CN107630103B - 一种鉴定水稻品种的caps分子标记方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定水稻籼稻和粳稻品种的CAPS分子标记方法及应用。所述方法包括如下步骤：S1.提取水稻样本基因组DNA；S2.以权利要求3所述引物对步骤S1基因组DNA进行PCR扩增；S3.将步骤S2的PCR产物经Hha I酶切后电泳，得到CAPS标记；S4.电泳结果判断：若得到440bp的电泳条带则该水稻样本为籼稻，若得到220bp的电泳条带，则该水稻品种为粳稻。本发明的CAPS分子标记方法特异性高，能方便准确的地将水稻栽培品种进行籼稻和粳稻的种质资源区分。同时，本发明提供的分子标记在实际应用中，只需PCR结合酶切，且成本低、通量高、特异性高，非常适用于生产实践。

Description

一种鉴定水稻品种的CAPS分子标记方法及应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域。更具体地，涉及一种鉴定水稻品种的CAPS分子标记方法及应用。

背景技术

水稻种植品种主要为亚洲栽培稻，又根据一系列表型差异分为籼稻（OryzasalivasubspIndica）和粳稻（OryzasalivasubspJapanica），我国根据不同地域种植条件和生产需求，发展培育了上千种籼稻和粳稻品种。要保证高产稳产，水稻品种的种子纯度是最关键的因素之一。传统上鉴定水稻品种纯度，在幼苗期、抽穗期、腊熟期等不同生育期进行。鉴定的性状主要有三个方面，即植株性状、穗部性状与谷粒性状，但在实际生产应用上受鉴定者的经验影响极大。而且随着现代育种发展，部分品种的表型性状与经典的籼稻粳稻差异较大，例如部分粳稻的谷粒不是阔而短，较厚，呈椭圆形或卵圆形而是偏向于谷粒狭长等。因此，在生产实践中，有必要寻找快速精确鉴定籼稻、粳稻差异的方法。针对水稻遗传信息DNA序列在籼稻和粳稻间的遗传差异进行分子标记鉴定是高效准确的方法。SNP（single nucleotide polymorphism）标记以及根据SNP标记发展出的CAPS标记（cleavedamplified polymorphic sequence）技术能够获得其它分子标记技术不能显示的更加丰富的多态性（RafalskiA.Applications of single nucleotide polymorphisms incropgenetics.CurrOpin Plant Biol，2002，5(2)94～100）。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服传统水稻籼稻和粳稻品种鉴别技术存在的缺陷和不足，提供一种能快速、准确鉴定水稻是否为籼稻或者粳稻品种的CAPS分子标记方法。本发明提供的分子标记在实际应用中，只需PCR结合酶切，成本低、通量高、加上特异性高，非常适用于生产实践中。

本发明的目的是提供一种水稻V14基因的特异性分子标记V14SNP1。

本发明的另一目的是提供一种检测上述分子标记的引物。

本发明的再一目的是提供一种鉴定水稻籼稻和粳稻品种的CAPS分子标记方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种水稻V14基因的特异性分子标记V14SNP1，其在粳稻中的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，在籼稻中的序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的的特异性分子标记V14SNP1，其在粳稻品种和普通野生稻，籼稻和Nivara野生稻中都高度保守，V14SNP1在粳稻和籼稻中的序列在222bp处存在一个G←→C的SNP位点差异，本发明对比了众多水稻品种的V14SNP1，证实其在水稻粳稻和籼稻中高度保守，表明可利用特异性分子标记V14SNP1来鉴别水稻品种。

因此，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的特异性分子标记V14SNP1在鉴定水稻籼稻和粳稻品种中的应用亦在本发明保护范围内。

一种用于检测上述分子标记V14SNP1的引物组，所述引物的序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示；

上游引物：5’-TGAGAAACTTACCATTGGC-3’（ SEQ ID NO：3）；

下游引物：5’-AAGCATCCTCTTCATATCCTTG-3’（ SEQ ID NO：4）。

SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物组可作为CAPS标记引物用于鉴定水稻品种，因此，所述引物组在鉴定水稻籼稻和粳稻品种中的应用亦在本发明保护范围内。

一种鉴定水稻籼稻和粳稻品种的CAPS分子标记方法，包括如下步骤：

S1.提取水稻样本基因组DNA；

S2.以上述引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4对步骤S1基因组DNA进行PCR扩增；

S3.将步骤S2的PCR产物经Hha I酶切后电泳，得到CAPS标记；

S4.电泳结果判断：若得到440bp的电泳条带则该水稻样本为籼稻，若得到220bp的电泳条带，则该水稻品种为粳稻。

优选地，所述PCR反应体系为10×PCR Buffer 10μL，10mmol/L dNTPs 0.2μL，0.1μmol/L PCR引物各1μL，高保真PCR聚合酶 5U，DNA模板0.2μg，去离子水补充至100μL。

优选地，所述PCR反应程序为95℃预变性2min；95℃ 15sec，52℃ 20sec，72℃30sec，共30个循环；72℃延伸5min。

本发明的分子标记V14SNP1籼稻型和粳稻型序列相比，存在一个G←→C的SNP位点差异；粳稻在该位点徬邻序列具有限制性内切酶Hha I酶切识别位点：GCGC。而籼稻在该酶切识别位点的SNP突变GCGG造成无法被限制性内切酶Hha I酶切识别。因此在Hha I酶切识别以上PCR片段后，粳稻片段被酶切为220bp大小的DNA片段，而籼稻仍保持440bp大小的DNA片段。

上述分子标记V14SNP1还可以用来检测鉴定水稻亲本纯合度，因此，所述分子标记V14SNP1在水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用亦在本发明保护范围内。

同时，上述CAPS分子标记方法在水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用也在本发明保护范围内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种用于鉴定水稻籼稻和粳稻品种的CAPS分子标记方法。所述CAPS分子标记方法特异性高，能方便准确的地将水稻栽培品种进行籼稻和粳稻的种质资源区分。同时，本发明提供的分子标记在实际应用中，只需PCR结合酶切，且成本低、通量高、特异性高，非常适用于生产实践。

附图说明

图1为是CAPS标记引物PCR扩增和Hha I酶切结果图。其中，籼稻品种1～7分别为93-11，矮脚南特，广陆矮4号，珍汕97，明恢63，黄丝占，黄华占；粳稻品种1～7分别为日本晴，台中65，中花11，农垦58，云粳23号，鄂晚3号，晋稻1号。对以上品种的PCR扩增产物进行Hha I酶切结果为籼稻和Nivara野生稻片段不能被酶切，而粳稻品种和普通野生稻片段被酶切为220bp的DNA片段。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1鉴别水稻的分子标记及检测引物

本发明人前期研究发现，水稻中存在着一种分子标记V14-SNP1，其在粳稻中的序列如SEQ ID NO：1所示，在籼稻中的序列如SEQ ID NO：2所示，均为440bp，且在222bp处，存在一个G←→C的SNP位点差异，推测可利用上述分子标记去鉴定水稻籼稻和粳稻品种。分析发现，由于粳稻在该SNP位点位点徬邻序列具有限制性内切酶Hha I酶切识别位点：GCGC，而籼稻在该酶切识别位点的SNP突变GCGG造成无法被限制性内切酶Hha I酶切识别，因此可通过CAPS分子标记方法去检测鉴定水稻籼稻和粳稻品种，当用Hha I酶切识分子标记V14-SNP1后，粳稻品种会被酶切为220bp大小的DNA片段，而籼稻仍保持440bp大小的DNA片段，由此来鉴定水稻的籼稻和粳稻品种。

同时，通过比对分子标记V14-SNP1在粳稻和籼稻中的序列，设计了如下PCR扩增引物作为CAPS标记引物：

上游引物：5’-TGAGAAACTTACCATTGGC-3’（ SEQ ID NO：3）；

下游引物：5’-AAGCATCCTCTTCATATCCTTG-3’（ SEQ ID NO：4）。

PCR反应体系为10×PCR Buffer 10μL，10mmol/L dNTPs 0.2μL，0.1μmol/L PCR引物各1μL，高保真PCR聚合酶 5U，DNA模板0.2μg，去离子水补充至100μL。

PCR反应程序为95℃预变性2min；95℃ 15sec，52℃ 20sec，72℃ 30sec，共30个循环；72℃延伸5min。

实施例2 鉴定水稻籼稻和粳稻品种的CAPS分子标记方法

本发明用于鉴定水稻籼稻和粳稻品种的CAPS分子标记方法的实验材料包括普通野生稻和Nivara野生稻；籼稻品种分别为93-11，矮脚南特，广陆矮4号，珍汕97，明恢63，黄丝占，黄华占；粳稻品种分别为日本晴，台中65，中花11，农垦58，云粳23号，鄂晚3号，晋稻1号。具体步骤如下：

1、水稻样本基因组DNA提取

（1）取水稻叶片约0.5g，把叶片剪碎，放入预冷的研钵中，加入液氮，将叶片研磨成粉末后，放入2 mL离心管中，加入800 μL 2×CTAB抽提缓冲液，混匀，65℃水浴30min；

（2）加入等体积的氯仿，异戊醇和无水乙醇（76：4：20），振荡10 min，充分混匀；

（3）在12000 转/分的条件下离心12min，将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入其0.6倍体积异丙醇或两倍体积无水乙醇，混匀，12000 转/分离心2min，去上清，用0.5ml 70％的乙醇漂洗两次，风干，溶于100-200 μL 0.5×TE缓冲液中；

（4）取1μL用于后续的PCR扩增反应。

2、PCR扩增反应

以实施例1的CAPS标记引物对上述水稻样本基因组DNA进行扩增；

所述PCR扩增反应体系为：10×PCR Buffer 10μL，10mmol/L dNTPs 0.2μL，0.1μmol/L PCR引物各1μL，高保真PCR聚合酶 5U，DNA模板0.2μg，去离子水补充至100μL。

所述PCR扩增反应在DNA扩增仪上进行，PCR反应程序为95℃预变性2min；95℃15sec，52℃ 20sec，72℃ 30sec，共30个循环；72℃延伸5min，随后于4℃保存备用；

3、酶切

对上述水稻样本的PCR扩增产物用Hha I酶切，酶切后的PCR扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5V/cm)，溴化乙锭(EtBr)染色，用凝胶成像***观察并拍照记录。

4、结果与分析

对16个不同水稻材料基因组DNA进行PCR扩增，均能扩增出非常清晰的单一条带，并且8个条带大小相同，经3次重复，结果稳定一致（如图1A所示）。经过正反序列测定，16个PCR产物长度均为440bp；并且，PCR扩增所用的引物全部在两端被正确测出。其中，粳稻品种和普通野生稻序列见序列均如SEQ ID NO：1所示，籼稻和Nivara野生稻序列均如SEQ IDNO：2所示。

在Hha I酶切识别上述水稻品种的PCR片段后，粳稻片段被酶切为220bp大小的DNA片段，而籼稻仍保持440bp大小的DNA片段（如图1B所示），因此本发明的CAPS分子标记方法可用来鉴定水稻籼稻和粳稻品种。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种鉴定水稻品种的CAPS分子标记方法及应用

<141> 2017-10-13

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 440

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

gagaaactta ccattggcaa tattctacat ttccagcatt ctaatatatt ctcttactct 60

tttcaggatg atctatcagg tttggagtat cctggtgtac tttattcaaa caatcctcgt 120

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actactaagg ttgattcagt gtgtccatgt tcttgtttat gttcaatatt taacgtatgc 420

aggataaatg attgatttat 440

<210> 2

<211> 440

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

gagaaactta ccattggcaa tattctacat ttccagcatt ctaatatatt ctcttactct 60

tttcaggatg atctatcagg tttggagtat cctggtgtac tttattcaaa caatcctcgt 120

gctccaatca agaaaccagg tatgaaaggc tgtgaaaatc cctgatatcc agtggttact 180

ttgtattaat actttattct ccaggccggg aaaaaccagc ggtgaaacaa aactgggaag 240

gaagacaacc taaaacacga gacagatgtg acacttcaaa aaaagtcgat gctctgcatg 300

ccaagagtaa agctagcaga tcaactggtc ttgtggacat agataatgaa gtagaggtag 360

actactaagg ttgattcagt gtgtccatgt tcttgtttat gttcaatatt taacgtatgc 420

aggataaatg attgatttat 440

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

tgagaaactt accattggc 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

aagcatcctc ttcatatcct tg 22

Claims (8)

1.一种水稻V14基因的特异性分子标记V14SNP1在鉴定水稻籼稻和粳稻品种中的应用，其特征在于，所述V14SNP1在籼稻中的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在粳稻中的序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种用于检测权利要求1所述分子标记V14SNP1的引物组，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4所示。

3.权利要求2所述引物组在鉴定水稻籼稻和粳稻品种中的应用。

4.一种鉴定水稻籼稻和粳稻品种的CAPS分子标记方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取水稻样本基因组DNA；

S2.以权利要求2所述引物对步骤S1基因组DNA进行PCR扩增；

S3.将步骤S2的PCR产物经Hha I酶切后电泳，得到CAPS标记；

S4.电泳结果判断：若得到440bp的电泳条带则该水稻样本为籼稻，若得到220bp的电泳条带，则该水稻品种为粳稻。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系为10×PCR Buffer 10μL，10mmol/L dNTPs 0.2μL，0.1μmol/L PCR引物各1μL，高保真PCR聚合酶5U，DNA模板0.2μg，去离子水补充至100μL。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反应程序为95℃预变性2min；95℃15sec，52℃20sec，72℃30sec，共30个循环；72℃延伸5min。

7.水稻V14基因的特异性分子标记V14SNP1在水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用，其特征在于，所述V14SNP1在籼稻中的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在粳稻中的序列如SEQ ID NO：2所示。

8.权利要求4～6任一项所述CAPS分子标记方法在水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用。

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