CN109735500B

CN109735500B - 一种分泌型靶向cd133的car-t细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109735500B
Application number: CN201910075308.5A
Authority: CN
Inventors: 尚小云; 李甲璐; 王丹; 沈慧; 马丽; 许先进; 刘慧莹
Original assignee: Suzhou Maximum Bio Tech Co ltd
Current assignee: Suzhou Maximum Bio Tech Co ltd
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2039-01-25
Also published as: CN109735500A

Abstract

本发明公开了一种分泌型靶向CD133的CAR‑T细胞，包括分泌PD‑1抗体且靶向CD133的CAR‑T细胞；分泌IL12细胞因子且靶向CD133的CAR‑T细胞。本发明还公开了此分泌PD‑1抗体或IL12的CAR‑T细胞的制备方法以及该CAR‑T细胞在制备抗肿瘤的细胞治疗药物中的应用。本发明CAR‑T细胞分泌的PD‑1抗体，特异性的与T细胞表面的PD‑1相结合，阻断PD‑1/PD‑L1信号对T细胞活性的抑制反应，有利于CAR‑T长时间对肿瘤细胞生长产生有效的抑制；本发明CAR‑T细胞分泌的IL12细胞因子，可作用于肿瘤抑制性免疫微环境中的免疫抑制细胞，降低其免疫抑制能力，进而增强CAR‑T细胞的杀伤效果。

Description

一种分泌型靶向CD133的CAR-T细胞及其制备方法和应用

技术领域

本研究涉及医学生物领域，具体涉及一种靶向CD133且分泌PD-1抗体或IL12细胞因子的CAR-T细胞。此外，本发明还涉及该细胞的制备方法及应用。

背景技术

近年来，肿瘤免疫治疗的临床应用已经取得了显著进展，成为继手术、放疗、化疗和靶向治疗的另一种有效的肿瘤治疗手段。在多种肿瘤免疫治疗方法中，嵌合抗原受体(Chimeric Antigen receptor，CAR)修饰的T淋巴细胞(CAR-modified T lymphocyte，CAR-T)疗法被证实是一种针对恶性肿瘤极具前景的治疗手段。

大量的临床数据表明，针对CD19的CAR-T细胞对难治性或恶性B细胞淋巴瘤有很好的治疗效果，特别是对急性或慢性淋巴性白血病以及霍奇金淋巴瘤，被认为是最有希望攻克肿瘤的手段之一。目前针对CD19特异的CAR-T疗法——Kymriah and Yescarta，用于治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤，已在美国批准上市。

CAR-T是一种通过把患者自己的防御细胞(T细胞)取出来，人工(依靠基因技术)加上一种能够识别癌症细胞的部件(癌细胞识别抗原受体)，并大量复制，再给回患者，从而激发患者自身防御细胞的杀伤功能杀死癌症细胞。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，使得免疫细胞HLA具有非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力。CAR分子的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原结合区(Single chain antibody Fragment，scFv)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号转导区。其中scFv段的设计对于CAR的特异性、有效性以及基因改造免疫细胞自身的安全性是关键的决定因素。

CD133是人类干/祖细胞膜上发现的一种跨膜糖蛋白，常表达于神经原始细胞、上皮/内皮祖细胞谱系、造血干/祖细胞等，是目前用来标记或分选干/祖细胞的最常用的膜表面标志。近年来，越来越多的研究表明，CD133已经成为众多肿瘤干细胞表面的特异性标记分子，在超过50％的肝细胞癌(HCC)中均检测到CD133的高表达。此外，在多种实体瘤中均有CD133的较高表达，包括神经胶质瘤、肝癌、肺癌，结肠癌、胰腺癌、乳腺癌及卵巢癌等。已有报道表明，在晚期肝癌患者中，检测到较高的CD133表达，且CD133的高表达也预示着较差的预后。此外，CD133作为肿瘤干细胞(CSCs)和内皮祖细胞的标志物，已被证实与肿瘤发生、转移、侵袭、耐药及复发等密切相关。因此，CD133的这些特性使其成为CD133表达阳性的晚期肿瘤患者免疫治疗的理想靶点。已报道的靶向CD133阳性细胞的方法包括抗CD133的免疫毒素、双特异性抗体等，均显示了一定应用前景。此外，靶向肿瘤干细胞靶点CD133的嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞或NK细胞可以特异性杀伤病人的脑胶质瘤干细胞或卵巢癌干细胞。在一个晚期胆管癌患者中，CD133特异性的CAR-T细胞治疗使其获得了持续4.5个月的部分响应。

虽然CAR-T细胞免疫治疗在动物模型和患者身上表现了令人振奋的作用，但二代、三代CAR-T细胞在实体瘤治疗领域仍面临巨大挑战，主要包括：缺乏肿瘤特异性抗原，从而存在攻击正常细胞引起严重副反应的风险；T细胞难以有效的到达肿瘤部位，CAR-T细胞浸润实体瘤的能力不足、存活时间短，以及一系列的免疫抑制分子及免疫抑制肿瘤微环境等均会限制CAR-T细胞的抗肿瘤疗效，如T细胞膜蛋白3(TIM-3)、淋巴细胞激活因子3(LAG-3)、细胞毒性T淋巴细胞-4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)及其两个主要配体PD-L1、PD-L2等。

肿瘤抑制性免疫微环境是CAR-T在实体瘤中疗效不佳的重要原因。白细胞介素12(Interleukin-12，IL-12)是一种由P35(IL12A)和P40(IL-12B)两条链组成的异源二聚体，是一种促炎细胞因子，主要由树突状细胞和巨噬细胞等抗原提呈细胞分泌，可激活自然杀伤(NK)细胞，诱导IFN-γ的产生，增强吞噬细胞的吞噬和释放炎性细胞因子的能力，也可作用于肿瘤抑制性免疫微环境中的免疫抑制细胞，降低其免疫抑制能力等。

程序性死亡受体1(PD-1)是T细胞活化的负调节，通过与其两个配体PD-L1、PD-L2相互作用来限制T细胞的活性。抑制免疫负调控取得了突破性进展，例如抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1等免疫检查点单抗阻断质量，开创了癌症治疗新时代。目前应用于临床研究的PD-1或者PD-L1抗体，通过阻断PD-1或者PD-L1通路，部分恢复T细胞的功能，使其能够继续杀伤肿瘤细胞具有治疗多种类型肿瘤的潜力。恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈鳞状上皮细胞癌、霍奇金淋巴瘤、肾细胞癌、结直肠癌、卵巢癌等都均显示良好的临床疗效。且PD-1和PD-L1的单抗已被美国食品药品监督局(FDA)批准用于复发或难治性恶性黑色素瘤或非小细胞肺癌的治疗。

本技术方案采用的是***的CAR结构，CAR-T细胞在识别CD133同时能够分泌细胞因子如IL12或者PD-1的抗体，分泌的细胞因子如IL12会加强CAR-T细胞自身的杀伤功能，同时招募其他的免疫细胞如DC细胞同时对肿瘤细胞杀伤；分泌的PD-1抗体可以阻断肿瘤细胞表面PD-L1分子与CAR-T细胞的结合，从而解除PD-L1对CAR-T细胞的抑制作用，本技术方案因此能够提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供分泌型靶向CD133的CAR-T细胞，该CAR-T细胞表达CD133-CAR同时可以分泌抗体或细胞因子，能更好的克服肿瘤微环境的免疫抑制，增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

本发明要解决的技术问题之二是提供该分泌型靶向CD133的CAR-T细胞的制备方法，该方法能够制备出既有细胞杀伤毒性，又能高水平表达抗体或细胞因子的细胞。

本发明要解决的技术问题之三是提供该分泌型靶向CD133的CAR-T细胞在制备抗肿瘤的细胞治疗药物中的应用。这些分泌scFv的CAR-T细胞以旁分泌和自分泌方式起作用，以改善CAR-T细胞和肿瘤特异性T细胞抗肿瘤活性。scFv的设计对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性都起到关键的决定因素。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供分泌型靶向CD133的CAR-T细胞，包括如下细胞：

表达CD133-CAR的同时分泌抗体的T细胞；

表达CD133-CAR的同时分泌细胞因子的T细胞。

在本发明中，术语CD133-CAR指CD133嵌合抗原受体，包含有靶向CD133的scFv序列。

scFv：全称single-chain antibody fragment，即单链抗体片段。

在本发明中，术语CD133-scFv指抗CD133单链抗体片段，进行密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该核苷酸序列用于慢病毒表达载体上、逆转录病毒载体上、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或者其他类型的表达载体上，优选为慢病毒表达载体上。

作为本发明优选的技术方案，所述的表达CD133-CAR的同时分泌抗体的T细胞，其抗体优选为PD-1抗体。

作为本发明优选的技术方案，所述的表达CD133-CAR的同时分泌细胞因子的T细胞，其细胞因子优选为IL12。

在本发明的第二方面，提供该分泌型靶向CD133的CAR-T细胞的制备方法，包括如下步骤：

(1)构建携带CD133-CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒；

(2)将携带CD133-CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主细胞，制备可感染T细胞的重组慢病毒载体；

(3)从供者提供的外周血中分离PBMC，使用磁珠分离、活化T细胞；

(4)将步骤(2)所得的重组慢病毒载体转导进入T细胞，产生表达CD133-CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR-T细胞；

(5)将步骤(4)所得细胞体外培养；

(6)将步骤(5)所得细胞大量扩增；

(7)收集表达CD133-CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR-T细胞。

本发明中的T细胞也可替换为NK细胞。

嵌合抗原受体(CAR)的基本设计中包含一个肿瘤相关抗原结合区(Single chainantibody Fragment，scFv)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号转导区。

本发明步骤(1)中所述CD133-CAR的胞膜外肿瘤相关抗原结合区为用于结合CD133蛋白的CD133单链抗体(scFv)，依次串联c-myc表位标记、CD8 Hinge嵌合受体铰链和CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区。

本发明步骤(1)中中所述CD133-CAR的胞内信号转导区包含编码共刺激因子区域，该共刺激因子区域选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LIGHT、B7-H3、特异性结合CD83的配体、ICAM-1、HVEM(LIGHTR)、CD160、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、IL2Rα、CD103、CD11b、CD11c、TRANCE/RANKL、SLAMF4(CD244,2B4)、CD69、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)中的一种或多种的任意组合。

作为本发明优选的技术方案，所述共刺激因子区域为CD28-4-1BB；所述胞内信号传导区为CD28-4-1BB-CD3ζ，其中CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，4-1BB核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，CD3ζ核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中，所述优化密码子后得到的序列为scFv区域序列，该核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中，所述重组慢病毒质粒是重组后的复制缺陷型慢病毒质粒，能将外源片段整合入宿主基因，一次性使用，无法复制和增殖，安全可靠；所述重组慢病毒质粒是二代或者三代的慢病毒转基因质粒，优选为第三代慢病毒转基因质粒。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中，所述重组慢病毒质粒是第三代慢病毒质粒，所述第三代慢病毒骨架质粒序列已公开在发明名称为“一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体及其构件方法和应用”，专利申请号为20161000860.5的专利申请文件中。本发明所用第三代慢病毒骨架质粒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(淼灵生物，P0980)，见附图1所示，所述第三代慢病毒质粒包括氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子SV40 Ori序列、RSV启动子、慢病毒5Terminal LTR、慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、Gag顺式元件、RRE顺式元件、env顺式元件、cPPT顺式元件、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中，所述的重组慢病毒质粒是靶向CD133抗原的慢病毒转基因质粒，重组慢病毒质粒依次包含CMV启动子序列、CD133单链抗体(scFv)、C-myc表位标记、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、胞内信号传导区、NFAT启动子序列、IL12细胞因子序列，NFAT启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，IL12细胞因子核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；步骤(3)中，所述的重组慢病毒载体将靶向CD133的嵌合受体表达在T细胞表面，同时能够分泌细胞因子IL12。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中，所述的重组慢病毒质粒是靶向CD133抗原的慢病毒转基因质粒，重组慢病毒质粒依次包含CMV启动子序列、CD133单链抗体(scFv)、C-myc表位标记、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区(如SEQ ID NO.2所示)、胞内信号传导区、EF1α启动子序列、PD-1抗体序列，EF1α启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，IL2 SS核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，PD-1抗体核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；步骤(2)中，所述的重组慢病毒载体将靶向CD133的嵌合受体表达在T细胞表面，同时能够分泌PD-1抗体，所述的PD-1抗体为人PD-1抗体。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中，所述的慢病毒质粒中PD-1本身信号肽用强分泌信号肽IL2 SS替代，增加的人IL-2SS信号肽序列可进一步增强PD-1基因的表达。

作为本发明优选的技术方案，步骤(2)所述的宿主细胞为293FT或293T细胞。

本发明中的PD-1抗体(anti-PD-1)和IL12的scFv由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽连接而成，scFv能够较好的保留其对抗原的亲和力，并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。

在本发明的第三方面，提供上述分泌型靶向CD133的CAR-T细胞在制备抗肿瘤的细胞治疗药物中的应用。所述细胞可以用于制备抗肿瘤的细胞治疗药物，特别是靶向CD133阳性的肿瘤干细胞的细胞治疗药物；可以制作一种混合制剂，包括上述表达CD133-CAR的同时分泌抗体的CAR-T细胞和表达CD133-CAR的同时分泌细胞因子的CAR-T细胞以不同比例混合的药物。

作为本发明优选的技术方案，所述的表达CD133-CAR的同时分泌抗体的T细胞，其抗体优选为PD-1抗体；

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过表达CD133-CAR而识别和结合肿瘤细胞表面高表达的CD133的糖蛋白，并通过胞内信号传导区将信号传入T细胞，从而活化T细胞，促进T细胞分泌细胞因子，该细胞因子进而可以杀伤高表达CD133的肿瘤细胞。此外，构建一种CAR-T细胞还可以分泌PD-1抗体，阻断PD-1对效应细胞活性的抑制。

本发明中使用的共刺激因子的一种或多种因子组合，可使T细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，增强杀伤肿瘤细胞作用及免疫记忆。

附图说明

图1为本发明实施例1、2中pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP骨架载体质粒示意图；

图2为本发明实施例1中pCDH-CMV-CD133-Myc-EF1-anti-PD1-3rd质粒载体图谱；

图3为本发明实施例1、2所述的辅助质粒pRSV-Rev；

图4为本发明实施例1、2所述的辅助质粒pCMV-VSV-G；

图5为本发明实施例1、2所述的辅助质粒pMDLg-pPRE；

图6为本发明实施例1中表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞中PD-1抗体的分泌ELISA检测结果图；

图7为本发明实施例2中pCDH-CMV-CD133-Myc-NFAT-IL12-3rd质粒载体图谱；

图8为本发明实施例2中表达CD133-CAR的同时分泌IL12的CAR-T细胞中IL12的分泌ELISA检测结果图；

图9为本发明实施例3中不同效靶比条件下，表达CD133-CAR的同时分泌IL12的CAR-T细胞和表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞对靶细胞杀伤效率折线图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，具体说明发明的实施例不应解释为限制本分明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照制造商所建议的条件。除非另有说明，否则百分比按重量计算。一下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

虽然在本发明的实施例中可以使用与本发明所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的材料和方法。

实施例1制备表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞

本发明所述的表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞制备方法如下：

一、优化密码子：准备CD133嵌合抗原受体(CAR)，进行密码子优化，使之更易于在人体细胞内表达，密码子优化后地序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

二、构建携带CD133-CAR及抗体基因的慢病毒质粒：

通过基因合成获得CD133-CD8-CD28-4-1BBL-CD3ζ+EF1+anti PD1基因，且基因两端分别带有SanB1/Sall酶切位点。所述CD133基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EF1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，CD8、CD28、4-1BBL、CD3ζ等基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。SnaB1/Sall双酶切pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体(见图1)，通过in-Fusion技术将各基因片段克隆至载体中，挑选阳性克隆测序。鉴定正确的质粒扩大培养。获得靶向CD133且分泌PD-1抗体的慢病毒载体，命名为pCDH-CMV-CD133-Myc-EF1-anti-PD1-3rd质粒，如图2所示。

三、携带CD133-CAR及抗体基因的重组慢病毒质粒感染293FT细胞，制备可感染T细胞的重组慢病毒载体；

1.293FT细胞长到90％时，提前1h换无双抗培养液(此时细胞营养充分，细胞会变的饱满和圆润，细胞状态很好)；

2.配制lipo2000(40μL)+1.5ml OptimMEM(一个10cm dish的用量)，混匀，静置5min；

3.配制质粒混合液：准备一支无菌的5mL离心管加入1.5mL无血清Opti-MEM培养液、辅助质粒(pRSV-Rev(addgene，#12253)、pCMV-VSV-G(addgene,#8454)、pMDLg-pRRE(addgene，#12251)，分别见图3-5)和慢病毒表达质粒pCDH-CMV-CD133-Myc-EF1-anti-PD1-3rd(见图2)，充分吹打混匀；

4.Coating dish：10％ Ploy-L-Lys+90％ PBS，3ml/10cm dish，37℃10min；

5.将lipo2000和质粒一起混匀，静置20min；

6.1X TE消化293FT细胞，37℃消化1min(此细胞比较容易消化，1min即可)；

7.1000rpm离心3min收集细胞，PBS或DMEM清洗一次；

8.将Ploy-L-Lys coating好的dish用PBS清洗3次(Ploy-L-Lys对细胞有毒，必须清洗干净)；

9.向coating好的dish中加入5ml DMEM(10％ FBS，无双抗)；

10.向每个dish中加入3ml lipo2000和质粒的混合液；

11.向每个dish中加入3ml用DMEN重悬的293FT细胞，充分混匀，均匀铺版，37℃培养(悬浮转染，一盘90％的细胞全部用来转染)；

12.12h后换液，DMEM含10％ FBS，无双抗(液体和移液管必须84消毒处理)；

13.36h后观察细胞中荧光表达情况(荧光表达丰富，细胞培养液变黄，即可收病毒)；

14.收集细胞培养液，4℃保存(与下次收集的病毒一起纯化)；

15.向培养皿中加入8ml培养液(10％FBS，无双抗)，继续37℃培养，生产病毒(由于第二次生产的病毒会变少，故培养液液相应少加)；

16.36h后收集培养液(50ml收集管用封口膜封口，培养皿用84消毒液处理)；

17.4500rpm离心5min；

18.0.45μm滤膜过滤；

19.将滤液放入超速离心管中，18000rpm离心3h；

20.弃上清，沉淀用DMEM重悬(1ml DMEN/管)；

21.再用1ml DMEN洗一次，将重悬液加入真空超速离心管中，共6-7ml；

22.向离心管底部加3ml 20％蔗糖溶液；

23.24000rpm离心2h；

24.弃上清，吸干液体；

25.用100μl PBS重悬沉淀；

26.4℃摇床溶解；

27.-80℃保存(分装5μL/管)；

28.有限稀释法感染293FT细胞测定包装有重组载体的慢病毒滴度。

四、从供者提供的外周血中分离PBMC；

1.用抗凝管采集健康人(或患者)外周血15mL，室温静止30min；

2.350g离心5min(慢升慢降)，吸出血浆备用；

3.用PBS稀释抗凝血(1:1)混匀，依据样品体积取15mL离心管，按1:2加入淋巴细胞分离液(Ficoll)(Ficoll:血样＝1:2)，血液样本缓慢加入Ficoll，速度尽量缓慢(铺平后可适当的加快速度)，450g离心，25min；

4.离心结束后，小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层，转入一个新的15mL离心管中，加入PBS，300g离心10min，弃上清；

5.再次加入10mL PBS重悬细胞，160g离心15min，弃上清；

6.最后加入10mL的RPMI 1640培养基重悬，300g离心10min，弃上清即得到PBMC。

五、使用磁珠分离、活化T细胞：

1.以约1×106/mL密度加入淋巴细胞培养液培养，并按照磁珠：细胞比例为1:1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠和终浓度为300U/mL的重组人IL-2刺激培养48h；

2.Retronectin包被24孔板，每孔加入380μL 5μg/mL的Retronectin溶液(PBS)，4℃孵育过夜；

3.去除24孔板中的Retronectin溶液(PBS)，1mL PBS洗2次。

六、采用步骤(3)所得的重组慢病毒载体转导进入T细胞，产生表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞：

1.在转染前1h，步骤(5)所得培养液中补加终浓度为10μg/mL的Polybrene以提高转染效率，将细胞接种于包被了Retronectin的24孔板中，每孔细胞数目3×105，培养液体积600μL。

2.按照MOI＝10，在PBMCs细胞中加入浓缩后的慢病毒，32℃，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱中培养。

七、将步骤(6)所得细胞体外培养：按照MOI＝10，在PBMCs细胞中加入浓缩后的慢病毒，32℃，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱中培养。

八、将步骤(7)所得细胞大量扩增：感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度为300U/mL的重组人IL-2。

九、取部分细胞悬液，加入BFA 24h后，ELISA检测上清液中PD-1的分泌情况(见图6)，与对照组相比实验组分泌PD-1抗体，说明成功制得表达CD133-CAR且分泌PD-1抗体的CAR-T细胞，将细胞扩大培养并冻存。

十、培养7天后收集细胞，获得表达CD133-CAR(能靶向识别CD133)且分泌PD-1抗体的CAR-T细胞。

实施例2制备表达CD133-CAR的同时分泌IL12的CAR-T细胞

本发明所述的表达CD133-CAR的同时分泌IL12的CAR-T细胞制备方法如下：

一、优化密码子：准备CD133嵌合抗原受体(CAR)，即CD133-CAR，进行密码子优化，使之更易于在人体细胞内表达，密码子优化后地序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

二、构建携带CD133-CAR及细胞因子基因的慢病毒载体骨架。

通过基因合成获得CD133-CD8-CD28-4-1BBL-CD3ζ+NFAT+IL12基因，且基因两端分别带有SanB1/Sall酶切位点。所述NFAT启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CD8、CD28、4-1BBL、CD3ζ等基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。SnaB1/Sall双酶切pCDH-CMV-MCS-NFAT-copGFP载体，通过IN-Fusion技术将各基因片段克隆至载体中，挑选阳性克隆测序。鉴定正确的质粒扩大培养。获得靶向CD133且分泌IL-12细胞因子的慢病毒载体，命名为pCDH-CMV-CD133-Myc-NFAT-IL12-3rd质粒，见图7所示。

三、携带CD133-CAR及细胞因子基因的重组慢病毒质粒感染293FT细胞，制备可感染T细胞的重组慢病毒载体。

3.配制质粒混合液：准备一支无菌的5mL离心管加入1.5mL无血清Opti-MEM培养液、辅助质粒(pRSV-Rev(addgene，#12253)、pCMV-VSV-G(addgene,#8454)、pMDLg-pRRE(addgene，#12251)，分别见图3-5)和慢病毒表达质粒pCDH-CMV-CD133-Myc-NFAT-IL12-3rd(见图7)，充分吹打混匀；

4.Coating dish：10％ Ploy-L-Lys+90％ PBS，3ml/10cm dish，37℃10min；

5.将lipo2000和质粒一起混匀，静置20min；

7.1000rpm离心3min收集细胞，PBS或DMEM清洗一次；

9.向coating好的dish中加入5ml DMEM(10％ FBS，无双抗)；

10.向每个dish中加入3ml lipo2000和质粒的混合液；

14.收集细胞培养液，4℃保存(与下次收集的病毒一起纯化)；

17.4500rpm离心5min；

18.0.45μm滤膜过滤；

19.将滤液放入超速离心管中，18000rpm离心3h；

20.弃上清，沉淀用DMEM重悬(1ml DMEN/管)；

22.向离心管底部加3ml 20％蔗糖溶液；

23.24000rpm离心2h；

24.弃上清，吸干液体；

25.用100μl PBS重悬沉淀；

26.4℃摇床溶解；

27.-80℃保存(分装5μL/管)；

四、从供者提供的外周血中分离PBMC。

1.用抗凝管采集健康人(或患者)外周血15mL，室温静止30min；

350g离心5min(慢升慢降)，吸出血浆备用；

2.用PBS稀释抗凝血(1:1)混匀，依据样品体积取15mL离心管，按1:2加入淋巴细胞分离液(Ficoll)(Ficoll:血样＝1:2)，血液样本缓慢加入Ficoll，速度尽量缓慢(铺平后可适当的加快速度)，450g离心，25min；

3.离心结束后，小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层，转入一个新的15mL离心管中，加入PBS，300g离心10min，弃上清；

4.再次加入10mL PBS重悬细胞，160g离心15min，弃上清；

5.最后加入10mL的RPMI 1640培养基重悬，300g离心10min，弃上清即得到PBMC。

五、使用磁珠分离、活化T细胞。

3.去除24孔板中的Retronectin溶液(PBS)，1mL PBS洗2次；

六、采用步骤三所得的重组慢病毒载体转导进入T细胞，产生表达CD133-CAR的同时分泌细胞因子IL12的CAR-T细胞。

1.在转染前1h，步骤(5)所得培养液中补加终浓度为10μg/mL的Polybrene以提高转染效率，将细胞接种于包被了Retronectin的24孔板中，每孔细胞数目3×105，培养液体积600μL；

七、将步骤六所得细胞体外培养：按照MOI＝10，在PBMCs细胞中加入浓缩后的慢病毒，32℃，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱中培养。

八、将步骤七所得细胞大量扩增：感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度为300U/mL的重组人IL-2。

九、取部分细胞悬液，与靶细胞U251-CD133共培养后，再用PMA刺激两天，ELISA检测上清液中IL12的分泌情况(见图8)，与对照组相比IL12的分泌增强，说明成功制得表达CD133-CAR且分泌细胞因子IL-12的CAR-T细胞。

十、培养7天后收集细胞，获得表达CD133-CAR(能靶向识别CD133)且分泌细胞因子IL-12的CAR-T细胞。

实施例3制备的表达CD133-CAR的同时分泌IL12的CAR-T细胞和表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞体外杀伤验证

分别培养Raji细胞和效应细胞表达CD133-CAR的同时分泌IL12的CAR-T细胞和表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞和表达CD133-CAR的CAR-T细胞。

收集靶细胞Raji4×105cells和效应细胞(CAR-T细胞)各3×106cells，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；用1ml PBS溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；重复一次；用700μl培养基(AIM-V培养基+10％FBS)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基+10％FBS)重悬靶细胞。

设置效靶比为1:1、5:1、10:1、20:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔，37℃5％CO2培养箱中培养2h；500g，离心5min，慢升慢降平板离心；取每个孔的20μl上清到新96孔板中，并且每孔加入50μl底物溶液(避光操作)，室温避光孵育15min；每孔加入50μl终止液，酶标仪检测490nm吸光度。结果如图9所示，不同效靶比条件下，表达CD133-CAR的同时分泌IL12的CAR-T细胞和表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞在Raji靶细胞中杀伤效率明显强于表达CD133-CAR的CAR-T细胞，当效靶比为20：1时，本发明制得的表达CD133-CAR的同时分泌IL12的CAR-T细胞和表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞肿瘤杀伤能力分别为56％和60％(见图9)。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州茂行生物科技有限公司

<120> 一种分泌型靶向CD133的CAR-T细胞及其制备方法和应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgctgctgc tggtgacctc tctgctgctc tgcgaactgc ctcacccagc ctttctgctg 60

atccctcagg tgcagctgca gcagtcagga gcagaactcg tgagaccagg agcctcagtg 120

aagctgtctt gcaaggccag cggctacacc ttcagcgact tcgagatgca ttgggtgaag 180

cagacaccag tgcacggcct cgagtggatt ggcgatatcg acccaggcac aggcgataca 240

gcctacaacc tgaagttcaa gggcaaggcc accctgacca ccgataagag cagcagcacc 300

gcctacatgg agctgagaag cctgaccagc gaggacagcg ccgtgtacta ttgcaccctg 360

ggagccttcg tgtattgggg acagggcaca ctggtgacag tgtccgccgc taaaaccacc 420

cctaagctgg aggagggcga gtttagcgag gctagagtgg acgtggtggt gacacagacc 480

cctctgtctc tgccagtgtc cttcggcgat caggtgtcca tctcttgccg gagctctcag 540

agcctggcca acagctacgg caacacctac ctgtcttggt acctgcacaa gcccggacag 600

agccctcagc tgctgatcta cggcatctcc aaccggttca gcggcgtgcc agacagattc 660

agcggaagcg gcagcggcac agacttcacc ctgaagatca gcaccatcaa gcccgaggac 720

ctgggcatgt actattgcct gcagggcacc caccagcctt atacctttgg cggaggcacc 780

aagctggaga tcaagagagc cgacgccgct gcagccggat ct 822

<210> 2

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttcgtccccg tgttcctgcc tgccaagcca acaactaccc ctgctccacg accacctact 60

ccagcaccta ccatcgcaag tcagcccctg tcactgcgac ctgaggcttg ccggccagca 120

gctggaggag cagtgcacac ccgaggcctg gacttcgcat gcgatatcta catttgggca 180

ccactggctg gaacctgtgg ggtcctgctg ctgagcctgg tcatcaccct gtattgtaac 240

cacagaaat 249

<210> 3

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aggagcaaac gctcccgact gctgcattcc gactacatga acatgacacc tcggagacca 60

ggccccacta gaaagcatta ccagccatat gccccaccca gggatttcgc agcctatcgg 120

agc 123

<210> 4

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggttcagcg tcgtgaaaag ggggcgcaag aaactgctgt acatcttcaa gcagcctttt 60

atgcgcccag tgcagacaac tcaggaggaa gacggatgct cttgtcggtt cccagaggag 120

gaggaaggag gctgcgagct g 141

<210> 5

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agagtgaagt tcagccggag cgccgatgca ccagcatatc agcagggaca gaatcagctg 60

tacaacgagc tgaatctggg caggcgcgag gaatatgacg tgctggataa gcgacgagga 120

cgggaccccg aaatgggagg aaaacccaga aggaagaacc ctcaggaggg gctgtataat 180

gaactgcaga aagacaagat ggctgaggca tacagcgaaa ttggaatgaa aggagagcgc 240

cgacggggga agggacacga tgggctgtac cagggactgt caaccgccac taaagatacc 300

tacgacgcac tgcacatgca ggctctgccc ccaagatga 339

<210> 6

<211> 524

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gagggacagc ccccccccaa agcccccagg gatgtaatta cgtccctccc ccgctagggg 60

gcagcagcga gccgcccggg gctccgctcc ggtccggcgc tccccccgca tccccgagcc 120

ggcagcgtgc ggggacagcc cgggcacggg gaaggtggca cgggatcgct ttcctctgaa 180

cgcttctcgc tgctctttga gcctgcagac acctgggggg atacggggaa aaggcctgga 240

ggaaaaactg tttcatacag aaggcgggag gaaaaactgt ttcatacaga aggcgggagg 300

aaaaactgtt tcatacagaa ggcgggagga aaaactgttt catacagaag gcgggaggaa 360

aaactgtttc atacagaagg cgggaggaaa aactgtttca tacagaaggc gattttgaca 420

cccccataat atttttccag aattaacagt ataaattgca tctcttgttc aagagttccc 480

tatcactctc tttaatcact actcacagta acctcaactc ctgc 524

<210> 7

<211> 1629

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gccaccatgt gtcaccagca gttggtcatc tcttggtttt ccctggtttt tctggcatct 60

cccctcgtgg ccatatggga actgaagaaa gatgtttatg tcgtagaatt ggattggtat 120

ccggatgccc ctggagaaat ggtggtcctc acctgtgaca cccctgaaga agatggtatc 180

acctggacct tggaccagag cagtgaggtc ttaggctctg gcaaaaccct gaccatccaa 240

gtcaaagagt ttggagatgc tggccagtac acctgtcaca aaggaggcga ggttctaagc 300

cattcgctcc tgctgcttca caaaaaggaa gatggaattt ggtccactga tattttaaag 360

gaccagaaag aacccaaaaa taagaccttt ctaagatgcg aggccaagaa ttattctgga 420

cgtttcacct gctggtggct gacgacaatc agtactgatt tgacattcag tgtcaaaagc 480

agcagaggct cttctgaccc ccaaggggtg acgtgcggag ctgctacact ctctgcagag 540

agagtcagag gggacaacaa ggagtatgag tactcagtgg agtgccagga ggacagtgcc 600

tgcccagctg ctgaggagag tctgcccatt gaggtcatgg tggatgccgt tcacaagctc 660

aagtatgaaa actacaccag cagcttcttc atcagggaca tcatcaaacc tgacccaccc 720

aagaacttgc agctgaagcc attaaagaat tctcggcagg tggaggtcag ctgggagtac 780

cctgacacct ggagtactcc acattcctac ttctccctga cattctgcgt tcaggtccag 840

ggcaagagca agagagaaaa gaaagataga gtcttcacgg acaagacctc agccacggtc 900

atctgccgca aaaatgccag cattagcgtg cgggcccagg accgctacta tagctcatct 960

tggagcgaat gggcatctgt gccctgcagg ggcggaggcg gaagcggagg cggaggaagc 1020

ggcggtggcg gcagcagaaa cctccccgtg gccactccag acccaggaat gttcccatgc 1080

cttcaccact cccaaaacct gctgagggcc gtcagcaaca tgctccagaa ggccagacaa 1140

actctagaat tttacccttg cacttctgaa gagattgatc atgaagatat cacaaaagat 1200

aaaaccagca cagtggaggc ctgtttacca ttggaattaa ccaagaatga gagttgccta 1260

aattccagag agacctcttt cataactaat gggagttgcc tggcctccag aaagacctct 1320

tttatgatgg ccctgtgcct tagtagtatt tatgaagact tgaagatgta ccaggtggag 1380

ttcaagacca tgaatgcaaa gcttctgatg gatcctaaga ggcagatctt tctagatcaa 1440

aacatgctgg cagttattga tgagctgatg caggccctga atttcaacag tgagactgtg 1500

ccacaaaaat cctcccttga agaaccggat ttttataaaa ctaaaatcaa gctctgcata 1560

cttcttcatg ctttcagaat tcgggcagtg actattgata gagtgatgag ctatctgaat 1620

gcttcctaa 1629

<210> 8

<211> 546

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaggatctgc gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc 60

cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120

aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180

gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240

acagctgaag cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc gcccgccgcc ctacctgagg 300

ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg cctcctgaac 360

tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga ccgggccttt gtccggcgct 420

cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc tgcttgctca 480

actctacgtc tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatccaagc tgtgaccggc 540

gcctac 546

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaactcg 60

<210> 10

<211> 2196

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atggagttct ggttgtcatg ggtctttctg gtagctattc ttaagggagt acagtgtcag 60

gtgcagctgg tgcagagcgg cgtggaagtg aaaaaaccgg gcgcgagcgt gaaagtgagc 120

tgcaaagcga gcggctatac ctttaccaac tattatatgt attgggtgcg ccaggcgccg 180

ggccagggcc tggaatggat gggcggcatt aacccgagca acggcggcac caactttaac 240

gaaaaattta aaaaccgcgt gaccctgacc accgatagca gcaccaccac cgcgtatatg 300

gaactgaaaa gcctgcagtt tgatgatacc gcggtgtatt attgcgcgcg ccgcgattat 360

cgctttgata tgggctttga ttattggggc cagggcacca ccgtgaccgt gagcagcgcg 420

agcaccaaag gcccgagcgt gtttccgctg gcgccgtgca gccgcagcac cagcgaaagc 480

accgcggcgc tgggctgcct ggtgaaagat tattttccgg aaccggtgac cgtgagctgg 540

aacagcggcg cgctgaccag cggcgtgcat acctttccgg cggtgctgca gagcagcggc 600

ctgtatagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg ccgagcagca gcctgggcac caaaacctat 660

acctgcaacg tggatcataa accgagcaac accaaagtgg ataaacgcgt ggaaagcaaa 720

tatggcccgc cgtgcccgcc gtgcccggcg ccggaatttc tgggcggccc gagcgtgttt 780

ctgtttccgc cgaaaccgaa agataccctg atgattagcc gcaccccgga agtgacctgc 840

gtggtggtgg atgtgagcca ggaagatccg gaagtgcagt ttaactggta tgtggatggc 900

gtggaagtgc ataacgcgaa aaccaaaccg cgcgaagaac agtttaacag cacctatcgc 960

gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcatcag gattggctga acggcaaaga atataaatgc 1020

aaagtgagca acaaaggcct gccgagcagc attgaaaaaa ccattagcaa agcgaaaggc 1080

cagccgcgcg aaccgcaggt gtataccctg ccgccgagcc aggaagaaat gaccaaaaac 1140

caggtgagcc tgacctgcct ggtgaaaggc ttttatccga gcgatattgc ggtggaatgg 1200

gaaagcaacg gccagccgga aaacaactat aaaaccaccc cgccggtgct ggatagcgat 1260

ggcagctttt ttctgtatag ccgcctgacc gtggataaaa gccgctggca ggaaggcaac 1320

gtgtttagct gcagcgtgat gcatgaagcg ctgcataacc attataccca gaaaagcctg 1380

agcctgagcc tgggcaaaga attcgaagga tccgcggccg ctgagggcag aggaagtctt 1440

ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc ggcccttccg ggatggagtt ctggttgtca 1500

tgggtctttc tggtagctat tcttaaggga gtacagtgtg aaattgtgct gacccagagc 1560

ccggcgaccc tgagcctgag cccgggcgaa cgcgcgaccc tgagctgccg cgcgagcaaa 1620

ggcgtgagca ccagcggcta tagctatctg cattggtatc agcagaaacc gggccaggcg 1680

ccgcgcctgc tgatttatct ggcgagctat ctggaaagcg gcgtgccggc gcgctttagc 1740

ggcagcggca gcggcaccga ttttaccctg accattagca gcctggaacc ggaagatttt 1800

gcggtgtatt attgccagca tagccgcgat ctgccgctga cctttggcgg cggcaccaaa 1860

gtggaaatta aacgcaccgt ggcggcgccg agcgtgttta tttttccgcc gagcgatgaa 1920

cagctgaaaa gcggcaccgc gagcgtggtg tgcctgctga acaactttta tccgcgcgaa 1980

gcgaaagtgc agtggaaagt ggataacgcg ctgcagagcg gcaacagcca ggaaagcgtg 2040

accgaacagg atagcaaaga tagcacctat agcctgagca gcaccctgac cctgagcaaa 2100

gcggattatg aaaaacataa agtgtatgcg tgcgaagtga cccatcaggg cctgagcagc 2160

ccggtgacca aaagctttaa ccgcggcgaa tgctag 2196

Claims

1.一种分泌型靶向CD133的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T为表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞或表达CD133-CAR的同时分泌IL12细胞因子的CAR-T细胞，所述的CD133-CAR包含scFv区域，该scFv区域用于识别CD133抗原，该scFv区域序列为经过优化的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的分泌型靶向CD133的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）构建携带CD133-CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒；

（2）将携带CD133-CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主细胞，制备可感染T细胞的重组慢病毒载体；

（3）从供者提供的外周血中分离PBMC，使用磁珠分离、活化T细胞；

（4）将步骤（2）所得的重组慢病毒载体转导进入T细胞，产生表达CD133-CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR-T细胞；

（5）将步骤（4）所得细胞体外培养；

（6）将步骤（5）所得细胞大量扩增；

（7）收集表达CD133-CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR-T细胞。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的重组慢病毒质粒是二代或者三代的慢病毒转基因质粒。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的重组慢病毒质粒是第三代慢病毒转基因质粒；所述的重组慢病毒质粒是靶向CD133抗原且分泌IL12细胞因子的慢病毒转基因质粒，重组慢病毒质粒依次包含CMV启动子序列、CD133单链抗体、C-myc表位标记、CD8嵌合受体跨膜区、胞内信号传导区、NFAT启动子序列、IL12细胞因子序列；步骤（2）中所述的重组慢病毒载体将靶向CD133抗原的嵌合抗原受体表达在T细胞表面，同时能够分泌IL12细胞因子。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的重组慢病毒质粒是第三代慢病毒转基因质粒；所述的重组慢病毒质粒是靶向CD133抗原且分泌PD-1抗体的慢病毒转基因质粒，重组慢病毒载体依次包含CMV启动子序列、CD133单链抗体、C-myc表位标记、CD8嵌合受体跨膜区、胞内信号传导区、EF1启动子序列、IL2SS序列、PD-1抗体序列；步骤（3）中所述的重组慢病毒载体将靶向CD133抗原的嵌合抗原受体表达在T细胞表面，同时能够分泌PD-1抗体。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述胞内信号传导区包含编码共刺激因子区域，该共刺激因子区域选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LIGHT、B7-H3、特异性结合CD83的配体、ICAM-1、HVEM(LIGHTR)、CD160、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、IL2Rα、CD103、CD11b、CD11c、TRANCE/RANKL、SLAMF4(CD244,2B4)、CD69、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)中的一种或多种的任意组合。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的辅助质粒有三个，分别为pRSV-Rev、pCMV-VSV-G、pMDLg-pRRE，所述的宿主细胞为293FT细胞或293T细胞。

8.一种混合制剂，包括如权利要求1所述的表达CD133-CAR的同时分泌PD-1的CAR-T细胞或表达CD133-CAR的同时分泌IL2的CAR-T细胞。