CN112062864A - 靶向bcma肿瘤抗原受体修饰t细胞的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞的制备方法及应用，所述靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞通过6种不同的抗BCMA抗原的嵌合抗原受体在T细胞中表达后，特异性识别肿瘤细胞表面BCMA分子，能够有效清除表达BCMA抗原的肿瘤靶细胞，对抗原阴性的细胞无毒副作用，能够用于肿瘤的靶向治疗尤其是对多发性骨髓瘤的靶向治疗。所述的靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞中，TSN1‑CAR‑T细胞、TSN2‑CAR‑T细胞、TSN5‑CAR‑T细胞、TSN6‑CAR‑T细胞、TSN7‑CAR‑T细胞、TSN8‑CAR‑T细胞和TSN9‑CAR‑T细胞能特异性杀伤BCMA表达量低的骨髓瘤细胞。

Description

靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞的制备方法和应用
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞的制备方法和应用。
背景技术
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)(June CH，Blazar BR，Riley JL，Engineering lymphocyte subsets：tools，trials and tribulations.Nat RevImmunol.2009；9:704-16)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般地，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区、共刺激区以及胞内信号转导区组成。CAR-T细胞疗法通过外源基因转染技术，把可特异性识别肿瘤相关抗原的单链抗体(Single chain fragment variable，scFv)和T细胞活化序列的融合蛋白表达到T细胞表面，使可特异性识别肿瘤相关抗原的scFv通过跨膜区与T细胞胞内的活化增殖信号域偶联。表达CAR的T细胞以抗原依赖、但非MHC限制的方式识别肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。目前为止，CAR-T细胞免疫疗法在血液肿瘤、淋巴瘤的治疗上取得了较好的效果。对于B系恶性肿瘤，最常用的是抗CD19 CAR的过继性T细胞方法。抗CD19 CAR-T细胞在小鼠试验中，发现能够治愈小鼠白血病和淋巴瘤，一些患者在输入抗CD19 CAR-T细胞临床试验中发现病情得到缓解，但CD19很少在多发性骨髓瘤的恶性浆细胞中表达，因此用CAR表达的T细胞治疗多发性骨髓瘤需要寻找其它更好的靶标。
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种由成熟浆细胞在骨髓中恶性增殖累积导致骨破坏和骨髓衰竭的常见的血液***恶性肿瘤。常见的临床表现为骨疼痛、贫血、溶骨性病变、高钙血症、肾功能损害、血细胞减少症、症状性浆细胞产生等症状。目前多发性骨髓瘤为血液***第二大恶性肿瘤，占血液***恶性肿瘤的10％，多发病于男性，其发病率随着年龄的增长逐年增高，近几年更是有年轻化的趋势[Siegel，R.，etal.，Cancerstatistics，2014.CA Cancer J Clin，2014.64(1)：p.9-29.]。多发性骨髓瘤治疗后复发概率高，且不能治愈。尽管一些单克隆抗体已经在临床前研究和早期临床试验中显示出治疗MM的希望，但并没有得到一致性认可。显然，对MM进行新的免疫治疗研究显然是非常需要的。
目前，BCMA已成为MM和其他血液***恶性肿瘤的一个非常热门的免疫治疗靶点。BCMA全称为B细胞成熟抗原，也称CD269，由184个氨基酸残基组成，其胞内区含80个氨基酸残基，胞外区序列很短，只有一个糖类识别结构域为B细胞表面分子。BCMA属于缺少信号肽的I型跨膜信号蛋白，仅表达在成熟B细胞表面，是一种重要的B细胞生物标记物。BCMA是肿瘤坏死因子受体家族(TNFR)一员，它可分别与B细胞激活因子BAFF或增殖诱导配体(aproliferation induced ligand，APRIL)两种配体相结合[Tumor necrosis factorfamily ligand-receptor binding.Curr Opin Struct Biol，2004.14(2)：p.154-60.]。该受体还与各种TRAF家族成员结合，介导细胞存活和增殖的信号。研究表明，在正常细胞中，BCMA主要由浆细胞和一部分成熟B细胞表达，而在大部分B细胞以及其它器官上都不表达。BCMA基因剔除小鼠免疫***表现正常，B淋巴细胞的发育正常，但浆细胞数量明显减少，证明BCMA在维持浆细胞的存活中起了重要的作用，其机制主要包括BCMA与BAFF蛋白结合，并上调抗凋亡基因Bcl-2，Mcl-1及Bclw等，维持细胞生长[BCMA is essential for thesurvival of long-lived bone marrow plasma cells.J Exp Med，2004.199(1):p.91-8.]。
研究发现，BCMA普遍表达于多发性骨髓瘤细胞系[Expression of BCMA，TACI，andBAFF-R in multiple myeloma：a mechanism for growth and surviva.Blood，2004.103(2)：p.689-94.]。在高达60％-70％的多发性骨髓瘤病例中，BCMA在B细胞发育过程中表达，并且广泛表达于MM细胞表面。鉴于BCMA表达特征，我们可以把BCMA作为CAR-T细胞的靶点之一用于多发性骨髓瘤的细胞免疫治疗。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞的制备方法和应用。本发明提供6种靶向BCMA肿瘤抗原的嵌合抗原受体，进而获得所述靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞，所述靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞通过特异性识别肿瘤细胞表面BCMA分子，介导对BCMA阳性肿瘤的杀伤，且能特异性杀伤BCMA表达量低的骨髓瘤细胞，并且对抗原阴性的细胞无毒副作用。
本发明所采用的技术方案为：
本发明提供一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，结构包括依次串联的信号肽、BCMA抗原识别区、铰链区、跨膜区、胞内信号域和EGFR的胞外结构域Ⅲ和胞外结构域Ⅳ的片段。
优选地，所述BCMA抗原识别区为抗BCMA的单链抗体；
所述抗BCMA的单链抗体有6种，分别为TSN1、TSN3、TSN5、TSN7、TSN8和TSN9；其中，所述TSN7的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；需要说明的是本发明人前期筛选并经实验验证出6个单链抗体均具有结合BCMA蛋白的能力(6个单链抗体为结构类似的同源物)，因此采用所述6个单链抗体制备的靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞对BCMA蛋白呈阳性的靶细胞具有特异性的杀伤效果。
所述信号肽为CD8信号肽，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的铰链区和跨膜区为CD8铰链区和跨膜区，所述CD8铰链区和跨膜区的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述的胞内信号域为CD3ζ胞内信号域，所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQID NO.5所示；所述的EGFR胞外结构域III和胞外结构域IV片段的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
优选地，所述跨膜区与所述胞内信号域之间还连接共刺激信号域；所述的共刺激信号域为4-1BB共刺激信号域，所述4-1BB共刺激信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述胞内信号域与所述EGFR的片段之间还连接T2A片段，所述T2A片段的氨基酸序列如SEQID NO.7所示。
优选地，所述共刺激信号域还添加IL2RB刺激信号域，从而所述的共刺激信号域除了4-1BB共刺激信号域外还添加了IL2RB刺激信号域(氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示)，目的是筛选出能够稳定表达、有效性高的CAR组合。
所述的靶向BCMA嵌合抗原受体的CAR结构中加入了EGFR胞外结构域III和胞外结构域IV片段。EGFR的片段前还加入了CD8信号肽序列。EGFR片段的主要功能：可以作为细胞表面的标记，同时也适合T细胞的体内追踪，可通过流式和免疫组化检测，也可以在体内被妥西单抗(cetuximab)清除。本申请发明人在研究中发现，通过引入上述EGFR的片段既可使CAR-T细胞在体内很好的被示踪，也可以作为CAR-T细胞的安全开关：当想让CAR-T细胞停止发挥作用时，加入妥西单抗，安全有效地控制输注的针对BCMA靶点的CAR-T细胞在体内发挥作用。为临床实验和临床治疗安全性奠定良好的基础。
需要说明的是，在其他的实施例中，本领域技术人员可以根据实际情况或需要来改变信号肽、铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激信号域、IL2RB刺激信号域和CD3ζ胞内信号域的组合类别和序列，无论基于何种形式的改变，只要该嵌合抗原受体具有本发明所述BCMA抗原识别区序列，均在本发明的保护范围内。
本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子编码所述靶向BCMA嵌合抗原受体。
优选地，所述核酸分子中，编码所述TSN7的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；编码所述CD8信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；编码所述CD8铰链区和跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；编码所述4-1BB共刺激信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；编码所述CD3ζ胞内信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；编码所述EGFR胞外结构域III和胞外结构域IV片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；编码所述T2A片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；编码所述IL2RB刺激信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明还提供一种重组载体，所述重组载体为含有所述核酸分子的重组病毒载体。优选地，所述的重组病毒载体为慢病毒、逆转录病毒或RNA表达载体中的一种。
本发明还提供一种基因修饰的T细胞，其特征在于，所述T细胞中含有所述的重组载体或所述T细胞的染色体中整合有外源的所述核酸分子或表达所述的嵌合抗原受体。
本发明还提供所述靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)通过PCR方法获得所述靶向BCMA嵌合抗原受体的核酸序列片段；
(2)将所述靶向BCMA嵌合抗原受体的核酸序列片段克隆到表达载体中，得到TSNs-CAR的表达质粒；
(3)将步骤(2)所述TSNs-CAR的表达质粒转染至293T细胞，经包装、浓缩后，得到慢病毒浓缩液；
(4)利用所述慢病毒浓缩液感染T细胞，即得所述靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰的T细胞。
所述的靶向BCMA的嵌合抗原受体、所述的核酸分子、所述的重组载体、所述的靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞在制备用于预防和/或治疗癌症或肿瘤药物中的应用。尤其是在预防和/或治疗BCMA阳性B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤或浆细胞白血病药物中的应用。
本发明的有益效果为：
(1)本发明所述的靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞，通过6种不同的抗BCMA抗原的嵌合抗原受体在T细胞中表达后，特异性识别肿瘤细胞表面BCMA分子，能够有效清除表达BCMA抗原的肿瘤靶细胞，对抗原阴性的细胞无毒副作用，能够用于肿瘤的靶向治疗尤其是对多发性骨髓瘤的靶向治疗。
(2)本发明所述的靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞中：TSN1-CAR-T细胞、TSN2-CAR-T细胞、TSN5-CAR-T细胞、TSN6-CAR-T细胞、TSN7-CAR-T细胞、TSN8-CAR-T细胞和TSN9-CAR-T细胞能特异性杀伤BCMA表达量低的骨髓瘤细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A和图1B分别为本发明所述靶向BCMA嵌合抗原受体的结构示意图；
图2为本发明所述的pLVKn-TSNs-CAR表达质粒的图谱；
图3为不同靶向BCMA的CAR-T细胞杀伤BCMA肿瘤细胞的结果对比图；
图4为不同靶向BCMA的CAR-T细胞杀伤BCMA低表达肿瘤细胞的结果对比图；
图5A和5B为胞内细胞因子染色法检测不同靶向BCMA的CAR-T细胞与靶细胞共培养后效应细胞因子表达结果对比图；
图6为注射不同靶向BCMA的CAR-T细胞后小鼠肿瘤体积变化情况的对比图；
图7为体内荧光成像检测小鼠体内肿瘤消除情况结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。
一、不同靶向BCMA的pLVKn-TSNs-CAR表达质粒的构建
1.基因序列合成
依次合成CD8信号肽(编码所述CD8信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)、BCMA单链抗体(TSN1，TSN3，TSN5，TSN7，TSN8，TSN9)、CD8铰链区和跨膜区(编码所述CD8铰链区和跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)、4-1BB共刺激信号域(编码所述4-1BB共刺激信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)、IL2RB刺激信号域(编码所述IL2RB刺激信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)、CD3ζ信号传导结构域(编码所述CD3ζ胞内信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)、T2A片段(编码所述T2A片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)、EGFR的胞外结构域III和胞外结构域IV片段(编码所述的EGFR胞外结构域III和胞外结构域IV片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，氨基酸序列如SEQID NO.6所示)；
采用重叠PCR法将上述序列依次连接。分别得到8种嵌合抗原受体表达盒TSNs-CAR，构型图分别如图1A和图1B所示，分别命名为：TSN1-CAR、TSN2-CAR(在TSN1-CAR结构中加入IL2RB刺激信号域)、TSN3-CAR、TSN5-CAR、TSN6-CAR(在TSN5-CAR结构中加入IL2RB刺激信号域)、TSN7-CAR(全长核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.18)、TSN8-CAR和TSN9-CAR；
2.将上述TSNs-CAR表达框序列构建到pLVKn慢病毒载体中得到pLVKn-TSNs-CAR表达载体
在各TSNs-CAR表达框序列两段分别含有BamHI和SalI酶切位点，用BamHI和SalI双酶切该CAR分子的核苷酸序列和pLVKn慢病毒载体质粒，经T4连接酶连接，然后将连接产物转化到大肠杆菌感受态(stbl3)中；
从转化有TSNs-CAR的平板中随机挑取2个单克隆，分别加入含有氨苄青霉素(100ug/ml)的5mlLB培养基中进行扩培，12-16小时后进行质粒提取，并用BamHI和SalI进行酶切鉴定，酶切正确的质粒送上海生工进行测序进一步确定。测序正确的即为pLVKn-TSNs-CAR表达质粒，表达质粒图谱如图2所示。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定
1.慢病毒的包装
(1)细胞处理：转染前24h收集处于对数生长期的第3-10代293T细胞，将293T细胞接种于10cm细胞培养皿中，接种量为1×107，细胞在含有10ml 10％FBS的DMEM培养基中生长，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养18小时，细胞密度达到60-80％即可进行转染；(2)向293T细胞中共转染慢病毒表达载体质粒TSNs-CAR及其包装质粒(pSPAX2，pMD2-G)；(3)转染后72小时收集293T培养上清液，3000rpm离心15分钟，分别收集细胞和上清液，反复冻融三次裂解细胞，离心收集上清液，弃细胞沉淀；(4)用0.45μm滤器过滤病毒上清，分别获得TSN1-CAR、TSN2-CAR、TSN3-CAR、TSN5-CAR、TSN6-CAR、TSN7-CAR、TSN8-CAR和TSN9-CAR病毒溶液；
2.慢病毒的浓缩及病毒滴度测定
(1)将上述获得的病毒溶液使用PEG6000浓缩病毒，向病毒溶液中加入1/4体积的PEG6000/NaCl溶液(25％PEG6000+4.4％NaCl)，混匀，4℃静置1小时；(2)于4℃，5000rpm离心30分钟；(3)弃上清，加入2ml病毒溶解液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，2mM MgCl2，5％蔗糖)溶解慢病毒沉淀，并于-80℃储存，得慢病毒浓缩液；(4)测定病毒滴度，预先接种BHK21细胞至24孔板，105/孔，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养18小时；(5)溶解病毒，准备从10-2到10-7的10倍稀释病毒样品；(6)去除细胞培养液，加入含有不同病毒量的细胞培养液，并在培养液液中加入6ug/ml的聚凝胺(polybrene)，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养2小时；(7)去除细胞培养液，加入1％FBS的DMEM培养液，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养48小时；(8)去除细胞培养液，加入含2ug/ml嘌呤霉素、1％FBS的DMEM培养液，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养72小时；(9)去除细胞培养液，加入结晶紫染色液，计数被染色克隆数，并计算病毒滴度；(10)将病毒稀释至107TU/ml，于-80℃储存。
三、T细胞的分离培养及慢病毒转导T细胞
1.使用淋巴细胞分离液Ficoll密度梯度离心获得人PBMC细胞；2.使用MiltenyiBiotec公司的T细胞分离试剂从人PBMC细胞中分离获得T淋巴细胞；3.向细胞中加入CD3/CD28磁珠，将细胞置于RPMI-1640培养基中培养24小时；4.将细胞转入RetroNectin预包被的MOI＝10的慢病毒(装有慢病毒浓缩液)培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，24小时后换液，持续添加IL-2 200IU/ml。采用不同的病毒液，得到不同的可表达靶向人BCMA抗原的嵌合抗原受体修饰的T细胞；分别命名为TSN1-CAR-T、TSN2-CAR-T、TSN3-CAR-T、TSN5-CAR-T、TSN6-CAR-T、TSN7-CAR-T、TSN8-CAR-T和TSN9-CAR-T细胞；5.流式细胞仪检测T细胞表面CAR的表达。
实施例1
本实施例提供一种靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞(TSN7-CAR-T)的制备方法，包括如下步骤：
(1)通过PCR方法获得所述靶向BCMA嵌合抗原受体的核酸序列片段TSN7-CAR，具体为：依次合成CD8信号肽、抗BCMA的单链抗体TSN7(编码所述TSN7的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，所述TSN7的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)、CD8铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激信号域、CD3ζ胞内信号域、T2A和EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV片段的核苷酸序列；采用重叠PCR法将上述序列依次连接，得到靶向BCMA嵌合抗原受体的表达框，构型图1A所示，命名为TSN7-CAR，全长核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；
(2)将所述TSN7-CAR表达框序列克隆到pLVKn慢病毒载体质粒中，得到表达质粒pLVKn-TSN7-CAR；图谱如图2所示；操作方法详见“将上述TSNs-CAR表达框序列构建到pLVKn慢病毒载体中得到pLVKn-TSNs-CAR表达载体”该部分的记载；
(3)将步骤(2)所述表达质粒pLVKn-TSN7-CAR转染至293T细胞，经包装、浓缩后，得到慢病毒浓缩液；操作方法详见“慢病毒的包装、浓缩和滴度测定”该部分的记载；
(4)利用所述慢病毒浓缩液感染T细胞，即得所述靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰的T细胞(TSN7-CAR-T)，操作方法详见“T细胞的分离培养及慢病毒转导T细胞”该部分记载。
实验例
1、验证靶向BCMA的肿瘤抗原受体修饰T细胞(CAR-T)的体外杀伤BCMA靶细胞的能力
对本发明所得靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰的T细胞(TSN1-CAR-T、TSN2-CAR-T、TSN3-CAR-T、TSN5-CAR-T、TSN6-CAR-T、TSN7-CAR-T、TSN8-CAR-T和TSN9-CAR-T)及LAMA84(BCMA表达阴性)和KMS11(BCMA表达阳性)细胞计数，调节细胞密度为1×106/ml，按照效靶比10:1、20:1、30:1共培养。经过4h共培养后，将细胞用Annexin V及PI试剂盒染色，同时设置对照组。设置两个对照组，第一个对照组中加入靶细胞但同时加入未感染CAR的T细胞(UNT)，第二个对照组为加入靶细胞但同时加入感染含EGFR胞外结构域III、胞外结构域IV片段的病毒的T细胞(CON)。使用流式细胞术对细胞杀伤进行检测。结果见图3所示，图中TSN1是TSN1-CAR-T细胞，TSN2是TSN2-CAR-T细胞；TSN3是TSN3-CAR-T细胞，TSN5是TSN5-CAR-T细胞，TSN6是TSN6-CAR-T细胞，TSN7是TSN7-CAR-T细胞，TSN8是TSN8-CAR-T细胞，TSN9是TSN9-CAR-T细胞；UNT是未转染CAR的T细胞做对照；CON是只转染含EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV片段的病毒的T细胞；LAMA84为BCMA表达阴性细胞；KMS11为BCMA表达阳性细胞。从图3中可以看出，虽然UNT及CON转染细胞存在非特异杀伤，但TSNs-CAR-T(其中s代表1、2、3、5、6、7、8、9)细胞对KMS11细胞显示出更强的杀伤效应，随着效靶比增大杀伤效应也变大。
本发明制备的TNS1-CAR-T、TNS2-CAR-T、TNS5-CAR-T、TNS6-CAR-T、TNS7-CAR-T、TNS8-CAR-T、TNS9-CAR-T细胞还能够特异杀伤BCMA低表达的骨髓瘤细胞。取感染后9天的T细胞(TNS1-CAR-T、TNS2-CAR-T、TNS5-CAR-T、TNS6-CAR-T、TNS7-CAR-T、TNS8-CAR-T、TNS9-CAR-T)及AMO-1细胞(BCMA表达量非常低)、ARD(BCMA表达量较低)和RPMI-8226(BCMA表达量较低)细胞计数，调节细胞密度为1×106/ml，按照效靶比5:1、10:1、15:1、20:1、25:1共培养。经过4h共培养后，将细胞用Annexin V及PI试剂盒染色，使用流式细胞术对细胞杀伤进行检测。结果如图4所示，本发明制备的TNS1-CAR-T、TNS2-CAR-T、TNS5-CAR-T、TNS6-CAR-T、TNS7-CAR-T、TNS8-CAR-T、TNS9-CAR-T细胞能够特异杀伤BCMA低表达骨髓瘤细胞。
2、检测靶向BCMA的肿瘤抗原受体修饰T细胞(CAR-T)对肿瘤细胞杀伤时细胞因子分泌能力
具体操作如下：
(1)取制备好的靶向BCMA的CAR-T细胞，重悬于Lonza培养基中，调整细胞浓度为1×106/mL；(2)实验组每孔含靶细胞(K562-CD269)2×105个，CAR-T细胞2×105个，200μl不含IL-2的Lonza培养基，充分混匀后加入96孔板中。同时加入胞内透膜试剂盒BD Golgiplug(含BFA，每1ml细胞培养基中加入1μl的BD Golgiplug)，充分混匀后，37℃孵育5-6h；收集细胞，作为实验组；(3)每管用1mL的PBS清洗细胞1次，300G离心5min，仔细吸去或倒掉上清；(4)PBS洗细胞后，加入250μl/EP管固定/破膜液，4℃孵育20min；以固定细胞及破膜。用1×BD破膜/预洗液洗细胞2次，1mL/次；(5)进行胞内因子染色，取适量细胞因子荧光抗体，用BD破膜/预洗液稀释至50μl；用此抗体稀释液充分重悬已固定破膜的细胞，4℃避光孵育30min，1×BD破膜/预洗液1mL/次清洗细胞2次，然后用PBS重悬。(6)流式细胞仪检测。结果如图5A和5B所示，TSNs-CAR-T细胞与BCMA阳性的细胞共培养产生效应细胞因子，且分泌的细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α的相对含量都比较高。
3、验证靶向BCMA的CAR-T细胞在小鼠皮下瘤模型中抑制BCMA阳性肿瘤生长的能力
使用6周龄NSG免疫缺陷鼠，皮下注射3×106个KMS11细胞系，允许肿瘤生长15天左右，用测径器测量肿瘤大小，肿瘤体积计算公式为：V＝0.52×L×W2，其中V表示肿瘤体积；L表示肿瘤块的最长直径；W表示与最长径垂直的一条最长横径。当肿瘤大小达到20-50mm3时，通过尾静脉注射5×106个对照T细胞(CON组和PBS组)或5×106个CAR阳性的靶向BCMA的CAR-T细胞：TSN1-CAR-T、TSN2-CAR-T、TSN3-CAR-T及TSN7-CAR-T，观察并记录肿瘤体积的变化。肿瘤生长曲线如图6所示，在KMS11皮下肿瘤模型中，输注TSN7-CAR-T细胞产生强烈抗肿瘤效应，完全消灭了皮下肿瘤。输注TSN1-CAR、TSN2-CAR、TSN3-CAR细胞与输注CON细胞抑瘤效应没有显著差别，相比较PBS组具有轻微抗肿瘤效应。
注射靶向BCMA的CAR-T细胞TSN7-CAR-T之后31天，小鼠用体内荧光成像法证实5只小鼠中有3只小鼠肿瘤完全消灭，2只小鼠残余很小的肿瘤。其中2号小鼠(图7中腹侧成像，从上往下数第二只小鼠)体重明显减轻，有发生GVHD的可能，处死解剖后发现原始肿瘤接种部位没有发现肉眼可见肿瘤块结果如图7所示。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 普世麦生物科技(北京)有限公司
<120> 靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞的制备方法和应用
<130> 2010
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala
130 135 140
Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
145 150 155 160
Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr
180 185 190
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys
<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
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Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
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Ile Thr Leu Tyr Cys
65
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
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Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
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Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Pro Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
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Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
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Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
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Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
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Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
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Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
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Arg
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<213> 人工序列
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Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
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Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
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Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
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Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
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Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
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Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
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Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
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Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
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Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
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Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
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Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
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Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
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Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agttgtaaag catctggcta taccttcacc gactacagca taaattgggt gaaacgggcc 120
cctggaaagg gcctcaaatg gatgggttgg atcaataccg aaactaggga gcctgcttat 180
gcatatgact tccgcgggag attcgccttt tcactcgaga catctgcctc tactgcttac 240
ctccaaataa acaacctcaa gtatgaagat acagccactt acttttgcgc cctcgactat 300
agttacgcca tggactactg gggacaggga acctccgtta ccgtcagttc cggtggcggt 360
ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatctgaca ttgtgctcac tcagtcacct 420
cccagcctgg ccatgagcct gggaaaaagg gccaccatct cctgtagagc cagtgagtcc 480
gtcacaatct tggggagcca tcttattcac tggtatcagc agaagcccgg gcagcctcca 540
acccttctta ttcagctcgc gtcaaacgtc cagacgggtg tacctgccag attttctggt 600
agcgggtccc gcactgattt tacactgacc atagatccag tggaagaaga cgatgtggcc 660
gtgtattatt gtctgcagag cagaacgatt cctcgcacat ttggtggggg tactaagctg 720
gagattaag 729
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ccg 63
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<212> DNA
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gaactg 126
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<400> 13
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cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
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gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
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<213> 人工序列
<400> 16
ggatccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc 60
gccaggccgc aaattcagct ggtccagagc ggacctgagc tgaaaaaacc cggcgagact 120
gttaagatca gttgtaaagc atctggctat accttcaccg actacagcat aaattgggtg 180
aaacgggccc ctggaaaggg cctcaaatgg atgggttgga tcaataccga aactagggag 240
cctgcttatg catatgactt ccgcgggaga ttcgcctttt cactcgagac atctgcctct 300
actgcttacc tccaaataaa caacctcaag tatgaagata cagccactta cttttgcgcc 360
ctcgactata gttacgccat ggactactgg ggacagggaa cctccgttac cgtcagttcc 420
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatctgacat tgtgctcact 480
cagtcacctc ccagcctggc catgagcctg ggaaaaaggg ccaccatctc ctgtagagcc 540
agtgagtccg tcacaatctt ggggagccat cttattcact ggtatcagca gaagcccggg 600
cagcctccaa cccttcttat tcagctcgcg tcaaacgtcc agacgggtgt acctgccaga 660
ttttctggta gcgggtcccg cactgatttt acactgacca tagatccagt ggaagaagac 720
gatgtggccg tgtattattg tctgcagagc agaacgattc ctcgcacatt tggtgggggt 780
actaagctgg agattaagac cactacccca gcaccgaggc cacccacccc ggctcctaca 840
attgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc 900
gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 960
acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 1020
aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 1080
gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 1140
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac cagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1200
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1260
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1320
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1380
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1440
cttcacatgc aggccctgcc gcctcggctc gagagtggaa gcggcgaggg cagaggaagt 1500
cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat cccggcccta ggatggcctt accagtgacc 1560
gccttgctcc tgccgctggc cttgctgctc cacgccgcca ggccgcgcaa agtgtgtaac 1620
ggaataggta ttggtgaatt taaagactca ctctccataa atgctacgaa tattaaacac 1680
ttcaaaaact gcacctccat cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt 1740
gactccttca cacatactcc tcctctggat ccacaggaac tggatattct gaaaaccgta 1800
aaggaaatca cagggttttt gctgattcag gcttggcctg aaaacaggac ggacctccat 1860
gcctttgaga acctagaaat catacgcggc aggaccaagc aacatggtca gttttctctt 1920
gcagtcgtca gcctgaacat aacatccttg ggattacgct ccctcaagga gataagtgat 1980
ggagatgtga taatttcagg aaacaaaaat ttgtgctatg caaatacaat aaactggaaa 2040
aaactgtttg ggacctccgg tcagaaaacc aaaattataa gcaacagagg tgaaaacagc 2100
tgcaaggcca caggccaggt ctgccatgcc ttgtgctccc ccgagggctg ctggggcccg 2160
gagcccaggg actgcgtctc ttgccggaat gtcagccgag gcagggaatg cgtggacaag 2220
tgcaaccttc tggagggtga gccaagggag tttgtggaga actctgagtg catacagtgc 2280
cacccagagt gcctgcctca ggccatgaac atcacctgca caggacgggg accagacaac 2340
tgtatccagt gtgcccacta cattgacggc ccccactgcg tcaagacctg cccggcagga 2400
gtcatgggag aaaacaacac cctggtctgg aagtacgcag acgccggcca tgtgtgccac 2460
ctgtgccatc caaactgcac ctacggatgc actgggccag gtcttgaagg ctgtccaacg 2520
aatgggccta agatcccgtc catcgccact gggatggtgg gggccctcct cttgctgctg 2580
gtggtggccc tggggatcgg cctcttcatg tgagtcgac 2619
<210> 17
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aactgcagga acaccgggcc atggctgaag aaggtcctga agtgtaacac cccagacccc 60
tcgaagttct tttcccagct gagctcagag catggaggag acgtccagaa gtggctctct 120
tcgcccttcc cctcatcgtc cttcagccct ggcggcctgg cacctgagat ctcgccacta 180
gaagtgctgg agagggacaa ggtgacgcag ctgctccccc tgaacactga tgcctacttg 240
tccctccaag aactccaggg tcaggaccca actcacttgg tg 282
<210> 18
<211> 868
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala
65 70 75 80
Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser
85 90 95
Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
145 150 155 160
Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys
165 170 175
Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His Trp
180 185 190
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala
195 200 205
Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
210 215 220
Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp Val
225 230 235 240
Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly
245 250 255
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
260 265 270
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
275 280 285
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
290 295 300
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
305 310 315 320
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
325 330 335
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
340 345 350
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
355 360 365
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
370 375 380
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
385 390 395 400
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
405 410 415
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
420 425 430
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
435 440 445
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
450 455 460
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
465 470 475 480
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg
485 490 495
Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
500 505 510
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
515 520 525
His Ala Ala Arg Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu
530 535 540
Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys
545 550 555 560
Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe
565 570 575
Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu
580 585 590
Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln
595 600 605
Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu
610 615 620
Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val
625 630 635 640
Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile
645 650 655
Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala
660 665 670
Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr
675 680 685
Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln
690 695 700
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
705 710 715 720
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
725 730 735
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
740 745 750
Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn
755 760 765
Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His
770 775 780
Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met
785 790 795 800
Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
805 810 815
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly
820 825 830
Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr
835 840 845
Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile
850 855 860
Gly Leu Phe Met
865

Claims (10)

1.一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，结构包括依次串联的信号肽、BCMA抗原识别区、铰链区、跨膜区、胞内信号域和EGFR的胞外结构域Ⅲ和胞外结构域Ⅳ的片段。
2.根据权利要求1所述的靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述BCMA抗原识别区为抗BCMA的单链抗体；
所述抗BCMA的单链抗体有6种，分别为TSN1、TSN3、TSN5、TSN7、TSN8和TSN9；
其中，所述TSN7的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述信号肽为CD8信号肽，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的铰链区和跨膜区为CD8铰链区和跨膜区，所述CD8铰链区和跨膜区的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述的胞内信号域为CD3ζ胞内信号域，所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQID NO.5所示；所述的EGFR胞外结构域III和胞外结构域IV片段的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
3.根据权利要求1所述的靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区与所述胞内信号域之间还连接共刺激信号域；所述的共刺激信号域为4-1BB共刺激信号域，所述4-1BB共刺激信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述胞内信号域与所述EGFR的片段之间还连接T2A片段，所述T2A片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求3所述的靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激信号域还添加IL2RB刺激信号域，所述IL2RB刺激信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-5任一项所述靶向BCMA嵌合抗原受体。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，编码所述TSN7的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；
编码所述CD8信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；编码所述CD8铰链区和跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
编码所述4-1BB共刺激信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；编码所述CD3ζ胞内信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
编码所述EGFR胞外结构域III和胞外结构域IV片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
编码所述T2A片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
编码所述IL2RB刺激信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
7.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求6或7中所述的核酸分子。
8.一种基因修饰的T细胞，其特征在于，所述T细胞中含有权利要求7所述的重组载体或所述T细胞的染色体中整合有外源的权利要求5所述的核酸分子或表达权利要求1所述的嵌合抗原受体。
9.一种权利要求8所述靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)通过PCR方法获得所述靶向BCMA嵌合抗原受体的核酸序列片段；
(2)将所述靶向BCMA嵌合抗原受体的核酸序列片段克隆到载体质粒中，得到TSNs-CAR的表达质粒；
(3)将步骤(2)所述TSNs-CAR的表达质粒转染至293T细胞，经包装、浓缩后，得到慢病毒浓缩液；
(4)利用所述慢病毒浓缩液感染T细胞，即得所述靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰的T细胞。
10.权利要求1-4任一项所述的靶向BCMA的嵌合抗原受体、权利要求5或6所述的核酸分子、权利要求7所述的重组载体、权利要求8所述的靶向BCMA肿瘤抗原受体修饰T细胞在制备用于预防和/或治疗癌症或肿瘤药物中的应用。
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