CN112080492A - 一种高得率的游离dna和rna共抽提试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒及使用方法,包括含有GITC的裂解液、硅基纳米磁珠和漂洗液。本发明采用特殊的裂解液提高了游离DNA和RNA的得率,同时又保证了RNA的完整性;采用磁珠进行抽提简化了操作,节约时间,易于自动化,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别涉及一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒及使用方法。
背景技术
血清/血浆或其他体液中的游离核酸(cfNA,游离DNA和RNA,cfDNA&cfRNA)的遗传和表观遗传分析,为广泛的临床疾病如癌症、自身免疫性疾病、感染或胎儿的疾病的早期检测,提供了一个极难得的机会。绝大多数的患者体液中游离核酸含量非常低,片段小,提取过程中容易丢失,得率不高,使检测灵敏度降低,给后续检测带来很大挑战。目前,已有相关技术针对抽提游离DNA或游离RNA提出了改进方案和产品,但是同时检测游离DNA和RNA是一种新的需求,而cfDNA&cfRNA共抽提试剂盒少之又少,不能很好的满足检测的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒及使用方法,解决了现有技术多用吸附柱法,但通量低、不易自动化、成本相对较高的缺陷。
本发明提供了一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒,包括含有GITC的裂解液、硅基纳米磁珠和漂洗液。
所述含有GITC的裂解液的组成为:4-10M GITC,10-100mM Tris-HCl,1-10%SDS,5-15%TWEEN-20,1-2mM DTT。高浓度蛋白质变性剂GITC(四乙酰基-b-D-葡萄糖异硫氰酸酯)能快速破坏细胞膜,进而迅速抑制住细胞内的RNA酶,从而确保了RNA的完整性。
所述硅基纳米磁珠的浓度为10-100mg/mL。磁珠当高盐低pH值时结合核酸,当低盐高pH值时洗脱,可实现手动操作类似一管内抽提,实现抽提的自动化,不需要离心、转移等步骤,最大限度地降低核酸的丢失,提高核酸的得率。硅基纳米磁珠,粒径纳米级,具有超顺磁性,快速磁响应性,悬浮性好,沉降时间长,同时吸磁时间短,吸附量大,适用于微量样本、小片段DNA/RNA的分离纯化。
所述漂洗液的组成为:1-10mM Tris-HCl,50-80%异丙醇。所述漂洗液可以有效去除残留的杂质,避免核酸的丢失,提高核酸的得率。
本发明还提供了一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
首先向样本中加入含有GITC的裂解液和硅基纳米磁珠,涡旋混匀后室温震荡,静置后再加入漂洗液,涡旋混匀后室温震荡,静置后最后加入Elution Buffer,涡旋后静置进行检测。
所述样本与含有GITC的裂解液的体积比为1:1.5-2。
所述样本与硅基纳米磁珠的体积比为1:0.02-0.04。
所述样本与漂洗液的体积比为1:1-1.5。
所述样本与Elution Buffer的体积比为1:0.04-0.08。
有益效果
本发明采用特殊的裂解液提高了游离DNA和RNA的得率,同时又保证了RNA的完整性;采用磁珠进行抽提简化了操作,节约时间,易于自动化,相比于吸附柱方法通量更高,具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例中所用试剂盒的组成如下:
裂解液:5M GITC,50mM Tris-HCl,5%SDS,10%TWEEN-20,1mM DTT。硅基纳米磁珠,50mg/mL。漂洗液:2mM Tris-HCl、70%异丙醇。
实施例1
针对正常人血清样本,本发明与现有QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit方法抽提,管家基因GAPDH CT值比较。
1、样本准备:
取10例正常分离后的血清样本,每例4mL;每例血浆均分为2份,分别为2mL。
2、核酸提取:
2.1本方法
a.2ml样本中加入3ml裂解液和40μl硅基纳米磁珠,涡旋震荡混匀,置于混匀仪上,室温振荡6min。在振荡期间,每隔2分钟颠倒混匀5sec。
b.将上述样本管置于磁力架上,静置1min。静置结束后,小心移除上清,液面的泡沫也一并移除。
c.将上述样本管取下磁力架并加入2ml漂洗液,涡旋震荡混匀,瞬时离心,置于磁力架上,静置1min;静置结束后,小心移除上清,液面的泡沫也一并移除。重复此步骤一次。
d.将上述样本管置于磁力架上,开盖静置5min。磁珠干燥后将样本管取下磁力架,加入80ul Elution Buffer,涡旋打散磁珠。室温静置5min,期间每隔2分钟涡旋打散一次。
e.将上述样本管置于磁力架上,静置5min,将上清转移至新的Nuclease-free离心管中。
2.2对比方法
a.取2mL样本,加入到15mL尖底离心管中,分别加入200μL蛋白酶K。加入1.6mL ACL溶液,拧紧盖子,震荡混匀30s。转移至水浴锅中60℃,孵育30min。
b.取出离心管,加入3.6mL ACB溶液,拧紧盖子,震荡混匀20s。将离心管放置-20度冰箱中孵育5min。
准备好真空抽滤装置(插上一次性适配接头),插上QIAamp mini柱,再***一只20mL tube extender于QIAamp mini柱中。往20mL tube extender中加入15mL尖底离心管的液体,开启真空泵。
d.待液体抽干,拔掉并丢弃20mL tube extender,往QIAamp mini柱加入600μLACW1。
待液体抽干,往QIAamp mini柱加入750μL Buffer ACW2溶液。
待液体抽干,往QIAamp mini柱加入750μL乙醇溶液。
待液体抽干,取出QIAamp mini柱,置于一个干净的2mL收集管中,14000rpm离心3min。
e.取出QIAamp mini柱,置于新的2mL收集管中,打开QIAamp mini柱的盖子,转移至金属浴,56℃干燥10分钟。
取出QIAamp mini柱,置于新的1.5mL试剂盒自带洗脱管中,加入42μL AVE溶液,盖上管盖,室温静置5min。
4000rpm离心1min,重复操作1次。
f.14000rpm离心1min,丢弃QIAamp mini柱,盖好1.5mL洗脱管盖。
3、检测:
将获得的游离核酸利用管家基因GAPDH进行荧光定量PCR验证,根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果。与采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取的游离核酸的检测结果进行比较,两种方法的CT值间存在差异,通过管家基因的qPCR验证,可以判断本实施例抽提技术效果略高于QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit,获得的核酸浓度大,得率高。而本方法更易于自动化和实现高通量提取。
结果如下表所示:
实施例2
针对含病原菌血清样本,本发明与现有QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit方法抽提,内参16srRNA基因CT值比较。
1、样本准备:
取10例正常分离后的含病原菌血清样本,每例4mL;每例血浆均分为2份,分别为2mL。
2、核酸提取:
2.1本方法
a.2ml样本中加入3ml裂解液和40μl硅基纳米磁珠,涡旋震荡混匀,置于混匀仪上,室温振荡6min。在振荡期间,每隔2分钟颠倒混匀5sec。
b.将上述样本管置于磁力架上,静置1min。静置结束后,小心移除上清,液面的泡沫也一并移除。
c.将上述样本管取下磁力架并加入2ml漂洗液,涡旋震荡混匀,瞬时离心,置于磁力架上,静置1min;静置结束后,小心移除上清,液面的泡沫也一并移除。重复此步骤一次。
d.将上述样本管置于磁力架上,开盖静置5min。磁珠干燥后将样本管取下磁力架,加入80μL Elution Buffer,涡旋打散磁珠。室温静置5min,期间每隔2分钟涡旋打散一次。
e.将上述样本管置于磁力架上,静置5min,将上清转移至新的Nuclease-free离心管中;
2.2对比方法
a.取2mL样本,加入到15mL尖底离心管中,分别加入200μL蛋白酶K。加入1.6mL ACL溶液,拧紧盖子,震荡混匀30s。转移至水浴锅中60℃,孵育30min。
b.取出离心管,加入3.6mL ACB溶液,拧紧盖子,震荡混匀20s。将离心管放置-20度冰箱中孵育5min。
准备好真空抽滤装置(插上一次性适配接头),插上QIAamp mini柱,再***一只20mL tube extender于QIAamp mini柱中。往20mL tube extender中加入15mL尖底离心管的液体,开启真空泵。
d.待液体抽干,拔掉并丢弃20mL tube extender,往QIAamp mini柱加入600μLACW1。
待液体抽干,往QIAamp mini柱加入750μL Buffer ACW2溶液。
待液体抽干,往QIAamp mini柱加入750μL乙醇溶液。
待液体抽干,取出QIAamp mini柱,置于一个干净的2mL收集管中,14000rpm离心3min。
e.取出QIAamp mini柱,置于新的2mL收集管中,打开QIAamp mini柱的盖子,转移至金属浴,56℃干燥10分钟。
取出QIAamp mini柱,置于新的1.5mL试剂盒自带洗脱管中,加入42μL AVE溶液,盖上管盖,室温静置5min。
4000rpm离心1min,重复操作1次。
f.14000rpm离心1min,丢弃QIAamp mini柱,盖好1.5mL洗脱管盖。
3、检测:
将获得的游离核酸利用内参16srRNA基因进行荧光定量PCR验证,根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果。与采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取的游离核酸的检测结果进行比较,两种方法的CT值间存在差异,通过内参基因的qPCR验证,可以判断本实施例抽提技术效果高于QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit,获得的核酸浓度大,得率高。
Claims (9)
1.一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒,其特征在于:包括含有GITC的裂解液、硅基纳米磁珠和漂洗液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述含有GITC的裂解液的组成为:1-10MGITC,10-100mM Tris-HCl,1-10%SDS,5-15%TWEEN-20,1-2mM DTT。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述硅基纳米磁珠的浓度为10-100mg/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述漂洗液的组成为:1-10mM Tris-HCl,50-80%异丙醇。
5.一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
首先向样本中加入含有GITC的裂解液和硅基纳米磁珠,涡旋混匀后室温震荡,静置后再加入漂洗液,涡旋混匀后室温震荡,静置后最后加入Elution Buffer,涡旋后静置进行检测。
6.根据权利要求5的使用方法,其特征在于:所述样本与含有GITC的裂解液的体积比为1:1.5-2。
7.根据权利要求5的使用方法,其特征在于:所述样本与硅基纳米磁珠的体积比为1:0.02-0.04。
8.根据权利要求5的使用方法,其特征在于:所述样本与漂洗液的体积比为1:1-1.5。
9.根据权利要求5的使用方法,其特征在于:所述样本与Elution Buffer的体积比为1:0.04-0.08。
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