CN116396402A - 一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤生物免疫治疗技术领域，具体公开了一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其构建方法和应用。本发明构建了靶向人Siglec6的嵌合抗原受体(CAR)以及该CAR的重组表达载体和该CAR修饰的免疫应答细胞。该CAR结构通过抗原特异性识别Siglec6后，可以激活该免疫应答细胞，启动其细胞毒性杀伤作用，靶向杀伤AML肿瘤细胞及白血病干细胞。经体内外实验证明，该CAR‑T细胞能精准有效的靶向攻击AML肿瘤细胞，可用来制备用于肿瘤生物免疫治疗的生物制剂。该CAR‑T细胞中还加入了用于终止CAR‑T细胞过度扩增的RQR8开关，保证了其安全性。

Description

一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其 构建方法和应用
技术领域
本发明涉及肿瘤生物免疫治疗技术领域，尤其是涉及一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其构建方法和应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人工表达能识别特定肿瘤表面抗原的抗原结合域，使T细胞获得抗体的特异性肿瘤识别能力，并识别肿瘤细胞之后通过CAR的胞内信号区激活T细胞，从使CAR-T细胞通过释放细胞因子、颗粒酶等方式发挥细胞毒作用，从而靶向清除恶性肿瘤细胞的一种新型免疫疗法。多项临床研究已经证实，这种工程化T细胞能够对多种难治性血液肿瘤显示出高效的抗肿瘤活性。然而，CAR-T细胞也会因脱靶效应等，导致一些临床副作用和毒性。
目前，CAR-T在B细胞恶性血液肿瘤和多发性骨髓瘤中已经展现出了很好的疗效，已有六款以CD19和BCMA为靶抗原的CAR-T细胞产品经美国FDA批准上市。然而在髓系恶性血液肿瘤和实体瘤中，CAR-T细胞仍然作用有限，其临床应用也鲜有进展。有研究已研制出多种靶向AML不同靶点的CAR-T细胞，主要的靶点有CLL-1，CD33，CD123等。虽然上述几种靶向AML肿瘤表面抗原的CART已投入临床试验，但是效果均较不佳。根据现有研究表明，靶向CLL-1的CAR-T细胞在临床试验中的疗效佳，但由于CLL-1在正常粒细胞中也表达，因此会引起严重的粒细胞缺乏症从而影响治疗后患者的正常造血功能恢复，使用CLL1 CART治疗的患者往往需要桥接造血干细胞移植，这很大程度上限制了此CART的临床应用；而靶向CD123的CAR-T细胞治疗的临床数据显示CR率很低，效果不佳，而此外的靶向其他靶点的CAR-T细胞也均未达到理想的疗效。限制CAR-T细胞对AML疗效的很重要的一个原因在于缺乏稳定表达于髓系恶性肿瘤细胞表面而不存在于正常细胞之上的特异性靶抗原，靶点的特异性越强，越有助于CAR-T细胞识别和杀伤肿瘤细胞，也有利于减轻CAR-T细胞的脱靶毒性。
因此，亟需新的针对AML的CART治疗靶点并设计和构建CART细胞。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其构建方法和应用。本发明构建出嵌合抗原受体，结合目前CAR-T工程技术，制备出能够特异性识别和杀伤髓系肿瘤等恶性肿瘤的免疫应答细胞(例如T细胞)，有希望为今后靶向Siglec6的其他免疫效应细胞疗法的设计提供依据，有希望为急性髓系白血病的治疗提供一种新的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含：
从羧基端到氨基端依次为标签蛋白、切割蛋白、信号肽结构域、抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激信号结构域，胞内信号传导结构域；所述抗原为Siglec6。
本发明的嵌合抗原受体上融合标签蛋白，用于标记、分选、消除宿主细胞。跨膜结构域用于锚定结合细胞膜，在抗原识别之后，激活信号被跨膜结构域传递到细胞内部。
本发明构建的嵌合抗原受体靶向的Siglec6抗原在原代AML母细胞及AML干细胞亚群中表达，而在正常的中性粒细胞及造血干细胞等细胞亚群中不表达，因此能在赋予免疫应答细胞(例如T细胞)特异性识别AML肿瘤细胞及更强抗肿瘤能力的同时也不会造成粒细胞缺乏等脱靶毒性。
作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述标签蛋白包括RQR8、EGFRt、CD20、c-MYC、6×His、GST、Fc、Flag、HA中的至少一种；所述切割蛋白包括切割蛋白2A或弗林蛋白酶；所述切割蛋白2A包括切割蛋白T2A、切割蛋白P2A、切割蛋白E2A、切割蛋白F2A中的至少一种。
所述标签蛋白可以通过可切割蛋白(可以为2A或弗林蛋白酶)或启动子与CAR连接存在于CAR构建体上。
作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述标签蛋白为RQR8，所述切割蛋白为切割蛋白T2A；所述RQR8的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述切割蛋白T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
该嵌合抗原受体的结构带有RQR8***开关，当CAR-T细胞在治疗过程中毒性过强时，可利用CD20单抗启动抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)作用和补体依赖的细胞毒性(CDC)作用以诱导CART***，从而使其更加安全可控，具有较高临床应用价值。
作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述信号肽结构域包括人CD8α信号肽结构域、人GM-CSF信号肽结构域、人胰岛素信号肽结构域、人IL-2信号肽结构域、人胰蛋白酶原信号肽结构域中的至少一种，优选地，所述信号肽结构域为人CD8α信号肽结构域，所述人CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述抗原结合结构域为抗Siglec6的单链抗体核酸序列。
作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述抗Siglec6的单链抗体核酸序列由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区和轻链可变区通过至少一个linker连接。其排列方式可为VH—linker—VL或VL—linker—VH。
在一些实施例中，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)来源于全人源抗体JML1。
在一些实施例中，linker的长度可以为1～25个或多个氨基酸。
作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述linker包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、LRQKD(GGGS)2ERP、DGGGS、LRQRDGERP、TGEKP、KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKVD、GGRRGGGS、GGRR、LRQKDGGGSERP和(GGGGS)n中的至少一种；甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物为柔性linker；
其中，甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n中的n为大于1的整数；
(GGGGS)n中的n为1、2、3、4或5。
本发明选用的linker不限于上述种类，还包括其他柔性linker或刚性linker。刚性linker包括但不限于(XP)n和(EAAAK)n，其中X可为指定任何氨基酸，1≤n≤10。
优选地，所述嵌合抗原受体还包括铰链结构域，跨膜结构域与所述抗原结合结构域之间可直接连接或由铰链结构域连接。
铰链结构域是将抗原结合结构域连接至跨膜结构域的一段足够柔性的氨基酸结构，允许抗原结合结构域定向在不同的方向上，以利于抗原识别。铰链结构域包括人CD8α铰链区、人CD28铰链区、人免疫球蛋白恒定区或其变体、人免疫球蛋白铰链区、人IgG4铰链区、人免疫球蛋白CH1/CL区、Fc区、人免疫球蛋白CH2结构域、人免疫球蛋白CH3结构域中的至少一种。优选地，所述铰链结构域为人CD8α铰链区。所述人CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ IDNO：5所示。
作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述抗Siglec6的单链抗体核酸序列如SEQ ID NO：4所示。
作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述跨膜结构域包括人CD8跨膜区、人CD8α跨膜区、人CD28跨膜区、人CD4跨膜区、人CD28跨膜区、人CD3ζ跨膜区、人CD137/4-1BB跨膜区、人CD134/OX40跨膜区、人ICOS跨膜区、人CD5跨膜区、人CD9跨膜区、人CD16跨膜区、人CD22跨膜区、人CD33跨膜区、人CD37跨膜区、人CD45跨膜区、人CD64跨膜区、人CD80跨膜区、人CD86跨膜区、人CD154跨膜区、人TCRα跨膜区、人TCRβ跨膜区中的至少一种；优选地，所述跨膜结构域为人CD8跨膜区，所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
作为本发明所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述共刺激信号结构域包括人CD28胞内共刺激信号结构域、人CD137/4-1BB胞内共刺激信号结构域、人CD134/OX40胞内共刺激信号结构域、人CD27胞内共刺激信号结构域、人ICOS胞内共刺激信号结构域、人B7-H3胞内共刺激信号结构域、人2B4胞内共刺激信号结构域、人DAP10胞内共刺激信号结构域、人DNAM1胞内共刺激信号结构域、人DAP12胞内共刺激信号结构域中的至少一种；所述胞内信号传导结构域包括人CD3ζ或人FcεRIγ；优选地，所述共刺激信号结构域为人CD137/4-1BB胞内共刺激信号结构域，所述人CD137/4-1BB胞内共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQID NO：7所示；所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
第二目的，本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的核酸，编码所述嵌合抗原受体的核酸的核苷酸序列从5’端到3’端依次为编码标签蛋白的核苷酸序列、编码切割蛋白的核苷酸序列、编码信号肽结构域的核苷酸序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列，编码铰链结构域的核苷酸序列、编码跨膜结构域的核苷酸序列，编码共刺激信号结构域的核苷酸序列，编码胞内信号传导结构域的核苷酸序列。
优选地，编码所述嵌合抗原受体的核酸的核苷酸序列从5’端到3’端依次为编码标签蛋白RQR8的核苷酸序列、编码切割蛋白T2A的核苷酸序列、编码所述人CD8α信号肽的核苷酸序列、编码抗Siglec6的单链抗体核酸序列(抗人Siglec6 scFv的核苷酸序列)、编码人CD8α铰链区的核苷酸序列、编码人CD8α跨膜区的核苷酸序列、编码人CD137/4-1BB共刺激信号结构域的核苷酸序列、编码人CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列。
在一实施方式中，所述编码人RQR8的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
在一实施方式中，所述编码切割蛋白T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
在一实施方式中，所述编码人CD8α信号肽的核苷酸序列SEQ ID NO：11所示。
在一实施方式中，所述编码抗Siglec6的单链抗体核酸序列如SEQ ID NO：12所示。
在一实施方式中，所述编码人CD8α铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
在一实施方式中，所述编码人CD8α跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。
在一实施方式中，所述编码人CD137/4-1BB共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQID NO：15所示。
在一实施方式中，所述编码人CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ IDNO：16所示。
第三目的，本发明提供了一种包含上述核酸的重组表达载体。本发明的重组表达载体包括但不限于重组DNA或RNA构建体、慢病毒载体、γ-逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺联病毒载体等病毒载体、一些非病毒载体、电转导载体、睡美人转座子载体。
在一实施方式中，所述重组表达载体为重组DNA构建体。
本发明将上述的重组表达载体转染至免疫应答细胞(例如T细胞、NK细胞)，可实现对该免疫应答细胞的靶向CAR修饰。
本发明构建重组表达载体中还含有启动子，所述启动子包括但不限于EF1α启动子，MND启动子，MSCV启动子，CMV启动子。在一实施方式中，所述启动子为EF1α启动子。
第四目的，本发明提供了一种包含上述核酸的重组病毒。本发明所述的重组病毒包括但不限于慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺联病毒。
在一些实施方式中，所述重组病毒为上述的重组表达载体与辅助包装质粒pSPAX2和pMD2G共转染293T细胞得到的重组病毒。
第五目的，本发明提供了一种所述的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞。在一些实施方式中，所述免疫应答细胞为T淋巴细胞、NK细胞或NKT细胞。
在一实施方式中，所述免疫应答细胞为T淋巴细胞。
本发明构建的靶向人Siglec6靶点的免疫应答细胞(例如靶向Siglec6的CAR-T细胞)在直接抗肿瘤的同时能够减轻脱靶效应和CAR-T细胞过度扩增带来的例如粒细胞缺乏等的毒副作用，改善恶性肿瘤的预后
Siglec6(CD327)全称结合免疫球蛋白样凝集素(Siglec)-6，表达于包括AML干细胞亚群在内的原代AML肿瘤细胞，而在正常的造血干细胞和祖细胞、T细胞、NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞上几乎不表达；在其他恶性细胞和组织中，Siglec6也有着不同程度的表达，如慢性淋巴细胞白血病、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、克隆性肥大细胞疾病和甲状腺癌等，这提示Siglec6是一个有前景的抗肿瘤治疗靶点。本发明构建得到的免疫应答细胞可以在尽量减少副作用和毒性的基础上用于恶性肿瘤的治疗。
第六目的，本发明提供了所述的免疫应答细胞在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。
优选地，免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细胞。所述淋巴谱系的细胞选自T、B和NK细胞。所述T细胞包括但不限于细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、记忆T细胞(包括干细胞样T细胞、中央记忆T细胞)、效应T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。在一些优选实施方式中，本发明的免疫应答细胞是T细胞。
本发明构建的免疫应答细胞不仅用于治疗急性髓系白血病，还可以用于治疗慢性淋巴细胞白血病、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、克隆性肥大细胞疾病等血液***恶性肿瘤及实体恶性肿瘤(甲状腺癌等)。
第七目的，本发明提供了所述的免疫应答细胞的构建方法，所述方法包括将上述编码上述嵌合抗原受体的核酸引入细胞的步骤。
所述的免疫应答细胞的构建方法具体构建方法，包括以下步骤：
S1、将编码所述的嵌合抗原受体的核酸以及RQR8标签蛋白的核苷酸序列通过分子克隆方式重组连接到慢病毒载体上，经测序鉴定，构建出包含抗Siglec6的单链抗体核酸序列的全长CAR序列以及编码独立于CAR表达的RQR8标签蛋白的核苷酸序列的慢病毒表达载体；
S2、将步骤S1构建的慢病毒表达载体转化感受态细胞，通过摇菌、质粒提取，得到扩增的Anti-Siglec6-CAR表达质粒；将Anti-Siglec6-CAR表达质粒和病毒包装辅助质粒pSPAX2和pMD2G共转染293T细胞得到重组慢病毒；
S3、分离患者外周血单个核细胞，从中阳性分选/阴性分选出CD3+T细胞，经磁珠刺激扩大培养后即可获得免疫应答细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明基于抗Siglec6的单链抗体核酸序列构建了靶向人Siglec6的嵌合抗原受体(CAR)以及该CAR的重组表达载体和该CAR修饰的免疫应答细胞(例如T细胞，Anti-Siglec6 CAR-T)。该CAR结构通过抗原特异性识别Siglec6后，可以激活该免疫应答细胞，启动其细胞毒性杀伤作用，靶向杀伤AML肿瘤细胞及白血病干细胞。该免疫应答细胞不会杀伤正常的造血干细胞和祖细胞、T细胞、NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞，理论上不会产生诸如粒细胞缺乏症等毒副作用。经体内外实验证明，该CAR-T细胞能精准有效的靶向攻击AML肿瘤细胞，可用来制备用于肿瘤生物免疫治疗的生物制剂。该CAR-T细胞中还加入了用于终止CAR-T细胞过度扩增的RQR8开关，保证了其安全性。本发明提供的Anti-Siglec6CAR-T为恶性肿瘤治疗提供了一种新的方案，具有较大的基础研究及临床应用价值，具有良好的产业前景。
附图说明
图1为本发明嵌合抗原受体的结构示意图；
图2为本发明嵌合抗原受体表达载体图谱；
图3为鉴定本发明嵌合抗原受体转染的T细胞的流式示意图；
图4为CD34+造血干细胞表面Siglec6表达情况图；
图5为AML细胞系表面Siglec6的表达情况图；
图6为Anti-Siglec6 CAR-T对AML细胞系的细胞毒性检测及杀伤过程中的细胞因子释放检测结果图；
图7为患者原代AML肿瘤细胞表面Siglec6的表达情况及原代杀伤检测图；
图8为RQR8开关诱导Anti-Siglec6 CAR-T/未转染T细胞的自伤作用结果图；
图9为经MOCK-T细胞与Anti-Siglec6 CAR-T治疗的小鼠体内肿瘤负荷变化情况以及小鼠的生存曲线。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、构建靶向人Siglec6的嵌合抗原受体(Anti-Siglec6 CAR)表达质粒
本实施例构建了一个表达人源化抗Siglec6 scFv(Anti-Siglec-6mAb JML-1)的嵌合抗原受体(结构如图1所示)。
本发明提供的嵌合抗原受体结构包括依次连接的RQR8开关结构域(标签蛋白)、切割蛋白(T2A)、信号肽结构域(人CD8α，CD8αSP)、抗原结合结构域(靶向人Siglec6的单链抗体结构域(抗Siglec6 scFv)、铰链结构域(人CD8α铰链区，CD8αH)、跨膜结构域(人CD8α跨膜区，CD8αTM)、共刺激信号结构域(人CD137/4-1BB胞内共刺激信号结构域，CD137/4-1BBCS)、胞内信号传导结构域(人CD3ζ胞内结构域，CD3ζ)。
上述嵌合抗原受体表达质粒的构建步骤包括：
步骤一：靶向Siglec6嵌合抗原受体的氨基酸序列及核苷酸序列的检索：
抗人的Siglec6全人源抗体JML1的VH和VL查自U.S.Patent 8，877，199，VH和VL之间用linker连接，构成抗Siglec6的单链抗体核酸序列(SEQ ID NO：12)，从美国国立医学图书馆NCBI的Genbank数据库中搜索到以上氨基酸序列相对应的核苷酸序列：人CD8α信号肽(SEQ ID NO：11)、人CD8α铰链区(SEQ ID NO：13)、人CD8跨膜区(SEQ ID NO：14)、人CD137/4-1BB共刺激信号结构域(SEQ ID NO：15)、人CD3ζ胞内信号传导序列(SEQ ID NO：16)。
将上述结构按照CD8αSP—Anti-Siglec6 scFv—CD8αH—CD8 TM—4-1BB CS—CD3ζ依次连接，得到靶向人Siglec6的嵌合抗原受体核苷酸序列，将此核苷酸序列标记为CAR-Siglec6。
步骤二：靶向人Siglec6特异性嵌合抗原受体的表达载体的构建和鉴定：
基因合成RQR8安全开关标签以及CAR-Siglec6的编码核苷酸序列，通过分子克隆技术，通过分子克隆的方式连接到慢病毒载体
pCDH-EF1α-copGFP-T2A-Puro(如图2所示)，构建靶向人Siglec6的嵌合抗原受体载体结构。
具体操作步骤如下：
1.通过基因合成方法得到RQR8安全开关和CAR-Siglec6的基因序列，通过PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增此基因序列并在两端分别添加酶切位点BamH I和酶切位点EcoR I，之后进行酶切反应，得到黏性末端基因序列。再将慢病毒载体质粒pCDH-EF1α-copGFP-T2A-Puro同样进行BamH I和酶切位点EcoR I的双酶切反应，得到无copGFP-T2A-Puro的载体酶切后片段(酶切反应条件为：酶切温度为37℃，酶切时间为1小时20分钟。酶切体系包括：5μL的10×buffer、1μg的待酶切物的DNA、1μL的BamHⅠ酶、1μL的EcoRⅠ酶，用去离子水将酶切体系的体积补至50μL)。
2.将含有RQR8分子开关和CAR-Siglec6的黏性末端基因片段和无copGFP-T2A-Puro的载体酶切后片段分别利用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳并进行胶回收，之后将目的片段和载体酶切片段进行连接(反应体系如下：适量载体酶切产物和含有CAR-Siglec6和RQR8安全开关的黏性末端的酶切产物使得二者的摩尔比为1:5、1μl的T4 DNA连接酶、1μl的10×T4 DNA连接酶Buffer，添加无菌双蒸水至10μl体系。16℃连接2小时)在慢病毒表达载体pCDH-EF1α-copGFP-T2A-Puro上，经测序鉴定，成功构建如图2所示的表达质粒。
3.将该连接产物转入DH5α感受态细胞(Takara)中，冰水浴30min后，于42℃下热激45s，再冰上静置2min，得到转化产物，将转化产物加入未添加氨苄青霉素的LB肉汤培养基中，在37℃、220rpm条件下摇床培养60min至液体浑浊后，500g常温下离心3-5min，弃去上清液后，用300μl新鲜LB肉汤培养基重悬，并将重悬液用三区划菌法均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基平板上，于37℃的温箱中，过夜培养8-12h，次日在长有菌落的LB琼脂培养基平板上挑取阳性克隆。
4.鉴定阳性克隆：将步骤3中挑取的阳性克隆接种至5-7ml含氨苄青霉素抗性的LB肉汤培养基中，于37℃、180rpm恒温摇床培养8-12h后，取适量菌液进行质粒小提。将小提得到的质粒经BamH I和EcoR I双酶切，具体操作参见步骤3中提到的双酶切反应，将酶切产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳以鉴定目的DNA片段，获得了大小约为2000bp的目的片段。将大小为2000bp的凝胶电泳所得产物回收，经测序鉴定可确定该片段与CAR-Siglec6和RQR8安全开关的基因序列完全匹配。
5.将测序完全正确的对应菌液加入200ml含1/1000氨苄青霉素的LB肉汤培养基中，在37℃、220rpm条件下恒温摇床培养过夜。12-16小时后，用无内毒素质粒大提试剂盒(天根)大提质粒，具体方法参照说明书，从而完成所需慢病毒表达载体质粒的构建。
实施例2、重组慢病毒的的制备及重组慢病毒滴度测定
步骤一：慢病毒的包装：将实施例1中所构建的Anti-Siglec6 CAR的表达质粒，以及病毒包装质粒pSPAX2和pMD2G按4：3：2的比例(共10ug)与PEI(Polyscience,美国)及Opti-MEM培养基共孵育后转染至293T细胞(100mm培养皿，融合度约50％～70％)。具体的转染操作过程参见PEI转染试剂说明书。转染后24小时更换DMEM完全培养基。
步骤二：收取病毒及病毒浓缩：分别在换液后48小时和72小时，收集上清液，在4℃、3000g条件下离心15min后，用0.45μm滤膜(Millipore,美国)过滤，分装至EP管后转入-80℃保存，此后应避免浓缩病毒液反复冻融。
步骤三：慢病毒滴度的测定：在24孔板中以1*105 293T/500μl接种5孔细胞，每孔500μl，8h后在第一、二、三、四孔中分别加入100μl、10μl、1μl、0.1μl步骤二中获取的病毒，第五孔保留原始状态，24h后向每孔中添加500μl DMEM完全培养基，72h后用胰酶(Gibco)消化293T细胞，并将其分别取入流式管中，加入CD34抗体(PE通道，Abcam，克隆号：QBEnd/10)后，室温避光孵育15min，孵育结束后用生理盐水清洗，并用流式细胞仪(贝克曼库尔特公司)检测。
实施例3、构建靶向人Siglec6的嵌合抗原受体T细胞(命名为Anti-Siglec6CAR-T)
靶向人Siglec6的嵌合抗原受体T细胞的构建方法包括以下步骤：
步骤一(分离人外周血单个核细胞)：取15ml Ficoll淋巴细胞分离液(天津灏洋)于50ml离心管中，从含有肝素的真空采血管中吸取等量人外周新鲜血液在Ficoll液面上方约1cm处沿离心管管壁缓慢加至Ficoll上层(离心管应倾斜)。在常温，700g条件下离心20分钟。离心后的液体将分为四层，从上到下依次为血浆层、单个核细胞层(即白膜层)、分层液层和红细胞和粒细胞层，从中轻轻吸出白膜层放入新的15ml离心管，用PBS清洗，于常温、500g条件下离心10分钟后，用1ml PBS重悬细胞沉淀并计数，后将细胞密度调整至1*107/ml。
步骤二(分离CD3+T细胞)：取步骤一中的2*107个细胞(2ml)，加入40μLCD3Microbeeds(Milteny，美天旎)，4-8℃孵育15min后，向其中加入10ml PBS，于300g条件下离心10min，后弃上清，用2ml PBS重悬细胞。将磁珠配套LS柱置于磁力架(美天旎)上，用2mlPBS预冲LS柱后，将细胞重悬液倒入LS柱，待细胞流下后，用2ml PBS清洗LS柱三次。后将LS柱与磁力架分离，向LS柱中加入3ml PBS，用活塞将CD3+T细胞冲洗出来，并用X-VIVO15 T细胞专用培养基(Lonza)培养。
步骤三(激活CD3+T细胞)：将步骤二中获取的T细胞在4℃、500g条件下离心10min后弃上清，用X-VIVO15培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1*106/ml。向培养基中加入细胞因子IL2(100U/ml)以及CD3/CD28刺激磁珠(Gibco)(25μl刺激磁珠/1*106个细胞)，培养36～48小时后即可进行慢病毒的转染。
步骤四(慢病毒感染T细胞)：向经磁珠激活36～48小时的T细胞(将细胞密度调整至1*106/ml)中加入病毒浓缩液，将慢病毒以MOI＝5的感染系数进行转染，并加入病毒转染试剂polyberen(Sigma，7μg/ml)。混匀后在37℃、5％CO2温箱中孵育，24小时后更换新鲜培养基，并调整细胞密度为1*106/ml。转染后的T细胞可以继续培养10-14天，应在培养过程中根据细胞数量进行补液(含有终浓度为100U/ml的IL-2的X-VIVO15培养基)并扩大培养，使细胞密度保持为1*106/ml。
步骤五(慢病毒转染效率检测)：以RQR8标签阳性作为该CAR成功转入T细胞的标志，用抗CD34抗体检测转染效率具体操作为：首先取转染3天后的T细胞和未经转染的T细胞各一管(每管约2*105个细胞)，在500g条件下离心3min，弃上清后，用PBS清洗细胞一次，后加入200μl PBS重悬细胞。向两管细胞中分别加入5μl CD34抗体(PE通道，Abcam，克隆号：QBEnd/10)，混匀后室温避光孵育15min。孵育结束后用生理盐水清洗细胞，后用流式细胞仪进行检测(贝克曼库尔特公司)。检测结果如图3所示。结果显示，未经转染的T细胞未检测到RQR8的表达，而采用慢病毒转染的T细胞则检测到其的表达。本实施例所制备的Anti-Siglec6 CAR-T转染率约为70％。
实施例4、检测正常造血干细胞Siglec6表达情况
为证明实施例三中所制备的Anti-Siglec6 CAR-T不会影响正常的造血功能，本申请人检测了6位患者/供者的造血干细胞细胞表面Siglec6的表达情况，结果如图4所示。
具体操作步骤为：首先取一定量经造血动员后的外周血标本，向其中分别加入5μlCD327抗体(APC通道，Milteny，克隆号：REA852)和CD34抗体(PE，Miltenyi，克隆号：REA1164)，混匀后室温避光孵育15min。孵育结束后用生理盐水清洗细胞，后用流式细胞仪进行检测(贝克曼库尔特)，检测时首先用CD34抗体的通道圈出造血干细胞，后在造血干细胞中检测Siglec6的表达量，检测结如图4所示。
结果证明，正常CD34+造血干细胞表面不表达Siglec6抗原，说明Anti-Siglec6CAR-T在理论上不会对正常造血干细胞产生特异性识别和杀伤作用，因此不会影响患者的造血功能(所有样本的获取均符合伦理要求，均获得了知情和许可)。
实施例5、检测AML细胞系Siglec6表达情况
为证明实施例3中所制备的Anti-Siglec6 CAR-T的靶向AML细胞系杀伤能力，本申请人首先检测了5株急性髓系白血病细胞系THP1、MOLM13、KG1a、U937、NB4和一株急性淋巴细胞白血病细胞系NALM6表面Siglec6的表达情况，结果如图5所示。
具体操作步骤为：首先培养多种肿瘤细胞株，每种细胞富集约1*106个细胞，100μlPBS重悬细胞后，向其中分别加入5μl抗Sigelc6抗体(APC通道，Milteny，克隆号：REA852)，混匀后室温避光孵育15min。孵育结束后用生理盐水清洗细胞，后用流式细胞仪进行检测(贝克曼库尔特公司)。
检测结果如图5所示，结果显示，急性髓系白血病细胞系均高表达Siglec6靶点，而急性淋巴细胞白血病等其他恶性肿瘤细胞系均不表达Siglec6靶点。通过结果筛选出Siglec6表达较高的U937、M13及THP1三种细胞。
实施例6、对AML细胞系的杀伤检测及细胞因子释放检测
本申请人选取实施例5中检测出的Siglec6高表达的U937、M13及THP1细胞系检测实施例3中所制备的Anti-Siglec6 CAR-T的靶向AML细胞系的杀伤能力(结果如图6所示)。
具体操作步骤如下：首先本申请通过慢病毒转染、嘌呤霉素筛选和单细胞克隆培养成功构建U937-LGP、M13-LGP、THP1-LGP细胞系，细胞纯度为99％-100％(图6A)。将MOCK-T细胞/Anti-Siglec6 CAR-T与四种肿瘤细胞系按效靶(E/T)比为1:1、2：1和5:1共孵育，在24小时后采用流式细胞术检测对肿瘤细胞的杀伤作用，并同时收集体系上清，通过细胞因子检测试剂盒(达科为)检测效靶比为1:1时分泌的细胞因子情况(每组实验各重复三次)，具体细胞因子检测步骤见达科为细胞因子检测试剂盒(流式荧光法)说明书。结果表明，Anti-Siglec6 CAR-T具有靶点特异性，对Siglec6高表达的AML细胞系具有良好的杀伤作用，检测结果如图6B所示。并且相关细胞因子水平明显高于Mock-T细胞组,检测结果如图6C所示。
实施例7、AML原代肿瘤细胞表面Siglec6表达情况及杀伤检测
步骤一：检测AML原代肿瘤细胞Siglec6的表达：
为证明实施例三中所制备的Anti-Siglec6 CAR-T的靶向AML原代肿瘤细胞杀伤能力，本申请人检测了10位患者肿瘤细胞表面Siglec6的表达情况，结果表1所示。
具体操作步骤为：首先分离AML患者骨髓标本中的单个核细胞，用生理盐水清洗细胞两次后，每位患者分别富集约1*106个细胞，100μl PBS重悬细胞，加入用于标记肿瘤细胞的抗体和抗Siglec6抗体，混匀后室温避光孵育15min。孵育结束后用生理盐水清洗细胞，后用流式细胞仪进行检测(贝克曼库尔特)，检测结果及患者基本情况如表1所示。
表1
Figure BDA0004142287890000141
结果证明，大部分AM L患者的肿瘤细胞表达Siglec6，说明Anti-Siglec6CAR-T在理论上能对原代肿瘤细胞产生特异性识别和杀伤作用(所有的患者样本的获取均符合伦理要求，均获得了患者的知情和许可)。
步骤二：原代细胞杀伤实验检测：
本申请人收集了10例急性髓细胞白血病患者骨髓细胞样本，提取其中单个核细胞后，分别按1：1的比例与MOCK-T细胞/Anti-Siglec6 CAR-T共孵育。48小时后采用流式细胞术检测MOCK-T细胞/Anti-Siglec6 CAR-T对肿瘤细胞的杀伤率，实验结果如图7所示。数据显示，Anti-Siglec6 CAR-T相比MOCK-T细胞，对AML肿瘤细胞显示出明显杀伤作用。
实施例8、RQR8***开关功能验证
实施例3中的Anti-Siglec6 CAR-T携带有了RQR8标签蛋白，其可用于对CAR-T细胞进行标记、分选以及清除，以暂停治疗过程中发生的严重毒副反应或者避免治疗后残存的CAR-T细胞造成严重的骨髓抑制作用。RQR8是一种含136aa的膜蛋白，它能够被CD34的抗体QBEnd10识别，因此可以用于CART细胞的标记和分析；此外RQR8还含有两个CD20单抗(利妥昔单抗，RTX)的模拟表位，能够在发生安全问题时，通过利妥昔单抗迅速清除CAR-T细胞。RTX是靶向人CD20抗原的特异性治疗性单克隆抗体，当RTX与Anti-Siglec6 CAR-T表面的RQR8结合后，其可通过激活补体依赖性细胞毒作用(CDC)以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)实现对RQR8阳性细胞的耗竭。
为验证RQR8***开关的有效性，本申请人将不低于临床应用剂量抗(50μg/ml)的RTX加入NK细胞与MOCK-T细胞/Anti-Siglec6 CAR-T共培养的体系中(设置效靶比分别为10:1、5:1、2:1、1:1)，48h后，取一定量共培养体系中的细胞标记CD3抗体(用于标记T细胞)和CD34抗体(用于标记CAR-T细胞，PE通道，Abcam公司，克隆号：QBEnd/10)，流式细胞术检测体系中残余CD3+T/CAR-T细胞的数量。结果显示，相对于MOCK-T细胞，CD20单抗在一定浓度下，能通过ADCC作用实现对Anti-Siglec6 CAR-T的清除(图8)。该结果初步证明RQR8作为***开关的可行性。
实施例9、动物实验验证
参考图9，为了进一步验证Anti-Siglec6 CAR-T的体内肿瘤靶向清除作用，本申请人对6只重度免疫缺陷NSG小鼠进行尾静脉肿瘤细胞注射，每只小鼠注射2×106个U937-LGP细胞以建立AML小鼠模型，并将这些小鼠分为两组(实验组和对照组)，每组各3只。在肿瘤细胞注射后第7天，实验组的小鼠均接受5×106个Anti-Siglec6 CAR-T治疗，对照组小鼠接受等量MOCK-T细胞进行治疗。此后，通过活体成像技术每周1次监测小鼠体内肿瘤负荷。实验结果显示，参考图9，相比于MOCK-T细胞，Anti-Siglec6 CAR-T治疗的小鼠体内肿瘤负荷更低(图9A)，生存时间更长(图9B)。
以上实验结果可以证明：Anti-Siglec6 CAR-T可以特异性靶向清除高表达Siglec6的肿瘤细胞。根据体外细胞系实验显示，Anti-Siglec6 CAR-T对表达Siglec6的细胞系有较强的杀伤能力，并在杀伤过程中分泌较高的细胞毒性相关的细胞因子。体外原代细胞杀伤实验显示Anti-Siglec6 CAR-T可以有效靶向AML患者体内表达Siglec6的肿瘤细胞，并在杀伤过程中分泌较高的细胞毒性相关的细胞因子。小鼠体内实验结果显示，相较于MOCK-T细胞，Anti-Siglec6CAR-T能更有效地消除小鼠体内表达Siglec6的肿瘤细胞系(即U937-LGP细胞系)，延长小鼠的生存期。
因此，本发明所构建的靶向Siglec6的嵌合抗原受体及通过慢病毒转染而得到的靶向Siglec6的特异性免疫应答细胞可以应用于治疗急性髓系白血病等的多种恶性肿瘤。特别指出，该嵌合抗原受体T细胞除外能有效规避粒细胞缺乏等严重的细胞毒副作用，还嵌入了可用于对CAR-T细胞进行标记、分选以及清除的RQR8开关，具有良好的安全性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (15)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含：
从羧基端到氨基端依次为标签蛋白、切割蛋白、信号肽结构域、抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激信号结构域，胞内信号传导结构域；所述抗原为Siglec6。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述标签蛋白包括RQR8、EGFRt、CD20、c-MYC、6×His、GST、Fc、Flag、HA中的至少一种；所述切割蛋白包括切割蛋白2A或弗林蛋白酶；所述切割蛋白2A包括切割蛋白T2A、切割蛋白P2A、切割蛋白E2A、切割蛋白F2A中的至少一种；优选地，所述标签蛋白为RQR8，所述切割蛋白为切割蛋白T2A；所述RQR8的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述切割蛋白T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽结构域包括人CD8α信号肽结构域、人GM-CSF信号肽结构域、人胰岛素信号肽结构域、人IL-2信号肽结构域、人胰蛋白酶原信号肽结构域中的至少一种，优选地，所述信号肽结构域为人CD8α信号肽结构域，所述人CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域为抗Siglec6的单链抗体核酸序列。
5.如权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗Siglec6的单链抗体核酸序列由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区和轻链可变区通过至少一个linker连接。
6.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述linker包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、LRQKD(GGGS)2ERP、DGGGS、LRQRDGERP、TGEKP、KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKVD、GGRRGGGS、GGRR、LRQKDGGGSERP和(GGGGS)n中的至少一种；
其中，甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n中的n为大于1的整数；
(GGGGS)n中的n为1、2、3、4或5。
7.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗Siglec6的单链抗体核酸序列如SEQ ID NO：4所示。
8.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域包括人CD8跨膜区、人CD8α跨膜区、人CD28跨膜区、人CD4跨膜区、人CD28跨膜区、人CD3ζ跨膜区、人CD137/4-1BB跨膜区、人CD134/OX40跨膜区、人ICOS跨膜区、人CD5跨膜区、人CD9跨膜区、人CD16跨膜区、人CD22跨膜区、人CD33跨膜区、人CD37跨膜区、人CD45跨膜区、人CD64跨膜区、人CD80跨膜区、人CD86跨膜区、人CD154跨膜区、人TCRα跨膜区、人TCRβ跨膜区中的至少一种；优选地，所述跨膜结构域为人CD8跨膜区，所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
9.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激信号结构域包括人CD28胞内共刺激信号结构域、人CD137/4-1BB胞内共刺激信号结构域、人CD134/OX40胞内共刺激信号结构域、人CD27胞内共刺激信号结构域、人ICOS胞内共刺激信号结构域、人B7-H3胞内共刺激信号结构域、人2B4胞内共刺激信号结构域、人DAP10胞内共刺激信号结构域、人DNAM1胞内共刺激信号结构域、人DAP12胞内共刺激信号结构域中的至少一种；所述胞内信号传导结构域包括人CD3ζ或人FcεRIγ；优选地，所述共刺激信号结构域为人CD137/4-1BB胞内共刺激信号结构域，所述人CD137/4-1BB胞内共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQID NO：7所示；所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
10.编码如权利要求1～9任一项所述的嵌合抗原受体的核酸，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体的核酸的核苷酸序列从5’端到3’端依次为编码标签蛋白的核苷酸序列、编码切割蛋白的核苷酸序列、编码信号肽结构域的核苷酸序列、编码抗原结合结构域的核苷酸序列，编码铰链结构域的核苷酸序列、编码跨膜结构域的核苷酸序列，编码共刺激信号结构域的核苷酸序列，编码胞内信号传导结构域的核苷酸序列。
11.一种包含如权利要求10所述的核酸的重组表达载体。
12.一种包含如权利要求10所述的核酸的重组病毒。
13.一种如权利要求1～9任一项所述的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞。
14.如权利要求13所述的免疫应答细胞在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。
15.如权利要求13所述的免疫应答细胞的构建方法，其特征在于，所述方法包括将如权利要求10所述的核酸引入细胞的步骤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117126296A (zh) * 2023-07-20 2023-11-28 广州默锐医药科技有限公司 一种car-t细胞及其构建方法和应用

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