CN109824783B - 表达于t淋巴细胞表面的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体包括顺序连接的：胞外结合区，铰链区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别MUC1和NKG2D配体的蛋白。所述嵌合抗原受体表达于T淋巴细胞表面，具有同时特异性识别MUC1和NKG2D配体的蛋白的效果。

Description

表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及基因修饰细胞及肿瘤治疗技术领域，尤其涉及表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

CAR-T疗法，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。其主要原理是，从癌症病人身上分离免疫T细胞，利用基因工程技术为T细胞引入一个能够识别肿瘤细胞并同时激活T细胞的嵌合抗体，也就是制备CAR-T细胞，再将扩增好的CAR-T细胞回输到病人体内，通过免疫疗法对抗癌细胞。嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)主要由两部分构成，一端位于细胞外，能够特异性识别癌细胞表面的某一抗原；另一端位于胞内，含有信号激活元件(如T细胞受体的Zeta链)，起传递信号激活T细胞的作用。这样表达CAR的T淋巴细胞(CAR-T细胞)就能避免T细胞受体识别靶细胞的限制，从而起到靶向癌细胞的的杀伤作用。目前诺华公司针对治疗罹患B细胞前体急性淋巴性白血病的CAR-T细胞CTL019已经上市，会让不少患者受益，但是仍有不少患者因白血病复发和难治而去世。Zah等报道了以CD19和CD20为双向靶点设计出新型CAR-T，提高了杀伤效果，降低复发的可能性。另外，CAR-T疗法还存在缺乏足够的持久性、抗原逃逸会导致复发等问题，这就需要研究者们研发更为有效的CAR-T细胞。

Mucin 1是膜结合型粘蛋白家族成员，简称MUC1。在正常情况下，MUC1呈低水平表达在乳腺，胰腺，胃肠道，呼吸道及泌尿生殖道的上皮细胞的近管腔面，不能被机体免疫***识别，其表达特点为极性表达，顶端分布，糖基化丰富。MUC1在肿瘤细胞中过表达并失去极性，成为肿瘤相关的MUC1，重新分布在细胞表面以及细胞浆。大量研究表明，很多与肿瘤增殖、转移、侵袭、血管生成、凋亡、药物抵抗和免疫调节相关的基因的转录调节与MUC1的表达密切相关。因此，MUC1能通过调控多种信号通路调节细胞效应，是促进肿瘤发生发展的重要癌基因。最近一个调查研究表明，在75个发展癌症疫苗的肿瘤相关抗原中，MUC1是排名第二的潜在靶点。由于在大多数腺癌、血液系恶性肿瘤中MUC1呈异常过表达，糖基化不全，并失去极性，遍布于整个细胞表面，使其成为肿瘤标志物，可被免疫***识别，因此，MUC1蛋白可作为CAR-T细胞抗肿瘤治疗的一个理想靶点。

NKG2D是一种II型跨膜糖蛋白，通过二硫键形成同源二聚体的形式表达于细胞表面，胞外区含1个C型凝集素样区域，因此，通常被称作C-型凝集素样受体同源二聚体。几乎所有的自然杀伤(natural killer，NK)细胞表面(包括人类和鼠类)表达NKG2D。人类的CD8+T细胞天然表达NKG2D，NKG2D也表达在自然杀伤T细胞(natural killer T cell，NKT)、γδT细胞、CD4+T细胞的一部分亚群。人类NKG2D的配体主要有组织相容性复合体I类链相关蛋白A/B(major histo compatibility complex class I chain-related protein A/B，MICA/B)和人巨细胞病毒UL16结合蛋白(HCMV UL16-binding protein，ULBP)。一般认为，NKG2D配体的表达是细胞处于“应激状态”的一个指标，例如病毒感染和恶性转化时，但很少会出现在健康细胞的表面。NKG2D配体几乎在人体所有组织来源的肿瘤细胞上有不同程度的表达。许多上皮来源的癌细胞、恶性黑色素瘤细胞及多种类型的白血病细胞表达MICA。另外，MICA、MICB表达于原发性肝细胞癌，且与肝癌细胞对NK细胞的敏感性有关。原发性白血病、恶性黑色素瘤和神经胶质瘤来源的肿瘤细胞表达ULBP分子。由于NKG2D能够识别肿瘤细胞上相应的配体，而NKG2D配体的表达作为机体发生肿瘤时肿瘤细胞上的一个特异性的改变，因此，NKG2D配体为肿瘤的免疫治疗提供了一个更为精确的靶点，也为肿瘤新的免疫治疗方法的开发及应用提供方向和思路。近年来，设计表达NKG2D的CAR修饰T细胞能够特异性识别NKG2D配体阳性的肿瘤细胞，诱导肿瘤裂解，并获得较好的预后。这种嵌合NKG2D的CAR是由活化性受体NKG2D与CD3ζ融合组成，表达于T淋巴细胞表面；其胞质区的CD3ζ能够与接头蛋白DAP10结合，进行信号传导。嵌合NKG2D的CAR修饰T细胞活化后，溶解NKG2D配体阳性的肿瘤细胞，并分泌促炎性细胞因子，发挥其强大的细胞毒作用。

目前还没有能同时靶向MUC1和NKG2D配体的CAR-T细胞。

发明内容

本发明提供一种表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体，能特异性识别MUC1和NKG2D配体。

本发明还提供了编码所述嵌合抗原受体的核酸，包含所述核酸的表达载体，以及包含所述表达载体的病毒。

本发明还提供了所述核酸，或所述表达载体，或所述病毒的用途，用于制备靶向MUC1和NKG2D配体的基因修饰的T淋巴细胞。

本发明还提供了一种基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达所述的嵌合抗原受体，使得所述T淋巴细胞能靶向MUC1和NKG2D配体。

本发明还提供了所述的基因修饰的T淋巴细胞的用途，用于制备抑制肿瘤的药物，所述肿瘤是MUC1和NKG2D配体阳性的肿瘤。

本发明提供的表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括顺序连接的：胞外结合区，铰链区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别MUC1和NKG2D配体的蛋白。

进一步的，所述胞外结合区为特异性识别MUC1蛋白的SCFV与特异性识别NKG2D配体的NKG2D即SCFV-NKG2D，所述铰链区为IgD，所述胞内信号区为CD28–4-1BB–CD3ζ。

更进一步的，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列。

本发明还提供了编码所述嵌合抗原受体的核酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述核酸具有SEQ ID NO:2所述的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述表达载体来源于慢病毒质粒，例如pGreenpuro。

本发明提供的一种基因修饰的T淋巴细胞，其转导有所述的核酸、或所述的表达载体或所述的病毒。

本发明提供的一种基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列。

本发明还提供了所述的基因修饰的T淋巴细胞的用途，用于制备抑制肿瘤的药物，所述肿瘤是MUC1和NKG2D配体阳性的肿瘤。

本发明方案具有以下优点：

1)本发明提供的基因修饰的T淋巴细胞，能够特异性识别和高效杀伤MUC1和NKG2D配体阳性的肿瘤。

附图说明

图1显示了识别MUC1的嵌合抗原受体，以及识别MUC1和NKG2D配体的嵌合抗原受体的设计示意图。

图2显示了本发明提供基因修饰的T淋巴细胞在体外对乳腺癌细胞系MCF-7的杀伤效果。

图3显示了本发明提供基因修饰的T淋巴细胞在体外对胰腺癌细胞系BxPC-3的杀伤效果。

图4显示了本发明提供基因修饰的T淋巴细胞在体内***效果。

图5显示了慢病毒表达载体pGreen puro的结构示意图。

具体实施方式

实施例1靶向MUC1和NKG2D配体的T淋巴细胞、靶向MUC1的T淋巴细胞的制备

1.合成和扩增

1)合成编码本发明靶向MUC1和NKG2D配体的嵌合抗原受体的核苷酸序列(SEQ IDNO:2)，以及仅靶向MUC1的嵌合抗原受体1(SCFV-IgD–CD28–4-1BB–CD3ζ)的核苷酸序列(SEQID NO:3)，均由苏州泓迅生物科技有限公司合成；

2)将SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3扩增后，分别克隆到慢病毒表达载体pGreen puro(购自爱迪基因(Add gene)公司)中，pGreen puro的结构示意图如图5所示，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3通过酶切位点BamHI和EcoRI连到载体里，分别获得重组慢病毒载体1，重组慢病毒载体2，经酶切鉴定获得了重组载体。步骤2)中的扩增与克隆步骤均可采用本领域常规实验条件进行完成，这对于本领域技术人员来说是可以实现的。

2.慢病毒的包装

1)用含10％FBS的1640培养基培养293T细胞；然后将293T细胞以3x 10⁵/cm²的密度传至直径15cm的培养皿中培养20h，保证转染时细胞汇合度为80-90％；用不含血清的1640培养基换液，备用；

2)取两个EP管，分别在两个EP管中加入1ml 1640培养基；将重组慢病毒载体pGreen puro(即重组慢病毒载体1或重组慢病毒载体2)与pMDLg PRRE、pRSV-Rev和pMD2.G质粒按照摩尔比1：1：1：1在EP管1中混匀，在EP管2中加入150ul Lipo2000，混匀放置5min；将EP管2中混有lipo2000的1640培养基加入含有质粒的EP管1中，混匀得到混合液，室温放置20min；

3)然后将所述混合液逐滴加入上述制备的293T细胞的培养皿中，继续培养4h后，用含10％FBS的1640培养基更换培养液，继续培养48h后收集293T细胞的上清用于病毒纯化。

3.慢病毒的纯化

将293T细胞的上清用0.22μm过滤膜过滤，滤液收集在50ml超滤管中，3000g/min下离心45min；将剩余的浓缩液转移至EP管，放-80℃保存备用，获得含有重组慢病毒1(含有SEQ ID NO:2)或重组慢病毒2(含有SEQ ID NO:3)的浓缩液。

4.CD8+T淋巴细胞的分离

A、人全血倒入50ml离心管，室温700g下离心20分钟(普通离心)。

B、弃上清，在沉淀中加DPBS至50ml。

C：分别取25ml上述液体加到20ml人淋巴细胞分离液(购自北京索莱宝科技有限公司),将离心管室温离心800g 15分钟。

D：取白膜层细胞，加入DPBS，补足至50ml。

E：离心600g 10分钟，弃上清液，得外周血单个核细胞PBMC。

F：采用CD8+T细胞磁珠分选试剂盒(购自德国美天旎)分选CD8+T细胞。

5.靶向MUC1和NKG2D配体的T淋巴细胞的制备，以及仅靶向MUC1的T淋巴细胞的制备

a.重组慢病毒1感染CD8+T淋巴细胞：

用含10％胎牛血清(购自Gibco-BRL)的RPMI 1640完全培养基(RPMI1640购自Gibco-BRL,添加胎牛血清后即为RPMI 1640完全培养基)培养CD8+T细胞。

第一天：加入抗CD3单克隆抗体(购自北京同立海源生物科技有限公司)对CD8+T细胞进行活化；

第三天：将活化的CD8+T细胞分为实验组和对照组

1)实验组，在4x10⁶个活化的CD8+T细胞中加入150MOI的重组慢病毒1(含有编码SCFV-NKG2D-IgD–CD28–4-1BB–CD3ζ的基因即SEQ ID NO:2)；

2)对照组，不做处理；

16h后将培养基更换为含有50IU/ml重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基(IL-2购自北京同立海源生物科技有限公司)，继续培养10-20天，然后观察T淋巴细胞生长情况。结果显示：细胞在感染病毒后，能够形成典型的增殖克隆团。

第十四天，将实验组CD8+T细胞，以600g的离心力离心10min，弃尽上清以收集CD8+T细胞沉淀；再用PBS溶液重悬CD8+T细胞，并将CD8+T细胞调整密度为1x 10⁷个/ml；将100μl的CD8+T细胞置于EP管，加入10μl FITC标记小鼠抗人CD8单克隆抗体(购自BD公司)和10μlPE标记的羊抗鼠F(ab)2抗体(购自Coulter公司)；4℃孵育30min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪检测特异性识别MUC1和NKG2D配体的嵌合抗原受体SCFV-NKG2D-IgD–CD28–4-1BB–CD3ζ的正确表达，说明获得了靶向MUC1和NKG2D配体的T淋巴细胞(即Anti MUC1/NKG2D配体CAR-T细胞)。

b.重组慢病毒2感染CD8+T淋巴细胞：

实验步骤同重组慢病毒1，不同之处在于，第三天：实验组4x10⁶个活化的CD8+T细胞中加入150MOI的重组慢病毒2(含有编码SCFV-IgD–CD28–4-1BB–CD3ζ的基因即SEQ IDNO:3)。

第十四天，上流式细胞仪检测仅特异性识别MUC1的嵌合抗原受体1SCFV-IgD–CD28–4-1BB–CD3ζ的正确表达，说明获得了靶向MUC1的T淋巴细胞(即Anti MUC1CAR-T细胞)。

图1显示了识别MUC1的嵌合抗原受体，以及识别MUC1和NKG2D配体的嵌合抗原受体的设计示意图。

实施例2本发明提供基因修饰的CD8+T淋巴细胞在体外***效果验证

一、以稳定表达MUC1和NKG2D配体的乳腺癌细胞系MCF-7作为靶细胞(购自ATCC)，将其分为3组。

将实施例1中制备的靶向MUC1和NKG2D配体的CD8+T淋巴细胞作为效应细胞1；将实施例1中制备靶向MUC1的CD8+T淋巴细胞作为效应细胞2；还有未感染病毒的CD8+T细胞作为效应细胞3；

1)实验组(Anti MUC1/NKG2D配体CAR-T细胞/MCF-7)，以5:1，10:1，20:1效靶比将效应细胞1加入第一组靶细胞；

2)对照组1(Anti MUC1CAR-T细胞/MCF-7)，以5:1，10:1，20:1效靶比将效应细胞2加入第二组靶细胞；

3)对照组2(T细胞/MCF-7)，以5:1，10:1，20:1效靶比将效应细胞3加入第三组靶细胞；

具体的，将靶细胞按照密度1x 10⁵个/ml接种96孔板，每孔100μl，然后按照上述1)-3)加入效应细胞，置于5％CO₂,37℃培养箱培养4h。

采用WST-1检测细胞活力，计算杀伤效率，结果表明靶向MUC1的T淋巴细胞和靶向MUC1和NKG2D配体的T淋巴细胞对MUC1和NKG2D配体阳性肿瘤细胞(MCF-7)具有很强的杀伤作用，且靶向MUC1和NKG2D配体的T淋巴细胞的抗肿瘤作用强于靶向MUC1的T淋巴细胞，实验结果如图2所示。

二、以稳定表达MUC1和NKG2D配体的胰腺癌细胞系BxPC-3作为靶细胞(购自ATCC)，将其分为3组。

将实施例1中制备的靶向MUC1和NKG2D配体的CD8+T淋巴细胞作为效应细胞1；靶向MUC1的CD8+T淋巴细胞作为效应细胞2；还有未感染病毒的CD8+T细胞作为效应细胞3；

1)实验组(Anti MUC1/NKG2D配体CAR-T细胞/BxPC-3)，以5:1，10:1，20:1效靶比将效应细胞1加入第一组靶细胞；

2)对照组1(Anti MUC1CAR-T细胞/BxPC-3)，以5:1，10:1，20:1效靶比将效应细胞2加入第二组靶细胞；

3)对照组2(T细胞/BxPC-3)，以5:1，10:1，20:1效靶比将效应细胞3加入第三组靶细胞；

具体的，将靶细胞按照密度1x 10⁵个/ml接种96孔板，每孔100μl，然后按照上述1)-3)加入效应细胞，置于5％CO₂,37℃培养箱培养4h。

采用WST-1检测细胞活力，计算杀伤效率，结果表明靶向MUC1的T淋巴细胞和靶向MUC1和NKG2D配体的T淋巴细胞对MUC1和NKG2D配体阳性肿瘤细胞(BxPC-3)具有很强的杀伤作用，且靶向MUC1和NKG2D配体的T淋巴细胞的抗肿瘤作用强于靶向MUC1的T淋巴细胞，实验结果如图3所示。

实施例3本发明提供基因修饰的T淋巴细胞在体内***效果验证

在20只裸鼠(6周龄，体重18～20g，购自广东省医学实验动物中心)右腋下皮下注射5x 10⁶MCF-7乳腺癌细胞(购自ATCC)，观察小鼠是否出现肿瘤，待肿瘤长到60mm³大小，将其随机分为4组。

1)对照组(对照/MCF-7)，尾静脉注射生理盐水200ul/次，每周2次；

2)T细胞治疗组(T细胞/MCF-7)，分别尾静脉注射没有经过病毒感染的CD8+T细胞1×10⁷个/次，每周2次；

3)靶向MUC1的T淋巴细胞治疗组(Anti MUC1CAR-T细胞/MCF-7)，分别尾静脉注射实施例1制备的靶向MUC1的T淋巴细胞1×10⁷个/次，每周2次；

4)靶向MUC1和NKG2D配体的T淋巴细胞治疗组(Anti MUC1/NKG2D配体CAR-T细胞/MCF-7)：尾静脉注射实施例1制备的靶向MUC1和NKG2D配体的T淋巴细胞1×10⁷个/次，每周2次。

统计100天内小鼠生存状态，做生存率曲线，实验结果如图4所示。靶向MUC1的T淋巴细胞以及靶向MUC1和NKG2D配体的T淋巴细胞可延长MUC1和NKG2D高表达的乳腺癌移植瘤小鼠模型的生存期，且靶向MUC1和NKG2D配体的T淋巴细胞的效果优于靶向MUC1的T淋巴细胞。

序列表

<110> 深圳市芥至和生物科技有限公司

<120> 表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体及其应用

<130> CNCNP201811695

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 820

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 嵌合抗原受体

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Phe Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr

130 135 140

Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala

145 150 155 160

Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His

165 170 175

Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val

180 185 190

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr

195 200 205

Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu

210 215 220

Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Gly Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp

260 265 270

Glu Met Ser Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp

275 280 285

Phe Ser Thr Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys

290 295 300

Cys Arg Glu Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val

305 310 315 320

Ala Met Gly Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val

325 330 335

Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu

340 345 350

Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn

355 360 365

Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala

370 375 380

Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu

385 390 395 400

Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu

405 410 415

Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile

420 425 430

Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys

435 440 445

Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr

450 455 460

Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser

465 470 475 480

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Phe Thr Cys Phe Val

485 490 495

Val Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly

500 505 510

Lys Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser

515 520 525

Asn Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu

530 535 540

Trp Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu

545 550 555 560

Pro Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro

565 570 575

Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala

580 585 590

Ala Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

595 600 605

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg

610 615 620

Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

625 630 635 640

Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

645 650 655

Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys

660 665 670

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

675 680 685

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

690 695 700

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala

705 710 715 720

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

725 730 735

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

740 745 750

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

755 760 765

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

770 775 780

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

785 790 795 800

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

805 810 815

Leu Pro Pro Arg

820

<210> 2

<211> 2460

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码嵌合抗原受体的核酸

<400> 2

gaagtgcagc tgcagcagtc aggaggagga ctggtgcagc caggaggctc tatgaagctg 60

tcttgcgtgg ccagcggctt taccttcagc aactactgga tgaattgggt ccggcagagc 120

ccagagaaag gactcgagtg ggtggcagag atccggctga agagcaacaa ctacgccacc 180

cactacgccg aaagcgtgaa gggcaggttc accatcagca gggacgacag caagagcagc 240

gtgtacctgc agatgaacaa cctgagggcc gaggacaccg gcatctacta ttgcaccttc 300

ggcaattcct tcgcctattg gggccaggga accacagtga cagtgtctag cggcggagga 360

ggatctggag gaggaggaag cggaggagga ggaagcgata tcgtggtgac ccaggagagc 420

gctctgacaa caagcccagg cgagacagtg accctgactt gcagaagcag cacaggagcc 480

gtgaccacca gcaactacgc caattgggtg caggagaagc ccgaccatct gttcaccgga 540

ctgatcggcg gcacaaacaa cagagcccca ggagtgccag ccagattcag cggatctctg 600

atcggcgata aggccgctct gaccatcacc ggagcccaga cagaagacga ggccatctac 660

ttctgcgccc tctggtacag caaccattgg gtgttcggcg gcggcacaaa actgacagtg 720

ctgggaagcg aaggaggagg aggaagcgga ggaggaggaa gcggaggagg aggatctatg 780

ggctggatca gaggcaggag aagcagacac tcttgggaga tgagcgagtt ccacaactac 840

aacctggacc tgaagaagag cgacttcagc acccgctggc agaaacagag gtgtccagtc 900

gtgaagagca agtgtcgcga gaacgccagc cccttcttct tctgttgctt catcgccgtg 960

gccatgggca tccggttcat catcatggtg gccatttgga gcgccgtgtt cctgaacagc 1020

ctgttcaacc aggaggtgca gatccccctg accgaaagct attgcggccc ttgccccaag 1080

aattggatct gctacaagaa caactgctac cagttcttcg acgagagcaa gaattggtac 1140

gagagccagg cctcttgcat gagccagaac gccagcctgc tgaaggtgta cagcaaggag 1200

gaccaggacc tgctgaagct ggtgaagagc taccattgga tgggcctggt gcacatcccc 1260

acaaacggct cttggcagtg ggaggacgga agcatcctga gccccaacct gctgaccatc 1320

atcgagatgc agaagggcga ttgcgccctg tacgccagca gcttcaaggg ctacatcgag 1380

aattgcagca cccccaacac ctacatttgc atgcagagaa ccgtgggagg aggaggaagc 1440

ggaggaggag gaagcggagg aggaggctct accttcactt gcttcgtcgt gggcagcgac 1500

ctgaaggacg ctcacctgac ttgggaggtg gccggaaaag tgcctacagg aggagtggag 1560

gaaggactgc tggagagaca cagcaacggc tctcagagcc agcacagcag actgaccctg 1620

cctagaagcc tgtggaacgc cggtacatcc gtgacctgca ccctgaacca cccttctctg 1680

cctccccaga gactgatggc tctgagagag ccagccgctc aggctccagt gaaactgtct 1740

ctgaacctgc tggcctctag cgatcctcca gaagccgcct tttgggtgct ggtggtcgtg 1800

ggaggagtgc tggcttgtta cagcctgctg gtgaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1860

cggagcaagc ggagcagact gctgcacagc gactacatga acatgacccc caggagaccc 1920

ggccctacca gaaagcacta ccagccctac gcccctccta gagattttgc cgcctaccgg 1980

agcagattca gcgtggtgaa gaggggccgg aagaagctgc tgtacatctt caagcagccc 2040

ttcatgcggc cagtgcagac aacacaggag gaagacggct gcagttgcag gtttccagag 2100

gaggaagagg gcggttgcga gctgagagtg aagttcagcc ggagcgccga acctccagct 2160

tatcagcagg gccagaacca gctgtacaac gagctgaacc tgggcaggag ggaggaatac 2220

gacgtgctgg acaagcggag gggaagagat ccagagatgg gcggcaagcc tagaaggaag 2280

aacccccagg agggcctgta caacgagctg cagaaggaca agatggccga ggcttacagc 2340

gagatcggca tgaagggcga gaggagaaga ggcaaaggcc acgacggact gtatcagggc 2400

ctgagcacag ccaccaagga cacctacgac gctctgcaca tgcaggctct gcctcctaga 2460

<210> 3

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 仅靶向MUC1的嵌合抗原受体1的核苷酸序列

<400> 3

gaagtgcagc tgcagcagtc aggaggagga ctggtgcagc caggaggctc tatgaagctg 60

tcttgcgtgg ccagcggctt taccttcagc aactactgga tgaattgggt ccggcagagc 120

ccagagaaag gactcgagtg ggtggcagag atccggctga agagcaacaa ctacgccacc 180

cactacgccg aaagcgtgaa gggcaggttc accatcagca gggacgacag caagagcagc 240

gtgtacctgc agatgaacaa cctgagggcc gaggacaccg gcatctacta ttgcaccttc 300

ggcaattcct tcgcctattg gggccaggga accacagtga cagtgtctag cggcggagga 360

ggatctggag gaggaggaag cggaggagga ggaagcgata tcgtggtgac ccaggagagc 420

gctctgacaa caagcccagg cgagacagtg accctgactt gcagaagcag cacaggagcc 480

gtgaccacca gcaactacgc caattgggtg caggagaagc ccgaccatct gttcaccgga 540

ctgatcggcg gcacaaacaa cagagcccca ggagtgccag ccagattcag cggatctctg 600

atcggcgata aggccgctct gaccatcacc ggagcccaga cagaagacga ggccatctac 660

ttctgcgccc tctggtacag caaccattgg gtgttcggcg gcggcacaaa actgacagtg 720

ctgggaagcg aaaccttcac ttgcttcgtc gtgggcagcg acctgaagga cgctcacctg 780

acttgggagg tggccggaaa agtgcctaca ggaggagtgg aggaaggact gctggagaga 840

cacagcaacg gctctcagag ccagcacagc agactgaccc tgcctagaag cctgtggaac 900

gccggtacat ccgtgacctg caccctgaac cacccttctc tgcctcccca gagactgatg 960

gctctgagag agccagccgc tcaggctcca gtgaaactgt ctctgaacct gctggcctct 1020

agcgatcctc cagaagccgc cttttgggtg ctggtggtcg tgggaggagt gctggcttgt 1080

tacagcctgc tggtgaccgt ggccttcatc atcttttggg tccggagcaa gcggagcaga 1140

ctgctgcaca gcgactacat gaacatgacc cccaggagac ccggccctac cagaaagcac 1200

taccagccct acgcccctcc tagagatttt gccgcctacc ggagcagatt cagcgtggtg 1260

aagaggggcc ggaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gccagtgcag 1320

acaacacagg aggaagacgg ctgcagttgc aggtttccag aggaggaaga gggcggttgc 1380

gagctgagag tgaagttcag ccggagcgcc gaacctccag cttatcagca gggccagaac 1440

cagctgtaca acgagctgaa cctgggcagg agggaggaat acgacgtgct ggacaagcgg 1500

aggggaagag atccagagat gggcggcaag cctagaagga agaaccccca ggagggcctg 1560

tacaacgagc tgcagaagga caagatggcc gaggcttaca gcgagatcgg catgaagggc 1620

gagaggagaa gaggcaaagg ccacgacgga ctgtatcagg gcctgagcac agccaccaag 1680

gacacctacg acgctctgca catgcaggct ctgcctccta ga 1722

Claims (8)

1.表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体，其特征在于，

所述嵌合抗原受体包括顺序连接的：胞外结合区，铰链区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别MUC1和NKG2D配体的蛋白；

所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述嵌合抗原受体的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，其包含权利要求2所述的核酸。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒质粒。

5.一种病毒，其特征在于，其包含权利要求3或4所述的表达载体。

6.权利要求2所述的核酸、或权利要求3或4所述的表达载体或权利要求5所述的病毒的用途，其特征在于，用于制备靶向MUC1和NKG2D配体的基因修饰的T淋巴细胞。

7.一种基因修饰的T淋巴细胞，其特征在于，其转导有权利要求2所述的核酸、或权利要求3或4所述的表达载体或权利要求5所述的病毒。

8.权利要求7所述的基因修饰的T淋巴细胞的用途，其特征在于，用于制备抑制肿瘤的药物，所述肿瘤是MUC1和NKG2D配体阳性的肿瘤。

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