CN116286798B - 一种适用于细菌dna提取纯化的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒及方法,所述试剂盒包括:含有破碎珠的裂解液,磁珠,清洗液1,清洗液2与洗脱液。本发明的试剂盒与方法兼容革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的通用型DNA提取纯化,克服了现有细菌提取试剂盒针对阳性菌和阴性菌不同操作,阳性菌额外搭配试剂,分步加热等复杂步骤的一系列问题,同时全流程只需20‑30min,与过柱法相比较,本发明还摆脱了对高速离心机的依赖,有利于进一步集成批量化提取。
Description
技术领域
本发明涉及DNA提取纯化,尤其涉及一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒及方法。
背景技术
核酸提取是指用物理,化学和生物的方法从样本中分离纯化出核酸的过程,提取后的核酸质量,纯度对下游的应用十分重要。传统的实验室方法有酚-氯仿法,碱裂解法,滤膜离心柱法等,传统方法操作复杂,污染概率高。现代的商品试剂盒主要是硅胶模离心柱法和磁珠法,硅胶模离心柱法提取产物一般浓度高,价格低廉,但是需要配合高速离心机使用,磁珠法容易实现自动化,也可以不依赖大型仪器设备,操作简单,提取产物与下游分子检测的兼容性也较好。
现有常规提取方法的流程为:1)离心富集细菌培养液;2)重悬液加入溶菌酶,37℃处理30分钟以上;3)加入蛋白酶K和缓冲液,70℃处理10分钟;4)加入无水乙醇混匀后离心,转入吸附柱;5)高速离心吸附柱,实用清洗液反复清洗数次,洗脱回收DNA。
病原体感染中除病毒外,细菌也是极其常见的一类,对于细菌的核酸提取,特别是***的提取,常见试剂盒都需额外借助蛋白酶K和溶菌酶两种酶中的一种或两种,由于两种酶的最佳活性温度不同,还需要分步添加操作,不同温度孵育,整个过程也变得繁琐,提取时间也很长。因此需要一款通用型提取试剂,步骤简单,免于加热,同时适用于***和革兰氏阴性菌的快速提取。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒及方法,本发明的试剂盒与方法兼容革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的通用型DNA提取纯化,克服了现有细菌提取试剂盒针对阳性菌和阴性菌不同操作,阳性菌额外搭配试剂,分步加热等复杂步骤的一系列问题,同时全流程只需20-30min。
为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒,所述试剂盒包括:含有破碎珠的裂解液,磁珠,清洗液1,清洗液2与洗脱液,其中,裂解液中包括破碎珠,200-400mM的乙酸锂,1%-3%的SDS,100-500mM的氯化钠(,优选150mM)和1-50mM的EDTA,裂解液的pH为6.5-7.5。
作为本发明的一种优选方案,所述清洗液1包括1-100mM的Tris-HCl和1-10mM的EDTA清洗液1的pH为6.5-7.5。
作为本发明的一种优选方案,所述清洗液2包括1-100mM的Tris-HCl,1-10mM的EDTA和0-300mM的NaCl,清洗液2的pH为6.5-7.5。
作为本发明的一种优选方案,所述洗脱液包括1-100mM的Tris-HCl和0-5mM的EDTA,洗脱液的pH为7.5-8.5;或者,洗脱液为无核酸酶的水。
作为本发明的一种优选方案,所述磁珠包括氨基修饰,羧基修饰或硅羟基修饰,混合液浓度为20-100mg/mL。
在本发明中,乙酸锂主要用于弱化细胞壁,结合破碎珠使细菌充分破裂,更好的完成裂解;SDS作为变性剂,作用是使蛋白变性,充分释放缠绕其间的核酸,三者的结合EDTA用来螯合金属离子,抑制样本中的核酸酶对核酸的降解作用,氯化钠可以维持核酸结构的稳定,同时提供一个盐环境;Tris-HCl主要是提供缓冲环境。
上述所有试剂均使用超纯水配置后,使用直径0.22uM孔径过滤器过滤除杂质。
本发明还提供了一种适用于细菌DNA提取纯化的方法,采用上述的试剂盒,所述方法包括以下步骤:
1)取菌液样本1mL离心弃上清,得到菌体;
2)步骤1)得到的菌体内加入100-200μL裂解液和破碎珠,涡旋或震荡混匀;
3)转移所有液体至含有20μL磁珠的离心管内,涡旋或颠倒混匀15-25次,离心管瞬时离心放入磁力架内;
4)30sec后,弃掉液体,取500μL清洗液1和/或清洗液2重悬清洗磁珠,将离心管再次放入磁力架上;
5)重复步骤4);
6)弃废液后,加入40-60μL洗脱液,涡旋洗脱,加热孵育;
7)将离心管转入磁力架吸附30sec,吸取上清,即为纯化后的DNA模板。
作为本发明的一种优选方案,步骤2)中,涡旋或震荡混匀的时间为5-20min。
作为本发明的一种优选方案,步骤3)中,涡旋或颠倒混匀的次数为15-25次。
作为本发明的一种优选方案,步骤6)中,加热孵育的温度为55℃。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1)本发明提供了一种兼容革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细菌通用型DNA提取纯化方法,该方法克服了现有细菌提取试剂盒针对阳性菌和阴性菌不同操作,阳性菌额外搭配酶催化试剂,分步加热等复杂步骤的一系列问题,同时全流程只需20-30min,产物纯度高,可直接应用于下游PCR检测。
2)与过柱法相比较,本发明还摆脱了对高速离心机的依赖,有利于进一步集成批量化提取。
附图说明
图1是本发明的流程图。
图2是实施例1的荧光定量PCR检测结果。
图3是实施例2的荧光定量PCR检测结果。
图4是实施例3重复性试验检测结果。
图5是实施例4重复性试验检测结果。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于理解,下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例,并非全部。基于实施方式中的实施例,本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例,都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本发明首先提供了一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒,所述试剂盒包括:含有破碎珠的裂解液,磁珠,清洗液1,清洗液2与洗脱液,其中,裂解液中主要含有破碎珠,乙酸锂(200-400mM,更优选300mM),SDS(1%-3%,更优选2%),氯化钠(100-500mM,更优选150mM)和EDTA(1-50mM,更优选10mM),pH=7.2(6.5-7.5)。
优选地,清洗液1包括Tris-HCl(1-100mM,更优选10mM)和EDTA(1-10mM,更优选5mM),pH=7(6.5-7.5)。
优选地,清洗液2包括Tris-HCl(1-100mM,更优选10mM),EDTA(1-10mM,更优选5mM),NaCl(0-300mM,更优选100mM),pH=7(6.5-7.5)。
实际应用中,清洗液1和清洗液2可以相同,也可以不同。
优选地,洗脱液包括Tris-HCl(1-100mM,更优选5mM)和EDTA(0-5mM,更优选1mM),pH=8(7.5-8.5);或者,洗脱液为无核酸酶的水。
优选地,磁珠包括但不限于氨基修饰,羧基修饰或硅羟基修饰,其混合液浓度为50mg/mL(20-100mg/mL),用来捕获纯化核酸。
参见图1,本发明还提供了一种适用于细菌DNA提取纯化的方法,采用上述的试剂盒,所述方法包括以下步骤:
1)取菌液样本1mL离心弃上清,得到菌体;
2)步骤1)得到的菌体内加入100-200μL裂解液和破碎珠,涡旋或震荡混匀;
3)转移所有液体至含有20μL磁珠的离心管内,涡旋或颠倒混匀15-25次,离心管瞬时离心放入磁力架内;
4)30sec后,弃掉液体,取500μL清洗液1和/或清洗液2重悬清洗磁珠,将离心管再次放入磁力架上;
5)重复步骤4);
6)弃废液后,加入40-60μL洗脱液,涡旋洗脱,加热孵育;
7)将离心管转入磁力架吸附30sec,吸取上清,即为纯化后的DNA模板。
实施例1
本实施例提供了适用于细菌DNA提取纯化的方法,包括:
1)取1mL的105CFU/mL和103CFU/mL的B群链球菌菌液各3份,10000rpm离心1min后弃上清。
2)加入100μL的裂解液和破碎珠。
3)涡旋20min后,将上清转移到含20μL磁珠的1.5mL离心管内,颠倒混匀20次后瞬时离心,转入磁力架吸附30sec。
4)弃废液后取下离心管,加入600μL清洗液2,颠倒混匀20次后瞬时离心,转入磁力架吸附30sec;其中,清洗液2为10mM的Tris-HCl和5mM的EDTA,pH=7。
5)弃废液后取下离心管,加入60μL洗脱液,放入55℃金属浴孵育3min,期间涡旋震荡2-3次。
6)将离心管转入磁力架吸附30sec,吸取上清,即为纯化后的DNA模板。
将提取后的产物进行荧光定量PCR检测,结果参见图2,从图2可见,显示本发明的方法提取一致性较好。
实施例2
本实施例提供了适用于细菌DNA提取纯化的方法,包括:
1)取1mL分装的1000CFU/mL的B群链球菌6支,10000rpm离心一分钟后弃上清。
2)其中3支按照天根细菌提取试剂盒阳性菌操作步骤进行操作(DP302细菌提取试剂盒,为市购,不再赘述),剩余3支分别加入100μL的裂解液和破碎珠。
3)涡旋20min后,将上清转移到含20μL磁珠的1.5mL离心管内,颠倒混匀20次后瞬时离心,转入磁力架吸附30sec。
4)弃废液后取下离心管,加入600μL清洗液1,颠倒混匀20次后瞬时离心,转入磁力架吸附30sec;其中,清洗液1为10mM的Tris-HCl和5mM的EDTA,pH=7。
5)弃废液后取下离心管,加入600μL清洗液2,颠倒混匀20次后瞬时离心,转入磁力架吸附30sec;其中,清洗液2为10mM的Tris-HCl,5mM的EDTA和100mMNaCl,pH=7。
6)弃废液后取下离心管,加入60μL洗脱液,放入55℃金属浴孵育3min,期间涡旋震荡2-3次。
7)将离心管转入磁力架吸附30sec,吸取上清,即为纯化后的DNA模板。
将两种方式提取的产物进行荧光定量PCR检测,结果见图3。
由图3可见,从PCR结果看,即便在1000CFU/mL革兰氏阳性菌液浓度下(偏低样本浓度),本方式也能有效提取纯化菌液,且效果与对照试剂盒相当。
实施例3
本实施例提供了适用于细菌DNA提取纯化的方法,包括:
1)取106CFU/mL的B族链球菌菌液10μL分装3支。
2)加入100μL的裂解液和破碎珠,涡旋20min后,将上清转移到含20μL磁珠的1.5mL离心管内,颠倒混匀20次后瞬时离心,转入磁力架吸附30sec。
3)弃废液后取下离心管,加入600μL清洗液2,颠倒混匀20次后瞬时离心,转入磁力架吸附30sec;其中,清洗液2为10mM的Tris-HCl,5mM的EDTA和100mMNaCl,pH=7。
4)弃废液后取下离心管,加入60μL洗脱液,放入55℃金属浴孵育3min,期间涡旋震荡2-3次。
5)将离心管转入磁力架吸附30sec,吸取上清,即为纯化后的DNA模板。
将提取后的产物进行荧光定量PCR检测,结果见图4,
由图4可见,本发明的方法稳定性好,可直接提取高浓度菌液,无需离心富集。
实施例1-3中用于PCR检测的引物探针如下:
B群链球菌:
SEQ ID NO.1,F:CGGTTAATGAGGCTATTACTAGTGTTGA;
SEQ ID NO.2,R:TGTTGAGTTGAAAAAGTGATTGCTT;
SEQ ID NO.3,P:FAM-CATTGCGTGCCAACCCTGAGACA-BHQ1。
实施例4
本实施例提供了适用于细菌DNA提取纯化的方法,包括:
1)取1mL分装的1000CFU/mL的大肠杆菌3支,10000rpm离心1min后弃上清。
2)菌体中分别加入100μL的裂解液和破碎珠。
3)涡旋15min后,将上清转移到含20μL磁珠的1.5mL离心管内,颠倒混匀20次后瞬时离心,转入磁力架吸附30sec。
4)弃废液后取下离心管,加入600μL清洗液2,颠倒混匀20次后瞬时离心,转入磁力架吸附30sec;其中,清洗液2为10mM的Tris-HCl和5mM的EDTA,pH=7。
5)弃废液后取下离心管,加入60μL洗脱液,放入55℃金属浴孵育3min,期间涡旋震荡2-3次,
6)将离心管转入磁力架吸附30sec,吸取上清,即为纯化后的DNA模板。
将提取的产物进行荧光定量PCR检测,结果见图5。
由图5可见,本发明的方法对大肠杆菌也有较好的提取效果。
实施例4中用于大肠杆菌PCR检测的引物探针如下:
SEQ ID NO.4,F:AACTATGCCGGGATCCATCG;
SEQ ID NO.5,R:TCAACAGACGCGTGGTTACA;
SEQ ID NO.6,P:FAM-CGTAATGCTCTACACCACGC-BHQ1。
上述实施例不限于全部应用,本方式是细菌的通用型提取试剂,样本浓度也可以继续降低(未做探究),对于低浓度样本的富集收集,后续裂解液可以进行冻干探究,直接用样本溶解裂解液干粉,可以进一步省略离心富集操作。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明任何形式上和实质上的限制,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还将可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例;同时,凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变,均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:含有破碎珠的裂解液,磁珠,清洗液1,清洗液2与洗脱液,其中,裂解液中包括破碎珠,300mM的乙酸锂,2%的SDS,150mM的氯化钠和10mM的EDTA,裂解液的pH为7.2;
所述清洗液1包括1-100mM的Tris-HCl和1-10mM的EDTA清洗液1的pH为7;
所述清洗液2包括1-100mM的Tris-HCl,1-10mM的EDTA和0-300mM的NaCl,清洗液2的pH为7;
所述洗脱液包括1-100mM的Tris-HCl和0-5mM的EDTA,洗脱液的pH为8;或者,洗脱液为无核酸酶的水;
所述磁珠包括氨基修饰,羧基修饰或硅羟基修饰,混合液浓度为20-100mg/mL。
2.一种适用于细菌DNA提取纯化的方法,其特征在于,采用权利要求1所述的试剂盒,所述方法包括以下步骤:
1)取菌液样本1mL离心弃上清,得到菌体;
2)步骤1)得到的菌体内加入100-200μL裂解液和破碎珠,涡旋或震荡混匀;
3)转移所有液体至含有20μL磁珠的离心管内,涡旋或颠倒混匀15-25次,离心管瞬时离心放入磁力架内;
4)30sec后,弃掉液体,取500μL清洗液1和/或清洗液2重悬清洗磁珠,将离心管再次放入磁力架上;
5)重复步骤4);
6)弃废液后,加入40-60μL洗脱液,涡旋洗脱,加热孵育;
7)将离心管转入磁力架吸附30sec,吸取上清,即为纯化后的DNA模板。
3.根据权利要求2所述的一种适用于细菌DNA提取纯化的方法,其特征在于,步骤2)中,涡旋或震荡混匀的时间为5-20min。
4.根据权利要求2所述的一种适用于细菌DNA提取纯化的方法,其特征在于,步骤3)中,涡旋或颠倒混匀的次数为15-25次。
5.根据权利要求2所述的一种适用于细菌DNA提取纯化的方法,其特征在于,步骤6)中,加热孵育的温度为55℃。
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一种简便高效的酵母基因组提取方法;唐巧玲等;《生物技术进展》;第2卷(第4期);第293-296页 * |
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