CN112048503A - 一种高通量快速磁珠法提取植物基因组dna的试剂盒及提取法 - Google Patents

一种高通量快速磁珠法提取植物基因组dna的试剂盒及提取法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高通量快速磁珠法提取植物基因组DNA的试剂盒及提取。和现有的磁珠分离纯化基因组DNA试剂盒相比，本试剂盒及相应方法更为高效简单。而本试剂盒配套一板96孔试剂盒，每次操作可完成96个样品，经测试每人可同时操作4‑8套96孔板，即相同时间内每人可操作400‑800个样品，效率得到飞跃式提高。

Description

一种高通量快速磁珠法提取植物基因组DNA的试剂盒及提 取法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种利用磁珠提取植物组织基因组DNA的试剂盒及其提取方法。
背景技术
核酸的分子生物学检测技术是现代医学、植物生物学发展基础和常规应用的最为重要的手段之一。提取、纯化的基因组DNA可直接用于后续的PCR检测、指示试纸检测、NGS二代测序文库制备等工作。从目前技术发展的程度来看，在实验室获得高质量、高纯度、高完整度的植物基因组DNA仍然是一个耗时耗力且不完全稳定的过程。植物每年可能种植2-3茬，在2次种植间往往需要在短时间内鉴定大量的植物样本，数千到上万个样本，传统方法消耗大量的人力和时间，往往难以在需要的时间内完成。开发新的简单、高效、快速的植物基因组DNA提取方法，获得高质量样品，具有非常重要的应用价值。
传统的核酸分离方法主要包含细胞壁破碎、溶剂萃取、沉淀，高速离心等过程，用酚或氯仿去除液相中有活性的核酸酶和其他蛋白组分，再用乙醇去除盐分，洗涤后可得到核酸DNA。一些膜吸附也可用来协助DNA的提取和纯化，比如硅胶膜、多聚糖膜。这些纯化方法的步骤繁杂、费时长、回收率低，且提取过程中使用酚、氯仿，破坏人的呼吸道，影响人体健康。
磁珠纯化技术是近些年来发展起来的新方法，特点是简单有效，主要原理是在具有超顺磁性的Fe磁核上均匀包被二氧化硅，二氧化硅连接能特异性吸附阴性电荷核酸的能力。磁珠法和传统方法相比，整个过程无需剧毒试剂参与，且避免多步骤高转速离心，步骤较少、且简单易行。但是现有的磁珠分离法存在得率不高或效率不高的问题，且大部分适用于单通道或8通道，无法实现真正意义上的高通量DNA提取；或者是全自动电动化的96通道，为进口大型仪器，不利于普及型应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种高通量、高效率的磁珠法提取植物组织基因组DNA的试剂盒及其提取方法。
本发明提供一种DNA提取剂，所述DNA提取剂包括磁珠悬浮液和裂解液1，所述裂解液1中的溶质为溴烷铵、十二烷基硫酸钠、氯化钠、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇辛基苯基醚、吐温20和叠氮化钠的Tris-HCL缓冲溶液。
其中溴烷铵(CTAB)的体积分数为2％,十二烷基硫酸钠(SDS)的体积分数为1％-2％,聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX)的体积分数为0.1％，吐温20(Tween20)的体积分数为1％；叠氮化钠(SodiumAzide)的体积分数1％，氯化钠的含量为0.2mol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)的含量为10mmol/L,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的含量为10mg/L，所述Tris-HCL缓冲溶液为浓度为100mmol/L、pH为8.5。
所述DNA提取剂包括结合液、漂洗液和洗脱液，所述结合液为100％异丙醇和2MGITC(异硫氝酸呱)；所述漂洗液为80％乙醇；所述洗脱液为去离子水。
所述磁珠悬浮液中的磁珠含量为200mg/ml。
所述磁珠的直径为80-1000nm。
本发明还提供一种DNA提取试剂盒，所述DNA提取试剂盒包括上述任一所示的DNA提取试剂。
所述DNA提取试剂盒还包括96孔深孔离心板、96孔磁力搅拌棒和5mm直径钢珠，与96孔半自动磁力架配合使用。
本发明还提供一种磁珠法提取植物基因组DNA的方法，使用上述的DNA提取剂和或所述的DNA提取试剂盒，包括：
1)将植物组织粉碎，加入裂解液1，65℃静置40分钟；
2)将步骤1)中的混合液离心后取上清液加入结合液和磁珠悬液，混合均匀后静置3-10分钟；
3)将步骤2中的磁珠浸没在漂洗液中，静置20秒，清洗第1次；再重复该步骤一次。
4)将清洗后的磁珠静置2分钟晾干，用洗脱液洗脱，得到纯化的DNA。
其中，所述步骤l)的静置温度为65℃，静置时间为40-60分钟；所述步骤2)的离心条件为4000rpm离心5min；所述裂解液1、结合液、磁珠悬液和洗脱液的体积比为600:600：5-20：100。
其中，步骤l)中，样品与裂解液的质量体积比为150mg:600μ1；步骤2)中，上清液与结合液的体积比为1:1；步骤(3)中，参与核酸提取的磁珠与漂洗液的体积比为1:60。
其中，所述植物组织为新鲜植物叶片、干植物叶片、植物种子中的一种。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一套适用于半自动方法的高通量DNA提取试剂盒。本发明的DNA提取试剂(试剂盒)和现有的磁珠分离纯化基因组DNA试剂盒相比，本试剂盒及相应方法更为高效简单、操作更为方便，并且在使用相同的原料的前提下，采用本发明的试剂盒能够得到更高浓度的DNA，大大提供DNA的提取效果。此外，本试剂盒配套一板96孔试剂盒，每次操作可完成96个样品，经测试每人可同时操作4-8套96孔板，即相同时间内每人可操作400-800个样品，效率得到飞跃式提高。
附图说明
图1为不同方法提取水稻、小麦及玉米基因组DNA检测结果图，其中，1、4和7为水稻；2、5和8为小麦；3、6和9为玉米。1-3中使用的是洛阳爱森磁珠法植物组织DNA提取试剂盒；4-6中使用的是本发明试剂盒1；7-9中使用的是索莱宝植物DNA提取试剂盒。
图2为本发明试剂盒1，2提取玉米、小麦、水稻结果图；其中，1-3中使用的是本发明试剂盒1；4-6中使用的是本发明试剂盒2。1和4为玉米，2和5为水稻；3和6为小麦。
图3为本发明试剂盒2提取玉米、谷子、水稻、小麦结果图，图中1234分别对应玉米、谷子、水稻、小麦。
图4为本发明中使用不同试剂盒从玉米、水稻和小麦中提取的DNA浓度示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的小麦为中国春、玉米为郑单58、水稻为93-11、谷子为中谷2。
下述实施例中的CTAB(溴烷铵，sigma,Cat no.H9151-250G)、氯化钠(国药，Catno.10019318)、EDTA(乙二胺四乙酸，西陇，Cat no.1-32)、Tris-HCL(amresco,Catno.0234)、TritonX(聚乙二醇辛基苯基醚，sigma,Cat no.V900502)、Tween20(吐温20，sigma,Cat no.P1379)、Sodium Azide(叠氮化钠，Merck Millipore，Cat no.01-0032-00)、RNase A(核糖核酸酶A，Thermo，Cat no.R1253)、异丙醇(国药，80109218)、GITC(异硫氝酸呱，sigma，V900474)、SDS(十二烷基硫酸钠，sigma，L6026)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮,sigma，234257)和乙醇(西陇，XL0041)。
实施例1试剂盒的制备
1.试剂盒1的制备
DNA提取剂1的制备，所述DNA提取剂1包括裂解液1、结合液、漂洗液和洗脱液，其中裂解液1为将CTAB、SDS、氯化钠、EDTA、TritonX、Tween20和Sodium Azide添加到Tris-HCL缓冲溶液中得到的混合溶液，其中Tris-HCL缓冲溶液为100mmol/L,pH＝8.5的Tris-HCL缓冲溶液；混合溶液中各成分的含量分别为1％CTAB,1％SDS,0.1mol/L氯化钠，10mmol/L EDTA,100mmol/L Tris—HCL,pH＝8.5，0.1％TritonX，1％Tween20,1％Sodium Azide,10mg/LPVP；磁珠悬浮液为100mg/ml，上述百分含量均为体积含量；结合液为100％异丙醇,1MGITC(异硫氝酸呱)；漂洗液为80％乙醇；洗脱液为去离子水。所述裂解液1、结合液、漂洗液和洗脱液均独立包装，可单独使用。
上述试剂可配合96孔深孔离心板、96孔磁力搅拌棒和5mm直径钢珠，与96孔半自动磁力架配合使用，完成DNA的提取。
2.试剂盒2的制备
DNA提取剂2的制备，所述DNA提取剂2包括裂解液1、结合液、漂洗液和洗脱液，其中裂解液1为将CTAB、SDS、氯化钠、EDTA、TritonX、Tween20和Sodium Azide添加到Tris-HCL缓冲溶液中得到的混合溶液，其中Tris-HCL缓冲溶液为100mmol/L,pH＝8.5的Tris-HCL缓冲溶液；混合溶液中各成分的含量分别为2％CTAB,2％SDS,0.2mol/L氯化钠，10mmol/L EDTA,100mmol/L Tris—HCL,pH＝8.5，10mM PVP，0.1％TritonX，1％Tween20；1％Sodium Azide，上述百分含量均为体积含量；磁珠悬浮液为200mg/ml；结合液为100％异丙醇,1M GITC(异硫氝酸呱)；漂洗液为80％乙醇；洗脱液为dd water。所述裂解液1、结合液、漂洗液和洗脱液均独立包装，可单独使用。
上述试剂可配合96孔深孔离心板、96孔磁力搅拌棒和5mm直径钢珠，与96孔半自动磁力架配合使用，完成DNA的提取。
实施例2使用不同的试剂盒提取玉米、水稻、小麦基因组DNA
1.使用试剂盒1提取玉米基因组DNA
将玉米叶片组织使用试剂盒1(包括试剂盒1中的DNA提取剂1)进行基因组DNA的提取，包括如下步骤：
1)取150mg植物组织(新鲜植物叶片)，样品置于与半自动磁珠吸附磁力架配套的96孔深孔板中，冷冻后于植物匀浆仪中充分研磨。
2)将研磨粉碎后的植物组织加入到600μl裂解液中，65℃孵化40分钟，得到裂解液混合物。
3)将裂解液混合物常温4000rpm，离心l0分钟，观察样品沉淀完全，吸取上清液备用。
4.)将上清液转移到新的96孔深孔板中，加入等体积的异丙醇和10μl磁珠悬浮液，混匀，静置10分钟。
5)将吸附套按在半自动磁珠吸附磁力架上，将磁力架的磁棒探入96孔深孔板，吸附5min。
6)将吸附好磁珠的磁棒置入漂洗液，30秒，漂洗两遍。
7)磁珠干燥后，置于去离子水中洗脱。
8)用Qubit(ThermoTM)测定浓度，记录3次重复结果，取平均值，将结果记录在表1中。
9)电泳检测实验结果见图1的6泳道和图2的1泳道。
2.使用试剂盒1提取小麦基因组DNA
将步骤1中的玉米叶片组织更换为小麦叶片组织，其他步骤不变，提取小麦基因组DNA，电泳检测实验结果见图1的5泳道和图2的3泳道。
3.使用试剂盒1提取水稻基因组DNA
将步骤1中的玉米叶片组织更换为水稻叶片组织，其他步骤不变，提取水稻基因组DNA，电泳检测实验结果见图1的4泳道和图2的2泳道。
4.使用试剂盒2提取玉米基因组DNA
将步骤1中的试剂盒1替换为试剂盒1(含有DNA提取剂2)，其他步骤不变，提取玉米基因组DNA，电泳检测实验结果见图2的4泳道和图3的1泳道。
5.使用试剂盒2提取小麦基因组DNA
将步骤4中的玉米叶片组织更换为小麦叶片组织，其他步骤不变，提取小麦基因组DNA，电泳检测实验结果见图2的6泳道和图2的4泳道。
6.使用试剂盒2提取水稻基因组DNA
将步骤4中的玉米叶片组织更换为水稻叶片组织，其他步骤不变，提取水稻基因组DNA，结果如表1所示。电泳检测实验结果见图2的5泳道和图3的3泳道。
7.使用试剂盒2提取谷子基因组DNA
将步骤4中的玉米叶片组织更换为水稻叶片组织，其他步骤不变，提取水稻基因组DNA，电泳检测实验结果见图3的2泳道。
8.使用索莱宝植物DNA提取试剂盒提取玉米基因组DNA
将玉米叶片组织使用索莱宝植物DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取，包括如下步骤：
1)取100mg植物组织(新鲜植物叶片)，置于2ml离心管，冷冻后于植物匀浆仪中充分研磨。
2)将研磨粉碎后的植物组织加入到400μl溶液A中，、20ul RNase A(10mg/ml)和5ul β-巯基乙醇的离心管中，充分颠倒混匀，室温放置10min。
3)加入140ul溶液B，充分颠倒混匀，12000rpm离心10min，将上清转移至新离心管。
4)加入和上清相同体积的溶液C，充分颠倒混匀，再加入和溶液C相同体积的无水乙醇，12000rpm离心5min。
5)向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液。
6)重复步骤5。
7)将吸附柱放入一个干净的离心管中，滴加50-200ul洗脱液，室温放置1-5min，12000rpm离心2min。
电泳检测实验结果见图1的3泳道。
9.使用索莱宝植物DNA提取试剂盒提取小麦基因组DNA
将步骤7中的玉米叶片组织更换为小麦叶片组织，其他步骤不变，提取小麦基因组DNA电泳检测实验结果见图1的2泳道。
10.使用索莱宝植物DNA提取试剂盒提取水稻基因组DNA
将步骤7中的玉米叶片组织更换为水稻叶片组织，其他步骤不变，提取水稻基因组DNA，电泳检测实验结果见图1的1泳道。
11.使用洛阳爱森磁珠法植物组织DNA提取试剂盒提取玉米基因组DNA
将玉米叶片组织使用洛阳爱森磁珠法植物组织DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取，包括如下步骤：
1)取新鲜植物样品0.2和或干燥植物样品0.1克，装入1.5ml或2ml的离心管中，同时加入3～6颗瓷珠，液氮冻透后，转移至冷冻研磨仪(MM400)高速匀浆2～3分钟。
2)加0.54ml Buffer SPL至样品管中，涡旋振荡60秒后65℃水浴15分钟。
3)加0.18ml Buffer PS至上述样品管中，涡旋振荡60秒后冰上放置20分钟。
4)室温下4000～5000g离心20分钟。
5)取400μl上清液转移至2ml96深孔板中。
6)加入80μL磁珠悬浮液以及550μL结合液(已加异丙醇)，颠倒混合均匀。将EP管高速涡旋振荡6min，使磁珠与核酸充分结合，振荡完毕静置2min。
7)将EP管置于磁力架上静置20s至磁珠吸附完全；如果EP管内盖有磁珠，可保持EP管在磁力架上，整体上下颠倒2～3次至磁珠被完全吸附。
8)向EP管中加入600μL清洗液，将EP管从磁力架上取下，用移液枪吹散磁珠，涡旋震荡2min，磁性分离。
9)加入100μL洗脱液(或去离子水)至管底，将重悬后磁珠转移至另一干净EP管中，65℃温浴5min，然后涡旋洗脱2min，确保磁珠与核酸完全洗脱解离。
电泳检测实验结果见图1的9泳道。
12.使用洛阳爱森磁珠法植物组织DNA提取试剂盒提取小麦基因组DNA
将步骤10中的玉米叶片组织更换为小麦叶片组织，其他步骤不变，提取小麦基因组DNA，结果如表1所示。电泳检测实验结果见图1的8泳道。
13.使用洛阳爱森磁珠法植物组织DNA提取试剂盒提取水稻基因组DNA
将步骤10中的玉米叶片组织更换为水稻叶片组织，其他步骤不变，提取水稻基因组DNA，结果如表1所示所示。电泳检测实验结果见图1的7泳道。
统计上述不同试剂盒从玉米、水稻和小麦中提取的DNA浓度，结果如表1和图3所示，从表1中的数据可以看出，本发明试剂盒1和本发明试剂盒2相较其他DNA提取试剂盒提取得率在各个作物物种均都显著提高(根据3次以上重复试验的结果)。
表1使用不同试剂盒从玉米、水稻和小麦中提取的DNA浓度
Figure BDA0002673315590000071
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种DNA提取剂，其特征在于，所述DNA提取剂包括磁珠悬浮液和裂解液1，所述裂解液1为含有溴烷铵、十二烷基硫酸钠、氯化钠、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇辛基苯基醚、吐温20和叠氮化钠的Tris-HCL缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述的DNA提取剂，其特征在于，所述裂解液1中溴烷铵的体积分数为2％,十二烷基硫酸钠的体积分数为1％-2％,聚乙二醇辛基苯基醚的体积分数为0.1％，吐温20的体积分数为1％，叠氮化钠的体积分数1％，氯化钠的含量为0.2mol/L，乙二胺四乙酸的含量为10mmol/L,聚乙烯吡咯烷酮的含量为10mg/L；所述Tris-HCL缓冲溶液为浓度为100mmol/L、pH为8.5。
3.根据权利要求1或所述的DNA提取剂，其特征在于，所述DNA提取剂包括结合液、漂洗液和洗脱液，所述结合液为100％异丙醇和2M的GITC(异硫氝酸呱)；所述漂洗液为80％乙醇；所述洗脱液为去离子水。
4.根据权利要求1-3任一所述的DNA提取剂，其特征在于，所述磁珠悬浮液中的磁珠含量为200mg/ml；所述磁珠的直径为80-1000nm。
5.一种DNA提取试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂盒包括权利要求1-4任一所示的DNA提取试剂。
6.根据权利要求5所述的DNA提取试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂盒还包括96孔深孔离心板、96孔磁力搅拌棒和5mm直径钢珠，与96孔半自动磁力架配合使用。
7.一种磁珠法提取植物基因组DNA的方法，其特征在于，使用权利要求1-4任一所述的DNA提取剂和权利要求5或6所述的DNA提取试剂盒，包括：
1)将植物组织粉碎，加入裂解液1，静置；
2)将步骤1)中的混合液离心后取上清液加入结合液和磁珠悬液，混合均匀后静置；
3)将步骤2中的磁珠在漂洗液中清洗2次；
4)将清洗后的磁珠晾干，用洗脱液洗脱，得到纯化的DNA。
8.根据权利要求7所述的磁珠法提取植物基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤l)的静置温度为65℃，静置时间为40-50min，离心条件为4000rpm离心5min；所述步骤2)中的离心条件为4000rpm离心20min，静置时间为10min；所述裂解液1、结合液、磁珠悬液和洗脱液的体积比为600:600：5-10:600。
9.根据权利要求7所述的磁珠法提取植物基因组DNA的方法，其特征在于，步骤l)中，样品与裂解液的质量体积比为150mg:600μ1；步骤2)中，上清液与结合液的体积比为1:1；步骤(3)中，参与核酸提取的磁珠与漂洗液的体积比为1:60。
10.根据权利要求7所述的磁珠法提取植物基因组DNA的方法，其特征在于，所述植物组织为新鲜植物叶片、干植物叶片、植物种子中的一种。
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