CN112143830A

CN112143830A - 水稻剑叶宽调控基因nal1的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN112143830A
Application number: CN202011220962.XA
Authority: CN
Inventors: 刘鸿艳; 马孝松; 罗利军
Original assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Current assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Priority date: 2020-11-05
Filing date: 2020-11-05
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2040-11-05
Also published as: CN112143830B

Abstract

本发明提供了一种可以鉴定水稻剑叶宽基因NAL1的分子标记、及其正反引物与并可将其应用于水稻叶宽性状的筛选与育种。该标记通过序列差异设计不存在遗传交换，准确性高；直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，更为简便；为共显性标记，可以检测纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高育种效率。

Description

水稻剑叶宽调控基因NAL1的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于植物繁殖技术领域，具体涉及农业生物技术领域，具体涉及一个水稻剑叶宽调控基因NAL1的分子标记及其应用。

背景技术

水稻是全世界近一半人口的主粮，同时，也是我国最重要的粮食作物。水稻的剑叶作为最为重要的功能叶，是进行光合作用的重要场所。宽剑叶对于水稻积累更多的光合产物具有重要意义，因此，适当提高剑叶宽对于提升水稻产量具有积极作用。大量研究表明，水稻的剑叶宽同时受到内在遗传机制和外界环境因子的双重因素调节。因此，了解水稻剑叶宽的遗传规律，通过改良剑叶宽，对于提高水稻产量具有重要意义。

近年，随着遗传学和分子生物学技术的发展，控制水稻剑叶宽的基因NAL1(Qi etal.,2008)、NARROW LEAF 7(NAL7)(Fujino et al.,2008)、nal9(Li et al.,2013)等被克隆。其中有研究表明来将粳稻日本晴的NAL1等位基因导入籼稻9311之后可以提高籼稻的叶宽、光合效率和产量等性状(Zhang et al.,2014)。水稻剑叶宽是典型的数量性状，受多基因控。分子标记辅助选择是一种利用与叶宽基因紧密连锁标记或者基因内功能标记，在后代中结合基因型和表型鉴定对目标性状进行选择的现代育种技术。该方法不仅可大大缩短育种年限，提高育种效率，而且还节约了大量的人力、物力成本。NAL1宽剑叶等位基因型主要来源于部分粳型水稻品种，而籼稻基本不含NAL1宽剑叶等位基因，因此在改良水稻剑叶宽度，提高水稻光合效率从而提高水稻产量方面有很大的应用价值，开发NAL1基因的功能性标记对充分利用该基因，进一步改良水稻剑叶宽、提高水稻产量有着重要意义。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种水稻剑叶宽基因NAL1的分子标记、及其正反引物与应用。具体技术方案如下：

一种水稻剑叶宽基因NAL1的分子标记，所述分子标记为NAL1-Rsa I，用于扩增所述分子标记的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

在其中一些实施例中，所述分子标记位于水稻基因组第4号染色体。

本发明还提供了水稻剑叶宽基因NAL1的分子标记的应用，具体如下：

所述的分子标记在水稻叶宽调控基因NAL1基因型的鉴定中的应用和/或在宽叶水稻的辅助选择育种中的应用。

本发明还提供了一种分子标记用于水稻剑叶宽调控基因NAL1的鉴定的方法，具体技术方案如下：

一种分子标记用于水稻剑叶宽调控基因NAL1的鉴定的方法，包括以下步骤：

1)提取供试水稻样品基因组DNA；

2)利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对步骤1)中所提取基因组进行PCR扩增，获得扩增产物；

3)利用限制性内切酶Rsa I对PCR扩增产物进行酶切。

在其中一些实施例中，通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测步骤3)得到的酶切产物，如果有399bp的单条带，则表示所述样品为品种珍汕97B等位基因型；如果有265bp和134bp的条带，则表示该检测样品基因型为IRAT109等位基因；如果同时含有399bp、265bp和134bp三条带型，则表示该检测样品为NAL1杂合基因型。

在其中一些实施例中，所述PCR扩增的扩增体系包含：Taq酶，模板DNA，dNTP，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物，PCR buffer。

在其中一些实施例中，其特征在于，所述PCR扩增的PCR反应程序为：95±1℃预变性4-6min，然后按98±1℃28-32s，54±1℃下28-32s，72±1℃下0.8-1.2min进行33-37个循环，最后72±1℃下延伸4-6min。

本发明还提供了一种分子标记用于宽叶水稻的辅助选择育种的方法，具体技术方案如下：

一种分子标记用于宽叶水稻的辅助选择育种的方法，包括以下步骤：

1)提取供试水稻样品基因组DNA；

3)利用限制性内切酶Rsa I对PCR扩增产物进行酶切。

在其中一些实施例中，通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测步骤3)得到的酶切产物，如果有265bp和134bp的条带，则表示该检测样品基因型为IRAT109等位基因；或如果同时含有399bp、265bp和134bp三条带型，则表示该检测样品为NAL1杂合基因型；为宽叶水稻品种。

本发明还提供了一种水稻剑叶宽调控基因NAL1的鉴定的试剂盒，具体技术方案如下：

一种水稻剑叶宽调控基因NAL1的鉴定的试剂盒，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，所述引物用于扩增水稻剑叶宽基因NAL1的分子标记，所述分子标记为NAL1-Rsa I。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种可以鉴定水稻剑叶宽基因NAL1的分子标记、及其正反引物与并可将其应用于水稻叶宽性状的筛选与育种。该标记通过序列差异设计不存在遗传交换，准确性高；直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，更为简便；为共显性标记，可以检测纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高育种效率。

附图说明

图1为是本发明中分子标记NAL1-Rsa I对10个水稻品种的电泳检测图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下面通过实施例对本发明进行详细介绍：

实施例1水稻剑叶宽基因NAL1基因分子标记的开发

(1)供试材料：宽剑叶品种：IRAT109；窄剑叶品种：珍汕97B。

(2)水稻基因组DNA提取方法：在研钵中，取10mg水稻叶片，加入适量的液氮，将水稻叶片研磨成粉末，加入400μL 1.5×CTAB(1.5％CTAB,75mmol/L Tris-HCl,15mmol/LEDTA,1.05mol/L NaCl,Ph＝8.0)研磨成匀浆，再加入400μL 1.5×CTAB，吸取研磨液至1.5ml离心管中，加入550μL氯仿，混匀，12000r/min离心10min，取上清至另一离心管，加入预冷的等体积异丙醇，12000r/min离心5min，去上清，干燥沉淀物，最后加入200μL ddH₂O溶解即可。

(3)基因分子标记NAL1-Rsa I的开发：NAL1位于第4号染色体，在日本晴参考基因组收录号为AL662950.2。

(4)根据核苷酸序列差异，利用Primer Premier 5.0软件设计引物NAL1-Rsa I，其正反引物序列为：

NAL1-Rsa I F：5’-TGCTACTCCACATCTTGTTGTTTA-3’(SEQ ID NO.1)；

NAL1-Rsa I R：5’-GTTGGATTGATGGAGAACAAGGA-3’(SEQ ID NO.2)。

(5)利用功能标记NAL1-Rsa I对供试水稻品种IRAT109与珍汕97B进行PCR扩增，PCR扩增体系为：20ng/μL水稻基因组DNA模板1μL，10μL的2×Taq Master mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，10μM的前后引物各1μL，补充dd H₂O至20μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min，然后按98℃30s，54℃下30s，72℃下1min进行35个循环，最后72℃下延伸5min。

(6)利用限制性内切酶Rsa I(NEB(北京)有限公司)对PCR产物进行酶切：酶切体系为，向PCR产物中加入2.5uL 10×NEBuffer,加入1μL限制性内切酶Rsa I(5U/uL)，补充ddH₂O至25μL。然后在37℃条件下反应2小时。

(7)取酶切产物8μL上样于1％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，第10泳道为宽叶水稻品种IRAT109，酶切后出现了两条条带，条带大小分别为265bp和134bp。第9泳道为未酶切的IRAT109的PCR产物，条带大小为399bp。第8泳道为酶切后的珍汕97B的PCR产物，条带大小为399bp。第7泳道为珍汕97B/IRAT109杂种F1酶切后的PCR产物。从图1可以看出电泳条带清晰，差异明显。

(8)电泳切胶带回收/测序。胶回收使用北京全式金生物技术有限公司的胶回收试剂盒(离心柱型，产品目录号:EG101-02)，测序由上海博尚生物技术有限公司完成。测序结果见表1。

表1：IRAT109与珍汕97B的碱基比较

IRAT109：(SEQ ID NO.3)

TGCTACTCCACATCTTGTTGTTTATTCTACTGATTCCATCTTTTCGTTCGGGCCAGGCCAGCTAGCTAGCCGCAAGCGCTGACTGTCTTGATCATTGATTCCTCCTTCCACAATAACTCTAAAAGATTGGAAGTACATTTGCATGATTGATGGTTTTCCCGTCGCTTTCGGCATTCGTTATCTACCTGTCCATTAGCCTTCAGGATCATGCTTTCTGACTTGCTTGTTCTCATTCTTAGGGCCATAACTTCAGCTTCTCCCATCTATAATAGGTTCGCAAACTGTTCAGCACAATGAAGCCTTCGGACGATAAGGCGCAGCTCTCCGGTTTGGCGCAATCAGAAGAATCGTCACTTGATGTGGATCACCAGTCATTTCCTTGTTCTCCATCAATCCAAC

珍汕97B(SEQ ID NO.4)

TGCTACTCCACATCTTGTTGTTTATTCTACTGATTCCATCTTTTCGTTCGGGCCAGGCCAGCTAGCTAGCCGCAAGCGCTGACTGTCTTGATCATTGATTCCTCCTTCCACAATAACTCTAAAAGATTGGAAGCACATTTGCATGATTGATGGTTTTCCCGTCGCTTTCGGCATTCGTTATCTACCTGTCCATTAGCCTTCAGGATCATGCTTTCTGACTTGCTTGTTCTCATTCTTAGGGCCATAACTTCAGCTTCTCCCATCTATAATAGGTTCGCAAACTGTTCAGCACAATGAAGCCTTCGGACGATAAGGCGCAGCTCTCCGGTTTGGCGCAATCAGAAGAATCGTCACTTGATGTGGATCACCAGTCATTTCCTTGTTCTCCATCAATCCAAC

实施例2：NAL1-Rsa I分子标记的亲本多态性检测

(1)提取供试水稻品种基因组，提取方法同实施例1。供试水稻品种分别为：湘晴、SILEWAH、旱恢15、云陆8号、秀水123、绵恢725。

(2)PCR扩增，同实施例1。

(3)酶切，同实施例1。

(4)电泳检测，同实施例1。结果如图1所示。

其中1-10分别表示水稻品种湘晴(粳稻，剑叶宽＝1.52mm)、SILEWAH(粳稻，剑叶宽＝2.02mm)、旱恢15号(籼稻，剑叶宽＝1.70mm)、云陆8号(粳稻，剑叶宽＝2.40mm)、秀水123(粳稻，剑叶宽＝1.55mm)、绵恢725(籼稻，剑叶宽＝1.60mm)、珍汕97B/IRAT109杂种F1(剑叶宽＝1.75mm)、珍汕97B(籼稻，剑叶宽＝1.60mm)、IRAT109(未酶切)、IRAT109(粳稻，剑叶宽＝1.80mm)；M表示D2000Marker。

可见，含有窄叶等位基因的品种湘晴(第1泳道)、旱恢15(第3泳道)、秀水123(第5泳道)、绵恢725(第6泳道)的电泳条带大小为399bp；而宽剑叶等位基因品种SILEWAH(第2泳道)、云陆8号(第4泳道)的电泳结果显示为两条条带，条带大小分别为265bp和134bp。

实施例3：NAL1-Rsa I分子标记的验证与应用

(1)利用NAL1基因分子标记NAL1-Rsa I对水稻保持系珍汕97B与宽剑叶品种IRAT109的杂种F1代单株基因组DNA进行PCR扩增，再通过限制性内切酶Rsa I对PCR产物进行酶切，酶切产物在1％的琼脂糖凝胶进行电泳分型，在杂种F1单株中检测到有399bp、256bp和134bp三条带，表明NAL1-Rsa I可以用于杂种F1的鉴定，检测样品为NAL基因杂合基因型。

(2)利用NAL1基因分子标记NAL1-Rsa I对198个IRAT109/珍汕97B的F₁₀代重组自交系的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物经过Rsa I酶切，酶切产物在1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，分别有106个株系含有珍汕97B的等位基因型(399bp条带)、92个株系含有与IRAT109一致的等位基因型(含有256bp和134bp两条带)，剑叶宽鉴定结果表明，含有珍汕97B的等位基因型的株系剑叶宽极显著小于含有IRAT109等位基因型株系的粒型(P＜1.28E-12)。

利用NAL1基因分子标记NAL1-Rsa I对237份水稻种质资源的基因组DNA进行NAL1基因型鉴定，产物在1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，发现在210份种质资源中为399bp带型，27份种质资源为两条带，条带大小分别为256bp和134bp，含有两条带型(256bp和134bp)的种质资源剑叶宽极显著大于含有399bp带型的种质资源(P＜8.6E-4)，同时国内的主栽品种亲本(明恢63，珍汕97B，包协7B，9311，旱恢3号、绵恢725、沪旱7B，C418，中413等)均为399bp带型。

因此表明可以利用分子标记NAL1-Rsa I进行水稻剑叶宽基因NAL1的鉴定和/或宽剑叶水稻的辅助选择育种。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海市农业生物基因中心

<120> 水稻剑叶宽调控基因NAL1的分子标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctactcca catcttgttg ttta 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttggattga tggagaacaa gga 23

<210> 3

<211> 399

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

tgctactcca catcttgttg tttattctac tgattccatc ttttcgttcg ggccaggcca 60

gctagctagc cgcaagcgct gactgtcttg atcattgatt cctccttcca caataactct 120

aaaagattgg aagtacattt gcatgattga tggttttccc gtcgctttcg gcattcgtta 180

tctacctgtc cattagcctt caggatcatg ctttctgact tgcttgttct cattcttagg 240

gccataactt cagcttctcc catctataat aggttcgcaa actgttcagc acaatgaagc 300

cttcggacga taaggcgcag ctctccggtt tggcgcaatc agaagaatcg tcacttgatg 360

tggatcacca gtcatttcct tgttctccat caatccaac 399

<210> 4

<211> 399

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

tgctactcca catcttgttg tttattctac tgattccatc ttttcgttcg ggccaggcca 60

gctagctagc cgcaagcgct gactgtcttg atcattgatt cctccttcca caataactct 120

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tctacctgtc cattagcctt caggatcatg ctttctgact tgcttgttct cattcttagg 240

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cttcggacga taaggcgcag ctctccggtt tggcgcaatc agaagaatcg tcacttgatg 360

tggatcacca gtcatttcct tgttctccat caatccaac 399

Claims

1.一种水稻剑叶宽基因NAL1的分子标记，所述分子标记为NAL1-Rsa I，用于扩增所述分子标记的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的水稻剑叶宽基因NAL1的分子标记，其特征在于，所述分子标记位于水稻基因组第4号染色体。

3.权利要求1或2所述的分子标记在水稻叶宽调控基因NAL1基因型的鉴定中的应用和/或在宽叶水稻的辅助选择育种中的应用。

4.一种分子标记用于水稻剑叶宽调控基因NAL1的鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取供试水稻样品基因组DNA；

3)利用限制性内切酶RsaI对PCR扩增产物进行酶切。

5.根据权利要求4所述分子标记用于水稻剑叶宽调控基因NAL1的鉴定的方法，其特征在于，通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测步骤3)得到的酶切产物，如果有399bp的单条带，则表示所述样品为品种珍汕97B等位基因型；如果有265bp和134bp的条带，则表示该检测样品基因型为IRAT109等位基因；如果同时含有399bp、265bp和134bp三条带型，则表示该检测样品为NAL1杂合基因型。

6.根据权利要求4或5所述的分子标记用于水稻剑叶宽调控基因NAL1的鉴定的方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增体系包含：Taq酶，模板DNA，dNTP，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物，PCR buffer。

7.根据权利要求6所述的分子标记用于水稻剑叶宽调控基因NAL1的鉴定的方法，其特征在于，所述PCR扩增的PCR反应程序为：95±1℃预变性4-6min，然后按98±1℃28-32s，54±1℃下28-32s，72±1℃下0.8-1.2min进行33-37个循环，最后72±1℃下延伸4-6min。

8.一种分子标记用于宽叶水稻的辅助选择育种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取供试水稻样品基因组DNA；

3)利用限制性内切酶RsaI对PCR扩增产物进行酶切。

9.根据权利要求8所述的辅助选择育种的方法，其特征在于，通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测步骤3)得到的酶切产物：如果有265bp和134bp的条带，则表示该检测样品基因型为IRAT109等位基因；或如果同时含有399bp、265bp和134bp三条带型，则表示该检测样品为NAL1杂合基因型；为宽叶水稻品种。

10.一种水稻剑叶宽调控基因NAL1的鉴定的试剂盒，其特征在于，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，所述引物用于扩增水稻剑叶宽基因NAL1的分子标记，所述分子标记为NAL1-Rsa I。