CN113549156A

CN113549156A - 靶向cd38嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN113549156A
Application number: CN202110755407.5A
Authority: CN
Inventors: 王建勋; 冯娅茹; 李晓瑞; 尚凤琴; 余卓营; 宋志茹; 童建松; 刘颖
Original assignee: Beijing University of Chinese Medicine
Current assignee: Beijing University of Chinese Medicine
Priority date: 2021-07-05
Filing date: 2021-07-05
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2041-07-05
Also published as: CN113549156B

Abstract

本发明一种靶向CD38嵌合抗原受体(CD38CAR)及其应用，该受体的包含重链可变区与轻链可变区的单链抗体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。本发明的两种CD38CARs制备出的CAR‑T细胞对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用，并且对肿瘤细胞的杀伤具有持久性。

Description

靶向CD38嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，具体涉及一种靶向CD38嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

多发性骨髓瘤(MM)是一种血液***恶性肿瘤，其特征是骨髓中浆细胞不受控制的扩张。疾病的临床表现包括内脏器官损害的迹象，如高钙血症、肾功能不全、贫血和/或溶骨性损害。MM占所有癌症的1％，发病率为每10万人中有6-7例，是第二大最常见的血液***恶性肿瘤，据估计，在2021年，美国将有34,920个该疾病的新病例被确诊，并且将有15,600个MM相关的死亡病例发生。

在过去的几十年里，随着新的治疗方法的快速发展，如蛋白酶体抑制剂(PIs)、免疫调节药物(IMiD)、单克隆抗体(mABs)、自体干细胞移植(ASCT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，MM患者的预后和疗效得到了明显的改善。然而，MM在很大程度上仍是不治之症，而且复发率很高。在这方面，新的免疫疗法已经被开发出来以对抗MM。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)疗法最近出现，在MM的临床治疗上取得了令人鼓舞的效果。靶向CD19的CAR-T细胞治疗慢性/急性淋巴细胞白血病的成功，使其在2017年获得FDA批准。这刺激了人们对将CAR-T细胞疗法扩展到MM的兴趣。目前，CD19和BCMA是临床试验中常用的，而且正在开发新的靶点。其中CD38在骨髓瘤细胞中高度均匀地表达，是MM的理想靶抗原。然而，由于CAR转基因的免疫原性，宿主对鼠源性单链可变区(ScFv)的免疫反应导致CAR T细胞的持久性差，治疗效果不持久。在CAR-T细胞治疗中，人源化ScFv已被应用为降低CAR免疫原性并随后提高疗效的策略，但它不能有效防止导致过敏反应的抗IgE反应的发生。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了两种人源的ScFvCAR序列，其靶抗原是CD38。这两种靶向CD38的CAR-T细胞具有明显有效的细胞因子分泌和特异性肿瘤杀伤能力，体外增殖能力强，体内异种移植肿瘤杀伤能力非常强和持续时间长。

本发明提供一种靶向CD38嵌合抗原受体，该受体的包含重链可变区与轻链可变区的单链抗体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。在一种实施方式中，该受体包括依次串联的上游的信号肽和用于检测的myc标签；包含重链可变区与轻链可变区的CD38CAR抗原靶向区域；CD8铰链-跨膜结构域；CD28或4-1BB协同激活结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。

在一种实施方式中，CD38 CAR抗原靶向区域的重链可变区与轻链可变区之间由甘氨酸和丝氨酸组成的柔性接头(G4S)3连接。

在一种实施方式中，本发明提供一种靶向CD38蛋白的嵌合抗原受体T细胞，其表达有上述的嵌合抗原受体。

在一种实施方式中，本发明提供一种***的药物，其含有上述的嵌合抗原受体T细胞。

在一种实施方式中，本发明提供上述嵌合抗原受体在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤治疗中的应用。

在一种实施方式中，所述肿瘤是表面CD38阳性的肿瘤。

在一种实施方式中，所述肿瘤是多发性骨髓瘤。

在一种实施方式中，本发明提供上述嵌合抗原受体的应用，将编码所述嵌合抗原受体的基因片段***病毒表达载体，包装成病毒载体颗粒，感染人T细胞，制备得到嵌合抗原受体T细胞，用于表面CD38阳性的肿瘤治疗。

在本发明中，在成功制备的两种CD38CAR T细胞表面没有CD38的表达，但并不影响T细胞的功能。本发明的两种CD38CAR T细胞对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用，并且可以永久性地杀死肿瘤细胞；本发明的两种CD38CAR T细胞抗肿瘤作用具有持久性，能有效防止导致过敏反应的抗IgE反应的发生。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明的CD38CAR结构示意图；

图2是RT-qPCR检测本发明的CD38 CAR21和CD38 CAR22用PG13细胞包装产生的病毒载体上清的拷贝数结果图；

图3是本发明的CD38 CAR21和CD38 CAR22在不同供者原代T细胞中的转导效率结果图；

图4是RT-qPCR检测每个原代T细胞CD38 CAR21和CD38 CAR22整合的病毒载体拷贝数结果图；

图5是流式细胞术检测CD38 CAR21-T和CD38 CAR22-T转导后的人原代T细胞表面CD38抗原的表达结果图，其中图5A是Pan-T表达结果图，图5B是CD38 CAR21-T表达结果图，和图5C是CD38 CAR22-T表达结果图；

图6是不同肿瘤细胞表面CD38抗原表达结果图；

图7是荧光素酶活性测定CD38 CAR21-T和CD38 CAR22-T细胞杀伤不同肿瘤细胞的能力结果图；其中图7A是杀伤RPMI-gfp-luc细胞的结果图，图7B是杀伤Raji-luc细胞的结果图；

图8是IncuCyte S3***检测CD38 CAR21-T和CD38 CAR22-T细胞杀伤RPMI-gfp-luc肿瘤细胞的能力结果图；

图9是流式细胞术检测CD38 CAR21-T和CD38 CAR22-T细胞对不同肿瘤细胞的杀伤能力结果图，其中图9A是杀伤RPMI-gfp-luc细胞的结果图，图9B是杀伤Raji-luc细胞的结果图，图9C是杀伤Daudi细胞的结果图，和图9D是杀伤K562-和hBCMA细胞的结果图；

图10是CD38 CAR21-T和CD38 CAR22-T细胞在不同肿瘤细胞刺激下的不同细胞因子分泌结果图，其中图10A是RPMI-gfp-luc细胞的分泌TNF-α结果图，图10B是Raji-luc细胞的分泌TNF-α结果图，图10C是Daudi细胞的分泌TNF-α结果图，图10D是K562-hBCMA细胞的分泌TNF-α结果图，图10E是RPMI-gfp-luc细胞的分泌IFN-γ结果图，图10F是Raji-luc细胞的分泌IFN-γ结果图，图10G是Daudi细胞的分泌IFN-γ结果图，图10H是K562-hBCMA细胞的分泌IFN-γ结果图；图10I是RPMI-gfp-luc细胞的分泌IL-2结果图，图10J是Raji-luc细胞的分泌IL-2结果图，图10K是Daudi细胞的分泌IL-2结果图，图10L是K562-hBCMA细胞的分泌IL-2结果图；图10M是RPMI-gfp-luc细胞的分泌Granzyme B结果图，图10N是Raji-luc细胞的分泌Granzyme B结果图，图10O是Daudi细胞的分泌Granzyme B结果图，图10P是K562-hBCMA细胞的分泌Granzyme B结果图；

图11是CD38 CAR21-T和CD38 CAR22-T细胞的增殖能力检测结果图；

图12是CD38 CAR21-T和CD38 CAR22-T细胞抗肿瘤体内实验方案示意图；

图13肿瘤移植小鼠成瘤检测及分组结果图；

图14小动物活体成像肿瘤生物发光信号强度检测结果图；

图15以平均荧光强度表示的肿瘤负荷结果图；

图16是CD38 CAR21-T和CD38 CAR22-T细胞治疗后第2天血浆中人IFN-γ释放水平检测结果图；

图17是肿瘤异种移植模型中小鼠外周血CD3+T细胞数检测结果图；

图18是肿瘤异种移植模型中小鼠不同脏器CD38抗原残余检测结果图；

图19是小鼠生存曲线图；

图20是小鼠体重变化曲线图。

具体实施方式

为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。

一.材料和方法

1.细胞系和细胞培养

逆转录病毒载体包装所需的Phoenix-ECO细胞系和PG13细胞系均购自美国组织培养中心(ATCC，Manassas，VA，USA)。两种细胞系都在含有10％胎牛血清(FBS，Gibco，USA)的DMEM(Gibco，USA)中培养，并用于逆转录病毒载体包装。肿瘤细胞RPMI-gfp-luc、Raji-luc、Daudi和K562-hBCMA细胞系从ATCC获得。上述所有的肿瘤细胞系都在RPMI-1640培养基(Gibco,USA)中维持生长，其中含有10％的FBS。

2.CAR设计，逆转录病毒载体生产和检测

CD38 CAR包含以下组分：上游的信号肽(SP)和用于检测的myc标签；包含重链可变区与轻链可变区的CD38 CAR抗原靶向区域(ScFvs)，重链可变区与轻链可变区之间由由甘氨酸和丝氨酸组成的柔性接头(G4S)3连接，柔性接头(G4S)3可增加靶细胞结合区的灵活性，提高CAR与抗原间的亲和力；CD8铰链-跨膜结构域；CD28协同激活结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域，具体参见图1。

在本发明中CD38 CAR21的ScFv氨基酸序列：SQVQLVQSGGGLVQPGRSLRLPCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGSGSYYNPFYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNTVAWYQQLPGTAPKLLIYNYSQRPSGVPDRFSGSKSGTSSSLAIGGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVLG(SEQID NO:1)。

在本发明中CD38 CAR22的ScFv氨基酸序列：SQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGFVLLWFGELFTSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISNHLNWYQQKPGKAPKILIYIASILQSGVPSRFSGGGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQSHSSFVTFGGGTKVEIKR(SEQ IDNO:2)。

逆转录病毒载体上清液是通过以下两种细胞系产生的，依次使用Phoenix-ECO和PG13逆转录病毒载体包装细胞系。将CAR质粒转染Phoenix-ECO细胞并收集细胞上清液，以收获亲嗜性逆转录病毒载体，并用其转导PG13细胞。将收集到的逆转录病毒载体上清液转染PG13细胞混合，以水平离心的方式促进逆转录病毒载体转导PG13细胞，得到稳定的PG13逆转录病毒载体生产细胞系。收集PG13细胞上清液，-80℃保存。

载体的拷贝数通过定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)进行分析。首先，从含病毒的上清液中提取病毒RNA(

Viral RNA Mini Kit，Cat#:52904)，然后将病毒RNA逆转录成cDNA(QuantiNova Reverse Transcription Kit，Cat#:205410)。之后，用QuantStudio6 Flex***(Applied Biosystems)进行实时PCR，并不断稀释质粒以建立标准曲线(QuantiNova

Green PCR Kit，Cat#：75600)，公式如下。DNA量(ng)×6.022×10²³)/(长度(bp)×1×10⁹×650)。重组CD38 CAR逆转录病毒载体的滴度以转化单位(TU)/mL报告。本实验独立重复三次。引物序列如表1所示。

表1引物序列表

3.人PBMC分离、T细胞富集和CAR-T细胞生成

所有献血者的血液采采集都是在获得知情同意后进行的，并且方案得到了北京中医药大学医学伦理委员会的批准。通过Ficoll密度梯度离心法(Lymphoprep,Stemcell,Canada)从健康的供体中分离出人类外周血单核细胞(PBMCs)。用100ng/mL可溶性OKT3(Sino Biological，GMP-10977-H001)和100U/mL IL-2(Sino Biological，GMP-11848-HNAE)激活PBMCs，然后在37℃的5％CO2培养箱中培养48小时。T细胞生长培养基由AIM-V培养基(Gibco，USA)与10％FBS和100U/mL IL-2组成。

用流式细胞仪(BD LSRFortessa，美国)检测T细胞转导效率，用FlowJo V10分析数据。样品直接用APC结合的抗CD3(Biolegent，Cat#：300312)抗体和PE结合的抗myc(R&D，Cat#：9E10)抗体进行染色。通过RT-qPCR测定载体拷贝数整合后的原代T细胞，引物序列在表2中提供。CD38在CAR-T细胞表面的表达用APC结合的抗CD38(Biolegend,Cat#:102711)抗体进行染色，并通过流式细胞仪检测。

表2引物序列表

4.基于生物发光成像的细胞裂解试验

为了确定CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞对CD38阳性肿瘤细胞的裂解能力，将CAR-T细胞或未转化的T细胞(Pan-T)与RPMI-gfp-luc或Raji-luc细胞以不同的效应细胞：靶细胞比率(效靶比)孵育12小时。使用以下公式进行分析：细胞裂解率＝1-(实验组裂解-空白组裂解)/(最大释放孔裂解-空白组裂解)×100％。每个实验都是重复三次。

5.使用IncuCyte进行基于荧光的检测

RPMI-gfp-luc细胞与CAR-T细胞或Pan-T细胞以1:1的效靶比进行孵育。用IncuCyte S3活细胞分析***(Sartorius，德国)对细胞进行分析。每两小时采集一次图像，共68小时。每孔总体的GFP总强度被评估为活的GFP+肿瘤细胞的定量测量。这些值被归一化为起始值。每个实验都是重复三次。

6.基于流式细胞仪的细胞裂解试验

将CAR-T细胞或Pan-T细胞与RPMI-gfp-luc、Raji-luc、Daudi细胞或K562-hBCMA(表达BCMA但不表达CD38的K562-hBCMA为阴性对照)以不同的效靶比培养12小时。然后，用BV421标记的抗CD3抗体对细胞进行染色，用Annexin V-Alexa Fluor 647(BioFriend，Cat#:P04D12)染色来检测肿瘤细胞的凋亡。通过流式细胞仪收集数据，并通过FlowJo进行分析。肿瘤细胞的凋亡率以CD3阴性和Annexin V阳性细胞在总细胞中的百分比计算。每个实验都是重复三次。

7.细胞因子释放试验

为了评估CAR-T细胞的细胞因子释放，在与不同类型的肿瘤细胞孵化12小时后，收获上清液，按照制造商的操作说明，用细胞计数珠阵列(CBA，Biolegend，Cat#:B314528)试剂盒进行评估。珠子通过流式细胞仪进行分析。每个实验都是重复三次。

8.细胞增殖试验

根据制造商的说明书，用二醋酸羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，BD，Cat#:565082)标记CAR-T细胞或Pan-T细胞，以追踪CAR-T细胞的增殖。然后，在不添加外源细胞因子IL-2的情况下，将标记的CAR-T细胞与RPMI-gfp-luc细胞以1:1的比例进行培养72小时，通过监测CFSE稀释度评估T细胞的增殖情况。用流式细胞仪收集细胞，用FlowJo分析数据。

9.小鼠异种移植肿瘤

NPG/Vst小鼠是NOD-Prkdc^scidIl2rg^null家族的成员。患有严重联合免疫缺陷的雌性NPG/Vst小鼠购自VITALSTART(北京，中国)。所有小鼠都在特定的无病原体条件下饲养。该动物实验项目得到了北京中医药大学生物医学研究伦理委员会的批准(BUCM-4-2020060101-2015)。

对NPG小鼠(6-8周龄)静脉注射2×10⁶个RPMI-gfp-luc细胞。14天后，将移植的小鼠随机分为4组(对照组、Pan-T组、CD38 CAR21-T组和CD38 CAR22-T组)，每组5只小鼠。在同一天，小鼠接受静脉注射1x10⁸/kg的CAR T细胞或Pan-T细胞。第二次注射是在第一次CAR-T细胞注射后7天进行的。第二天，根据制造商的方案，使用多功能体内成像仪(MIIS，Molecular Devices)每周监测一次肿瘤负荷。肿瘤接种后第16天，收集小鼠外周血，分离血浆，用CBA试剂盒检测人IFN-γ的水平。肿瘤接种后第35天(CAR-T细胞注射后21天)，收集小鼠外周血100μL，并进行BV785结合的抗CD3(Biolegend，Cat#:300472)染色。然后，通过流式细胞仪检测小鼠血液中人CD3的表达，以评估注射的CAR-T细胞在体内的持久性。所有动物每周称重一次。实验持续了62天。在小鼠死亡时，收集血液、肝脏、骨髓。通过流式细胞仪监测残留的CD38阳性肿瘤细胞。

10.统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0软件对获得的数据进行分析，并以算术平均值±SEM表示。两组或两个数据点的比较用学生的t检验进行。所有的实验都使用独立的供体细胞进行了≥3次，以确定其可重复性。P值<0.05被认为具有统计学意义。

二.实验结果

1.第二代CD38 CARs的构建和CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞的制造

为了构建CD38 CAR，我们使用两种不同的抗CD38单链抗体的可变重链和轻链序列作为ScFv序列，CD8作为铰链和跨膜结构域，CD28作为协同激活结构域，CD3ζ作为细胞内激活结构域，参见图1。Phoenix-ECO细胞和PG13细胞被用来包装和生产CD38CAR逆转录病毒载体。通过RT-qPCR测定载体拷贝数，并计算载体滴度。结果如图2显示，产生了高滴度的CD38CAR逆转录病毒颗粒，CD38 CAR21和CD38 CAR22的逆转录病毒载体滴度分别为：3.12×10⁷±1.56×10⁶copies/mL、1.33×10⁷±7.07×10⁴copies/mL，可见两个重组抗CD38逆转录病毒载体颗粒具有较高滴度，足以用于转导T细胞实验。

用CD38 CAR逆转录病毒载体转导活化的人类初级T细胞。通过流式细胞仪检测CD38 CAR的表达。结果如图3显示，我们包装的两个CD38 CAR逆转录病毒载体具有很高的转导效率，流式细胞术检测抗CD38CAR逆转录病毒的表达结果表明我们包装的两种抗CD38CAR21和CD38 CAR22逆转录病毒转导效率分别为90.46±5.87％,80.52±9.63％。

RT-qPCR检测结果进一步证实了这两个CD38 CAR被整合到T细胞基因组中，如图4所示，CD38CAR21和CD38CAR22逆转录病毒颗粒整合入基因组中的拷贝数分别为0.84±0.07拷贝数/T细胞，1.27±0.08拷贝数/T细胞。转导后CD38在T细胞表面的表达几乎消失，如图5所示，CD38CAR21-T细胞表面CD38抗原表达由98.5％降为1.17％,CD38CAR22-T细胞表面CD38抗原表达由98.5％降为0.65％。

2.CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞在体外杀伤CD38阳性肿瘤细胞方面具有高度的有效性和特异性

细胞毒性是CAR-T细胞最重要的特征，直接决定了CAR-T细胞的抗肿瘤活性。为了确定CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性，我们建立了一个体外杀伤肿瘤的实验，将CAR-T细胞与不同类型的CD38阳性肿瘤细胞以不同的效靶比进行共孵育。肿瘤细胞上CD38表达的结果见图6，RPMI-gfp-luc细胞的CD38表达为99.9％，Raji-luc细胞的CD38表达为96.4％，Daudi细胞的CD38表达为99.7％。首先，通过荧光素酶实验分析了CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞对肿瘤细胞的细胞溶解作用。我们发现，与Pan-T细胞相比，CD38 CAR21-T和CD38 CAR22-T细胞对RPMI-gfp-luc和Raji-luc细胞均表现出更强的细胞溶解作用，而且这种细胞溶解能力与效靶比呈正相关，结果参见图7。此外，我们将CAR-T细胞与表达绿色荧光蛋白的RPMI-gfp-luc细胞以1:1的比例进行实时监测，发现两种CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞在4小时后就出现明显的杀伤作用，参见图8。这些结果表明，我们的CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞具有快速、高效的有效抗肿瘤能力。

为了验证CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞的这种抗肿瘤作用的抗原特异性，将CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞与表达CD38抗原的RPMI-gfp-luc、Raji-luc和Daudi细胞进行共孵育。不表达CD38但表达BCMA的K562-hBCMA细胞作为对照。样品通过流式细胞仪进行检测。结果显示，与Pan-T相比，不同的效靶比下，CD38 CAR21-T和CD38 CAR22-T细胞对三种不同的CD38阳性的肿瘤细胞在均有更强的杀伤力，并且这种对靶细胞的杀伤能力与效靶比呈现正相关，但对CD38阴性的K562-hBCMA细胞呈现出与Pan-T无差别的杀伤能力，说明，CD38 CAR21-T和CD38 CAR22-T细胞对肿瘤细胞的CD38抗原特异性，结果参见图9。

细胞因子的产生是CAR-T细胞激活的一个标志。将CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞与RPMI-gfp-luc、Raji-luc和Daudi或K562-hBCMA细胞共孵育12小时，收获细胞培养液，用CBA试剂盒测量细胞因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-2和颗粒酶B。如图10所示与Pan-T细胞相比，在CD38阳性肿瘤细胞的刺激下，CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞分泌的细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2和颗粒酶B均显著增多，但是在CD38阴性的肿瘤细胞刺激下，CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞分泌的细胞因子与Pan-T无明显差异。这些细胞因子的释放不仅表明CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞可以被有效激活，进一步证实了CD38 CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞具有强大的抗肿瘤活性。并且，CD38 CAR T细胞的活化也具有CD38抗原特异性。

3.CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞可以在体外快速增殖和扩展

产生强大而持久的抗肿瘤免疫反应，不仅需要引发细胞毒性和细胞因子的产生，还需要刺激CAR-T细胞的增殖。为了评估两种CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞在体外的增殖能力，我们将CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞分为两组：单一培养和与RPMI-gfp-luc共培养。采用基于CFSE的检测方法来测量增殖。结果显示，取刚染的细胞检测，发现细胞CFSE染色均匀，CD38 CAR21-T和CD38CAR22-T细胞的荧光信号强度与Pan-T细胞无差异，培养72小时后，与Pan-T细胞相比，CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞的CFSE绿色荧光信号明显减弱，表明这两种CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞的扩增速度更快。此外，在与RPMI-gfp-luc细胞的刺激下，CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞显示出比单独培养的CAR-T细胞CFSE绿色荧光信号减弱更为明显，显示出更好的增殖效果，参见图11。

4.CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞在体内有效地抑制了肿瘤的进展

为了证实CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞在体内的抗肿瘤作用，实验方案示意图见图12，我们通过静脉注射2x10⁶RPMI-gfp-luc肿瘤细胞来建立肿瘤异种移植模型，14天小鼠成瘤后，移植的小鼠被随机分为4组，参见图13，随后小鼠接受1x10⁸/kg CAR-T细胞或Pan-T细胞的尾静脉注射。第二次注射是同样的方式在第一次CAR-T细胞注射后7天进行的，第一次注射完CAR-T后2天，尾静脉采血，分离出血浆检测细胞因子的含量，从第一次注射CAR-T细胞后3天开始每周一次进行小鼠体内生物发光成像，检测肿瘤细胞变化，肿瘤细胞移植后35天，尾静脉采血检测血液中注射的T细胞残余，处死小鼠时取肝、骨髓、血液，检测肿瘤细胞残余。如图14和图15所示，体内生物发光成像的结果显示，与模型组或Pan-T组相比，CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞组的肿瘤在第二次注射CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞后被完全清除。肿瘤接种后第16天(第一次注射CAR-T细胞后的第二天)，我们发现用CD38CAR21-T和CD38 CAR21-T细胞治疗的小鼠血液中的人IFN-γ水平均显著高于模型组和Pan-T组小鼠，这说明CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞在短时间内产生了更多的IFN-γ，CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞被有效激活，参见图16。肿瘤细胞接种后35天，血液中仍可检测到人T细胞，且CAR-T组的数量高于对照组，参见图17，由图可见，CD38CAR21-T组每100ul血液中含有167075个CD3+T细胞，CD38CAR22-T组每100ul血液中含有30325个CD3+T细胞，与Pan-T细胞每100ul血液中含有5575个CD3+T细胞相比，CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞在体内的持久性明显更好，说明CAR-T细胞在体内的存活时间更长，抗肿瘤效果更持久。在研究结束时，CD38抗原在血液、肝脏和骨髓中几乎检测不到，参见图18，显示出体内强大的抗肿瘤能力，直到实验结束，也没有发现复发。肿瘤细胞移植后53天模型组小鼠全部死亡，59天Pan-T组小鼠也全部死亡，但是直至62天实验结束CD38CAR22组小鼠存活率为40％，CD38 CAR22-T组小鼠的存活率为100％，说明CD38CAR21-T和CD38CAR22-T组小鼠存活率均高于Pan-T组，参见图19。此外，注射CAR-T时小鼠体重为25g±1.052g，实验结束时Pan-T组小鼠体重为19g±0g，CD38 CAR21-T组小鼠体重为25.8g±1.142g，CD38 CAR22-T组小鼠体重为25.267g±3.808g，实验结果表明CAR-T治疗的小鼠的体重相对稳定，参见图20。

MM是一种恶性肿瘤，主要特征是骨髓中的浆细胞恶性增殖，分泌大量的单克隆免疫球蛋白(M蛋白)，最终导致器官损伤。MM仍然是不可治愈的。采用细胞免疫疗法是一种很有前途的治疗癌症的方法。近年来，基于CAR T细胞的免疫疗法在治疗血液恶性肿瘤，特别是淋巴瘤方面取得了显著的成功。随着CAR-T细胞治疗急性淋巴细胞白血病的成功，CAR-T治疗MM的研究也在不断推进。在这项研究中，我们证明了使用新型人类ScFv衍生的CAR-T细胞靶向CD38治疗MM的巨大潜力。MM细胞表达许多标志物；其中，CD38分子在骨髓瘤细胞表面均匀且高度表达。最近，许多研究表明，CD38可能是抗原特异性采用细胞疗法的理想目标。

CARs主要包括作为信号结合域的单链可变区和连接重链(VH)和轻链可变(LH)胞外结构域的连接体。在我们的研究中，我们使用了由甘氨酸和丝氨酸组成的柔性连接子(G4S)3来增加抗原结合域的灵活性。目前，临床上使用的CAR-T细胞大多含有小鼠来源的ScFv作为胞外信号域，但宿主可能对小鼠来源的ScFv产生免疫反应，导致人类抗小鼠抗体反应，从而降低疗效。我们实验室噬菌体展示筛选的两种人CD38抗体的ScFv序列可以降低CAR的免疫原性。跨膜区通常来自CD8，而细胞内分子包含CD3ζ信号链。第二代CAR细胞的协同刺激域使用CD28或4-1BB，而CD28能促进CAR-T细胞分泌细胞因子，并显示出更强的抗肿瘤能力。因此，在本实验中，我们使用了第二代CAR结构，我们使用的细胞内刺激是CD28。我们用逆转录病毒载体将CD38 CARs稳定地整合到有丝***靶细胞的基因组中。我们发现，在成功制备的CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞表面没有CD38的表达，但并不影响CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞的功能。CD38的丢失可能是由于CD38阳性T细胞区间的"自我分解"造成的。

为了确定CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞在体外的抗肿瘤能力，我们选择了不同种类的CD38阳性细胞，并以CD38阴性肿瘤细胞作为对照。在不同的实验研究中，我们发现CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞对CD38阳性肿瘤细胞有高效的杀伤作用，但对CD38阴性肿瘤细胞没有杀伤作用。这些结果表明，我们的CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。在细胞因子分泌实验中，CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞在受到肿瘤细胞刺激后会分泌促炎性细胞因子，从而促进肿瘤细胞的凋亡。CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞可以被CD38阳性的肿瘤细胞激活，但不能被不表达CD38的肿瘤细胞激活，这进一步证实了这种CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞的杀伤特异性。我们发现CAR-T细胞的增殖速度比Pan-T细胞快，在肿瘤细胞的刺激下，CAR-T细胞的增殖能力进一步增强，说明我们的CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞可以永久性地杀死肿瘤细胞。

此外，我们建立了NPG小鼠异种移植肿瘤模型来确定CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞在体内的抗肿瘤能力。我们发现，IFN-γ细胞因子的分泌明显增强，在尾静脉注射CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞两天后，CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞被有效激活，这表明了强大的抗肿瘤能力。此外，在连续观察期间没有观察到肿瘤的复发，流式细胞检测结果显示CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞可以在小鼠体内持续存在。这表明CD38CAR21-T和CD38CAR22-T细胞的抗肿瘤作用具有持久性。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

序列表

<110> 北京中医药大学

<120> 靶向CD38嵌合抗原受体及其应用

<130> PF2134

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 254

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Arg Ser Leu Arg Leu Pro Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp

20 25 30

Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Ala Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Glu Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Pro Phe Tyr Tyr

100 105 110

Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg

145 150 155 160

Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn Thr

165 170 175

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile

180 185 190

Tyr Asn Tyr Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205

Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ser Ser Leu Ala Ile Gly Gly Leu Gln Ser

210 215 220

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn

225 230 235 240

Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

245 250

<210> 2

<211> 251

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 2

Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser

20 25 30

Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Lys Asp Arg Gly Phe Val Leu Leu Trp Phe Gly Glu Leu Phe

100 105 110

Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

130 135 140

Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

145 150 155 160

Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Pro Ile Ser Asn His Leu

165 170 175

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ile Leu Ile Tyr

180 185 190

Ile Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Gly

195 200 205

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro Glu

210 215 220

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Ser Phe Val Thr

225 230 235 240

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

245 250

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacaccagac taagaaccta gaac 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcaaagtag acggcatcgc agct 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacaccagac taagaaccta gaac 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcaaagtag acggcatcgc agct 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

catgttcgtc atgggtgtga acca 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggcatgga ctgtggtcat gagt 24

Claims

1.一种靶向CD38嵌合抗原受体，其特征在于，该受体的包含重链可变区与轻链可变区的单链抗体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，该受体包括依次串联的上游的信号肽和用于检测的myc标签；包含重链可变区与轻链可变区的CD38 CAR抗原结合区域；CD8铰链-跨膜结构域；CD28或4-1BB协同激活结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，CD38 CAR抗原靶向区域的重链可变区与轻链可变区之间由甘氨酸和丝氨酸组成的柔性接头(G4S)3连接。

4.一种靶向CD38蛋白的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，其表达有权利要求1-3任一所述的嵌合抗原受体。

5.一种***的药物，其特征在于，其含有权利要求4所述的嵌合抗原受体T细胞。

6.根据权利要求1-3任一所述的嵌合抗原受体在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤治疗中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，所述肿瘤是表面CD38阳性的肿瘤。

8.根据权利要求6所述的应用，所述肿瘤是多发性骨髓瘤。

9.根据权利要求1-3任一所述的嵌合抗原受体的应用，其特征在于，将编码所述嵌合抗原受体的基因片段***病毒表达载体，包装成病毒载体颗粒，感染人T细胞，制备得到嵌合抗原受体T细胞，用于表面CD38阳性的肿瘤治疗。