CN111485031A - 水稻分子标记dof8及其应用、一种利用水稻分子标记dof8鉴别粳稻和籼稻的方法 - Google Patents

水稻分子标记dof8及其应用、一种利用水稻分子标记dof8鉴别粳稻和籼稻的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种水稻分子标记DOF8及其应用、一种利用水稻分子标记DOF8鉴别粳稻和籼稻的方法，涉及水稻品种鉴别技术领域。本发明所述分子标记DOF8中包括位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基的多态性为A/G的核苷酸序列。本发明提供的水稻分子标记DOF8特异性高，能方便准确的地将水稻栽培品种进行籼稻和粳稻的种质资源区分。本发明还提供利用上述水稻分子标记DOF8鉴别粳稻和籼稻的方法，只需要进行PCR以及酶切，即可实现粳稻和籼稻的快速鉴别。本发明所述鉴别方法的成本低、通量高、加上特异性高(即准确度高)，适用于生产实践中。同理，所述分子标记DOF8还可用于鉴别普通野生稻和尼瓦拉野生稻。

Description

水稻分子标记DOF8及其应用、一种利用水稻分子标记DOF8鉴 别粳稻和籼稻的方法
技术领域
本发明涉及水稻品种鉴别技术领域，尤其涉及水稻分子标记DOF8及其应用、一种利用水稻分子标记DOF8鉴别粳稻和籼稻的方法。
背景技术
水稻种植品种主要为亚洲栽培稻，又根据一系列表型差异分为籼稻(Oryzasaliva subsp Indica)和粳稻(Oryza saliva subsp Japanica)，我国根据不同地域种植条件和生产需求，发展培育了上千种籼稻和粳稻品种。要保证高产稳产，水稻品种的种子纯度是最关键的因素之一。传统上鉴定水稻品种纯度，在幼苗期、抽穗期、腊熟期等不同生育期进行。鉴定的性状主要有三个方面，即植株性状、穗部性状与谷粒性状，但在实际生产应用上受鉴定者的经验影响极大。而且随着现代育种发展，部分品种的表型性状与经典的籼稻粳稻差异较大，例如部分粳稻的谷粒不是阔而短，较厚，呈椭圆形或卵圆形而是偏向于谷粒狭长等。因此，在生产实践中，有必要寻找快速精确鉴定籼稻、粳稻差异的方法。针对水稻遗传信息DNA序列在籼稻和粳稻间的遗传差异进行分子标记鉴定是高效准确的方法。
SNP(single nucleotide polymorphism)标记以及根据SNP标记发展出的CAPS标记(cleaved amplified polymorphic sequence)技术能够获得其它分子标记技术不能显示的更加丰富的多态性(Rafalski A.Applications of single nucleotidepolymorphisms in cropgenetics.Curr Opin Plant Biol，2002，5(2)94～100)。
发明内容
本发明为了克服现有区分粳稻、籼稻的方法不够快速和精确的缺陷，提供了一种用于鉴别粳稻和籼稻的水稻分子标记DOF8，这一分子标记在籼稻和粳稻中存在多态性差异，通过检测分子标记DOF8可快速鉴别水稻的粳性和籼性。
本发明还提供了一种鉴别粳稻和籼稻的方法，在利用上述水稻分子标记DOF8的基础上，进一步利用限制性内切酶进行酶切，无需对PCR扩增的目的产物进行测序即可判断结果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于鉴别粳稻和籼稻的水稻分子标记DOF8，所述分子标记DOF8中包括位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基的多态性为A/G的核苷酸序列。
优选的，粳稻的分子标记DOF8中包括位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基为A的核苷酸序列。
优选的，所述粳稻的分子标记DOF8的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，籼稻的分子标记DOF8中包括位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基为G的核苷酸序列。
优选的，所述籼稻的分子标记DOF8的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述技术方案所述分子标记DOF8在鉴别粳稻和籼稻中的应用。
本发明还提供了一种鉴别粳稻和籼稻的方法，包括以下步骤：
1)提取待测水稻的基因组DNA；
2)设计前述技术方案所述分子标记DOF8的PCR引物对；
3)利用步骤2)所述引物对扩增步骤1)所述基因组DNA，得到目的序列；
4)采用能够区分位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基的多态性位点A/G、并且在所述分子标记DOF8中有且只有一个酶切位点的限制性内切酶对步骤3)得到的目的产物酶切，若酶切产物中存在两个片段，则判断待测水稻为粳稻；若酶切产物中仅存在一个片段，则判断待测水稻为籼稻。
优选的，步骤2)设计得到的引物对中，上游序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，步骤4)所述的限制性内切酶为Bfa I。
本发明还提供了前述技术方案所述分子标记DOF8在鉴别普通野生稻和尼瓦拉野生稻中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一种用于鉴别粳稻和籼稻的水稻分子标记DOF8，所述分子标记DOF8中包括位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基的多态性为A/G的核苷酸序列。本发明提供的水稻分子标记DOF8特异性高，能方便准确的地将水稻栽培品种进行籼稻和粳稻的种质资源区分。
(2)本发明还提供利用上述水稻分子标记DOF8鉴别粳稻和籼稻的方法，只需要进行PCR以及酶切，即可实现粳稻和籼稻的快速鉴别。本发明所述鉴别方法的成本低、通量高、加上特异性高(即准确度高)，适用于生产实践中。
(3)本发明还提供了所述分子标记DOF8在鉴别普通野生稻和尼瓦拉野生稻中的应用。本发明研究表明，普通野生稻中的分子标记DOF8序列与粳稻相同，而尼瓦拉野生稻中的分子标记DOF8序列与籼稻相同，因而本发明所述分子标记DOF8还可以用于区分普通野生稻和尼瓦拉野生稻。
附图说明
图1为实施例1中利用所述DOF8分子标记鉴定水稻籼稻和粳稻品种的DOF8分子标记电泳图和酶切产物电泳图；其中，上图为各水稻品种的PCR目的产物电泳图，下图为各水稻品种的目的产物酶切产物的电泳图；
其中，由左到右的泳道依次为籼稻品种1～7、普通野生稻、尼瓦拉野生稻以及粳稻品种1～7；
籼稻品种1～7依次为93-11、矮脚南特、广陆矮4号、珍汕97、明恢63、黄丝占和黄华占；
粳稻品种1～7依次为日本晴、台中65、中花11、农垦58、云粳23号、鄂晚3号和晋稻1号。
具体实施方式
本发明提供了一种用于鉴别粳稻和籼稻的水稻分子标记DOF8，所述分子标记DOF8中包括位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基的多态性为A/G的核苷酸序列。
在本发明中，粳稻的分子标记DOF8中优选的包括位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基为A的核苷酸序列；更优选的，所述粳稻的分子标记DOF8的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：
gctactggac ggagggcggc tcgctccgca acgtccccgt cggcggcggc tcacggaaga
acaagcgctc gtcgtcctcg gtggtgccgt cggcggccgc gtcggcctcc acctccgcgg
cggtgtccgg ctcggtcccc gtggggctgg cggccaagaa cccgaagctg atgcacgagg
gagcgcagga cctcaaccta gcgttcccgc accaccacgg ccgcgccctg cagccgccgg
agttcacggc gttcccgagc ttggagagca gcagcgtgtg caaccccgga ggcaacctgg
cggcggcgaa cggcgccggt ggcaggggca gcgtgggcgc gttctcggcg atggagttgc
tgaggagcac cggctgctac gttccgctgc cgcagatggc。
在本发明中，籼稻的分子标记DOF8中优选的包括位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基为G的核苷酸序列；更优选的，所述籼稻的分子标记DOF8的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；
gctactggac ggagggcggc tcgctccgca acgtccccgt cggcggcggc tcacggaaga
acaagcgctc gtcgtcctcg gtggtgccgt cggcggccgc gtcggcctcc acctccgcgg
cggtgtccgg ctcggtcccc gtggggctgg cggccaagaa cccgaagctg atgcacgagg
gagcgcagga cctcaacctg gcgttcccgc accaccacgg ccgcgccctg cagccgccgg
agttcacggc gttcccgagc ttggagagca gcagcgtgtg caaccccgga ggcaacctgg
cggcggcgaa cggcgccggt ggcaggggca gcgtgggcgc gttctcggcg atggagttgc
tgaggagcac cggctgctac gttccgctgc cgcagatggc。
本发明研究表明，籼稻与粳稻在所述分子标记DOF8序列中仅有一个多态性位点差异，即位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基存在多态性A/G，利用本发明所述分子标记DOF8对籼稻和粳稻进行鉴别的特异性高，鉴别结果更为精确。
本发明还提供了一种上述技术方案所述分子标记DOF8在鉴别粳稻和籼稻中的应用，仅需要利用PCR扩增该分子标记DOF8，进而鉴定分子标记DOF8中的多态性位点碱基，即可确定待测水稻为粳稻还是籼稻。
本发明还提供了一种鉴别粳稻和籼稻的方法，包括以下步骤：
1)提取待测水稻的基因组DNA；
2)设计权利要求1～5任意一项所述分子标记DOF8的PCR引物对；
3)利用步骤2)所述引物对扩增步骤1)所述基因组DNA，得到目的序列；
4)采用能够区分位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基的多态性位点A/G、并且在所述分子标记DOF8中有且只有一个酶切位点的限制性内切酶对步骤3)得到的目的产物酶切，若酶切产物中存在两个片段，则判断待测水稻为粳稻；若酶切产物中仅存在一个片段，则判断待测水稻为籼稻。
本发明提取待测水稻的基因组DNA，以便后续的PCR扩增。本发明对如何提取水稻基因组DNA无特殊限定，采用本领域已知方法或试剂盒均可，比如CTAB法或氯化离心法。
本发明根据前述技术方案所述的分子标记DOF8序列设计PCR引物对，用于扩增基因组DNA中的分子标记DOF8。本发明优选的，所述分子标记DOF8的引物对中，上游序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游序列的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示：
SEQ ID NO.3：5’-GCTACTGGACGGAGGGCG-3’；
SEQ ID NO.4：5’-GCCATCTGCGGCAGCGGAAC-3’。
得到基因组DNA和分子标记DOF8的引物对后，本发明利用该引物对PCR扩增所述待测水稻的基因组DNA，得到目的序列。优选的，利用由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成的引物对能够扩增得到如SEQ ID NO.1(粳稻)或SEQ ID NO.2(籼稻)的目的产物。
在本发明中，所述PCR扩增的反应体系每100μL优选的包括：10mmol/L的dNTP混合物0.2μL，0.1μmol/L的引物对上下游引物各1μL，高保真PCR聚合酶5U(1μL)，基因组DNA0.2μg(根据提取浓度不同，加入的DNA的质量基本相同，反应体系的总体积可以最后根据所需调整加入水的量)，10倍的反应缓冲液10μL以及余量的无离子水。
在本发明中，所述PCR反应的反应条件优选为：95℃预变性2min后，然后按照95℃15s、52℃ 20s、72℃ 30s的设置进行30个循环；循环结束后，在72℃下延伸5min。
得到目的产物后，本发明采用能够区分位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基的多态性位点A/G、并且在所述分子标记DOF8中有且只有一个酶切位点的限制性内切酶对得到的目的产物酶切，若酶切产物中存在两个片段，则判断待测水稻为粳稻；若酶切产物中仅存在一个片段，则判断待测水稻为籼稻。
在本发明中，所述能够区分位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基的多态性位点A/G、并且在所述分子标记DOF8中有且只有一个酶切位点的限制性内切酶优选为BfaI，其酶切识别位点为：CTAG。该限制性内切酶可以识别并酶切粳稻的DOF8分子标记，酶切为两个条带；而籼稻在分子标记DOF8的多态性位点上碱基为“G”，即“CTGG”，无法被限制性内切酶Bfa I酶切，形成一个条带。因此，本发明提供的粳稻和籼稻鉴别方法可以通过条带数量来区分籼稻和粳稻，结果简单易得，特异性高。
本发明优选的，所述通过对酶切产物进行电泳来确定酶切产物中的片段数量。
本发明还提供了前述技术方案所述分子标记DOF8在鉴别普通野生稻(Oryzarufipogon Griff.)和尼瓦拉野生稻(O.nivara Sharma et Shastry)中的应用。本发明研究表明，普通野生稻与粳稻的分子标记DOF8序列一致，而尼瓦拉野生稻与籼稻的分子标记DOF8序列一致，因而粳稻与籼稻在DOF8分子标记上的的差异同样也体现在普通野生稻和尼瓦拉野生稻之间，当本领域技术人员需要确定水稻是普通野生稻还是尼瓦拉野生稻时，采用本发明所述分子标记DOF8即可有效鉴别。具体的鉴别方式如上述粳稻和籼稻的鉴别方法，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、材料和方法
1.1实验材料
作为本发明的鉴定水稻籼稻和粳稻品种的分子标记方法的实验材料包括普通野生稻和尼瓦拉野生稻(Nivara野生稻)；籼稻品种1～7分别为93-11、矮脚南特、广陆矮4号、珍汕97、明恢63、黄丝占和黄华占；粳稻品种1～7分别为日本晴、台中65、中花11、农垦58、云粳23号、鄂晚3号和晋稻1号。
1.2实验方法
步骤1)
(1)取水稻叶片约0.5g，把叶片剪碎，放入预冷的研钵中，加入液氮，将叶片研磨成粉末后，放入2mL离心管中，加入800μL 2×CTAB抽提缓冲液，混匀，65℃水浴30min；
(2)加入等体积的氯仿，异戊醇和无水乙醇(76：4：20)，振荡10min，充分混匀；
(3)在12000转/分的条件下离心12min，将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入其0.6倍体积异丙醇或两倍体积无水乙醇，混匀，12000转/分离心2min，去上清，用0.5ml70％的乙醇漂洗两次，风干，溶于100-200μL0.5×TE缓冲液中；
(4)取1μL用于后续的PCR扩增反应。
步骤2)
PCR扩增反应中
a、反应液的反应体积以100μL为参考，所用物品的组成及含量为：10mmol/L的dNTP混合物0.2μL，0.1μmol/L的PCR引物(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)2μL，高保真PCR聚合酶5U(1μL)，基因组DNA 0.2μg，10倍的反应缓冲液10μL，无离子水加到100μL；
b、PCR扩增反应在DNA扩增仪上进行，反应条件为95℃预变性2min后，然后按照95℃ 15sec、52℃ 20sec、72℃ 30sec的设置进行30个循环；循环结束后，在72℃下延伸5min，随后于4℃保存备用；
步骤3)
对PCR扩增产物经过Bfa I酶切，酶切后的PCR扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5V/cm)，溴化乙锭(EtBr)染色，用凝胶成像***观察并拍照记录。
2结果与分析
2.1 DOF8的序列测定
引物(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)对16个不同水稻材料基因组DNA进行PCR扩增，均能扩增出非常清晰的单一条带，并且8个条带大小相同，经3次重复，结果稳定一致(见图1)。经过正反序列测定，16个PCR产物长度均为400bp；并且，PCR扩增所用的引物全部在两端被正确测出。其中，粳稻品种和普通野生稻序列见序列表SEQ ID NO.1，籼稻和Nivara野生稻序列见序列表SEQ ID NO.2。
2.2 DOF8序列的SNP标记和特性分析
对测定的16条序列进行Blastn分析，结果表明本研究克隆的DNA片段为DOF8。通过对克隆的DNA序列进行ClustalW分析发现，粳稻品种和普通野生稻序列克隆的序列全部相同，籼稻和Nivara野生稻序列；而籼稻和粳稻序列相比，存在一个G←→A的SNP位点差异。粳稻在该位点徬邻序列具有限制性内切酶Bfa I酶切识别位点：CTAG。TCGA而籼稻在该酶切识别位点的SNP突变CTGG造成无法被限制性内切酶Bfa I酶切识别。因此在Bfa I酶切识别以上PCR片段后，粳稻片段被酶切为200bp大小的DNA片段，而籼稻仍保持400bp大小的DNA片段(图1)。
由以上实施例可知，本发明提供的水稻分子标记DOF8在粳稻/籼稻、普通野生稻/尼瓦拉野生稻之间，存在位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基的多态性为A/G的核苷酸序列差异，可以通过该多态性对粳稻和籼稻、葡萄野生稻和尼瓦拉野生稻进行区分，特异性高，方法简单易行。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 水稻分子标记DOF8及其应用、一种利用水稻分子标记DOF8鉴别粳稻和籼稻的方法
<141> 2019-01-24
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 400
<212> DNA
<213> Oryza sativa subsp. geng
<400> 1
gctactggac ggagggcggc tcgctccgca acgtccccgt cggcggcggc tcacggaaga 60
acaagcgctc gtcgtcctcg gtggtgccgt cggcggccgc gtcggcctcc acctccgcgg 120
cggtgtccgg ctcggtcccc gtggggctgg cggccaagaa cccgaagctg atgcacgagg 180
gagcgcagga cctcaaccta gcgttcccgc accaccacgg ccgcgccctg cagccgccgg 240
agttcacggc gttcccgagc ttggagagca gcagcgtgtg caaccccgga ggcaacctgg 300
cggcggcgaa cggcgccggt ggcaggggca gcgtgggcgc gttctcggcg atggagttgc 360
tgaggagcac cggctgctac gttccgctgc cgcagatggc 400
<210> 2
<211> 400
<212> DNA
<213> Oryza sativa subsp. xian
<400> 2
gctactggac ggagggcggc tcgctccgca acgtccccgt cggcggcggc tcacggaaga 60
acaagcgctc gtcgtcctcg gtggtgccgt cggcggccgc gtcggcctcc acctccgcgg 120
cggtgtccgg ctcggtcccc gtggggctgg cggccaagaa cccgaagctg atgcacgagg 180
gagcgcagga cctcaacctg gcgttcccgc accaccacgg ccgcgccctg cagccgccgg 240
agttcacggc gttcccgagc ttggagagca gcagcgtgtg caaccccgga ggcaacctgg 300
cggcggcgaa cggcgccggt ggcaggggca gcgtgggcgc gttctcggcg atggagttgc 360
tgaggagcac cggctgctac gttccgctgc cgcagatggc 400
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctactggac ggagggcg 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccatctgcg gcagcggaac 20

Claims (10)

1.一种用于鉴别粳稻和籼稻的水稻分子标记DOF8，其特征在于，所述分子标记DOF8中包括位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基的多态性为A/G的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的分子标记DOF8，其特征在于，粳稻的分子标记DOF8中包括位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基为A的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的分子标记DOF8，其特征在于，所述粳稻的分子标记DOF8的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的水稻分子标记DOF8，其特征在于，籼稻的分子标记DOF8中包括位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基为G的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的水稻分子标记DOF8，其特征在于，所述籼稻的分子标记DOF8的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.权利要求1～5任意一项所述分子标记DOF8在鉴别粳稻和籼稻中的应用。
7.一种鉴别粳稻和籼稻的方法，包括以下步骤：
1)提取待测水稻的基因组DNA；
2)设计权利要求1～5任意一项所述分子标记DOF8的PCR引物对；
3)利用步骤2)所述引物对扩增步骤1)所述基因组DNA，得到目的序列；
4)采用能够区分位于水稻基因组2号染色体、第2743687位碱基的多态性位点A/G、并且在所述分子标记DOF8中有且只有一个酶切位点的限制性内切酶对步骤3)得到的目的产物酶切，若酶切产物中存在两个片段，则判断待测水稻为粳稻；若酶切产物中仅存在一个片段，则判断待测水稻为籼稻。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)设计得到的引物对中，上游序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的限制性内切酶为Bfa I。
10.权利要求1～5任意一项所述分子标记DOF8在鉴别普通野生稻和尼瓦拉野生稻中的应用。
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