CN108676796B - 一种水稻粒型基因OsSNB的分子标记用于大粒水稻的辅助选择育种 - Google Patents

一种水稻粒型基因OsSNB的分子标记用于大粒水稻的辅助选择育种 Download PDF

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Abstract

本发明涉及水稻粒型基因OsSNB的分子标记及其应用，应用分子标记OsSNB_indel辅助选育大粒水稻的方法是以水稻基因组DNA为模板，OsSNB_indel为引物进行PCR扩增，通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果有441bp的单条带，则表示该检测样品含有大粒品种IRAT109的等位基因型；如果有215bp的单条带，则表示该检测样品基因型为日本晴等位基因；如果有215bp和441bp两条带，则表示该检测样品为OsSNB杂合基因型。该标记通过序列差异设计不存在遗传交换，准确性高；直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，更为简便；为共显性标记，可以检测纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高效率。

Description

一种水稻粒型基因OsSNB的分子标记用于大粒水稻的辅助选 择育种
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及一个水稻粒型基因OsSNB的分子标记及其应用的分子标记及其用于大粒水稻的辅助选择育种。
背景技术
水稻作为最重要的粮食作物，全世界超过一半以上的人口以水稻为主食，水稻产量构成因素包括单位面积上的穗数、每穗粒数(每穗颖花数)、结实率和粒重四个基本因素构成，而粒重的主要由粒长、粒宽、粒厚等因素决定。因此，选育和种植大粒水稻品种提高水稻粒重是提高水稻产量的重要途径之一。所以挖掘、利用大粒基因改良水稻粒型是提高水稻产量的重要途径。
水稻粒型是典型的数量性状，受多基因控。分子标记辅助选择是一种利用与粒型基因紧密连锁标记或者基因内功能标记，在后代中结合基因型和表型鉴定对目标性状进行选择的现代育种技术。该方法不仅可大大缩短育种年限，提高育种效率，而且还节约了大量的人力、物力成本。OsSNB大粒等位基因型来源于少数粳稻品种，位于水稻第7号染色体，目前生产上大面积使用的品种均为小粒品种日本晴等位基因型，因此在改良水稻粒型，提高水稻产量方面有很大的应用价值，开发OsSNB基因的功能性标记对充分利用该基因，进一步改良水稻粒型、提高水稻产量有着重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供水稻粒型基因OsSNB的分子标记、及其其的正反引物与应用。
为了解决上述技术问题提出的技术方案是提供水稻粒型基因OsSNB的分子标记用于大粒水稻的辅助选择育种，所述分子标记编号为OsSNB_indel，其特征在于，所述分子标记OsSNB_indel的正反向引物序列为：
OsSNB_indel F：5’-TAATACACCCTACATACACAAAACCA-3’；
OsSNB_indel R：5’-GTGAGGGAGACGAAGGGTAT-3’。
进一步的方案是，所述分子标记OsSNB_indel用于水稻粒型基因OsSNB单倍型的鉴定。
进一步的方案是，所述用于水稻粒型基因OsSNB的分子标记辅助选择育种包括以下实验步骤：
i、提取供试水稻样品基因组；
ii、利用所述分子标记OsSNB_indel的正反引物组合对步骤i中所提取基因组进行PCR扩增，获得扩增产物；
iii、通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测所述扩增产物，当有215bp的单条带，则表示所述样品为日本晴等位基因型；当有441bp的单条带，则表示所述样品含有大粒品种IRAT109等位基因型；当有215bp和441bp两条带，则表示所述样品为OsSNB基因杂合。
进一步的方案是，在相应的基因组位置上下游300bp内合成成对引物，所扩增出序列片段包含所述水稻粒型基因OsSNB的分子标记。
本发明的有益效果是：
本发明通过利用核苷酸序列差异设计OsSNB基因的功能分子标记，不存在遗传交换，准确性高；由于扩增片段差异较大可直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，更为简便；为共显性标记，可以检测纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高效率。
附图说明
图1是本发明中分子OsSNB_indel标记对8个水稻品种的电泳检测图。注：其中1-8分别表示水稻品种日本晴(粒长＝7.29mm，粒宽＝3.36mm)、珍汕97B(粒长＝7.82mm，粒宽＝3.36mm)、IRAT109(粒长＝8.49mm，粒宽＝3.73mm)、CICA4(粒长＝8.09mm，粒宽＝4.11mm)、云陆8号(粒长＝9.85mm，粒宽＝4.11mm)、毫补卡(粒长＝10.09mm，粒宽＝4.45mm)、晚旱稻(粒长＝7.87mm，粒宽＝4.12mm)、磨王谷(粒长＝9.13mm，粒宽＝4.06mm)；M表示D2000Marker。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的一个水稻粒型基因OsSNB的分子标记及其应用作进一步说明。
实施例1：水稻粒型基因OsSNB基因分子标记的开发
(1)、供试材料：大粒品种：IRAT109；小粒水稻品种：日本晴。
(2)、水稻基因组DNA提取方法:参考楼巧君(2006)中所述方法。在研钵中，取20mg叶片，加入400μl 1.5×CTAB(1.5％CTAB，75mmol/L Tris-HCl，15mmol/L EDTA，1.05mol/LNaCl，pH＝8.0)研磨成匀浆，然后再加入400μl 1.5×CTAB，吸取研磨液至1.5ml离心管中，加入550μl氯仿：异戊醇(24:1)，混匀，12000r/min离心6min，取上清至另一离心管，加入预冷的等体积异丙醇，12000r/min离心8min，取上清，干燥沉淀物，最后加入400μl ddH2O溶解即可。(楼巧君,陈亮,罗利军.三种水稻基因组DNA快速提取方法的比较[J].分子植物育种,2006,3(5):749-752)
(3)、基因分子标记OsSNB_indel的开发：OsSNB位于水稻第7染色体，在日本晴参考基因组收录号为AP014963.1，大粒品种IRAT109的基因序列在OsSNB的起始密码子上游-357位点前***了231bp。
表1：日本晴与IRAT109的碱基比较
Figure GDA0003145175010000041
Figure GDA0003145175010000051
(4)、根据核苷酸序列差异，利用Primer Premier 5.0软件设计引物OsSNB_indel，其正反引物序列为：
OsSNB_indel F：5’-TAATACACCCTACATACACAAAACCA-3’
OsSNB_indel R：5’-GTGAGGGAGACGAAGGGTAT-3’。
实施例2：OsSNB_indel基因分子标记的亲本多态性检测
(1)、提取供试水稻品种基因组，提取方法为常规CTAB法。供试水稻品种分别为：日本晴、珍汕97B、IRAT109、CICA4、云陆8号、毫补卡、晚旱稻、磨王谷。
(2)、利用功能标记OsSNB_indel对供试水稻品种进行PCR扩增，PCR扩增体系为：20ng水稻基因组DNA模板，10uL Taq PCR Mastermix(天根生化科技(北京)有限公司)，10uM的前后引物各1uL，补充dd H2O至20uL。PCR反应程序为：95℃预变性5min，然后按95℃30s，54℃下30s，72℃下1min进行32个循环，最后72℃下延伸5min。
(3)、取PCR产物8uL上样于1％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，小粒水稻品种日本晴和珍汕97B扩增出215bp的单条带，在其他大粒水稻品种中均扩增出441bp的单条带，电泳条带清晰，差异明显。
实施例3：OsSNB基因分子标记的验证与应用
利用OsSNB基因分子标记OsSNB_indel对水稻保持系珍汕97B与大粒品种IRAT109的杂种F1代单株基因组DNA进行PCR扩增，产物在1％的琼脂糖凝胶进行电泳分型，在杂种F1单株中检测到有215bp和441bp两条带，表示这些检测样品为OsSNB基因杂合，且粒型显著大于珍汕97B的粒型。
利用OsSNB基因分子标记OsSNB_indel对188个IRAT109和珍汕97B的F10代重组自交系单株的基因组DNA进行PCR扩增，产物在1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，分别有117个株系含有珍汕97B的等位基因型、71个株系含有与IRAT109一致的等位基因型，粒型鉴定结果表明，含有珍汕97B的等位基因型的株系粒型极显著小于含有IRAT109等位基因型株系的粒型。
利用OsSNB基因分子标记OsSNB_indel对226份水稻种质资源，其中籼稻128份，粳稻98份的基因组DNA进行PCR扩增，产物在1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，发现在204份种质资源中为215bp带型，22份粳型种质资源为441bp带型，含有441bp的种质资源粒宽极显著大于含有215bp的种质资源(P<10-6)且粒长无统计学差异，同时国内的主栽品种亲本(明恢63，珍汕97B，包协7B，9311，旱恢3号、沪旱7B，C418，中413等)均为215bp带型。
因此表明可以利用该标记进行水稻粒型基因OsSNB的鉴定和/或大粒水稻的辅助选择育种。
本发明的不局限于上述实施例，本发明的上述各个实施例的技术方案彼此可以交叉组合形成新的技术方案，另外凡采用等同替换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。
序列表
<120> 水稻粒型基因OsSNB的分子标记及其应用
<140> 201810042202.0
<141> 2018-01-17
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> SNB在IRAT109中的序列
<212> RNA
<213> Rice Genes
<400> 1
<210> 2
<211> SNB在日本晴中的序列
<212> RNA
<213> Rice Genes
<400> 2

Claims (4)

1.一种水稻粒型基因OsSNB的分子标记用于大粒水稻的辅助选择育种，所述分子标记编号为OsSNB_indel，其特征在于，所述分子标记OsSNB_indel的正反向引物序列为：
OsSNB_indel F：5’-TAATACACCCTACATACACAAAACCA-3’；
OsSNB_indel R：5’-GTGAGGGAGACGAAGGGTAT-3’。
2.根据权利要求1所述水稻粒型基因OsSNB的分子标记用于大粒水稻的辅助选择育种，其特征在于：所述分子标记OsSNB_indel用于水稻粒型基因OsSNB单倍型的鉴定。
3.根据权利要求2所述水稻粒型基因OsSNB的分子标记用于大粒水稻的辅助选择育种，其特征在于，所述用于水稻粒型基因OsSNB的分子标记辅助选择育种包括以下实验步骤：
i、提取供试水稻样品基因组；
ii、利用所述分子标记OsSNB_indel的正反引物组合对步骤i中所提取基因组进行PCR扩增，获得扩增产物；
iii、通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测所述扩增产物，当有215bp的单条带，则表示所述样品为日本晴等位基因型；当有441bp的单条带，则表示所述样品含有大粒品种IRAT109等位基因型；当有215bp和441bp两条带，则表示所述样品为OsSNB基因杂合。
4.根据权利要求1所述水稻粒型基因OsSNB的分子标记用于大粒水稻的辅助选择育种，其特征在于：在相应的基因组位置上下游300bp内合成成对引物，所扩增出序列片段包含所述水稻粒型基因OsSNB的分子标记。
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