CN112457386A

CN112457386A - 一种控制玉米穗长和行粒数相关的蛋白ead1及其编码基因与应用

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Publication number: CN112457386A
Application number: CN202110066902.5A
Authority: CN
Inventors: 陈化榜; 裴元荣
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2021-01-19
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2021-03-09

Abstract

本发明公开了一种控制玉米穗长和行粒数相关的蛋白EAD1及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与玉米穗长和行粒数相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的EAD1基因在玉米中能够控制穗长和行粒数等重要产量性状，即该基因的纯合突变导致玉米穗长变短，行粒数降低。本发明为植物特别是玉米的产量性状研究提供了新的基因资源，选择具有EAD1优良等位基因型的自交系作为供体用于玉米的遗传改良，将在玉米育种领域的应用中发挥重要作用。

Description

一种控制玉米穗长和行粒数相关的蛋白EAD1及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种控制玉米穗长和行粒数相关的蛋白EAD1及其编码基因与应用。

背景技术

玉米是我国种植面积最大的作物，集粮、经、饲于一体，在我国粮食安全和经济发展中占有重要地位。玉米产量是玉米生产和育种的首要目标，是经济发展的重大需求。目前，我国玉米单位面积产量仍有很大的提升空间，然而对于玉米主要产量构成因素关键遗传位点的解析是玉米遗传改良的瓶颈问题。基因组测序和组装技术的高速发展，使人们能很容易的获取大量的遗传信息，但对遗传密码进行有效的解读，建立基因型与表型之间的相互关系，才能用于遗传改良。

穗长是玉米产量构成的关键因素，与行粒数呈显著正相关。穗长的遗传力高，但又常受到微效多基因的共同作用，作为一个典型的数量性状，长期以来一直是基础及应用研究的热点和难点。到目前为止，基于不同群体的连锁和关联分析，检测到的影响穗长性状变异的QTLs位点共计140个，TAVs(trait-associated variation)共计87个，此外，检测到影响行粒数变异的QTLs位点47个，TAVs 14个，这些QTLs位点形成不同的clusters，分布在多个染色体上(Li et al.，2018)。但总体而言，QTLs位点的检测往往缺乏功能基因的克隆和深入的机制研究。前人利用多个群体对玉米穗长的遗传结构进行全基因组的解析，分离出一个关键QTL位点的候选基因TPK1，预测该基因可能通过转录水平的改变调控玉米穗长的变异，但该基因的功能及其潜在的遗传调控机制，以及对穗长和产量的实际贡献率均有待进一步探究(Xiao et al.，2016)。贾海涛等(Jia et al.，2020)克隆到一个控制玉米穗长和行粒数的主效基因KNR6，该基因编码一个丝氨酸苏氨酸类受体蛋白激酶，研究表明KNR6的表达量与穗长和行粒数呈极显著正相关，利用优异单倍型对郑58和昌7-2进行遗传改良，发现改良后的材料在穗长和行粒数上都有所增加，评估杂交种产量提高约5.6％。这些研究结果说明KNR6的优异单倍型可以被用于增加杂交种的穗长和行粒数，进而提高杂交种产量。

基于对玉米穗长作为典型数量性状的认识，研究人员对玉米穗长缺陷突变体进行的正向遗传学研究还鲜有报道，一方面是由于缺乏对穗长缺陷突变体的收集和创制，穗长缺陷常伴随表型稳定性差，鉴定难等问题；另一方面则是由于这类突变体常伴随发育缺陷，导致穗较小，穗粒数降低，被认为缺乏直接的育种价值。但不可否认的是穗长缺陷类突变体对于揭示功能基因的遗传调控机制是十分重要的，并且随着测序技术的发展使得克隆此类功能基因的最优等位变异成为可能，通过协调此类功能基因的遗传作用，用于生产实践，将能够有效的提高玉米穗长和行粒数，填补基于纵向提高玉米果穗长度和行粒数相关研究的空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种控制玉米穗长和行粒数相关的蛋白EAD1及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白质，名称为EAD1，来源于玉米属的玉米(Zea mays)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与控制玉米穗长和行粒数相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表序列1为EAD1的氨基酸序列，包括489个氨基酸残基，在该蛋白质序列中，疏水氨基酸占72个，亲水氨基酸占207个，碱性氨基酸占52个，酸性氨基酸占46个，该蛋白质的分子量为52.03KD，等电点为5.85。

为了便于上述(a)中所示蛋白质的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列4所示的DNA序列中的编码区(第84-1554位)缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因(命名为EAD1)，所述基因具体可为如下1)-6)中任一的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)序列表中序列4所示的DNA分子；

4)序列表中序列5所示的DNA分子；

5)在严格条件下与1)-4)中任一限定的DNA分子杂交且编码与控制玉米穗长和行粒数相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子；

6)与1)-6)中任一限定的DNA序列具有90％以上同一性，且编码控制玉米穗长和行粒数相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子。

其中，序列2为EAD1基因在所述野生型玉米HN321基因组中的序列；序列3为EAD1基因在突变体ead1玉米基因组中的序列；序列4为EAD1基因在所述野生型玉米中的cDNA序列(其中84-1554位为编码区序列)；序列5为EAD1基因在所述突变体ead1中的cDNA序列(其中第98-1564位为编码区序列)。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。

所述转基因细胞系为转入所述基因的非繁殖材料。

所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(a)植物育种和/或制种；

(b)调控玉米穗长和行粒数。

本发明还提供了培育转基因植物的方法。

本发明所提供培育转基因植物的方法，可为如下(A)或(B)：

(A)培育穗长和行粒数增加的转基因植物的方法，包括如下步骤：

(a1)向基因型为ead1/ead1受体植物中导入EAD1蛋白的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；所述受体植物的穗长和行粒数是由于所述受体植物表达有功能的所述EAD1蛋白的能力丧失或降低引起的；

(a2)从步骤(a1)所得转基因植物中得到穗长和行粒数增加的转基因植物；所述编码基因可通过以上重组表达载体p3300-EAD1导入所述受体植物。

(B)培育穗长和行粒数降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：

(b1)抑制基因型为EAD1/EAD1受体植物中EAD1蛋白的表达，得到转基因植物；

(b2)从步骤(b1)所得转基因植物中得到穗长和行粒数降低的转基因植物，所得转基因植物的穗长和行粒数降低是由于所述受体植物所述EAD1蛋白功能丧失引起的。

在所述方法步骤(b1)中，是通过如下实现抑制所述受体植物中所述编码基因的表达的：采用CRISPR/Cas9核酸酶对所述受体植物中编码EAD1蛋白的基因组DNA序列进行特异性剪切，使所述受体植物丧失表达有功能的EAD1蛋白的能力。

其中，所述CRISPR/Cas9核酸酶对所述受体植物中编码EAD1蛋白的基因组DNA序列进行特异性剪切时的靶标片段为所述受体植物中编码EAD1蛋白的基因组DNA序列中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数(如X为20)，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。更加具体的，所述靶标片段为所述受体植物中编码EAD1蛋白的基因组DNA序列中的“5’-GAGTAGTGGTCTGGAATGGCGGG-3’(即序列2的第113-136位)”。

在本发明中，所述植物既可为单子叶植物，也可为双子叶植物。其中，所述单子叶植物如禾本科植物，具体如玉米。

本发明采用图位克隆的策略，用玉米短穗突变体ead1与玉米自交系B73组配BC₁F₁群体，将控制这一突变性状的基因定位到玉米五号染色体199.62Mb到199.97Mb之间，以公布的B73基因组测序结果为参考物理距离约为0.35Mb，共包括9个基因。其中基因号为Zm00001d017570的序列在突变体与野生型之间存在差异，突变体有一个3bp的缺失和52个SNP的替换，导致1个氨基酸的缺失和26个氨基酸的改变。用转基因技术将所述基因在上述玉米短穗突变体中互补表达，可以恢复突变体的穗部表型；用转基因技术将玉米自交系Zong31中所述基因敲除，可以得到穗长、行粒数降低的穗部表型。因此Zm00001d017570基因即是控制玉米穗长和行粒数重要产量性状的目的基因，命名为EAD1。

本发明的EAD1基因在玉米中能够控制穗长和行粒数，即该基因的纯合突变或缺失能够使玉米穗长变短，在该基因突变或缺失的材料中正常表达EAD1基因能够恢复穗长表型。

本发明为玉米穗长和行粒数等重要产量性状的研究和应用提供了新的基因资源。

附图说明

图1为玉米突变体ead1与野生型(WT)的表型对比图。其中，A，植株形态和灌浆期的雌穗；B，完全成熟的雌穗；C，灌浆末期雌穗长度统计；D，灌浆末期雌穗的行粒数统计；E，野生型(左)和突变体(右)的幼穗发育过程观察，比例尺为1cm。

图2为ead1基因图位克隆图。其中，A，基因定位；B，候选基因结构示意图；C，敲除载体的靶向序列和获得的突变类型；D，互补载体的结构示意图。

图3为EAD1的功能验证结果。其中，A，受体植物Zong31和EAD1基因位点纯合敲除转基因株系的穗部表型对比；B，ead1突变体与受体植物Zong31和EAD1基因位点纯合敲除转基因植株分别杂交得到的F₁代植株的穗部表型对比；C，ead1突变体背景下(用aa表示)互补转基因阴性(用“-”表示)和互补转基因阳性株系的穗部表型对比。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所述野生型玉米自交系HN321、突变体ead1、常规材料B73为本实验室收集和保存。玉米转基因受体Zong31由北京博美兴奥科技有限公司提供。其中HN321、B73、Zong31的基因型为EAD1/EAD1，突变体基因型为ead1/ead1。玉米基因组测序信息参考MaizeGDB数据库，该数据库链接如下：http：//www.maizegdb.org/。

实施例1、控制玉米穗长和行粒数基因EAD1的图位克隆

一、玉米突变体ead1的表型

与正常植株相比，玉米突变体ead1在植株整体形态方面没有异常(图1中A)，但是突变体的穗长和行粒数显著降低(图1中B)，其中穗长平均降低了55.2％(图1中C)，行粒数平均降低了57％(图1中D)。通过观察野生型和突变体的穗发育过程(图1中E，标尺为1cm)，发现在当雌穗生长发育到约2cm时期，ead1雌穗顶端发生水化、变褐、生长停滞的现象，而穗的中下部仍能够正常生长发育。此时期野生型材料HN321的雌穗顶端花序分生组织尚未分化完成，仍具有分化能力，而突变体的顶端在分化完成前发生异常，因此认为突变体穗长变短，行粒数减少是由于突变体幼穗顶端分化发育末期出现异常导致的。

二、遗传定位群体的构建

我们将短穗突变体ead1与玉米自交系B73杂交组配F₁，F₁代雌穗发育均表现正常，不产生穗长变短的表型，说明ead1为隐性基因突变。用ead1回交F₁构建分离群体BC₁F₁，对分离群体862棵单株进行表型鉴定，利用适合性卡方测验分析长穗正常发育和短穗顶端异常发育的表型分离比符合1∶1的孟德尔分离定律(表1)，说明ead1穗长变短和顶端异常发育表型由单基因控制。我们将BC₁F₁群体扩大并作为遗传定位群体用于目的基因的图位克隆。

表1.BC₁F₁分离群体的适合性卡方测验

注：χ² _0.05(1)＝3.84

三、EAD1基因的图位克隆

首先，以构建遗传定位群体的两个亲本，突变体ead1和B73的基因组DNA为模板，用玉米全基因组引物筛选在突变体ead1和B73之间有多态性的引物。然后，从BC₁F₁群体中选取极端表型的短穗顶端发育异常单株和长穗正常单株各20株，验证多态性引物是否与穗长性状连锁。筛选出连锁引物，用于对群体中200个单株基因型的测定，结合雌穗穗长和顶端发育正常与否的表型筛选出基因型与表型不符的为交换单株，并根据不同引物筛选出的交换单株个数的不同，依照减少趋势确定定位区间，由此将EAD1基因定位于玉米五号染色体的引物标记IDP6939(187.8Mb)和IDP6872(207Mb)之间。在IDP6939和IDP6872之间继续开发多态性分子标记，并用于检测BC₁F₁群体的所有单株(3,491株)，最终将EAD1基因定位在标记199-4(199.62Mb)和200-3(199.97Mb)之间，参考已公布的玉米自交系B73基因组测序结果，物理距离约为0.35Mb(图2A)。其中，用于基因定位的分子标记引物序列如表2所示。

表2 用于基因定位的分子标记引物序列

四、EAD1基因的克隆

参考玉米基因组测序信息，定位区间的0.35Mb范围内包含9个基因，分别是Zm00001d017561、Zm00001d017562、Zm00001d017563、Zm00001d017564、Zm00001d017566、Zm00001d017567、Zm00001d017568、Zm00001d017570、Zm00001d017571。以野生型和突变体的基因组DNA为模板，扩增这9个基因并比较其序列差异，发现只有基因Zm00001d017570在野生型和突变体之间存在DNA序列上的差异，突变体序列中有一个3bp的碱基缺失和52个单碱基的替换，导致1个氨基酸的缺失和26个氨基酸的改变。因此推测Zm00001d017570可能就是EAD1的候选基因，图2B展示了Zm00001d017570的基因结构，由3个外显子(灰色方框)和2个内含子(黑色线段)组成。

以所述野生型自交系材料HN321的基因组DNA为模板，采用引物对F1/R1进行PCR扩增，所得PCR产物的序列为序列表中序列2，序列2即为EAD1基因在野生型玉米基因组中的序列；以所述突变体ead1材料的基因组DNA为模板，同样采用引物对F1/R1进行PCR扩增，所得PCR产物的序列为序列表中序列3，序列3即为EAD1基因在突变体玉米基因组中的序列。提取野生型自交系材料的总RNA，反转录为cDNA，采用引物对F1/R1进行PCR扩增，所得PCR产物的序列为序列表中序列4，序列4即为EAD1基因在野生型玉米中的cDNA序列，其中第85-1554位为编码区序列；提取突变体ead1材料的总RNA，反转录为cDNA，同样采用引物对F1/R1进行PCR扩增，所得PCR产物的序列为序列表中序列5，序列5即为EAD1基因在在突变体ead1中的cDNA序列，其中第98-1564位为编码区序列。序列2和序列4均编码序列表中序列1所示的EAD1蛋白。

F1：5’-CGCTGCAGGGTCACATTCTGTTGCC-3’；

R1：5’-TGCGATCATCGGATTTCGGA-3’。

实施例2、控制玉米穗长和行粒数基因EAD1的功能验证(基因敲除)

一、EAD1基因敲除载体的遗传转化实验

本发明的发明人设计实验将玉米自交系Zong31的EAD1基因进行编辑。具体是采用CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeatsassociated 9)基因编辑***，对玉米受体植株Zong31中EAD1基因的基因组序列进行定点编辑。CRISPR-Cas9技术可针对基因组上特定位点DNA进行切割，利用生物体对DNA链的修复无法每次都保证100％正确的特点，重新连接的DNA链在序列上与未被切割前会产生差异，从而使得基因序列发生变化，其编码的蛋白质也随之变化。

具体到本实验中，根据CRISPR-Cas9***的特点，选取EAD1基因的第一外显子上特定序列作为sgRNA(single guide RNA)靶点序列(图2中B红色线段所示靶点位置和图C中所示靶点序列5’-GAGTAGTGGTCTGGAATGGCGGG-3’，即序列2的第113-136位)，并将其连入到pBUN411载体(除草剂抗性)，构建成为EAD1基因敲除载体，并采用农杆菌介导的方法转化玉米受体植物Zong31。玉米遗传转化实验由天津吉诺沃生物科技有限公司完成重组pBUN411-EAD1载体向玉米Zong31自交系的遗传转化，具体的转化方法是常规的农杆菌介导的玉米幼胚的遗传转化方法。

二、敲除转基因后代的功能验证

将基因敲除转基因后代群体中的单株提取基因组DNA，并以此为模板，采用上述引物对F1/R1进行PCR扩增，将产物测序，筛选编辑位点为纯合突变的植株。观察纯合突变株的穗部表型，若出现突变体ead1的表型，即穗长变短、行粒数降低、穗顶端发育异常等，则该基因为目的基因。

分析测序结果，发现其与野生型相比，转基因植株在EAD1基因的第一个外显子上产生单碱基***，导致氨基酸移码和翻译的提前终止(图2中C)。观察T₂代纯合突变株系ko1、ko2的穗部表型各15个单株，与常规的受体植物Zong31比较，纯合敲除突变株表现出穗长变短、行粒数降低、穗顶端退化的表型，与突变体ead1相似的表型(图3A)。

同时为了验证敲除株系的穗部表型确实是由于EAD1基因被编辑发生突变导致的，而不是由于未知的脱靶效应所造成，我们将常规的受体植物Zong31和纯合敲除突变株ko1和ko2分别与突变体ead1杂交构建F₁，进行等位验证。观察每个组合F₁各22株，验证结果如图3B，只有当EAD1基因发生纯合突变时，才表现出穗长变短、行粒数降低的穗部表型，而突变体ead1不能恢复敲除突变体的短穗表型，说明EAD1即是控制突变体中玉米穗长和行粒数降低的目的基因。

实施例3、控制玉米穗长和行粒数基因EAD1的功能验证(功能互补)

一、EAD1互补载体的构建和遗传转化实验

本发明利用转基因互补实验证明EAD1调控玉米穗长和行粒数表型的功能。以所述野生型玉米自交系材料的基因组DNA为模版，用引物对F2和R2扩增EAD1的启动子序列(序列表中序列6为EAD1的启动子序列)，将实验室已有的p3300-eGFP-nos载体用EcoR I和BamH I双酶切，然后用琼脂糖凝胶电泳检测并回收DNA产物，利用同源重组的方法将EAD1启动子序列和酶切后的线性载体进行连接，构建成中间载体p3300-Native promoter：：eGFP-nos载体。以所述野生型玉米自交系材料的根系的cDNA为模版，用引物对F3和R3扩增EAD1缺失终止子的编码区序列(序列表中序列4的第84-1554位)，将中间载体用BamH I和Nco I双酶切，利用同源重组法构建成互补载体C-construct(p3300-Native promoter：：EAD1-eGFP-nos，图2D)，即所述重组表达载体p3300-EAD1(融合了野生型EAD1的启动子和编码区序列)。采用农杆菌介导的方法转化玉米受体植物Zong31。该玉米遗传转化实验由北京博美兴奥科技有限公司完成重组p3300-EAD1载体向玉米Zong31自交系的遗传转化，具体的转化方法是常规的农杆菌介导的玉米幼胚的遗传转化方法。

F2：5’-CTATGACATGATTACGAATTCGGTCCAAGTTTGCATGTCTA-3’；

R2：5’-GCCCTTGCTCACCATGGATCCGCTGACCGGTACAAGAGCGT-3’；

F3：5’-CGCTCTTGTACCGGTCAGCATGGACGCCGCCGCGAGGG-3’；

R3：5’-TCGCCCTTGCTCACCATGGATCCAGCCTTGCTTGTCTGGTTT-3’。

二、互补转基因后代的功能验证

为了验证EAD1基因的功能，将互补转基因阳性单株与突变体ead1杂交，构建F₂分离群体，通过基因型鉴定，找出突变体背景下的含有转基因的阳性单株和突变体背景下的不含转基因的阴性单株，进行穗部表型的鉴定分析。纯合突变体的鉴定引物为F4/R4，若所得产物为175bp单带，就可以确定这一段基因组DNA来源于突变体ead1。转基因阳性鉴定引物为F5/R5，若扩增得到大小为400bp的目的条带则为转基因阳性植株，无目的产物则为转基因阴性植株。

F4：5’-GTCGTTGTCTTCGAATACACTGT-3’；

R4：5’-CCACTCGGTTGAAACACTTGT-3’；

F5：5’-CGTGAAGCTGGGAGAGACGT-3’；

R5：5’-CTTCAGGGTCAGCTTGCCGTA-3’；

本发明检测两个互补转化事件(C1，，C2)组配的两个F₂分离群体，结果发现突变体背景下(用aa表示)含有转基因的阳性单株表现为长穗、行粒数多的表型，其穗部突变性状得以恢复；而突变体背景下不含转基因的阴性单株则仍表现为突变体短穗、行粒数少的表型，其穗部突变性状不能恢复(图3)。由此得出，向ead1突变体中转入可正常表达的EAD1基因可以恢复ead1纯合突变的短穗表型。

以上证明，玉米EAD1基因是一种控制玉米穗长和行粒数重要农艺性状的功能基因。

综合以上各实施例的研究结果，可见：通过图位克隆和转基因功能验证，本发明克隆的EAD1基因是一种控制玉米穗长和行粒数重要农艺性状相关的基因，该基因编码的蛋白突变以后，会导致玉米穗长变短、行粒数显著降低。本发明为植物特别是玉米的产量性状研究提供了新的基因资源，选择具有EAD1优良等位基因型的自交系作为供体用于玉米的遗传改良，将在玉米育种领域的应用中发挥重要作用。

Claims

1.蛋白质，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与玉米穗长和行粒数相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为如下1)-6)中任一的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)序列表中序列4所示的DNA分子；

4)序列表中序列5所示的DNA分子；

6)与1)-5)中任一限定的DNA序列具有90％以上同一性，且编码控制玉米穗长和行粒数相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4或5所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在如下任一中的应用：

(a)植物育种和/或制种；

(b)调控玉米穗长和行粒数。

7.培育转基因植物的方法为如下：

本发明所提供培育转基因植物的方法，可为如下A或B：

A.培育穗长和行粒数增加的转基因植物的方法，包括如下步骤：

(a1)向受体植物中导入序列1所示蛋白的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；所述受体植物的穗长和行粒数性状是由于所述受体植物表达有功能的序列1所示蛋白的能力丧失或降低引起的；

(a2)从步骤(a1)所得转基因植物中得到穗长和行粒数性状增加的转基因植物；所述编码基因可通过以上重组表达载体导入所述受体植物；

B.培育穗长和行粒数降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：

(b1)抑制基因型受体植物中所述蛋白的表达，得到转基因植物；

(b2)从步骤(b1)所得转基因植物中得到穗长和行粒数降低的转基因植物，所得转基因植物的穗长和行粒数降低是由于所述受体植物表达所述蛋白功能丧失或降低引起的。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，所述编码基因是通过权利要求5中的所述重组表达载体导入所述受体植物的；步骤(a3)中，是通过如下实现抑制所述受体植物中所述蛋白的表达的：采用CRISPR/Cas9核酸酶对所述受体植物中所述编码基因的基因组DNA序列进行特异性剪切，使所述受体植物丧失表达有功能的所述蛋白的能力。

9.根据权利要求7或8所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

10.根据权利要求7-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物；

所述禾本科植物具体为玉米。