CN111518933B - 一种小麦粒长相关snp标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小麦粒长相关SNP标记及其应用，涉及的是小麦分子育种的技术领域，包括位于小麦7A染色体450729566bp处的SNP标记，且这一SNP标记的核苷酸为G/C，以及利用上述SNP标记判断小麦粒长的方法，包括提取小麦DNA，并利用对应的引物对进行扩增，对扩增产物酶切，根据酶切结果判断小麦粒长的类型；本发明为小麦粒长选型提供了一种新的检测手段，检测方法简便，有助于提高分子标记选择的目标性和针对性，从而提高小麦高产分子育种的效率。
Description
技术领域
本发明涉及的是小麦分子育种的技术领域，尤其涉及的是一种小麦粒长相关SNP标记及其应用。
背景技术
小麦是我国主要的粮食作物之一。随着人口的增长、耕地面积的减少，提高产量是我国小麦育种的重要目标。千粒重是构成小麦产量的三要素之一，粒长、粒宽和粒厚是决定千粒重高低的重要因子(Campbell等，1999；陈佳慧等，2011)。研究表明，千粒重与粒长和粒宽呈极显著正相关(Li等2019)。因此，鉴定粒长相关主效位点，并开发与其紧密连锁的分子标记，有助于加快高产小麦新品种的分子标记辅助选育进程。
据资料报道，小麦粒长相关QTL主要分布于1B、2A、2B、2D、3A、3B、5A、6B、7A、7B和7D等染色体(Campbell et al.1999；Tyagi et al.2015；郭利建等，2017)。部分粒长相关基因在小麦中也被克隆，如Guo et al.(2013)在小麦6D染色体上克隆了控制籽粒长宽比等粒重相关性状的谷氨酰胺合成酶基因TaGS1a,并开发了CAPS标记；Zhang et al.(2014)在小麦7D染色体上克隆了控制水稻粒长、粒重基因OsGS3的同源基因TaGS-D1；Dong et al.(2014)在小麦7A染色体中同源克隆了与千粒重和粒长相关的Snakin/GASA基因家族成员TaGASR7-A1；Ma et al.(2015)在小麦3A染色体上克隆了水稻中与细胞分化有关的OsGS5的同源基因TaGS5-3A，其与小麦粒长和粒重显著关联；Yang et al.(2019)也通过同源克隆的手段在小麦中分离了水稻GL3基因的同源基因TaGL3-5A，并开发了KASP标记，其与小麦千粒重和粒长显著相关。
然而，粒长形成的分子遗传机理仍不清楚，挖掘控制粒长的新位点和新基因，开发与其紧密连锁的分子标记，有助于加快小麦高产基因聚合育种进程。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种小麦粒长相关SNP标记及其应用，以从不同小麦材料中鉴定更多的粒长新位点；
本发明的另一个目的在于提供一种利用上述SNP标记进行小麦粒长鉴定的方法，以解决小麦粒长无法迅速鉴定的问题。
本发明提供一种与小麦粒长相关的SNP标记，所述SNP标记位于小麦7A染色体450729566bp处，且这一SNP标记的核苷酸为G/C。
本发明还提供一种鉴定小麦粒长的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1、提取待测小麦基因组DNA
步骤2、利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的序列对步骤1获得的小麦基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
步骤3、利用限制性内切酶RsaI对所述扩增产物进行酶切，获得酶切产物；
步骤4、当步骤2获得的扩增产物可被酶切时，其对应的小麦为长粒小麦，若步骤2获得的扩增产物不可被酶切时，其对应的小麦为短粒小麦。
进一步，步骤2的PCR扩增体系配置：1μL 2.5mM dNTP，0.25μL 10μM引物，1μL 10×EasyTaq Buffer，0.5U EasyTaq，100ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到10μL；
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；62℃开始每循环降落0.3℃退火30；72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸8min。
进一步，步骤3中酶切体系为：5μL PCR产物，1μL 10×CutSmart Buffer，0.5URsaI，用双蒸馏水补齐到10μL。
进一步，所述小麦品种具体为京411或红芒春21。
本发明相比于现有技术具有以下优点：
本发明针对一个控制粒长的新主效位点Qgl.ahau-7A，发现了一个与粒长相关的SNP标记，开发了CAPS标记7A-3738。相对SSR分子标记，该CAPS标记经电泳检测后条带清晰可辩，不同粒长的小麦品种间带型差异明显，检测方法简便，有助于提高分子标记选择的目标性和针对性，从而提高小麦高产分子育种的效率。
附图说明
图1为酶切产物琼脂糖电泳图，其中；J为京411类型条带；H为红芒春21类型条带，M为2K Marker的条带；
图2为京411/红芒春21群体中粒长相关的新主效位点Qgl.ahau-7A的局部连锁图谱。
具体实施方式
实施例
为了验证本发明提出的SNP标记的有效性，本实施例进行了以下验证性实验：
(一)粒长(Grain length,GL)表型测定
对品种为京411和红芒春21的小麦分别随机取300粒小麦种子，采用万深SC-G型自动考种分析仪(由杭州万深检测科技有限公司提供)于2014、2015、2016、2017和2018共5个年份的收获季节，分别测量粒长GL(mm)，三次重复，并取其平均值。数据整理由Excel软件完成，表型数据与标记间的相关性分析由SPSS软件完成。亲本京411和红芒春21在5个年份粒长测定值如表1所示。
RILs群体亲本京411和红芒春21在5个年份粒长测定值(mm)
(二)小麦基因组DNA提取
用于DNA提取的试验材料为亲本京411和红芒春21、重组自交系RIL(京411/红芒春21)群体174个家系，258份中国小麦微核心种质资源。具体方法为：
1、将小麦单籽粒磨碎，取0.1g加入0.7mLSDS提取液(0.1M Tris-HCl(PH＝8.5)，0.1M NaCl，0.05M EDTA(PH＝8.0)，2％SDS)在60℃恒温下裂解45min，其间多次震荡。
2、在4℃12000rpm条件下，离心10min。
3、取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转至两相不很快分层。
4、在4℃12000rpm条件下，离心10min。
5、取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转数次。
6、在4℃12000rpm条件下，离心10min。
7、取上清液加入等体积的异丙醇于-20℃冰箱静置30min。
8、在4℃12000rpm条件下，离心10min。
9、用70％的乙醇洗涤两次。
10、在4℃12000rpm条件下，离心10min。
11、沉淀自然风干，4℃存，备用。
(三)简化基因组酶切方案设计和测序
1、酶切方案的选择：根据小麦的基因组大小以及GC含量等信息，最终选取小麦A基因组作为参考基因组进行酶切预测。通过酶切预测软件对参考基因组进行酶切预测，选择最合适的酶切方案。
2、具体实验流程：根据选定的最适酶切方案，对检测合格的各样品基因组DNA用限制性内切酶RsaI(New England Biolabs,NEB)，进行酶切。对得到的酶切片段(SLAF标签)用Klenow Fragment(3′→5′exo–)(NEB)和dATP在37℃下进行3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增(PCR扩增引物：F，AATGATACGGCGACCACCGA；R，CAAGCAGAAGACGGCATACG)、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM2500进行测序。为评估酶切实验的准确性，选用日本晴(Oryza sativa japonica)作为对照进行测序。
3、利用Dual-index识别测序得到的原始数据，获取各个样品的reads。评估过滤完接头的测序reads的测序质量和数据量。通过Control数据的比对效率来评估酶的酶切效率，进而验证实验过程的准确性与有效性。采用reads比对基因组的方法，在亲本以及子代中开发大量的SLAF标签，并筛选出多态性的SLAF标签。对多态性的SLAF标签进行基因型编码后，按如下标准进行质控：
(1)过滤父母本测序深度10×以下reads；
(2)过滤SNP数大于5的标签；
(3)过滤完整度小于70％的标记；
(4)过滤严重偏分离(P<0.01)标记。
将通过质控的SLAF标签利用HighMap作图软件，构建高密度遗传图谱，图谱评估合格后，用于QTL分析。
(四)QTL分析
采用如下三种算法进行QTL分析：
1、QTLICIMapping v4.1软件中完备复合区间作图的加性效应算法(ICIM-ADD)，1000次随机排列检验计算LOD阈值，步移区间1cM。
2、QTLnetwork v2.0软件中的基于混合线性模型的复合区间作图法(MCIM)，设定显著性水平(P)为0.05，默认步长1cM。
3、QTL.gCIMapping.GUI v1.1软件中多位点混合模型算法(gCIM)，LOD值设为3.0，步长1cM。
(五)小麦660K SNP芯片扫描
基于重组自交系群体174份家系的粒长表型值构建高、低混池，并利用小麦660KSNP芯片(北京博奥晶典公司)对高、低混池进行扫描。高、低混池分别包含1个长粒亲本和2个长粒混池(每个长粒混池选取5个极端长粒家系混合)以及1个短粒亲本和2个短粒混池(每个短粒混池选取5个极端短粒家系混合)。利用Excel将660K芯片中在池内一致、池间存在基因型差异的SNP进行筛选和提取，接着针对7A染色体主效QTL区段进行差异SNP的富集分析，挑选出位于Qgl.aau-7A目标区段内的差异SNP，用于进一步开发CAPS标记。
(六)QTL区段内CAPS标记7A-3738开发
1、差异SNP酶切位点分析
对目标区段内所有SNP进行酶切位点分析，发现AX-108743738(7A染色体450729566bp处)这一SNP的G/C差异可以通过限制性核酸内切酶RsaI(New EnglandBiolabs,NEB)区分。RsaI的识别位点为：GT^AC。
2、引物设计
用AX-108743738前后各35bp侧翼序列在小麦参考基因组上(IWGSC RefSeq v2.0，网址https://urgi.versailles.inra.fr/blast_iwgsc/blast.php)BLAST并前后各延伸300bp，得到一段总长671bp的序列SEQ ID NO.1。
然后以SEQ1为模板，利用Primer Premier 5.0软件设计一对特异性引物：
7A-3738-F:5'CTGCGATTTGGCGTCTT 3' SEQ ID NO.2
7A-3738-R:5'CATTCTGCTGCCCTGTG 3' SEQ ID NO.3
(七)目标产物的扩增、酶切和电泳
1、PCR扩增体系配置：1μL 2.5mM dNTP，0.25μL 10μM引物，1μL 10×EasyTaqBuffer，0.5U EasyTaq，100ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到10μL。
2、PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；62℃开始每循环降落0.3℃退火30；72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸8min。
3、扩增后酶切体系：5μL PCR产物，1μL 10×CutSmart Buffer，0.5U RsaI，用双蒸馏水补齐到10μL。
4、酶切反应程序：37℃6小时。
酶切后，在样品中加入3μL 6×DNA Loading Buffer，取5μL酶切后产物用2.5％的琼脂糖凝胶电泳分型。京411(长粒，G等位类型)条带可被酶切，红芒春21(短粒，C等位类型)条带不能被切开(如图1所示)。
(八)CAPS标记在重组自交系群体中的连锁分析
如表2和图2所示，将CAPS标记7A-3738加密到SLAF-seq构建的高密度遗传图谱上，采用ICIM、gCIM和MCIM三种算法进行粒长QTL分析，均发现7A-3738与7A染色体粒长相关主效QTL Qgl.ahau-7A紧密连锁，平均表型贡献率11.93％。
在京411/红芒春21群体中检测的粒长相关的新主效位点Qgl.ahau-7A信息
表2
注：ICIM和gCIM两种算法的QTL存在可能性用LOD值表示，MCIM算法的QTL显著性用P值表示。
(九)CAPS标记在自然群体中的验证
曼尼-惠特尼检验(U检验)分析表明，在258份小麦微核心种质组成的自然群体中，携带CAPS标记7A-3738的两种等位变异类型(7A-3738a和7A-3738b)的小麦品种间，其粒长GL表型值(2016GL和2017GL)之间的差异均达到极显著水平(表3)
利用258份小麦微核心种质验证CAPS标记7A-3738与粒长极显著相关
表3
注：**表示标记与性状之间在0.01水平上极显著相关；7A-3738a为与京411一致的等位类型；7A-3738b为与红芒春21一致的等位类型。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 一种小麦粒长相关CAPS标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 671
<212> DNA
<213> 小麦(Triticum aestivum L)
<400> 1
acttacaagt caaagcaagg aatcaagcag accaaaaccc tttttctgtt tcctaatccc 60
gacccgctaa accagccagt tgttgccata tgttagttta gctgtgctaa tcaaggagag 120
ctctggacaa gaacccaaga gccggctggc gagtgtggat tggcttggtg ccttctgggg 180
atgctgccgt ctggtggtgc tgaggatgag taaactacac attttgagct gcgatttggc 240
gtcttggtgc tggtgcgccg tcggtttacg atgctacaac gtctacatgt ataataataa 300
caacaacaat gttttggatg cagtgcatgt atgtagacat gtgagctgcc gtccatgatg 360
agctgaatgc cgttcctagg tggccgcttg gatggttctt gaatttggca tcaggtgcct 420
ggagtacctt tgcttgtctc tccggcacag caaagttgtg cttgctgtgt gctgtagcct 480
gcctgtacaa gtgcacagag ctgttgctga tgagtgatga cacagggcag cagaatgcaa 540
cggttcacat ggggtttact gctgggttcc acacgaattg caggagttgt gcgtttcgca 600
actgcggaga cggtcacgag ggtgatttaa ctgaaaaacc attcgattct cgtacttggc 660
agatccgaaa a 671
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 2
ctgcgatttg gcgtctt 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 3
cattctgctg ccctgtg 17
Claims (5)
1.一种与小麦粒长相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记位于参考基因组IWGSCRefSeq v2.0版本的小麦7A染色体450729566bp处，且这一SNP标记的核苷酸为G/C。
2.一种鉴定小麦粒长的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤1、提取待测小麦基因组DNA
步骤2、设计跨权利要求1所述SNP标记的PCR引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的序列对步骤1获得的小麦基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
步骤3、利用限制性内切酶RsaI对所述扩增产物进行酶切，获得酶切产物；
步骤4、当步骤2获得的扩增产物可被酶切时，其对应的小麦为长粒小麦，若步骤2获得的扩增产物不可被酶切时，其对应的小麦为短粒小麦。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2的PCR扩增体系配置：1μL 2.5mMdNTP，0.25μL 10μM引物，1μL 10×EasyTaq Buffer，0.5U EasyTaq，100ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到10μL；
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；62℃开始每循环降落0.3℃退火30；72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸8min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3中酶切体系为：5μL PCR产物，1μL10×CutSmart Buffer，0.5U RsaI，用双蒸馏水补齐到10μL。
5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，所述小麦品种具体为京411或红芒春21。
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-
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