CN112135826B

CN112135826B - 氨基降茨烷衍生物及其制备方法与应用

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Publication number: CN112135826B
Application number: CN201980029247.7A
Authority: CN
Inventors: 陈荣耀
Original assignee: Nanjing Transthera Biosciences Co Ltd
Current assignee: Yaojie Ankang (Nanjing) Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-09-29
Filing date: 2019-07-05
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2039-07-05
Also published as: AU2019348752B2; BR112021005960A2; WO2020063012A1; AU2019348752A1; CN112135826A; EP3858833A1; EP3858833A4; JP2022501403A; US20210332057A1; US20220144843A1; CA3114259A1; JP7370617B2; CN110964016B; MX2021003662A; US11420975B2; CN110964016A; KR20210070304A

Abstract

本发明涉及式I结构的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、活性代谢物、多晶型物、酯、光学异构体或前药，包含式I结构的化合物的药物组合物及其作为BTK(C481S)突变体高选择性的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂用于制备预防或治疗异种免疫性疾病、自身免疫性疾病或癌症的药物的用途。

Description

氨基降茨烷衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体是涉及氨基降茨烷衍生物作为对C481S突变体高选择性的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂、其药物组合物、其制备方法及其在制备药物中的用途。

背景技术

B细胞受体(B-cell receptor，BCR)信号通路在B细胞的成熟，分化和发展中起关键作用。异常的BCR介导的信号转导可引起错误调节的(deregulated)B细胞活化和/或病原性自身抗体的形成，导致多种人类疾病，包括癌症、自身免疫疾病和异种免疫性疾病，自身免疫疾病包括红斑狼疮、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病，异种免疫性疾病包括炎性疾病、哮喘等。

布鲁顿酪氨酸激酶(bruton tyrosine kinase，BTK)是非受体型酪氨酸激酶TEC家族的一员，在BCR信号通路的活化过程中起着关键的作用，是早期B细胞形成以及成熟B细胞激活和存活的关键调节剂(Khan等，Immunity 1995 3：283；Ellmeier等，J Exp Med 2000192：1611)。Btk在调节B细胞增殖和凋亡发挥重要的作用(Islam和Smith，Immunol Rev2000 178：49；Davis等，Nature 2010 463：88-94)，因此，对Btk的抑制可用于治疗某些B细胞淋巴瘤和白血病(Feldhahn等，J Exp Med 2005 201：1837)。

关于Btk在自身免疫疾病和炎性疾病中的作用的证据已经由Btk-缺陷型小鼠模式得到确认。在***性红斑狼疮(SLE)的临床前鼠模型中，Btk-缺陷型小鼠显示疾病进展的显著改善。此外，Btk-缺陷型小鼠对胶原蛋白诱惑的关节炎具有抗性(Jansson和Holmdahl，Clin Exp Immunol 1993 94：459)。选择性Btk抑制剂在小鼠关节炎模型中有着明显的量效关系(Pan等，Chem.Med.Chem.2007 2：58-61)。目前Btk抑制剂治疗关节炎的临床研究正在进行中。

依鲁替尼(Ibrutinib，商品名Imbruvica)作为第一个进入市场的布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂取得极大的成功，2017年年销售达26亿美元。然而与许多其他抗癌药物一样，部分患者对药物表现出耐药性。研究发现，BTK激酶的C481S突变是导致耐药的主要原因，依鲁替尼是通过与BTK激酶的C481色氨酸残基的不可逆共价结合而发生药效作用的，C481S突变将色氨酸变成丝氨酸从而失去与依鲁替尼共价结合的能力。

根据临床统计显示，BTK(C481S)突变占慢性淋巴癌(CLL)复发患者的87％(Woyach等，J Clin Oncol 2017 35：1437-1443)，在套细胞淋巴瘤(MCL)复发患者中～80％是BTK(C481S)突变(Chiron等，Cancer Discovery 2014 4(9)：1-14)。开发一种能对BTK(C481S)突变体有效的BTK抑制剂将能克服依鲁替尼因C481S突变而产生的耐药。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供新颖的、未见文献报道的对BTK(C481S)突变体高选择性的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂的化合物，其药学上可接受的盐、溶剂化物、活性代谢物、多晶型物、酯、光学异构体或前药，所述化合物在制药中的用途以及使用本发明化合物预防或治疗人或哺乳动物与过度Btk活性相关疾病的方法。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：

式(I)的化合物

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、活性代谢物、多晶型物、酯、光学异构体或前药，其中，

A环选自以下结构之一：

R⁵选自氢，卤素，氰基，羟基，炔基，氨基，C_1-3烷基，C_1-3烷氧基，C_1-3卤代烷基，C_1-3卤代烷氧基，C_1-3卤代烷氨基，C_3-7环烷基，C_3-7环烷氧基，C_3-7环烷氨基；

B环为取代或非取代的芳环或杂芳环；C环为取代或非取代的芳环或杂芳环；

L为单键、或以下结构之一；

R¹选自R³或以下结构之一，

其中，R³选自氢、取代或非取代的C_1-6烷基、取代或非取代的C_1-6炔基、取代或非取代的C_1-6烯基、取代或非取代的C_6-10芳基、取代或非取代的C_1-9杂芳基、取代或非取代的C_3-7环烷基或取代或非取代的C_2-7杂环烷氨基；

R⁴选自氢、取代或非取代的C_1-6烷基、取代或非取代的C_6-10芳基、取代或非取代的C_1-9杂芳基、取代或非取代的C_3-7环烷基、取代或非取代的C_3-7杂环烷基；

R²选自H、取代或非取代的C_1-3烷基、取代或非取代的C_3-7环烷基、取代或非取代的C_2-7杂环烷基、取代或非取代的C_6-10芳基或取代或非取代的C_1-9杂芳基。

R¹、R²以及与之相连的N形成取代或非取代的C_2-7杂环，R³、R⁴以及与之相连的N形成或不形成C_3-7杂环氨基或C_3-9杂芳环氨基。

优选的，所述R³中的取代的C_1-6烷基、取代的C_1-6炔基、取代的C_1-6烯基、取代的C_6-10芳基、取代的C_1-9杂芳基、取代的C_3-7环烷基、取代的C_2-7杂环烷基中的取代基选自卤素、氰基、羟基、氨基、取代或非取代的酰基胺基、取代或非取代的氨基酰基、取代或非取代的C_1-4烷基、取代或非取代的C_3-7环烷基、取代或非取代的C_3-7环烷氧基、取代或非取代的C_1-4烷基氨基、二[取代或非取代的C_1-4烷基]氨基、取代或非取代的C_3-7环烷氨基、取代或非取代的C_3-7杂环烷氨基、取代或非取代的C_1-3烷氧基、取代或非取代的C_3-7环烷氧基、取代或非取代的C_6-10芳基或取代或非取代的C_3-7杂环烷基中的一个或多个。

优选的，所述R⁴中的取代的C_1-6烷基、取代的C_6-10芳基、取代的C_1-9杂芳基、取代的C_3-7环烷基，取代的C_3-7杂环烷基中的取代基选自卤素、羟基、氰基、氨基、取代或非取代的C_1-4烯基、取代或非取代的C_3-7环烷基、取代或非取代的C_3-7环烷氧基、取代或非取代的C_1-4烷基氨基、二[取代或非取代的C_1-4烷基]氨基、取代或非取代的C_3-7环烷氨基、取代或非取代的C_3-7杂环烷氨基、取代或非取代的C_1-3烷氧基、取代或非取代的C_3-7环烷氧基、取代或非取代的C_6-10芳基或取代或非取代的C_3-7杂环烷基中的一个或多个。

优选的，所述A环结构如下式：

优选的，所述B环中的取代的芳环或芳杂环中的取代基选自卤素、羟基、氰基、氨基、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、卤代C_1-3烷基、卤代C_1-3烷氧基中的一个或多个。

优选的，所述B环结构如下式：

优选的，所述C环中的取代的芳环或芳杂环中的取代基选自卤素、羟基、氰基、氨基、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、卤代C_1-3烷基、卤代C_1-3烷氧基中的一个或多个。

优选的，所述C环结构如下式：

优选的，所述R²选自H，R¹选自：

其中，R³选自氢、取代或非取代的C_1-6烷基、取代或非取代的C_1-6炔基、取代或非取代的C_1-6烯基、取代或非取代的C_6-10芳基、取代或非取代的C_1-9杂芳基、取代或非取代的C_3-7环烷基、取代或非取代的C_2-7杂环烷氨基。

最优选的，所述化合物选自如下任一结构所示：

以上任一项所述的化合物在制备预防或治疗异种免疫性疾病、自身免疫性疾病或癌症的药物中的用途。

其中，所述异种免疫性疾病、自身免疫性疾病或癌症与过度布鲁顿酪氨酸激酶活性相关。

其中，所述异种免疫性疾病、自身免疫性疾病或癌症与异常B细胞增殖相关。

更进一步的，所述异种免疫性疾病为炎性疾病或哮喘。

更进一步的，所述自身免疫性疾病为红斑狼疮、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病。

一种药物组合物，包含一种或多种以上任一项所述的化合物。

一种药物制剂，包含治疗有效量的以上任一项所述的化合物，以及在药学上可接受的赋形剂。

所述的药物制剂，其配制用于选自口服施用、肠胃外施用、口腔施用、鼻腔施用、局部施用或直肠施用的施用途径。

所述的药物制剂用于治疗与过度布鲁顿酪氨酸激酶活性相关的疾病或状况，包括向需要的人或哺乳动物施用所述的药物制剂；所述过度布鲁顿酪氨酸激酶活性相关的疾病为异种免疫性疾病、自身免疫性疾病或癌症；所述异种免疫性疾病为炎性疾病、哮喘；所述自身免疫性疾病为红斑狼疮、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病。

本发明包括将所述药物制剂与Btk接触的步骤，所述的接触步骤包括体外或者体内试验。

上述化合物I的制备方法1：包括以下步骤：(S1)化合物IIIA和硼酸或硼酸酯II进行Suzuki偶合得到化合物IV；(S2)化合物IV用三氟乙酸处理脱去苄氧羰基后转化成化合物V的盐酸盐；(S3)化合物V与有机酸偶合得到权利要求1中所述的化合物I；

其中X＝卤素，R²，R³，L，A环，B环和C环如前所述。

上述化合物I的制备方法2，包括以下步骤：(A1)化合物IIIA用三氟乙酸处理脱去苄氧羰基后转化成化合物VI的盐酸盐；(A2)化合物VI与有机酸偶合得到化合物VII；(A3)化合物VII与硼酸或硼酸酯II进行Suzuki偶合得到权利要求1中所述的化合物I；

其中X＝卤素，R²，R³，L，A环，B环和C环如前所述。

上述化合物I的制备方法3，包括以下步骤：(B1)化合物IIIB和硼酸II在醋酸铜催化下进行Chan-Lam-Evans偶合得到化合物VIII；(B2)化合物VIII用三氟乙酸处理脱去苄氧羰基后转化成化合物IX的盐酸盐；(B3)化合物IX与有机酸偶合得到权利要求1中所述的化合物I；

其中R²，R³，L，A环，B环和C环如前所述。

方法1、2和3中反应所得的每一个产物可以通过传统分离技术来得到，这种传统技术包括但不限于过滤、蒸馏、结晶、色谱分离等。合成所需要的起始原料可以自己合成或从商业机构购买获得，例如，但不限于，Adrich或Sigma。这些原料可以使用常规手段进行表征，比如物理常数和光谱数据。本发明所描述的化合物可以使用合成方法得到单一的光学异构体或者是光学异构体的混合物。

本发明中字母上标表示基团的标号，下标表示该原子的个数，例如：R¹、R²、R³表示第1～3个R基团，C_1-4烷基表示含1～4个C原子的烷基。取代基上C原子数不计算在主链中。

附图说明

图1 OCI-LY10移植肿瘤模型。

图2 TMD-8移植肿瘤模型。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

中间体I-5的合成

中间体I-5的合成路线

4-(苄氧基羰基氨基)双环[2.2.1]庚烷-1-羧酸甲酯I-2

向4-(甲氧基羰基)双环[2.2.1]庚烷-1-羧酸I-1(3.5g，17.7mmol)和TEA(1.78g，17.7mmol)的甲苯(30mL)溶液中加入DPPA(5.34g，19.5mmol)。将混合物加热至90℃，保持2小时。冷却至室温并加入BnOH(1.9g，17.7mmol)。将反应在90℃下搅拌4天。冷却至室温，用乙酸乙酯稀释并用NaHCO₃水溶液洗涤，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将其用乙酸乙酯/石油醚＝1∶4的柱色谱法纯化，得到3g所需化合物I-2，收率：56％。

4-(苄氧基羰基氨基)双环[2.2.1]庚烷-1-羧酸I-3

向4-(苄氧基羰基)双环[2.2.1]庚烷-1-甲酸甲酯I-2(3g，9.9mmol)的溶液中加入NaOH(792mg，19.8mmol)，将混合物加热至60℃，保持10小时。浓缩，加入水(50mL)，用1N HCl水溶液将pH调节至4。将其用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将其不经纯化用于下一步，得到2.2g所需化合物I-3，收率：77％。

4-氨基甲酰基双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯I-4

向化合物I-3(2g，6.9mmol)和Et₃N(1g，10mmol)的DCM(20mL)溶液中滴加0℃的氯代异丁基酯(1.36g，10mmol)。将混合物在0℃下搅拌20分钟，滴加NH₄OH(10mL)并将其在室温下搅拌10分钟。将其倒入水(30mL)中，分离有机相，用DCM(2x15mL)萃取水溶液，将合并的有机相用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将其通过柱色谱法纯化，用EA/PE(1∶1)-EA/MeOH(10∶1)洗脱。得到1.7g所需化合物I-4，产率：85％。

4-氨基双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯I-5

将化合物I-4(1.6g，5.55mmol)和羟基甲基磺酰碘苯(2.17g，5.55mmol)在ACN(20mL)中的溶液加热回流1小时，蒸发溶剂并加入1M NaOH(12mL)，将其用EA(2x15mL)萃取，将有机相用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将其通过柱色谱法纯化，用DCM/MeOH＝(10∶1)洗脱。得到920mg所需化合物I-5，收率：64％。LC-MS m/z＝261.1[M+1]⁺。

中间体硼酸II的合成

中间体II-1的合成路线

4-溴-N-(吡啶-2-基)苯甲酰胺

在冰浴中向4-溴苯甲酸(5g，24.8mmol)和吡啶-2-胺(4.68g，49mmol)在吡啶(30mL)中的混合物中滴加POCl₃(11.4g，74mmol)。将悬浮液在室温下搅拌20分钟。将反应倒入水(100mL)中并用乙酸乙酯(3x40mL)萃取。有机相用饱和NaCl水溶液(2x50mL)洗涤。将有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。通过柱色谱法用乙酸乙酯/石油＝1∶9

1∶1进行纯化，得到产物4-溴-N-(吡啶-2-基)苯甲酰胺(3.28g，48％)。LC-MS m/z＝277.0[M+1]⁺。

(吡啶-2-基)-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲酰胺

将4-溴-N-(吡啶-2-基)苯甲酰胺(2g，7.22mmol)，4，4，5，5-四(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷(2.75g，10.83mmol)，PdCl₂(dppf)(527mg，0.72mmol)和KOAc(235mg，2.4mmol)在甲苯(30mL)中的混合物加热至110℃保持6小时。将反应液蒸发并加入水(100mL)。将其用乙酸乙酯(2x40mL)萃取。分离有机相，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。通过柱色谱法用乙酸乙酯/石油醚＝1∶4

1∶1纯化，得到产物(吡啶-2-基)-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲酰胺(2g，85％)。

(吡啶-2-基氨基甲酰基)苯基硼酸II-1

向N-(吡啶-2-基)-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲酰胺(2g，6.2mmol)在THF∶H₂O(24mL∶6mL)的混合溶剂中的溶液中加入NaIO₄(3.27g，18.6mmol)，并在室温下搅拌30分钟。加入2N HCl水溶液(1.65mL)。将其在室温下搅拌3小时。将混合物用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤。分离并用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过使用MeOH/DCM＝1∶10的柱色谱法纯化得到产物(吡啶-2-基氨基甲酰基)苯基硼酸II-1(1.4g，93％)。LC-MS m/z＝243.1[M+1]⁺。

中间体II-2的合成路线

4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲酰氯

向4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲酸(10g，40mmol)和1滴DMF的DCM(100mL)溶液中在冰浴下滴加草酰氯(10.2g，80mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，然后温热至室温另外3小时。浓缩，不经纯化用于下一步骤。

N-(4-氟吡啶-2-基)-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲酰胺

向4-氟吡啶-2-胺(421mg，3.76mmol)在吡啶(3mL)中的溶液中加入4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊-2-基)吡啶-2-基)苯甲酰氯(1g，3.76mmol)的DCM(6mL)溶液中，将悬浮液在0℃下搅拌30分钟。将其倒入水中并用DCM(2×20mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，分离并用无水Na₂SO₄干燥。蒸发并通过柱色谱法用乙酸乙酯/石油＝1∶9纯化，得到产物(1.04g，81％)。LC-MS m/z＝343.2[M+1]⁺。

4-((4-氟吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基硼酸II-2

向N-(4-氟吡啶-2-基)-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲酰胺(1.04g，3.04mmol)在THF∶H₂O(24mL∶6mL)的混合溶剂中的溶液中加入NaIO₄(1.9g，9.12mmol)，并在室温下搅拌30分钟。加入HCl水溶液(1.65ml)。将其在室温下搅拌3小时。将混合物用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤。分离并用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法用MeOH/DCM＝1∶10纯化。得到产物II-2(648mg，82％)。LC-MS m/z＝261.1[M+1]⁺。

4-((4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基硼酸II-3

以4-(三氟甲基)吡啶-2-胺(609mg，3.76mmol)和4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊-2-基)吡啶-2-基)苯甲酰氯(1g，3.76mmol)为原料，使用与II-2相同的合成方法得到607mg所需化合物。LC-MS m/z＝311.1[M+1]⁺。

4-((4-甲基吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基硼酸II-4

以4-甲基-吡啶-2-胺(406mg，3.76mmol)和4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊-2-基)吡啶-2-基)苯甲酰氯(1g，3.76mmol)为原料，使用与II-2相同的合成方法得到589mg所需化合物。LC-MS m/z＝257.1[M+1]⁺。

4-((4-氰基吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基硼酸II-5

以4-氰基-吡啶-2-胺(447mg，3.76mmol)和4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊-2-基)吡啶-2-基)苯甲酰氯(1g，3.76mmol)为原料，使用与II-2相同的合成方法得到465mg所需化合物。LC-MS m/z＝268.0[M+1]⁺。

中间体II-6的合成路线

4-溴-2-氟-N-(吡啶-2-基)苯甲酰胺

在冰浴中向4-溴-2-氟苯甲酸(1g，4.56mmol)的DCM(30mL)溶液中滴加草酰氯(1.16g，9.13mmol)，然后加入1滴DMF。将混合物在室温下搅拌3小时。将其浓缩并溶于DCM(6mL)中，将该溶液在0℃下加入吡啶-2-胺(428mg，4.56mmol)的吡啶(3ml)溶液中，将悬浮液在0℃下搅拌，30分钟。将其倒入水中并用DCM(2×20mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，分离并用无水Na₂SO₄干燥。蒸发并通过柱色谱法用乙酸乙酯/石油＝1∶9纯化，得到产物(1.05g，78％)。LC-MS m/z＝295.0[M+1]⁺。

将4-溴-2-氟-N-(吡啶-2-基)苯甲酰胺(1.05g，3.55mmol)，(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷(1.36g，5.3mmol)，PdCl₂(dppf)(260mg，0.36mmol)和KOAc(1.04g，10.65mmol)的甲苯(30mL)溶液加热至110℃保持6小时。将反应物蒸发并加入水(100mL)。将其用乙酸乙酯(2×40mL)萃取。分离有机相，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。通过柱色谱法用乙酸乙酯/石油醚＝1∶4

1∶1进行纯化，得到产物(971mg，80％)。

3-氟-4-(吡啶-2-基氨基甲酰基)苯基硼酸II-6

向2-氟-N-(吡啶-2-基)-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烯苯甲酰胺(970mg，2.84mmol)在THF∶H₂O(24mL∶6mL)的混合溶剂中的溶液中加入NaIO₄(1.8g，8.52mmol)，并在室温下搅拌30分钟。HCl水溶液(1.65ml)。将其在室温下搅拌3小时。将混合物用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤。分离并用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法用MeOH/DCM＝1∶10纯化。得到产物II-6(605mg，82％)。LC-MS m/z＝261.1[M+1]⁺。

(噻唑-2-基氨基甲酰基)苯基硼酸II-7

以噻唑-2-胺(376mg，3.76mmol)和4-((4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊-2-基)吡啶-2-基)苯甲酰氯(1g，3.76mmol)为原料，使用与II-2相同的合成方法得到580mg所需化合物II-7。LC-MS m/z＝249.1[M+1]⁺。

2-氟-4-(吡啶-2-基氨基甲酰基)苯基硼酸II-8

以4-溴-3-氟-苯甲酸和吡啶-2-胺为原料，使用与II-1相同的合成方法得到138mg所需化合物II-8。LC-MS m/z＝261.0[M+1]⁺。

2-氟-4-((4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基硼酸II-9

以4-溴-3-氟-苯甲酸和4-(三氟甲基)-吡啶-2-胺为原料，使用与II-1相同的合成方法得到130mg所需化合物II-9。LC-MS m/z＝329.0[M+1]⁺。

2-甲氧基-4-((4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基硼酸II-10

以4-溴-3-甲氧基苯甲酸(1g，4.36mmol)和4-(三氟甲基)-吡啶-2-胺(706mg，4.36mmol)为原料，使用与II-6相同的合成方法得到440mg所需化合物II-10。LC-MS m/z＝341.0[M+1]⁺。

中间体硼酸酯II-11的合成路线

N-(4-溴苄基)-2-甲氧基苯甲酰胺

4-溴苄胺(1g，5.38mmol)，2-甲氧基苯甲酸(818mg，5.38mmol)，HATU(2.45g，6.46mmol)和DIEA(1.39g，10.76mmol)在DMF(20mL)中室温下搅拌2小时。将其倒入水(50mL)中并过滤。将其用水(2×30mL)洗涤并干燥。它无需纯化即可用于下一步。得到所需化合物1.6g，收率：93％。

N-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼戊环-2-基)苄基)-2-甲氧基苯甲酰胺II-11

将N-(4-溴苄基)-2-甲氧基苯甲酰胺(1.6g，5mmol)，4，4，5，5-四甲基-2-(4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧戊环-2-基)-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷(1.9g，7.5mmol)，PdCl₂dppf(365mg，0.5mmol)和KOAc(1.47g，15mmol)的二恶烷(30mL)溶液加热至100℃，保持6小时。浓缩，加入水(100mL)，用乙酸乙酯(2×20mL)萃取。分离有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，用乙酸乙酯/石油＝1∶9的柱色谱法纯化。得到1.5g所需化合物II-11，产率：82％。

N-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼戊环-2-基)苄基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺II-12

以5-氟-2-甲氧基苯甲酸(915mg，5.38mmol)和4-溴苄胺(1g，5.38mmol)为原料，使用与II-11相同的合成方法得到900mg所需化合物II-12。

N-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼戊环-2-基)苄基)-4-氟-2-甲氧基苯甲酰胺II-13

以4-氟-2-甲氧基苯甲酸(915mg，5.38mmol)和4-溴苄胺(1g，5.38mmol)为原料，使用与II-11相同的合成方法得到1g所需化合物II-13。

中间体A-4的合成路线

4-(((3-氯吡嗪-2-基)甲基)氨基甲酰基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯A-1

4-(苄氧基羰基)双环[2.2.1]庚烷-1-羧酸(2g，6.9mmol)，HATU(2.89g，7.6mmol)，DIEA(3.56g，27.6mmol)和(3-氯吡嗪-2-基)甲胺的盐酸盐(1.3g，7.24mmol)的DMF(20mL)溶液在室温下搅拌6小时。倒入水(100mL)中并用乙酸乙酯(2×30mL)萃取。用饱和NaCl水溶液洗涤有机相。分离有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1～1∶0的柱色谱法纯化，得到2g所需化合物A-1，收率：70％。LC-MS m/z＝414.9[M+1]⁺。

4-(8-氯咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯A-2

向4N-(((3-氯吡嗪-2-基)甲基)氨基甲酰基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯A-1(2g，4.83mmol)的ACN(30mL)溶液中加入吡啶(381mg，4.83mmol)和PCl₅(4g，19.32mmol)，然后将混合物加热至56℃保持1小时。冷却至室温并缓慢倒入100mL冰饱和NaHCO₃水溶液中。保持pH＝9，将其用乙酸乙酯(2×30mL)萃取。用饱和NaCl水溶液洗涤有机相。分离有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将其用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到1.5g所需化合物A-2，收率：78％。

4-(8-氯-1-碘咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯A-3

将4-(8-氯咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯A-2(1.5g，3.79mmol)和NIS(1.13g，5.04mmol)的DMF(10mL)混合液在N₂气氛下加热至60℃，保持搅拌10小时。冷却至室温并倒入水(100mL)中并用乙酸乙酯(2×30mL)萃取。用饱和NaCl水溶液洗涤有机相。分离有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。用乙酸乙酯/石油醚＝2∶3的柱色谱法纯化，得到1.52g所需化合物A-3，收率：77％。

4-(8-氨基-1-碘咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯A-4

向化合物A-3(1.5g，2.87mmol)的IPA(15mL)悬浮液中加入NH₄OH(3mL)，将混合物加热至110℃，保持6小时。浓缩并加入20mL饱和NaHCO₃水溶液。用乙酸乙酯(2×30mL)萃取。用饱和NaCl水溶液洗涤有机相。分离有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将其用乙酸乙酯/石油醚柱色谱纯化＝1∶1，得到1.1g所需化合物A-4，收率：77％。

中间体B-3的合成路线

4-(4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯B-1

将2-(4，6-二氯嘧啶-5-基)乙醛(735mg，3.8mmol)，4-氨基双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯(1g，3.8mmol)和Et₃N(389mg，3.8mmol)的EtOH(20mL)溶液加热至80℃，保持16小时。将其浓缩并加入水(20mL)用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，通过柱色谱用EA/PE＝1∶4纯化，得到1.25g所需化合物B-1，收率：83％。LC-MS m/z＝397.1[M+1]⁺。

4-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯B-2

向化合物B-1(1.25g，3.16mmol)的DMF(10mL)溶液中加入NIS(950mg，4.2mmol)，将混合物加热至60℃，保持6小时。将其倒入水(20mL)中并用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，通过柱色谱法用EA/PE＝1∶4纯化，所需得到1.09g化合物，收率：66％。LC-MS m/z＝523.1[M+1]⁺。

4-(4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯B-3

向4-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)双环苄基的溶液[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸酯B-2(1.09g，2.08mmol)的IPA(10mL)溶液中加入NH₄OH(2mL)并将混合物加热至110℃保持6小时，浓缩并倒入NaHCO₃水溶液中，用DCM(2×20mL)萃取，分离有机相，干燥并过滤，将其浓缩并通过柱色谱法用MeOH/DCM＝1∶20纯化，得到900mg所需化合物B-3，收率：86％

中间体C-4的合成路线

4-(6-氯-5-硝基嘧啶-4-基氨基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯C-1

将4，6-二氯-5-硝基嘧啶(518mg，2.68mmol)，4-氨基双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯I-5(698mg，2.68mmol)和Et₃N(1.1g，10.72mmol)的DCM(20mL)溶液在室温下搅拌4小时。除去溶剂并将残余物用乙酸乙酯(50mL)处理，用饱和NaCl水溶液洗涤，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩，通过柱色谱法用EA/PE＝1∶4纯化。得到633mg所需化合物C-1，收率：57％。

4-(5-氨基-6-氯嘧啶-4-基氨基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯C-2

向化合物C-1(400mg，0.96mmol)在混合溶剂(EtOH/H2O＝20mL/4mL)中的溶液中加入Fe粉末(268mg，4.8mmol)和NH₄Cl(254mg，4.8mmol)。将混合物加热至回流1小时。冷却至室温并过滤，用MeOH(10mL)洗涤，浓缩滤液，通过柱色谱法用EA/PE＝1∶4纯化。得到292mg所需化合物C-2，收率：79％。

4-(6-氯-8-氧代-7，8-二氢嘌呤-9-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯C-3

在0℃下，向化合物C-2(290mg，0.75mmol)的DCM(10mL)溶液中加入Et₃N(166mg，1.5mmol)和三光气(291mg，0.9mmol)，然后在0℃下搅拌。持续2小时。将其倒入水(20mL)中，分离有机相，用DCM(2×10mL)萃取水溶液，分离，用Na₂SO₄干燥合并的有机相，过滤并浓缩，将其用于下一步骤不经纯化，得到C-3粗品316mg。

4-(6-氨基-8-氧代-7，8-二氢嘌呤-9-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯C-4

向化合物C-3(310mg，0.75mmol)的IPA(10mL)溶液中加入NH₄OH(2mL)，将混合物加热至150℃，保持24小时，浓缩，倒入NaHCO₃水溶液中，用将DCM(2×20mL)，分离有机相，干燥并过滤，将其浓缩并通过柱色谱法用MeOH/DCM＝1∶20纯化，得到100mg所需化合物C-4，收率：34％。LC-MS m/z＝395.1[M+1]⁺。

中间体D-5的合成路线

苄基4-(6-氯-5-甲醛基嘧啶-4-基氨基)双环[2.2.1]庚烷-1-基氨基甲酸D-1

将I-5(1.47g、5.65mmol)、4，6-二氯嘧啶-5-甲醛(1g、5.65mmol)、三乙胺(1.15g、11.4mmol)在DCM(20mL)中的混合液室温下搅拌过夜。反应液用EA(50mL)稀释，用水洗涤(2x30mL)。有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤和浓缩。残留物用硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯(1∶1)洗脱，得到所需的产品D-1(1.24g，55％)。LC-MS m/z＝401.0[M+1]⁺。

(E)-苄基4-(6-氯-5-(羟基亚氨基)甲基)嘧啶-4-基氨基)双环[2.2.1]庚烷-1-基氨基甲酸D-2

将D-1(1.2g，3.0mmol)，羟胺-O-磺酸(0.41g，3.6mmol)在DCM/ACN(50毫升/50毫升)的混合液在室温下搅拌16h，然后在50℃搅拌6h。冷却后，浓缩至10mL，固体过滤和用ACN(2mL)洗涤，得到所需的产品D-2(1.0g，81％)。LC-MS m/z＝416.0[M+1]⁺。

苄基4-(4-氯-1H-吡咯[3，4-d-]嘧啶-1-基)双环[2.2.1]庚烷-1-基氨基甲酸D-3

向D-2(1.0g，2.41mmol)的DCM(100mL)溶液中加了入DIEA(4mL)。然后滴加TsCl(0.23mL，2.9mmol)。混合物在室温下搅拌3h。反应混合物用水(100mL)处理。有机相用盐水洗涤(2x30mL)，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩。残留物用硅胶柱层析纯化，由乙酸乙酯/石油醚(1∶6)洗脱，得到所需的产品D-3(400mg，42％)。LC-MS m/z＝398.1[M+1]⁺。

苄基4-(4-氨基-1H-吡咯[3，4-d-]嘧啶-1-基)双环[2.2.1]庚烷-1-基氨基甲酸D-4

将D-3(400mg、1.0mmol)、氢氧化铵(30％、5mL)在异丙醇(20mL)的混合物在封管中在120℃下搅拌6h。蒸干溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，用PE/EA(2∶1)洗脱，得到所需的产品D-4(280mg，73.4％)。

苄基4-(4-氨基-3-碘-1H-吡咯[3，4-d-]嘧啶-1-基)双环[2.2.1]庚烷-1-基氨基甲酸D-5

将D-4(190mg、0.5mmol)、NIS(400mg、1.78mmol)、HBF₄(50％、19.6mmol、4mL)在ACN(2.5mL)的混合物在封管中加热到85℃搅拌6h。冷却后，用饱和NaHCO₃淬灭，用EA(2x50mL)提取。有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤和浓缩。残留物用硅胶柱层析纯化，由用EA/PE(1∶1-1∶0)洗脱，得到所需的产品D-5(96mg，38.1％)。LC-MS m/z＝505.0[M+1]⁺。

实施例1

化合物A-7-n的合成路线

3-(4-氨基双环[2.2.1]庚-1-基)-1-碘咪唑并[1，5-a]吡嗪-8-胺A-5

将化合物A-4(1g，1.99mmol)在TFA/DCM(10mL/10mL)的混合溶剂中的溶液加热至60℃，保持6小时。浓缩并加入DCM(2×20mL)，浓缩并溶于DCM(20mL)中，加入5mL HCl的二恶烷溶液并在室温下搅拌10分钟。将其蒸发并加入DCM(2×20mL)，将其蒸发并加入DME(20mL)。将其在室温下搅拌30分钟。过滤并用DME(2×10mL)洗涤。所得化合物A-5无需纯化即可用于下一步骤。LC-MS m/z＝370.1[M+1]⁺。

N-(4-(8-氨基-1-碘咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)丁-2-炔酰胺A-6

将化合物A-5(1.35g，2.8mmol)，DIEA(3.28g，25.2mmol)，丁-2-炔酸(235mg，2.8mmol)和HATU(1.06g，2.8mmol)的DMF(20mL)溶液在室温下搅拌30分钟。将其倒入水(30mL)中并用乙酸乙酯(2×30mL)萃取。用饱和NaCl水溶液洗涤有机相。分离有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。用乙酸乙酯/石油醚＝2∶3的柱色谱法纯化，得到800mg所需化合物A-6，收率：65％。

4-(8-氨基-3-(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(吡啶-2-基)苯甲酰胺A-7-1

将化合物A-6(30mg，0.069mmol)，4-(吡啶-2-基氨基甲酰基)苯硼酸II-1(20mg，0.085mmol)，Pd[PPh₃]₄(8mg，0.0069mmol)和Cs₂CO₃(45mg，0.138mmol)在DME/H₂O(1.5mL/0.3mL)的混合溶剂的溶液中加热至80℃ 3小时。浓缩，加入水(20mL)，用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将其用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到10mg所需化合物A-7-1，收率：30％。LC-MS m/z＝506.2[M+1]⁺。

4-(8-氨基-3-(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-氟吡啶吡啶-2-基)苯甲酰胺A-7-2

将化合物A-6(30mg，0.069mmol)，4-((4-氟吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基硼酸II-2(22mg，0.085mmol)，Pd[PPh₃]₄(8mg，0.0069mmol)和Cs₂CO₃(45mg，0.138mmol)在DME/H₂O(1.5mL/0.3mL)的混合溶剂中的的溶液加热至80℃，保持3小时。浓缩，加入水(20mL)。将其用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将其用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到15mg所需化合物A-7-2，收率：34％。LC-MS m/z＝524.0[M+1]⁺。

4-(8-氨基-3-(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-7-3

将化合物A-6(30mg，0.069mmol)，4-((4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基硼酸II-3(26mg，0.085mmol)，Pd[PPh₃]₄(8mg，0.0069mmol)和Cs₂CO₃(45mg，0.138mmol)在DME/H₂O(1.5mL/0.3mL)的混合溶剂中的的溶液中加热至80℃，保持3小时。浓缩，加入水(20mL)。将其用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将其用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到12mg所需化合物A-7-3，收率：31％。LC-MS m/z＝574.2[M+1]⁺。

4-(8-氨基-3-(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-甲基吡啶吡啶-2-基)苯甲酰胺A-7-4

将化合物A-6(30mg，0.069mmol)，4-((4-甲基吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基硼酸II-4(22mg，0.085mmol)，Pd[PPh₃]₄(8mg，0.0069mmol)和Cs₂CO₃(45mg，0.138mmol)在DME/H₂O(1.5mL/0.3mL)的混合溶剂中的溶液加热至80℃，保持3小时。浓缩，加入水(20mL)。将其用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将其用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到14mg所需化合物A-7-4，收率：39％。LC-MS m/z＝520.2[M+1]⁺。

4-(8-氨基-3(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-氰基吡啶-2-基)苯甲酰胺A-7-5

将化合物A-6(30mg，0.069mmol)，4-((4-氰基吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基硼酸II-5(23mg，0.085mmol)，Pd[PPh₃]₄(8mg，0.0069mmol)和Cs₂CO₃(45mg，0.138mmol)在DME/H₂O(1.5mL/0.3mL)的混合溶剂中的溶液加热至80℃，保持3小时。浓缩，加入水(20mL)。将其用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将其用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到12mg所需化合物A-7-5，收率：33％。LC-MS m/z＝531.0[M+1]⁺。

4-(8-氨基-3-(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-2-氟-N-(吡啶-2-基)苯甲酰胺A-7-6

将化合物A-6(30mg，0.069mmol)，3-氟-4-(吡啶-2-基氨基甲酰基)苯基硼酸II-6(22mg，0.085mmol)，Pd[PPh₃]₄(8mg，0.0069mmol)和Cs₂CO₃(45mg，0.138mmol)在DME/H₂O(1.5mL/0.3mL)的混合溶剂中的溶液加热至80℃，保持3小时。浓缩，加入水(20mL)。将其用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。将其用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到15mg所需化合物A-7-6，收率：42％。LC-MS m/z＝524.2[M+1]⁺。

4-(8-氨基-3-(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(噻唑-2-基)苯甲酰胺A-7-7

将化合物A-6(30mg，0.069mmol)，4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-N-(噻唑-2-基)苯甲酰胺II-7(28mg，0.085mmol)，Pd[PPh₃]₄(8mg，0.0069mmol)和Cs₂CO₃(45mg，0.138mmol)在DME/H₂O(1.5mL/0.3mL)的混合溶剂的溶液中加热至80℃保持3小时。浓缩，加入水(20mL)。用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸干。将其用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到13mg所需化合物A-7-7，收率：37％。LC-MS m/z＝512.0[M+1]⁺。

4-(8-氨基-3-(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-3-氟-N-(吡啶-2-基)苯甲酰胺A-7-8

将化合物A-6(30mg，0.069mmol)，2-氟-4-(吡啶-2-基氨基甲酰基)苯基硼酸II-8(22mg，0.085mmol)，Pd[PPh₃]₄(8mg，0.0069mmol)和Cs₂CO₃(45mg，0.138mmol)在DME/H₂O(1.5mL/0.3mL)的混合溶剂中的溶液加热至80℃达3小时。浓缩，加入水(20mL)。用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将其用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到14mg所需化合物A-7-8，收率：39％。LC-MS m/z＝524.0[M+1]⁺。

4-(8-氨基-3-(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-3-氟-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-7-9

将化合物A-6(30mg，0.069mmol)，2-氟-4-((4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基硼酸II-9(28mg，0.085mmol)，Pd[PPh₃]₄(8mg，0.0069mmol)和Cs₂CO₃(45mg，0.138mmol)在DME/H₂O(1.5mL/0.3mL)的混合溶剂中加热至80℃，保持3小时。浓缩，加入水(20mL)。将其用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到19mg所需化合物A-7-9，收率：47％。LC-MS m/z＝592.0[M+1]⁺。

4-(8-氨基-3-(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-3-甲氧基-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-7-10

将化合物A-6(30mg，0.069mmol)，2-甲氧基-4-((4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基硼酸II-10(29mg，0.085mmol)，Pd[PPh₃]₄(8mg，0.0069mmol)和Cs₂CO₃(45mg，0.138mmol)在DME/H₂O(1.5mL/0.3mL)的混合溶剂的溶液中加热至80℃，保持3小时。浓缩，加入水(20mL)。将其用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将其用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到16mg所需化合物A-7-10，收率：38％。LC-MS m/z＝604.0[M+1]⁺。

N-((4-(8-氨基-3-(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)苯基)甲基)-2-甲氧基A-7-11

将化合物A-6(30mg，0.069mmol)，N-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)-2-甲氧基苯甲酰胺II-11(31mg，0.085mmol)，Pd[PPh₃]₄(8mg，0.0069mmol)和Cs₂CO₃(45mg，0.138mmol)在DME/H₂O(1.5mL/0.3mL)的混合溶剂中加热至80℃，保持3小时。浓缩，加入水(20mL)。将其用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将其用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到21mg所需化合物A-7-11，收率：50％。LC-MS m/z＝549.3[M+1]⁺。

N-((4-(8-氨基-3-(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)苯基)甲基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺A-7-12

将化合物A-6(30mg，0.069mmol)，N-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺II-12(33mg，0.085mmol)，Pd[PPh₃]₄(8mg，0.0069mmol)和Cs₂CO₃(45mg，0.138mmol)在DME/H₂O(1.5mL/0.3mL)的混合溶剂中加热至80℃。持续3个小时。浓缩，加入水(20mL)。将其用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用无水Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将其用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到24mg所需化合物A-7-12，收率：56％。LC-MS m/z＝567.0[M+1]⁺。

N-((-(8-氨基-3-(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)苯基)甲基)-4-氟-2-甲氧基苯甲酰胺A-7-13

将化合物A-6(30mg，0.069mmol)，N-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基)-4-氟-2-甲氧基苯甲酰胺II-13(33mg，0.085mmol)，Pd[PPh₃]₄(8mg，0.0069mmol)和Cs₂CO₃(45mg，0.138mmol)在DME/H₂O(1.5mL/0.3mL)的混合溶剂中加热至80℃。持续3个小时。浓缩，加入水(20mL)。将其用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将其用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到26mg所需化合物A-7-13，收率：60％。LC-MS m/z＝567.1[M+1]+。

N-(4-(8-氨基-1-(4-苯氧基苯基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)丁-2-炔酰胺A-7-14

将化合物A-6(30mg，0.069mmol)，4-苯氧基苯硼酸(18mg，0.085mmol)，Pd[PPh₃]₄(8mg，0.0069mmol)和Cs₂CO₃(45mg，0.138mmol)在DME/H₂O(1.5mL/0.3mL)的混合溶剂中加热至80℃，保持3小时。浓缩，加入水(20mL)。将其用乙酸乙酯(2×20mL)萃取，分离有机相并用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸干。用乙酸乙酯/石油醚＝1∶1的柱色谱法纯化，得到19mg所需化合物A-7-14，收率：49％。LC-MS m/z＝478.0[M+1]+。

化合物A-10-n的合成路线

4-(1-(4-((4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基)-8-氨基咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚烷苄基-1-基氨基甲酸A-8

4-(8-氨基-1-碘咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸苄酯A-4(300mg，0.6mmoD，4-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯硼酸II-3(229mg，0.738mmol)，Pd[PPh₃]₄(69mg，0.06mmol)和Cs₂O₃(239mg，0.738mmol)在DME∶H₂O(2.5mL∶0.5mL)的混合溶剂中加热到80℃过夜。浓缩，用甲醇/DCM(1∶30)柱层析法对其进行纯化。获得265毫克所需化合物A-8，产率：69％。

4-(8-氨基-3-(4-氨基双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-9

将化合物A-8(265mg，0.42mmol)在DCM/TFA(10mL∶10mL)混合溶剂的溶液加热到60℃ 18小时。蒸干后加入DCM(2x20mL)，浓缩。剩余物溶于DCM(30mL)中，加入HCl二恶烷溶液中，蒸干，加入DCM(2X20毫升)，浓缩后加入异丙醚(30mL)，搅拌2小时，过滤和用异丙醚洗涤(2X10mL)，得到196mg所需的产品A-9的盐酸盐，未经纯化直接用于下一步。

(E)-4-(8-氨基-3-(4-(4-甲氧基-丁-2-烯酰胺基)双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-10-1

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HATU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16，0.12mmol)和(E)-4-甲氧基丁-2-烯酸(2.8mg，0.024mmol)的DMF(1mL)溶液在室温下搅拌1小时，将其倒入水(5mL)中并用乙酸乙酯(2X5mL)萃取，将有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，分离有机相。用无水Na₂SO₄干燥，过滤并蒸干。将其通过柱色谱法纯化，用DCM/MeOH＝20∶1洗脱，得到5mg产物A-10-1，产率：35％。LC-MS m/z＝606.1[M+1]+。

(E)-4-(8-氨基-3-(4-(4-(四氢吡咯-1-基)丁-2-烯酰胺基)双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-10-2

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和(E)-4-(四氢吡咯-1-基)-丁-2-烯酸(4mg，0.024mmol)在DMF(1mL)的溶液中在室温下搅拌1小时，倒入水中(5ml)，用乙酸乙酯(2x5ml)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到6mg产品A-10-2，产率：38％。LC-MS m/z＝645.0[M+1]+。

4-(3-(4-丙烯酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)-8-氨基咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-10-3

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和丙烯酸(2mg，0.024mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水(1ml)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到5mg产品A-10-3，产率：38％。LC-MS m/z＝562.0[M+1]+。

4-(3-(4-乙酰胺基双环[2.2.1]庚-1-基)-8-氨基咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-10-4

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和乙酸(1.5mg，0.024mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水(1ml)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到4mg产品A-10-4，产率：31％。LC-MS m/z＝550.0[M+1]+。

N-(4-(1-(4-(4-(三氟甲基)-吡啶-2-基)-氨基甲酰基苯基)-8-氨基咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)-3-甲基环氧丙烷基-3-甲酰胺A-10-5

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和3-甲基环氧丙烷-3-羧酸(3mg，0.024mmol)的DMF(1ml)的溶液中在室温下搅拌1小时，倒入水(5mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)，有机相洗涤的饱和NaCl水溶液，有机相分离和用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到6mg产品A-10-5，产率：40％。LC-MS m/z＝606.1[M+1]+。

4-(8-氨基-3-(4-(2-羟基-2-甲基丙酰胺)双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-10-6

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和2-羟-2-甲基丙酸(2.5mg，0.024mmol)在室温下被搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到6mg产品A-10-6，产率：41％。LC-MS m/z＝594.1[M+1]+。

4-(8-氨基-3-(4-(2-甲氧基乙酰胺基)双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-10-7

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和2-甲氧基乙酸(2mg，0.024mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到5mg产品A-10-7，产率：36％。LC-MS m/z＝580.1[M+1]+。

4-(8-氨基-3-(4-(3-甲氧基丙酰胺基)双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-10-8

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和3-甲氧基丙酸(2.5mg，0.024mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到5mg产品A-10-8，产率：35％。LC-MS m/z＝594.1[M+1]+。

4-(8-氨基-3-(4-(1-羟基环丙烷甲酰胺基)双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-10-9

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和1-羟基环丙烷甲酸(2.5mg，0.024mmol)的DMF(1ml)在室温下搅拌1小时，倒入水(5mL)，用乙酸乙酯(2X5毫升)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到5mg产品A-10-9，产率：36％。LC-MS m/z＝592.0[M+1]+。

4-(8-氨基-3-(4-(2-吗啉乙酰胺基)双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-10-10

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和2-吗啉乙酸(3.5mg，0.024mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到7mg产品A-10-10，产率：47％。LC-MS m/z＝635.0[M+1]+。

N-(4-(1-(4-(4-(三氟甲基)吡-2-基)-氨基甲酰基苯基)-8-氨基咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)-四氢呋喃-2-甲酰胺A-10-11

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和四氢呋喃-2-甲酸(2.8mg，0.024mmol)的DMF(1mL)中在室温下搅拌1小时，倒入水中(5mL)，用乙酸乙酯(2X5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到5mg产品A-10-11，产率：35％。LC-MS m/z＝606.0[M+1]+。

4-(8-氨基-3-(4-(1-氰基环丙烷甲酰胺基)双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-10-12

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和1-氰基环丙烷甲酸(2.7mg，0.024mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯萃取(2X5mL)，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到6mg产品A-10-12，产率：42％。LC-MS m/z＝601.3[M+1]+。

4-(8-氨基-3-(4-(2-氰基乙酰胺)双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-10-13

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和2-氰基乙酸(2mg，0.024mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到6mg产品A-10-13，产率：44％。LC-MS m/z＝575.2[M+1]+。

4-(8-氨基-3-(4-(2-氰基丙酰胺)双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺A-10-14

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和2-氰基丙酸(2.4mg，0.024mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到5mg产品A-10-14，产率：36％。LC-MS m/z＝589.3[M+1]+。

N-(4-(1-(4-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)-氨基甲酰基苯基)-8-氨基咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)-4-氰基四氢-2H-吡喃-4-甲酰胺A-10-15

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和4-氰基四氢-2H-吡喃-4-羧酸(3.7mg，0.024mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到6mg产品A-10-15，产率：39％。LC-MSm/z＝645.0[M+1]+。

1-(4-(1-(4-(4-三氟甲基)吡啶2基)氨基甲酰基苯基)-8-氨基咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)氨基甲酰基)环丙烷甲酸A-10-16

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和环丙烷-1，1-二羧酸(3mg，0.024mmol)的DMF(1mL)溶液中在室温下搅拌1小时，倒入水中(5mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到6mg产品A-10-16，产率：40％。LC-MS m/z＝555.3[M+1]+。

N-(4-(1-(4-(4-三氟甲基)吡啶2基)氨基甲酰基苯基)-8-氨基咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)苯甲酰胺A-10-17

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和苯甲酸(3mg，0.024mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到8mg产品A-10-17，产率：53％。LC-MS m/z＝612.2[M+1]+。

N-(4-(1-(4-(4-三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基苯基)-8-氨基咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)-吡啶-2-甲酸胺A-10-18

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和2-吡啶甲酸(3mg，0.024mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯萃取(2x5mL)，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到9mg产品A-10-18，产率：60％。LC-MS m/z＝613.2[M+1]+。

N-(4-(1-(4-(4-三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基苯基)-8-氨基咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)烟酰胺A-10-19

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和烟酸(3mg，0.024mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到8mg产品A-10-19，产量：54％。LC-MS m/z＝613.2[M+1]+。

N-(4-(1-(4-(4-三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基苯基)-8-氨基咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)-2-甲氧基苯甲酰胺A-10-20

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和2-甲氧基苯甲酸(3.6mg，0.024mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到8mg产品A-10-20，产率：52％。LC-MS m/z＝642.3[M+1]+。

N-(4-(1-(4-(4-三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基苯基)-8-氨基咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)呋喃-2-甲酰胺A-10-21

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和呋喃-2-羧酸(2.7mg，0.024mmol)的DMF(1mL)中在室温下搅拌1小时，倒入水中(5mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到6mg产品A-10-21，产率：43％。LC-MS m/z＝602.2[M+1]+。

N-(4-(1-(4-(4-三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基苯基)-8-氨基咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)噻唑-2-甲酰胺A-10-22

将化合物A-9(15mg，0.024mmol)，HTAU(9.12mg，0.024mmol)，DIEA(16mg，0.12mmol)和噻唑-2-羧酸(3mg，0.024mmol)的DMF(1mL)中在室温下搅拌1小时，倒入水中(5mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到6mg产品A-10-22，产率：40％。LC-MS m/z＝619.2[M+1]+。

化合物A-13-n的合成路线

苄基4-(8-氨基-1-(4-苯氧苯基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸A-11

4-(8-氨基-1-碘咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸A-4(300mg，0.6mmol)，4-苯氧苯酸(158mg，0.738mmol)，Pd[PPh₃]₄(69mg，0.06mmol)和Cs₂O₃(239mg，0.738mmol)在DME∶H₂O(2.5mL∶0.5mL)的混合溶剂中加热到80℃过夜。浓缩后采用柱层析法纯化，得到268毫克所需化合物A-11，产率：82％。

3-(4-氨基双环[2.2.1]庚-1-基)-1-(4-苯氧苯基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-8-胺A-12

化合物A-11(260mg，0.48mmol)在DCM/TFA(10mL∶10mL)混合溶剂中加热到60℃搅拌18小时。蒸干后加入DCM(2x20mL)，浓缩。剩余物溶解在DCM(30mL)中，加入HCl二恶烷溶液，蒸干并加入DCM(2x20mL)。浓缩并加入异丙醚(30mL)，搅拌2小时，过滤和用异丙醚洗涤(2x10mL)，得到200mg所需的产品A-12的盐酸盐，未经纯化直接用于下一步。

N-(4-(8-氨基-1-(4-苯氧苯基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺A-13-1

将化合物A-12(15mg，0.025mmol)，HATU(9.3mg，0.025mmol)，DIEA(19mg，0.15mmol)和2-羟基-2-丙酸(3mg，0.029mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙基乙酯萃取(2x5mL)，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到8mg产品A-13-1，产率：57％。LC-MS m/z＝498.4[M+1]+。

N-(4-(8-氨基-1-(4-苯氧苯基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)-3-甲氧基丙酰胺A-13-2

将化合物A-12(15mg，0.025mmol)，HATU(9.3mg，0.025mmol)，DIEA(19mg，0.15mmol)和3-甲氧基丙酸(3mg，0.029mmol)在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到6mg产品A-13-2，产率：40％。LC-MS m/z＝498.7[M+1]+。

N-(4-(8-氨基-1-(4-苯氧苯基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)-3-甲基环氧丙烷-3-甲酰胺A-13-3

将化合物A-12(15mg，0.025mmol)，HATU(9.3mg，0.025mmol)，DIEA(19mg，0.15mmol)和3-甲基环氧丙烷-3-羧酸(3.4mg，0.029mmol)的DMF(1mL)中在室温下搅拌1小时，倒入水中(5mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到8mg产品A-13-3，产率：53％。LC-MS m/z＝510.2[M+1]+。

N-(4-(8-氨基-1-(4-苯氧苯基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)-2-吗啉乙酰胺A-13-4

将化合物A-12(15mg，0.025mmol)，HATU(9.3mg，0.025mmol)，DIEA(19mg，0.15mmol)和2-吗啉乙酸(4.2mg，0.029mmol)在DMF(1mL)中室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到9mg产品A-13-4，产率：58％。

化合物A-16-n的合成路线

苄基4-(8-氨基-1-(4-(5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺)苯基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基-氨基甲酸A-14

将4-(8-氨基-1-碘咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸A-4(300mg，0.6mmol)，N-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼戊环-2-基)苄)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺II-12(284mg，0.738mmol)，Pd[PPh₃]₄(69mg，0.06mmol)和Cs₂O₃(239mg，0.738mmol)在DME∶H₂O(2.5mL∶0.5mL)的混合溶剂中加热到80℃搅拌过夜。浓缩后采用柱层析法纯化，得到285毫克所需化合物A-14，产率：75％。

N-(4-(8-氨基-3-(4-氨基双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)苯基)甲基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺A-15

化合物A-14(280mg，0.44mmol)在DCM/TFA(10mL∶10毫升)混合溶剂的溶液中加热到60℃搅拌18小时。蒸干并加入DCM(2x20mL)，浓缩。剩余物溶解在DCM(30mL)中，加入HCl的二恶烷溶液(10mL)，蒸干并加入DCM(2x20mL)。浓缩后加入异丙醚(30mL)，搅拌2小时，过滤和用异丙醚洗涤(2x10mL)，得到180mg所需的产品A-15的盐酸盐，未经纯化直接用于下一步。

N-(4-(8-氨基-3-(4-(2-羟基-2-甲基丙酰胺)双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)苯基)甲基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺A-16-1

将化合物A-15(15mg，0.025mmol)，HATU(9.3mg，0.025mmol)，DIEA(19mg，0.15mmol)和2-羟-2-丙酸(2.6mg，0.025mmol)在DMF(1mL)中室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯萃取(2x5mL)，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到6mg产品A-16-1，产率：40％。LC-MS m/z＝587.3[M+1]+。

N-(4-(8-氨基-3-(4-(3-甲氧基丙酰胺)双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)苯基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺A-16-2

将化合物A-15(15mg，0.025mmol)，HATU(9.3mg，0.025mmol)，DIEA(19mg，0.15mmol)和3-甲氧基丙酸(2.6mg，0.025mmol)在DMF(1mL)中室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到8mg产品A-16-2，产率：40％。LC-MS m/z＝587.3[M+1]+。

N-(4-(8-氨基-1-(4-(5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺)苯基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-3-基)双环[2.2.1]庚-1-基)-3-甲基环氧丙烷-3-甲酰胺A-16-3

将化合物A-15(15mg，0.025mmol)，HATU(9.3mg，0.025mmol)，DIEA(19mg，0.15mmol)和3-甲基环氧丙烷-3-羧酸(2.9mg，0.025mmol)的DMF(1mL)中在室温下搅拌1小时，倒入水中(5mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到10mg产品A-16-3，产率：66％。LC-MS m/z＝599.3[M+1]+。

N-(4-(8-氨基-3-(4-(2-吗啉乙酰胺)双环[2.2.1]庚-1-基)咪唑并[1，5-a]吡嗪-1-基)苯基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺A-16-4

将化合物A-15(15mg，0.025mmol)，HATU(9.3mg，0.025mmol)，DIEA(19mg，0.15mmol)和2-吗啉乙酸(3.6mg，0.025mmol)在DMF(1mL)中室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到9mg产品A-16-4，产量：57％。LC-MS m/z＝628.3[M+1]+。

化合物B-6-n的合成路线

苄基4-(5-(4-(4-三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基苯基)-4-氨基-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶-7-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸B-4

将化合物B-3(200mg，0.4mmol)，4-(4-(三氟甲基)吡啶2-基)氨基甲酰基)苯硼酸II-3(152mg，0.49mmol)，Pd[PPh₃]₄(46mg，0.04mmol)和Cs₂CO₃(159mg，0.49mmol)在DME∶H₂O(2.5mL∶0.5mL)的混合溶剂中加热到80℃过夜。浓缩后剩余物用甲醇/DCM(1∶40)柱层析纯化。得到187mg所需化合物B-4，产率：73％。

4-(4-氨基-7-(4-氨基双环[2.2.1]庚-1-基)-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶-5-基)-N(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺B-5

化合物B-4(187mg，0.29mmol)在DCM/TFA(10mL∶10mL)混合溶剂中加热到60℃ 18小时。蒸干并加入DCM(2x20mL)，浓缩。剩余物中再加入DCM(30mL)，加入盐酸二恶烷溶液中(10mL)，蒸干，重新加入DCM(2X20毫升)，再蒸干。加入异丙醚(30mL)，搅拌2小时，过滤和用异丙醚洗涤(2x10mL)，得到所需的产品B-5的盐酸盐，未经纯化直接用于下一步反应。

4-(4-氨基-7-(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶-5-基)-N(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺B-6-1

将化合物B-5(19mg，0.031mmol)，HATU(12mg，0.031mmol)，DIEA(24mg，0.19mmol)和丁-2-炔酸(2.6mg，0.031mmol)的DMF(1mL)溶液在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到11mg产品B-6-1，产率：59％。LC-MS m/z＝574.3[M+1]+。

4-(4-氨基-7-(4-(2-羟基-2-甲基丙酰胺)双环[2.2.1]庚-1-基)-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶-5-基)-N(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺B-6-2

将化合物B-5(19mg，0.031mmol)，HATU(12mg，0.031mmol)，DIEA(24mg，0.19mmol)和2-羟基-2-甲基丙酸(3.2mg，0.031mmol)的DMF(1mL)溶液在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到9mg产品B-6-2，产率：49％。LC-MSm/z＝594.2[M+1]+。

4-(4-氨基-7-(4-(3-甲氧基丙酰胺)双环[2.2.1]庚-1-基)-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶-5-基)-N(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺B-6-3

将化合物B-5(19mg，0.031mmol)，HATU(12mg，0.031mmol)，DIEA(24mg，0.19mmol)和3-甲氧基丙酸(3.2mg，0.031mmol)的DMF(1mL)溶液在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到12mg产品B-6-3，产率：66％。LC-MS m/z＝594.2[M+1]+。

N-(4-(5-(4-(4-(三氟甲基)吡啶2基)氨基甲酰基苯基)-4-氨基-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶-7-基)双环[2.2.1]庚-1-基)-3-甲基环氧丙烷-3-甲酰胺B-6-4

将化合物B-5(19mg，0.031mmol)，HATU(12mg，0.031mmol)，DIEA(24mg，0.19mmol)和3-甲基环氧丙烷-3-羧酸(3.6mg，0.031mmol)的DMF(1mL)溶液在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到12mg产品B-6-4，产率：64％。LC-MS m/z＝606.3[M+1]+。

4-(4-氨基-7-(4-(2-吗啉乙酰胺)双环[2.2.1]庚-1-基)-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶-5-基)-N(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺B-6-5

将化合物B-5(19mg，0.031mmol)，HATU(12mg，0.031mmol)，DIEA(24mg，0.19mmol)和2-吗啉乙酸(4.5mg，0.031mmol)的DMF(1mL)溶液在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到11mg产品B-6-5，产率：58％。LC-MS m/z＝635.2[M+1]+。

化合物C-7-n的合成路线

苄基4-(7-(4-(4-三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基苯基)-6-氨基-8-羰基-7，8-二氢嘌呤-9-基)双环[2.2.1]庚-1-基氨基甲酸C-5

将化合物C-4(100mg，0.25mmol)，4-(4-(三氟甲基)吡啶2基)氨基甲酰基)苯硼酸II-3(160mg，0.5mmol)，醋酸铜(60mg，0.3mmol)和Et₃N(30mg，0.3mmol)在DCM(10毫升)中在室温下搅拌24小时。倒入水中(20mL)，用乙酸乙酯(2x10mL)萃取。有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干，用柱层析法纯化EA/PE＝1∶1～EA。得到47mg所需的化合物C-5，产率：29％。LC-MS m/z＝657.3[M-1]^-。

4-(6-氨基-9-(4-氨基双环[2.2.1]庚-1-基)-8-羰基-8，9-二氢嘌呤-7-基)-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺C-6

将化合物C-5(45mg，0.09mmol)在DCM/TFA(10mL∶10mL)混合溶剂中加热到60℃ 18小时。蒸干并且加入DCM(2x20mL)，浓缩。剩余物溶解在DCM(30mL)中，加入盐酸二恶烷溶液中(10mL)，蒸干后再加DCM(2x20mL)，浓缩后加入异丙醚(30mL)，搅拌2小时，过滤和用异丙醚(2x10毫升)洗涤，得到所需的产品C-6的盐酸盐，未经纯化直接用于下一步。

4-(6-氨基-9-(4-丁-2-炔酰胺双环[2.2.1]庚-1-基)-8-羰基-8，9-二氢嘌呤-7-基)-N(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺C-7-1

将化合物C-6(13mg，0.022mmol)，HATU(9mg，0.022mmol)，DIEA(16.8mg，0.13mmol)和丁-2-炔酸(1.8mg，0.022mmol)的DMF(1mL)的溶液中在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，有机相分离，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到5mg产品C-7-1，产率：38％。LC-MSm/z＝591.2[M+1]+。

4-(6-氨基-9-(4-(2-吗啉乙酰胺)双环[2.2.1]庚-1-基)-8-羰基-8，9-二氢嘌呤-7-基)-N(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺C-7-2

将化合物C-6(13mg，0.022mmol)，HATU(9mg，0.022mmol)，DIEA(16.8mg，0.13mmol)和2-吗啉乙酸(3.2mg，0.022mmol)的DMF(1mL)溶液在室温下搅拌1小时，倒入水中(1mL)，用乙酸乙酯(2x5mL)萃取，有机相用饱和NaCl水溶液冲洗，分离有机相，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和蒸干。用柱层析法纯化DCM/MeOH＝20∶1，得到6mg产品C-7-2，产率：42％。LC-MS m/z＝652.2[M+1]+。

化合物D-8-n的合成路线

苄基4-(3-(4-(4-三氟甲基)吡啶2基)氨基甲酰基苯基)-4-氨基-1H-吡咯[3，4-d]嘧啶1-基)双环[2.2.1]庚烷-1-基氨基甲酸D-6

将D-5(96mg，0.19mmol)，II-3(73mg，0.234mmol)，Pd[PPh₃]₄(22mg，0.019mmol)，Cs₂CO₃(76.4mg，0.234mmol)在DME/H2O(9mL/1mL)的混合液用N₂脱氧1min后在封管中加热到80℃搅拌12h。冷却后，用盐水(20mL)淬火反应，用EA(2x50mL)萃取。有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤和浓缩。残留物用硅胶柱层析纯化，由用PE/EA(1∶1)洗脱，得到所需的产品D-6(42mg，34.4％)。LC-MS m/z＝643.2[M+1]+。

4-(4-氨基-1-(4-氨基双环[2.2，1]庚烷-1-基)-1H-吡咯[3，4-d]嘧啶-3-基)-N(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯酰胺D-7

将D-6(42mg，0.065mmol)在TFA/DCM(1mL/1mL)的混合物在60℃搅拌12h。冷却后，蒸干溶剂，加入二恶烷(2mL)的HCl溶液，搅拌10min，浓缩。残留物加入异丙醚(10mL)，搅拌，再浓缩。重复上述程序两次。固体被过滤和洗与异丙醚，干燥，得到所需的产品D-7的HCl盐(30mg，75％)。

4-(4-氨基-1-(4-丁-2-炔基氨基双环[2.2.1]庚烷-1-基)-1H-吡咯[3，4-d]嘧啶-3-基)-N(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯酰胺D-8-1

将D-7(15mg，0.025mmol)、丁-2-炔酸(2mg，0.024mmol)、HATU(9.1mg，0.024mmol)和DIEA(0.041mL，0.241mmol)在DMF(1mL)中的混合液在室温下搅拌4h。反应液用EA(30mL)稀释，用盐水洗涤，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩。残留物用硅胶柱层析纯化，用PE/EA(1∶1)洗脱，得到所需的产品D-8-1(12mg，86％)。LC-MS m/z＝575.1[M+1]+。

4-(4-氨基-1-(4-(2-吗啉乙酰胺基)双环[2.2.1]庚烷-1-基)-1H-吡咯[3，4-d]嘧啶-3-基)-N(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)苯酰胺D-8-2

将D-7(15mg、0.025mmol)、2-吗啉乙酸(3.5mg、0.024mmol)、HATU(9.1mg、0.024mmol)和DIEA(0.041mL、0.241mmol)在DMF(1mL)的混合液在室温下搅拌4h。反应用EA(30mL)稀释，用盐水洗涤，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩。残留物用硅胶柱层析纯化，用PE/EA(1∶1)洗脱，得到所需的产品D-8-2(8.5mg，56％)。LC-MS m/z＝636.3[M+1]+。

1.对BTK(wt)/BTK(C481S)的体外抑制活性(IC50值的测定)

(1)实验方法

底物溶液的配制是将底物聚(Glu，Tyr)钠盐(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)加入到底物反应缓冲液(20mM Hepes(pH 7.5)，10mM MgCl2，1mM EGTA，0.02％Brij35，0.02mg/ml BSA，0.1mM Na₃VO₄，2mM DTT和1％DMSO)中(最终底物在反应中的浓度是0.2uM)。将测试化合物用100％DMSO配制成10mM浓度的储备液中，并在384孔循环烯烃共聚物LDV微量培养板中进行10次剂量的3倍连续稀释。将BTK(WT)或者BTK(C481S)激酶(重组人源全长蛋白，组氨酸标签，在昆虫细胞中表达，Invitrogen，Carlsbad，CA)加入底物溶液中并轻轻混合(最终BTK在反应中的浓度为8nM)。然后，通过声学液体转移技术(Echo550；纳升范围)(LabcyteInc，Sunnyvale，CA)将100％DMSO中的测试化合物加入到激酶反应混合物中，并在室温下温育20分钟。将33P-ATP(特定活性10μCi/μl)加入到反应混合物中以引发反应，随后在室温下孵育2小时。取小部分反应液点在P-81离子交换滤纸(Whatman)上。用0.75％磷酸缓冲液洗去滤纸上未结合的磷酸盐(三次)并干燥后，测量留在滤纸上的放射性。激酶活性数据用测试样品中剩余激酶活性与载体(二甲基亚砜)空白反应的百分比来表示。使用Prism(GraphPad Software)软件对获得数据进行曲线拟合来计算IC 50值。

(2)实验结果

本发明所术大部分化合物拥有比第二代BTK抑制剂Acalabrutinib更强的对BTK(WT)野生型酶活性的抑制能力，更为重要的是绝大部分化合物对BTK(C481S)突变体显示出更杰出的抑制活性，有的甚至小于0.1nM。

表1.BTK(wt)/BTK(C481S)酶活性的抑制结果：A≤0.1nM；0.1nM＜B≤1nM；1nM＜C≤10nM；10nM＜D≤50nM；

2.体外肿瘤细胞增殖抑制实验

(1)实验方法

●将肿瘤细胞系(TMD-8/OCY-LY10)悬浮于RPMI1640+FBS10％中，在37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养。定期传代，取处于对数生长期的细胞用于铺板。

●用台盼兰进行细胞染色并计数活细胞。

●用培养基调节细胞浓度至7000/孔。

●添加90μl细胞悬浮液至96孔板中，在空白对照空中加入不含细胞的培养液。

●将96孔板中的细胞置于37℃，5％CO₂，及100％相对湿度的培养箱中培养过夜。

●制备400X化合物存储板：将待测化合物和参照药物用DMSO溶解，从最高浓度(400uM)3X梯度稀释至最低浓度(0.61uM)。

●10X化合物工作液的配制：在V形底的96孔板中加入78μL细胞培养液，从400X化合物存储板中吸取2μL化合物加入96孔板的细胞培养液中。在溶媒对照和空白对照中加入2μL DMSO。加入化合物或DMSO后用排枪吹打混匀。

●加药：取10μL的10X化合物工作液按表1所示加入到细胞培养板中。在溶媒对照和空白对照中加入10μL DMSO-细胞培养液混合液。DMSO终浓度为0.25％。

●将96孔细胞板放回培养箱中培养72h。

●将CellTiter-Glo缓冲液融化并放置至室温。

●将CellTiter-Glo底物放置至室温。

●在一瓶CellTiter-Glo底物中加入CellTiter-Glo缓冲液以溶解底物，从而配制CellTiter-Glo工作液。

●缓慢涡旋震荡使充分溶解。

●取出细胞培养板放置30分钟使其平衡至室温。

●在每孔中加入50μL(等于每孔中细胞培养液一半体积)的CellTiter-Glo工作液。用铝箔纸包裹细胞板以避光。

●将培养板在轨道摇床上振摇2分钟以诱导细胞裂解。

●培养板在室温放置10分钟以稳定发光信号。

●在2104 EnVision读板器上检测发光信号。

●数据分析：用下列公式来计算检测化合物的抑制率(Inhibition rate，IR)：IR(％)＝(1-(RLU化合物-RLU空白对照)/(RLU溶媒对照-RLU空白对照))*100％。在Excel中计算不同浓度化合物的抑制率，然后用GraphPad Prism软件作抑制曲线图和计算IC50。

(2)实验结果

对B细胞淋巴瘤细胞TMD-8及OCI-LY10的增殖抑制实验中，化合物A-10-10与Ibrutinib表现出很强的肿瘤细胞增殖抑制活性。

表2.化合物A-10-10/Ibrutinib的肿瘤细胞增殖抑制活性结果：

3.药代动力学研究

(1)实验方法

雄性SD大鼠，试验前过夜禁食。试验药物混悬于去离子水配制的0.5％甲基纤维素(MC)，0.1％的SDS中(w/w/v)，悬浊液浓度分别为1mg/mL，以5mL/kg灌胃给药。给药后15分钟，30分钟和1，2，4，6，8及24小时通过动物眼眶静脉丛采集约0.4mL，全血放入肝素抗凝管中，每个时间点采集三只动物并处死，样品的采集在不同个体完成。全血样品将在15分钟内进行离心，离心在4℃，4200转的条件下离心5分钟。所有血浆样品在分析前保存于-80±15℃的冰箱内。样品分析前先建立一个测定化合物的LC-MS/MS(Waters I Class UPLC串联Xevo TQD质谱)测定方法。通过对采集的血浆进行定量分析。动物的血浆浓度-时间数据用WinNonlin(专业版，版本5.2)软件进行分析。非房室模型用于浓度分析。计算受试化合物的药代动力学参数。

成年雄性比格犬(3只)，试验前过夜禁食。试验药物混悬于去离子水配制的0.5％甲基纤维素(MC)，0.1％的SDS中(w/w/v)，悬浊液浓度分别为1mg/mL，以5mL/kg灌胃给药。给药后15分钟，30分钟和1，2，4，6，8及24小时采血。动物通过水合氯醛浅麻醉，用玻璃采血管于前肢静脉采血约0.5mL全血，放于肝素抗凝管中，样品于4℃，4200转的条件下离心5分钟。所有血浆样品在分析前保存于-80±15℃的冰箱内。样品分析前先建立一个测定化合物的LC-MS/MS(Waters I Class UPLC串联Xevo TQD质谱)测定方法。通过对采集的血浆进行定量分析。动物的血浆浓度-时间数据用WinNonlin(专业版，版本5.2)软件进行分析。非房室模型用于浓度分析。计算受试化合物的药代动力学参数。

(2)实验结果

化合物A-10-10，灌胃给药(5mg/kg)。化合物A-10-10表现出良好的吸收，Cmax分别为8323ng/mL和641ng/mL；而化合物A-10-10有着相当高的血液暴露量(AUC0-inf＝73318hr*ng/mL和14867hr*ng/mL)。

表3.大鼠/比格犬(雄性)灌胃给药(5mg/kg)药代动力学数据(t1/2-半衰期；Tmax达峰时间；Cmax最大血药浓度；AUC_0-INF指0-inf时间-浓度曲线下面积)

4.对BTK(wt)和BTK(C481S)转染细胞HEK293的pBTK抑制实验

Ibrutinib在临床中出现耐药的主要原因是由于BTK激酶发生C481S突变，开发能够有效抑制BTK(C481S)变异的细胞的BTK抑制剂对克服Ibrutinib耐药性有着重要意义。

(1)实验方法

●用全长人源BTK或BTK[C481S]载体瞬时转染HEK293人胚肾细胞。

●将细胞以预先确定的细胞密度分配到96孔板中。

●用100％DMSO将每个待测化合物进行八次3倍系列稀释。

●然后将化合物在组织培养基中稀释至10倍最终测定浓度和5％DMSO。

●将化合物加入到96孔板中的细胞中(在培养基中稀释10倍)，最终浓度为1X化合物和0.5％DMSO。对于正(高信号)对照，细胞用0.5％DMSO单独处理。对于负(低信号)对照，细胞用20uM Ibrutinib处理，最终浓度为0.5％DMSO。

●将细胞与化合物在37℃下孵育2小时。

●将细胞裂解，将裂解物转移至ELISA板上，板上先前涂有捕获底物(人源BTK或BTK[C481S])的抗体。

●洗涤板，然后与HRP连接的抗体孵育以检测总的酪氨酸磷酸化。

●将板洗涤，然后加入HRP底物。在450纳米下读取吸光度。

●基于阳性和阴性对照值的吸光度读数计算％抑制值，并根据以下公式：(％INH＝((阳性对照-样本)/(阳性对照-阴性对照))*100。

●Z′值基于以下公式计算：1-[(3*阳性标准偏差+3*阴性标准偏差)/(平均阳性-平均阴性)]。

●将％抑制值vs化合物浓度的对数用GraphPad Prism软件作图。

●利用S形剂量反应曲线拟合后测定IC50值。

(2)实验结果

C481S突变使得Ibrutinib对HEK293细胞BTK磷酸化的抑制从0.021μM下降到1.58μM，而本发明的化合物A-10-10除了对BTK(WT)转染的HEK293细胞有很强的抑制外(0.077μM)，对BTK(C481S)转染的HEK293细胞有着更强的抑制(0.066μM)。

表4.BTK(WT)及BTK(C481S)转染的HEK293细胞pBTK抑制值(IC50)

5.药效学实验1

(1)实验方法

免疫功能严重缺陷CB17/SCID雌性小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF动物房。人源OCI-LY10细胞(上海君瑞-UFBN0102)体外单层培养，培养条件为RPMI 1640培养基中加10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃，5％CO₂孵箱培养。一周两次进行常规处理传代。当细胞饱和度为80％-90％，数量到达要求时，收取细胞，计数。将0.2mL(1×10⁷个)OCI-LY10细胞(加基质胶，体积比为1∶1)皮下接种于每只小鼠的右后背，在植入一周左右即可测量出肿瘤大小。使用游标卡尺测量肿瘤的大小，并用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(长×宽²)/2。肿瘤平均体积达到109mm³时开始分组给药，将小鼠分为4组(每组8个动物)，即溶媒(5％DMSO+20％HP-β-CD)对照组，Ibrutinib灌胃给药组(25mg/kg，1次/日)和化合物A-10-10灌胃给药组(25mg/kg，50mg/kg，2次/日)。将Ibrutinib或化合物A-10-10溶解在5％DMSO+20％HP-β-CD中，以10ml/kg灌胃给药，连续给药28天。

(2)实验结果

化合物A-10-10和Ibrutinib在OCI-LY10移植肿瘤模型中显示出极强的抗肿瘤活性(图-1)。化合物A-10-10灌胃给药(剂量为25mg/kg，bid；50mg/kg，bid)能显著抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞株OCI-LY10的生长(TGI＝110％，110％；p＜0.001，p＜0.001)。给药21天后，50mg/kg实验组所有OCI-LY10移植瘤完全消失。给药28天后，25mg/kg实验组所有OCI-LY10移植瘤也完全消失。对照化合物Ibrutinib 25mg/kg组在28天的TGI值为94％(p＜0.001)。

受试物对荷瘤鼠的体重变化影响如图1。荷瘤鼠对受试药物A-10-10在所有剂量下都显示出良好的耐受性，所有治疗组均无明显体重下降。

6.药效学实验2

(1)实验方法

免疫功能严重缺陷CB17/SCID雌性小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF动物房。人源TMD-8细胞(上海君瑞-UFBN1682)体外单层培养，培养条件为RPMI 1640培养基中加10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃，5％CO₂孵箱培养。一周两次进行常规处理传代。当细胞饱和度为80％-90％，数量到达要求时，收取细胞，计数。将0.2mL(1×107个)TMD-8细胞(加基质胶，体积比为1∶1)皮下接种于每只小鼠的右后背，在植入一周左右即可测量出肿瘤大小。使用游标卡尺测量肿瘤的大小，并用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(长×宽²)/2。肿瘤平均体积达到107mm³时开始分组给药，将小鼠分为4组(每组8个动物)，即溶媒(5％DMSO+20％HP-β-CD)对照组，Ibrutinib灌胃给药组(25mg/kg，1次/日)和化合物A-10-10灌胃给药组(25mg/kg，50mg/kg，2次/日)。将Ibrutinib或化合物A-10-10溶解在5％DMSO+20％HP-β-CD中，以10ml/kg灌胃给药，连续给药27天。

(2)实验结果

化合物A-10-10和Ibrutinib在TMD-8移植肿瘤模型中显示出极强的抗肿瘤活性(图-2)。化合物A-10-10灌胃给药(剂量为25mg/kg，bid；50mg/kg，bid)能显著抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞株TMD-8的生长(TGI＝94％，104％；p＜0.001，p＜0.001)。给药27天后，50mg/kg实验组5/8 TMD-8移植瘤完全消失。对照化合物Ibrutinib 25mg/kg组的TGI值为90％(p＜0.001)。

受试物对荷瘤鼠的体重变化影响如图2。荷瘤鼠对受试药物A-10-10在所有剂量下都显示出良好的耐受性，所有治疗组均无明显体重下降。