迫处理，发现过表达株系与野生型甘薯相比，耐盐抗旱增强。将转基因甘薯植株接种蔓割病菌与软腐病菌，发现过表达株系与野生型甘薯相比，蔓割病抗性和软腐病抗性增强。结果表明，IbGT1基因及其所编码的蛋白在植物对抗非生物及生物胁迫的过程中起着重要的作用。本发明所提供的IbGT1蛋白及其编码基因在提高植物胁迫抗性研究中具有重要的应用价值。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为甘薯拟转基因植株的PCR扩增结果。

图2为不同转基因株系中IbGT1基因的转录水平检测结果。

图3为甘薯植株接种蔓割病菌后的的生长状态。

图4为甘薯植株接种软腐病菌后的的生长状态。

图5为甘薯植株在86mM NaCl条件下生长状态和表型指标统计结果。

图6为甘薯植株受干旱胁迫后的生长状态和表型指标统计结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

甘薯耐盐突变体ND98记载于如下文献中：何绍贞.甘薯耐盐突变体的离体筛选及耐盐候选基因的克隆.中国农业大学博士学位论文，2008。公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

栗子香(王玉萍等，中国农业科学，2003，36(9)：1000-1005)为一甘薯品种，公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

克隆载体pMD19-T为宝生物工程(大连)公司产品，产品目录号为6013。载体pCAMBIA1300-GFP为华越洋公司产品，产品编号为北京华越洋生物VECT0460。植物总RNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品，目录号为DP432。pEASY-Blunt simple载体为北京全式金生物技术有限公司的产品。PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit为宝生物工程(大连)有限公司的产品，产品目录号为6110A。

下述实施例中的甘薯蔓割病菌SY菌株记载于如下文献中：雷剑,杨新笋,苏文瑾,王连军,柴沙沙.十个甘薯品种对蔓割病的抗性鉴定[J].湖北农业科学,2014,53(22):5422-5423，由湖北省农业科学院粮食作物研究所提供，由中国农业大学甘薯遗传育种研究室保存。

下述实施例中的甘薯软腐病菌记载于如下文献中：杨冬静,徐振,赵永强,张成玲,孙厚俊,谢逸萍.甘薯软腐病抗性鉴定方法研究及其对甘薯种质资源抗性评价[J].华北农学报,2014,29(S1):54-56，由江苏徐州甘薯研究中心提供，由中国农业大学甘薯遗传育种研究室保存。

实施例1、利用IbGT1基因在调控甘薯胁迫抗性中的应用

IbGT1基因来源于甘薯耐盐突变体ND98，其核苷酸序列(编码序列(CDS))如SEQ IDNo.2，其编码的蛋白命名为IbGT1蛋白或蛋白质IbGT1，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

一、重组质粒的构建

A、重组质粒pCAMBIA1300-IbGT1-GFP的构建

1、人工合成序列SEQ ID No.2自5′末端起第1至1335位所示的双链DNA分子(IbGT1基因)。以该双链DNA分子为模板，以OE-F-KpnI：5′-GGGGTACCATGGAATCTAATGGTATGTATTCG-3′和OE-R-SalI：5′-GCGTCGACTCATCCCGTCACAGAAGACGG-3′(下划线为限制性内切酶KpnI和SalI的识别序列)为引物进行PCR扩增，得到一端含有限制性内切酶KpnI识别位点和另一端含有限制性内切酶SalI识别位点的双链DNA分子。

2、将步骤1的双链DNA分子连接至pEASY-Blunt simple载体，得到重组质粒pEASY-IbGT1。

3、完成步骤2后，用限制性内切酶KpnI和SalI双酶切重组质粒pEASY-IbGT1，回收含有IbGT1基因的片段，简称片段1。

4、用限制性内切酶KpnI和SalI双酶切pCAMBIA1300-GFP载体，回收约1.1Kb的片段，简称为pCAMBIA1300-GFP载体骨架2。

5、将片段1与pCAMBIA1300-GFP载体骨架2连接，得到重组质粒pCAMBIA1300-IbGT1-GFP。

根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA1300-IbGT1-GFP进行结构描述如下：将重组质粒pCAMBIA1300-GFP的限制性内切酶KpnI和SalI识别序列间的小片段替换为序列表中序列2自5′末端起第1至1335位所示的DNA分子，保持pCAMBIA1300-GFP载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组质粒pCAMBIA1300-IbGT1-GFP表达SEQ ID No.1所示的IbGT1蛋白。

二、重组农杆菌的获得和甘薯转基因植株的再生

A、甘薯转基因阳性植株的再生

1、将重组质粒pCAMBIA1300-IbGT1-GFP转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为EHA105/pCAMBIA1300-IbGT1-GFP。

2、剥取长约0.5mm的栗子香的茎尖分生组织，置于胚性愈伤组织诱导固体培养基(含2.0mg/L 2，4-D，3.0％蔗糖的MS固体培养基，又称MS+2.0mg/L 2，4-D+3.0％蔗糖固体培养基)上，27±1℃培养8周，得到胚性愈伤组织，然后将胚性愈伤组织置于胚性愈伤组织诱导液体培养基(含2.0mg/L 2，4-D和3.0％蔗糖的MS液体培养基，又称MS+2.0mg/L 2，4-D+3.0％蔗糖液体培养基)中，水平摇床上振荡光暗交替培养3d(具体条件为：100r/min；27℃；光暗交替培养的周期为：每天光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为500lx)，得到直径为0.7-1.3mm的胚性细胞团。

3、完成步骤2后，采用农杆菌介导的方法将EHA105/pCAMBIA1300-IbGT1-GFP转化胚性细胞团，然后置于共培养基(含30mg/L AS、2.0mg/L 2,4-D的MS固体培养基，又称MS+2.0mg/L 2，4-D+30mg/L AS固体培养基)上，28℃暗培养3d。

4、完成步骤3后，将胚性细胞团用含900mg/L头孢噻肟钠(cefotaxime sodium，CS)和2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基(又称MS+900mg/L CS+2.0mg/L 2,4-D)洗涤2次，然后置于选择培养基(含2.0mg/L 2,4-D、300mg/L CS和5mg/L潮霉素(Hygromycin，Hyg)的固体MS培养基)上，27±1℃暗培养10-12周(每2周需更换一次选择培养基)。

5、完成步骤4后，将胚性细胞团置于体细胞胚诱导培养基(含有1.0mg/L ABA、300mg/L CS和5mg/L Hyg的MS固体培养基)上，27±1℃光暗交替培养(光暗交替培养的周期为：光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为3000lx)2-4周，得到抗性愈伤组织。

6、完成步骤5后，将抗性愈伤组织置于MS固体培养基上，27±1℃光暗交替培养(光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为3000lx)4-8周，即获得219株甘薯拟转基因植株，依次命名IbGT1-OX1至IbGT1-OX219。

7、分别提取步骤6获得的甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，以35S-F：5′-TCAGAAAGAATGCTAACCCACA-3′和IbGT1-R：5′-TCATCCCGTCACAGAAGACG-3′为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中含有1400bp的条带，则相应的甘薯拟转基因植株即为甘薯转基因阳性植株。用等体积水代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的基因组DNA，进行PCR扩增，作为空白对照(W)。用甘薯品种栗子香野生型植株的幼嫩叶片的基因组DNA代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的基因组DNA，进行PCR扩增，作为阴性对照(WT)。用重组质粒pCAMBIA1300-IbGT1-GFP代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的IbGT1基因组DNA，进行PCR扩增，作为阳性对照。

实验结果见图1中A(M为DNA分子Marker，W为空白对照，P为阳性对照，WT为阴性对照。结果表明，IbGT1-OX1、IbGT1-OX2、IbGT1-OX9、IbGT1-OX15、IbGT1-OX27、IbGT1-OX38、IbGT1-OX44、IbGT1-OX56、IbGT1-OX71、IbGT1-OX128、IbGT1-OX156均为甘薯拟转基因植株。

8、RT-qPCR

提取转基因甘薯阳性植株的总RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR，以野生型甘薯植株为对照。利用组成性表达的甘薯肌动蛋白(Actin)基因为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用IbGT1基因的特异引物进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-△△CT法(LivakKJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^-△△CT method.Methods.25:402-408)分析IbGT1基因的表达情况，每组样品重复3次。

甘薯肌动蛋白(Actin)基因的特异引物序列为：

IbActin-F：5′-AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC-3′

IbActin-R：5′-TGGAAAATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC-3′

IbGT1特异引物序列为：

IbGTD1-F：5′-CAAGCCCAAAATCACCCC-3′

IbGTD1-R：5′-CCACCATAATCAACAGCCTCAC-3′

结果如图2所示，结果表明IbGT1基因在甘薯转基因阳性植株中得到不同程度的表达。选取转基因甘薯植株L15(即IbGT1-OX15)、L27(即IbGT1-OX27)和L38(即IbGT1-OX38)进行组织培养(无性繁殖)扩繁，由一株转基因幼苗扩繁得到的植株作为一个株系，得到IbGT1过表达转基因株系L15、L27、和L38(简称转基因株系L15、L27和L38)，进行后续蔓割病抗性试验、抗盐性实验和抗旱性实验。选取转基因甘薯植株L2(即IbGT1-OX2)、L128(即IbGT1-OX128)和L156(即IbGT1-OX156)进行组织培养(无性繁殖)扩繁，由一株转基因幼苗扩繁得到的植株作为一个株系，得到IbGT1过表达转基因株系L2、L128和L156(简称转基因株系L2、L128和L156)进行后续软腐病抗性试验。

五、胁迫抗性鉴定

1、蔓割病抗性鉴定

待测甘薯株系为甘薯品种栗子香的野生型(WT)、IbGT1过表达转基因株系L15、L27、L38。

实验重复三次，每个株系每次种植20株，每次重复的步骤如下：

a、将甘薯蔓割病菌接种于PDA培养基，28℃光暗交替培养(光暗交替培养的周期为：每天光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为500lx)3d，然后28℃暗培养7d，得到菌丝。

b、完成步骤a后，将菌丝转移至三角瓶，加入100mL无菌蒸馏水，100r/min振荡30min，然后用双层无菌纱布过滤，用血球计数板在显微镜下计数，得到甘薯蔓割病菌孢子含量为1×10⁷cfu/mL的孢子悬浮液。

c、将长势基本一致的待测甘薯植株的幼苗剪口，对齐后置于孢子悬浮液中30min，然后种植于装有无菌沙土的盆池中(每个盆池种植3株)，然后正常培养。分别于种植的第0d、种植的第3d、种植的第5d、种植的第7d、种植的第9d和种植的第11d，观察甘薯植株的生长状态。测量并统计种植的第11d的甘薯植株的表型指标(干鲜重(g))。

蔓割病发病率和病情指数按0～6级进行鉴定，以株为单位，其中：

0级：植株生长正常，未见发病症状；1级：植株生长正常，茎基部维管束变褐在5cm以内。2级：植株生长基本正常，茎基部维管束变褐在1/3以内。3级：植株基部叶片变黄，维管束变褐在2/3以内。4级：植株叶片多数变黄枯死，维管束变褐扩展至全株；5级：全株枯死。根据病情指数进行抗病性评价。

病情指数的计算按如下公式计算：病情指数＝[(0.1×n1+0.2×n2+0.5×n3+0.8×n4+1.0×n5)/N]×100(其中：n为各级病株数，N为试验总株数)

根据病情指数检测甘薯蔓割病抗性，具体分级如下：

高抗(HR)：病情指数0.0～20.5；抗(R)：病情指数20.6～40.5；中抗(MR)：病情指数40.6～60.5；感(MS)：病情指数60.6～80.5；中感(S)：病情指数80.6～90.5；高感(HS)：病情指数90.6～100。病情指数(DI)＝[(Σ各级病株数×各级代表值)/总株数×最高级代表值)]×100。

采用SPSS统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用t-test检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。

甘薯植株在盆池的生长状态见图3(0d为种植的第0d，3d为种植的第3d，5d为种植的第5d，7d为种植的第7d，9d为种植的第9d，11d为种植的第11d，B为种植的第11d的从盆池取出洗净的甘薯植株)。实验结果如下：接种3d时，WT植株已有较明显的感病症状(叶片变黄)，转基因株系L15、L27和L38的生长状态均良好；接种9d时，WT植株叶片几乎全部变黄，部分老叶脱落，茎段部分褐化***，过表达株系有部分叶片变黄，表现出较轻的过敏反应；接种11d时，WT叶片枯萎脱落，茎段褐化，整株死亡，而过表达株系叶片变黄数较少，部分株系茎段较小程度褐化，植株仍能正常生长。病情指数计算结果如表1所示，WT植株为高感植株，而转基因株系L15表现为中抗，转基因株系L27表现为感病，转基因株系L38表现为抗病，表明转基因株系的蔓割病抗性得到不同程度的提高。因此，在甘薯中过表达IbGT1基因可提高甘薯的蔓割病抗性。

表1蔓割病病情调查结果

2、软腐病抗性鉴定

待测株系为甘薯品种栗子香的野生型植株(WT)、IbGT1过表达转基因株系L2、L128、L156。

实验重复三次，每个株系每次接种20块，每次重复的步骤如下：

a、将甘薯软腐病菌接种于PDA培养基，28℃光暗交替培养(光暗交替培养的周期为：每天光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为500lx)3d，然后28℃暗培养7d，得到菌丝。

b、将步骤a的菌丝转移至500mL三角瓶，加入100mL无菌蒸馏水，100r/min振荡30min，然后用双层无菌纱布过滤，用血球计数板在显微镜下计数，得到甘薯软腐病菌孢子含量为1×10⁷cfu/mL的孢子悬浮液。

c、取每个株系20个植株。利用打孔器在薯块打直径为1cm小孔，将打孔时带出的薯块细棒置于一旁待用。

d、用移液枪取1mL菌液注入小孔内，截取取适当长度的薯块细棒***小孔，然后由里向先后外涂抹凡士林和石腊进行封口。

e、28℃恒温培养10d后观察薯块的发病情况。

甘薯薯块接种软腐病后发病情况见图4，WT的薯块染病严重，菌丝几乎蔓延至整个切面；而过表达株系的薯块则只在接种区附近有菌丝，软腐病蔓延得到有效的控制。因此，在甘薯中过表达IbGT1基因可提高甘薯的软腐病抗性。

3、抗盐性鉴定

待测株系为甘薯品种栗子香的野生型植株(WT)、IbGT1过表达转基因株系L15和L38。

实验重复三次，每个株系每次重复每种处理20株，每次重复的步骤如下：

(1)取各待测株系的茎段(约25cm长且至少有3个茎节)，利用硬质泡沫板固定，培养在1/2霍格兰+86mM NaCl液体培养基(向1/2霍格兰培养液(刘德高.过表达IbP5CR、IbERD3、IbELT、IbNFU1基因的甘薯植株的获得及耐盐性鉴定)中加入NaCl至NaCl的含量为86mM得到的液体培养基)中，至少漫过1个茎节。

(2)完成步骤(1)后，每一周换一次1/2霍格兰+86mM NaCl液体培养基。4周后，观察甘薯植株的生长状态，测量并统计甘薯植株单株平均鲜重(FW)和干重(DW)。

按照上述方法，将步骤(1)中的1/2霍格兰+86mM NaCl液体培养基替换为1/2霍格兰营养液，其它步骤均不变，作为空白对照(Normal)。采用SPSS统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用t-test检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异)。

甘薯植株的生长状态及表型指标统计结果见图5中A1，A2和B1，B2(图5中A1和A2为空白对照，图5中B1和B2为盐胁迫，FW表示鲜重，DW表示干重)。结果表明，盐胁迫一段时间后，甘薯品种栗子香的野生型植株的生长状态显著变差，而IbGT1过表达转基因株系L15、L38的生长状态和表型指标均良好。因此，在甘薯中过表达IbGT1基因可提高甘薯的抗盐性。

4、抗旱性鉴定

待测株系为甘薯品种栗子香的野生型植株(WT)、IbGT1过表达转基因株系L15、L27、L38，分别进行水培实验和盆栽实验。

(1)取甘薯植株的茎段(约25cm长且至少有3个茎节)，种植于装有人工土壤(由1体积份蛭石和1体积份营养土混合而成)的盆池中，每个盆池种植3株。

(2)完成步骤(1)后，每个盆池用1/2霍格兰营养液灌溉2周。

(3)完成步骤(2)后，每个盆池自然干旱胁迫(Drought)8周(即不进行任何处理，包括不灌溉任何水分和营养液)。8周后，观察甘薯植株的生长状态，测量并统计甘薯植株的表型指标(如单株平均鲜重(FW)、单株平均干重(DW))。以不进行干旱胁迫，即正常灌溉1/2霍格兰营养液作为对照(Normal)。

甘薯植株的生长状态见图6中A1，A2和B1，B2(图6中A1和图6中B1为甘薯植株在盆池的生长状态，图6中A2和图6中B2为从盆池取出洗净的甘薯植株)。甘薯植株的表型指标统计结果见图6中A3和图6中B3。结果表明，干旱胁迫一段时间后甘薯品种栗子香的野生型植株的生长状态显著变差，而IbGT1过表达转基因株系L15、L27和L38的生长状态和表型指标均良好。因此，在甘薯中过表达IbGT1基因可提高甘薯的抗旱性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 胁迫抗性相关蛋白IbGT1及其编码基因及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 444

<212> PRT

<213> 甘薯（Ipomoea batatas ）

<400> 1

Met Glu Ser Asn Gly Met Tyr Ser Asn Met Gly Ser Gly Met Leu Gly

1 5 10 15

Leu Glu Met Ser Leu His His Val Pro Pro Gln Gln Asn Pro Met Gln

20 25 30

His Gln Ser His Pro Pro Met Val Ser Tyr Val Asp His Arg Gln Gln

35 40 45

Ser Gln Pro Pro Leu Arg Pro Gly Ser Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Ser

50 55 60

Gly Asn Lys Pro Lys Ile Thr Pro Gly Leu Thr Leu Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

Asp Pro Gly Gly Pro Thr Ala Asp Gln Asn Ser Ala Asp Asp Gly Lys

85 90 95

Arg Lys Thr Cys Pro Trp Gln Arg Met Lys Trp Thr Asp Asn Met Val

100 105 110

Arg Leu Leu Ile Met Val Val Tyr Tyr Ile Gly Asp Glu Val Gly Ser

115 120 125

Glu Gly Asn Ser Asn Asp Pro Ala Ala Gly Asn Lys Lys Lys Ala Gly

130 135 140

Ala Gly Ala Gly Leu Leu Gln Lys Lys Gly Lys Trp Lys Ser Val Ser

145 150 155 160

Arg Ala Met Met Glu Arg Gly Phe Tyr Val Ser Pro Gln Gln Cys Glu

165 170 175

Asp Lys Phe Asn Asp Leu Asn Lys Arg Tyr Lys Arg Val Asn Asp Ile

180 185 190

Ile Gly Lys Gly Thr Ala Cys Lys Val Val Glu Asn Gln Thr Leu Leu

195 200 205

Glu Thr Leu Asp Leu Ser Pro Lys Met Lys Glu Glu Ala Lys Lys Leu

210 215 220

Leu Asn Ser Lys His Leu Phe Phe Arg Glu Met Cys Ala Tyr His Asn

225 230 235 240

Ser Cys Ala His Gly Gly Ala Ser Gly Ser Ala Ala Ala Asp Gly Gly

245 250 255

Ser Asp Pro Thr Ser Gln Thr Asn Asn His His Gln Lys Cys Met His

260 265 270

Ser Ser Glu Asn Val Arg Ile Gly Pro Asn Leu Gly Pro Ala Glu Val

275 280 285

Glu Glu Pro Lys Asp Asn Asn Tyr Glu Asp Asp Glu Asp Ser Asp Asp

290 295 300

Asp Glu Asp Glu Glu Ser Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Lys Ser Arg

305 310 315 320

Lys Lys Ala Lys Lys Thr Glu Pro Trp Ser Pro Leu Leu Glu Gln Met

325 330 335

Ser Gly Glu Leu Thr Asn Val Cys Glu Asp Ser Thr Arg Ser Pro Gly

340 345 350

Glu Lys Arg Gln Trp Ile Lys Ala Arg Thr Met Gln Leu Glu Glu Gln

355 360 365

Arg Val Glu Phe Gln Ser Gln Ala Leu Glu Leu Glu Lys Gln Arg Leu

370 375 380

Lys Trp Glu Lys Phe Ser Ser Lys Lys Glu Arg Glu Met Glu Arg Glu

385 390 395 400

Lys Met Met Asn Gln Arg Lys Lys Leu Glu Asn Glu Arg Met Val Leu

405 410 415

Leu Leu His Gln Lys Glu Leu Glu Leu Asn Asp Val His His Gln Gly

420 425 430

Tyr Asn Arg Thr Ser Asp Pro Ser Ser Val Thr Gly

435 440

<210> 2

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaatcta atggtatgta ttcgaacatg ggttctggaa tgttagggct agaaatgtca 60

cttcaccatg tcccacctca acaaaacccc atgcagcacc aatcccaccc tcccatggtg 120

tcctacgttg accaccgtca acaaagtcaa ccgccgttga ggccaggcag cggcggcggc 180

gcttaccctt ccgggaataa gcccaaaatc accccaggct tgaccctcag cgacgaagat 240

gatcccggag ggcccaccgc cgatcagaac agcgctgatg atgggaagag gaaaacatgc 300

ccgtggcagc gaatgaaatg gacggataat atggtgaggc tgttgattat ggtggtgtat 360

tatatcggcg atgaggttgg atccgaaggg aatagcaacg acccggccgc cgggaacaag 420

aaaaaggccg gcgccggcgc cggccttttg cagaagaaag ggaagtggaa atcggtgtcg 480

cgggcgatga tggagagggg attctacgtg tccccccaac aatgcgagga taaattcaat 540

gatctgaaca aaaggtacaa aagggttaac gatatcatcg gaaaaggcac cgcgtgtaag 600

gttgtcgaga atcaaacctt gctggaaaca ttggatttat cgccaaagat gaaagaggaa 660

gccaagaaac tgctaaactc taaacacttg tttttccggg aaatgtgcgc ttaccataac 720

agctgcgccc acggcggcgc tagcggaagc gccgccgccg acggaggctc cgatcccacc 780

tctcagacta ataatcatca ccagaagtgt atgcattcat ctgagaatgt cagaatcgga 840

cccaatttgg ggcccgcaga ggtagaggaa ccaaaagaca acaactacga agacgacgag 900

gatagcgatg atgacgagga cgaggaatcc gaggaggacg aagaagacga aaaatcaaga 960

aagaaggcta aaaagacgga accttggtcg cccctgctag aacagatgag cggggaatta 1020

acaaacgtgt gtgaagacag tacgaggagt ccgggggaaa agcggcagtg gataaaagca 1080

agaacgatgc aattggagga gcagcgcgtg gagttccaat cccaagcatt ggagctggaa 1140

aagcagcgat tgaaatggga aaagttcagc agcaagaagg agagggagat ggagagggag 1200

aagatgatga atcaacggaa gaaattggag aacgagagaa tggttcttct gcttcaccag 1260

aaagagctgg aattgaacga tgttcatcac caaggttaca acagaactag cgatccgtct 1320

tctgtgacgg gatga 1335

Claims

1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为IbGT1蛋白，为如下的蛋白质：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1所示的蛋白质；

A2)在A1)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

2.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子为编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。

4.应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

U1)权利要求1所述的蛋白质或提高基因的表达物质或提高所述蛋白质活性或含量的物质在提高植物对胁迫的抗性中的应用，所述基因编码权利要求1所述的蛋白质；

U2)权利要求1所述的蛋白质或提高基因的表达物质或提高所述蛋白质活性或含量的物质在培育对胁迫的抗性改变的植物中的应用，所述基因编码权利要求1所述的蛋白质；

U3)权利要求1所述的蛋白质或提高基因的表达物质或提高所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用，所述基因编码权利要求1所述的蛋白质；

所述物质为权利要求2所述生物材料；

所述胁迫为软腐病害、蔓割病害、干旱胁迫或盐胁迫。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述核酸分子为编码链的编码序列是SEQID No.2的cDNA分子或DNA分子。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述植物是如下中的任一种：

C1)双子叶植物或单子叶植物；

C2)管状花目植物；

C3)旋花科植物；

C4)番薯属植物；

C5)甘薯。

7.一种提高植物抵抗胁迫的方法，其特征在于，所述方法包括步骤S，所述步骤S为增强、提高或上调目的植物中权利要求1所述蛋白质的活性和/或含量，或/和，增强、提高或上调权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达量，来提高植物对胁迫的抗性，所述胁迫为软腐病害、蔓割病害、干旱胁迫或盐胁迫。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S通过向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到对胁迫的抗性高于所述受体植物的目的植物。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述植物是如下中的任一种：

C1)双子叶植物或单子叶植物；

C2)管状花目植物；

C3)旋花科植物；

C4)番薯属植物；

C5)甘薯。