CN107286246B - 治疗脑胶质瘤的嵌合抗原受体修饰的树突状细胞及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种嵌合抗原受体和所述嵌合抗原受体修饰的树突状细胞，及其制备方法，还涉及所述树突状细胞在治疗脑胶质瘤免疫细胞中的应用，所述树突状细胞在制备用于治疗脑胶质瘤的药物中的用途。

Description

治疗脑胶质瘤的嵌合抗原受体修饰的树突状细胞及其制备 方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，涉及用于一种嵌合抗原受体(ChimericAntigen Receptor,CAR)和所述嵌合抗原受体修饰的树突状细胞(CAR-DC)，及其制备方法，以及所述树突状细胞在制备用于治疗脑胶质瘤的药物中的用途。
背景技术
树突状细胞是一类与粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞形态和功都不同的白细胞，其细胞膜向外伸出，形成与神经细胞轴突相似的膜性树状突起，命名为树突状细胞(dendritic cells，DC)。它是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，能够高效地摄取、加工处理和递呈抗原，DC通过表面的MHC分子与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽-MHC分子复合物，并递呈给T细胞，从而启动MHC-I类限制性CTL反应和MHC-Ⅱ类限制性的CD4+Thl反应。同时，DC还通过其高表达的共刺激分子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等)提供T细胞活化所必须的第二信号，启动了免疫应答(Stumbles PA.Regulation ofT helper celldifferentiation by respiratory tractdendritic cells.Immunology and CellBiology(1999)77,428–433)。
目前DC细胞治疗采用的是肿瘤患者自身的单个核细胞在体外增殖、培养、诱导生成DC，然后让DC负载相应的肿瘤抗原，经严格筛选后制备成负载肿瘤抗原的DC，然后将这些DC细胞回输到患者体内，激活人体内的天然抗肿瘤***，DC在这一过程中将肿瘤细胞的信息传递给免疫***，并引导人体自身抗癌免疫***去识别、清除肿瘤细胞(Turnis ME,Rooney CM.Enhancement ofdendritic cells as vaccines for cancer.Immunotherapy2010；2(6):847–62)。多年临床研究对比得出，DC细胞治疗广泛适用临床各型肿瘤治疗，尤其对恶性黑色素瘤、***癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、***、各种肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等治疗效果较好(Constantino J,Gomes C,FalcaoA,Cruz MT,Neves BM.Antitumor dendritic cell-based vaccines:lessons from20years of clinical trials and future perspectives.Transl Res2016；168:74–95)。但是，单纯靠体外活化DC、负载肿瘤抗原取得的疗效是有限的，因此在DC细胞免疫***的方法上仍需进一步改善。
EGFRvIII是在人肿瘤中最经常出现的突变型EGFR，并且在被称为多形性成胶质细胞瘤的脑肿瘤中尤为普遍。据报道，EGFRvIII存在于56％的成胶质细胞瘤，16％的非小细胞肺癌和78％的乳腺癌中(Carol J.Wikstrand,Laura P.Hale,et al.MonoclonalAntibodies against EGFRvIII Are Tumor Specific and React with Breast and LungCarcinomas and Malignant Gliomas.Cancer Res.1995Jul 15；55(14):3140-8)，而未在任何正常组织中发现该序列。因此，EGFRvIII是潜在的理想肿瘤靶标。
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)(June CH,Blazar BR,RileyJL.Engineering lymphocyte subsets:tools,trials and tribulations.NatRevImmunol.2009；9:704-16)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。嵌合抗原受体(CAR)由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。CAR-T细胞疗法通过外源基因转染技术，把识别肿瘤相关抗原的单链抗体(Single chainfragment variable，scFv)和T细胞活化序列的融合蛋白表达到T细胞表面，使可以特异识别肿瘤相关抗原的scFv通过跨膜区与T细胞胞内的活化增殖信号域偶联。表达CAR的T细胞以抗原依赖、但非MHC限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。但是，CAR-T会产生一定的脱靶毒性，影响其细胞免疫疗效；而且更重要的是，由于肿瘤的异质性，同一个肿瘤往往存在多种肿瘤抗原，因此针对单一肿瘤抗原的CAR-T疗效有限，而且容易复发。
鉴于DC细胞是人体最重要的抗原递呈细胞，我们通过将CAR结构转导至DC中，使DC更有效的识别递呈肿瘤抗原，同时加入DC活化扩增信号，进一步促进DC的激活；而且更重要的，靶向肿瘤的CAR-DC可以将同一个肿瘤的多种抗原有效的递呈给效应性T细胞，从而克服CAR-T的单靶点识别杀伤效应。在本发明中，我们设计了一种新型的DC细胞***策略，利用慢病毒***将CD40信号域与肿瘤相关嵌合抗原受体(anti-EGFRvIII scfv)融合，转导DC细胞，构建EGFRvIII CAR-DC。通过其肿瘤相关嵌合抗原受体与脑胶质瘤细胞结合活化DC细胞，同时递呈肿瘤抗原，刺激T细胞活化，从而起到抗肿瘤的效果。
发明内容
为了克服现有技术中体外活化DC细胞对肿瘤的杀伤作用比较弱、特异杀伤活性有待提高的缺陷，本发明提供了以下方面。
本发明首先提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、抗EGFRvIIIscFv、人CD8α铰链区、人CD40的跨膜区和胞内信号区顺次拼接构成，称为EGFRvIIICAR。
进一步的，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了编码所述嵌合抗原受体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了表达载体，其包含并能表达氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的嵌合抗原受体的编码基因。
进一步地，所述表达载体为慢病毒载体pCDH-EGFRvIIICAR。
本发明还提供了一种工程化的树突状细胞，其含有所述表达载体。
进一步地，所述表达载体为慢病毒载体pCDH-EGFRvIIICAR。
本发明还提供了所述的工程化的DC细胞在制备用于***的药物中的用途。
进一步地，所述肿瘤选自：脑胶质瘤、非小细胞肺癌和乳腺癌。
本发明还提供了一种表达嵌合抗原受体的树突状细胞的方法，其包括将所述嵌合抗原受体的表达载体进入树突状细胞。
进一步地，所述方法中的嵌合抗原受体为所述EGFRvIIICAR，优选为具有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。
进一步地，所述方法中的表达载体包含并能表达氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的嵌合抗原受体的编码基因，优选为慢病毒载体pCDH-EGFRvIIICAR。
附图说明
图1为本发明所使用的嵌合抗原受体EGFRvIIICAR的结构示意图，其由CD8α信号肽(CD8αSP)、EGFRvIII抗体轻链可变区(EGFR vIIIscfv-VL)、接头区、EGFRvIII抗体重链可变区(EGFRvIIIscfv-VH)、CD8α铰链区(CD8αHinge)、CD40跨膜区(CD40TM)和CD40胞内信号区组成。并设计其对照结构，其对照结构无CD40胞内信号区，简称EGFRvIIICAR’。
图2为pCDH-EGFRvIIICAR慢病毒表达载体质粒信息图。
图3为体外情况下，本发明的EGFRvIIICAR-DC细胞与EGFRvIII+肿瘤细胞U87(EGFRvIII+U87)共培养后活化情况。A：体外培养DC细胞；B：慢病毒空载体转导体外培养DC细胞；C：慢病毒pCDH-EGFRvIIICAR转导体外培养DC细胞；D：慢病毒pCDH-EGFRvIIICAR’转导体外培养DC细胞。如图所示，EGFRvIIICAR-DC细胞在EGFRvIII+U87细胞刺激下，在体外实现更高程度的活化成熟。
图4为T细胞活化情况。EGFRvIIICAR-DC细胞与T细胞共孵育，在EGFRvIII+U87细胞刺激下，促进了T细胞的活化。A：慢病毒pCDH-EGFRvIIICAR转导体外培养DC细胞(无T细胞)；B：慢病毒pCDH空载体转导体外培养DC细胞(+T细胞)；C：慢病毒pCDH-EGFRvIIICAR转导体外培养DC细胞细胞(+T细胞)；D：慢病毒pCDH-EGFRvIIICAR’转导体外培养DC细胞细胞(+T细胞)。
图5为小鼠脑胶质瘤模型中小鼠肿瘤体积变化。A：慢病毒EGFRvIIICAR转导体外培养DC细胞(无T细胞)；B：慢病毒空载体转导体外培养DC细胞(+T细胞)；C：慢病毒EGFRvIIICAR’转导体外培养DC细胞(+T细胞)；D：慢病毒EGFRvIIICAR转导体外培养DC细胞(+T细胞)。由图可得，注射EGFRvIIICAR-DC细胞+T细胞组的小鼠肿瘤得到明显抑制，随着时间延长，肿瘤体积明显缩小直至消失。
图6为小鼠脑胶质瘤模型中小鼠生存曲线图。A：慢病毒EGFRvIIICAR转导体外培养DC细胞(无T细胞)；B：慢病毒空载体转导体外培养DC细胞(+T细胞)；C：慢病毒EGFRvIIICAR’转导体外培养DC细胞(+T细胞)；D：慢病毒EGFRvIIICAR转导体外培养DC细胞(+T细胞)。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所
用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，其中：
DMEM培养基、X-VIVO 15培养基购自TaKaRa公司。
T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。
限制性核酸内切酶EcoR I、Xba I购自Thermo Fisher Scientific公司。
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司。
pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro(简称pCDH)及其包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG购自Addgene公司。
Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。
LipofectamineTM 2000Transfection Reagent转染试剂购自Invitrogen公司。
293T包装细胞、BHK21乳仓鼠肾成纤维细胞和U87胶质瘤细胞购自美国ATCC。
胎牛血清购自Gibco公司。
所有引物及基因合成均由上海生工生物科技有限公司合成。
PEG6000和NaCl均购自上海索莱宝生物科技有限公司。
人GM-CSF、IL-4、rhIL-2、CD3/CD28抗体等购自ebioscience公司。
抗MHC-I，MHC-II，CD80，CD86，CD3，CD25等流式抗体购自BD公司。
人DC细胞分选试剂盒、T细胞分选试剂盒购自STEM CELL公司。
NSG小鼠购自北京维通达生物技术有限公司。
实施例1
一、一种EGFRvIIICAR基因序列的确定
1.1从美国国立医学图书馆网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)GenBank数据库获得人CD8α信号肽基因(SEQ ID NO.3)、人CD8α铰链区基因(SEQ ID NO.7)、人CD40跨膜区(SEQ ID NO.8)和人CD40信号域基因(SEQ ID NO.9)序列。将人CD8α信号肽基因(SEQ ID NO.3)、EGFRvIIIscFv轻链基因(SEQ ID NO.4)、接头区(Gly4-Ser)3(SEQ IDNO.5)、EGFRvIIIscFv重链基因(SEQ ID NO.6)、人CD8α铰链区基因(SEQ ID NO.7)、人CD40跨膜区(SEQ ID NO.8)和人CD40信号域基因(SEQ ID NO.9)序列进行连接，形成最终完整的EGFRvIIICAR基因序列(SEQ ID NO.2)信息。
二、EGFRvIIICAR表达质粒的构建
2.1全基因合成：
由上海生工生物科技有限公司合成完整的EGFRvIIICAR序列(SEQ ID NO.2)，并在其5’端添加Xba I酶切位点，3’端添加EcoR I酶切位点。
2.2通过PCR扩增不包含有人CD40胞内信号区的EGFRvIIICAR’区，5’端添加Xba I酶切位点，3’端添加EcoR I酶切位点。F：GCTCTAGAATGGCCCTGCCTGTG(SEQ ID NO.10)；R：GGAATTCTCAGGTATCAGAAACCCCTGTAG(SEQ ID NO.11)。扩增回收1005bp片段。
2.3将EGFRvIIICAR及EGFRvIIICAR’分别克隆到pCDH慢病毒表达载体中，构建
pCDH-EGFRvIIICAR及pCDH-EGFRvIIICAR’质粒。具体如下：将pCDH载体、EGFRvIIICAR片段、EGFRvIIICAR’片段Xba I/EcoR I酶切，分别回收8192bp、1186bp、1000bp片段。分别使用T4DNA连接酶连接酶切后的pCDH载体与EGFRvIIICAR、pCDH载体与EGFRvIIICAR’，用连接产物转化Trans1-T1感受态过夜培养，挑取单克隆培养提取质粒并测序，获得pCDH-EGFRvIIICAR及pCDH-EGFRvIII质粒。EGFRvIIICAR及EGFRvIIICAR’结构见图1。pCDH-EGFRvIIICAR慢病毒表达载体的信息见图2。EGFRvIIICAR’基因序列及氨基酸序列见序列表SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13。
三、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定
3.1慢病毒的包装：
3.1.1细胞处理：转染前24小时收集处于对数生长期的第3-10代293T细胞，将293T细胞接种于六孔细胞培养板中，接种量为5×10^5/孔，细胞在含有2ml 10％FBS的DMEM培养基中生长，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养18小时，细胞密度达到60-80％即可进行转染。
3.1.2向293T细胞中共转染慢病毒载体质粒(pCDH或pCDH-EGFRvIIICAR或pCDH-EGFRvIIICAR’)及其包装质粒(pLP1，pLP2，pLP/VSVG)；
3.1.3转染后24小时，于荧光显微镜下观察293T细胞转染后GFP荧光表达情况。分别于转染后48小时、72小时收集293T培养上清中，3000rpm离心15分钟，分别收集细胞及上清，反复冻融三次裂解细胞，离心收集上清；
3.1.4用0.45μm滤器过滤病毒上清，分别获得pCDH空载体病毒、pCDH-EGFRvIIICAR’病毒、pCDH-EGFRvIIICAR病毒溶液。
3.2慢病毒的浓缩及病毒滴度测定
3.2.1分别收集细胞及培养上清，使用PEG6000浓缩病毒，向病毒溶液中加入1/4体积的PEG6000/NaCl溶液(25％PEG6000+4.4％NaCl)，混匀，4℃静置1小时；
3.2.24℃，5000rpm离心30分钟；
3.2.3弃上清，加入2ml病毒溶解液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，2mM MgCl2，5％蔗糖)溶解慢病毒沉淀，并于-80℃储存。
3.2.4测定病毒滴度。预先接种BHK21细胞至24孔板，10^5/孔，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养18小时；
3.2.5溶解病毒，准备从10-2到10-7的10倍稀释病毒样品；
3.2.6去除细胞培养液，加入含有不同病毒量的细胞培养液，并在培养液液中加入6ug/ml的聚凝胺(polybrene)，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养2小时；
3.2.7去除细胞培养液，加入1％FBS的DMEM培养液，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养48小时；
3.2.8去除细胞培养液，加入含2ug/ml嘌呤霉素、1％FBS的DMEM培养液，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养72小时；
3.2.9去除细胞培养液，加入结晶紫染色液，计数被染色克隆数，并计算病毒滴度。
2.10将病毒稀释至10^7TU/ml，于-80℃储存。
四、树突状细胞的体外培养、感染和扩增
4.1用树突状细胞分选试剂盒(购自STEM CELL公司)将CD14+细胞从外周血单核细胞(PBMC)中分选出来。
4.2用X-VIVO 15培养基重悬细胞，加入200U/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)溶液、500U/ml的IL-4溶液和5％的自体血浆，诱导CD14+细胞向树突状细胞分化。
4.3向培养6天的树突状细胞中分别加入pCDH或pCDH-EGFRvIIICAR’或pCDH-EGFRvIIICAR病毒浓缩液至病毒感染复数MOI＝10，以及终浓度为6μg/ml的聚凝胺，混匀，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养，24小时内不换液；感染后24小时进行第二次感染；
4.4感染后96小时，用荧光显微镜观察树突状细胞的绿色荧光的表达。
4.5收集细胞后，1000rpm离心10分钟，PBS洗涤1次，用200ul的PBS重悬细胞置于流式管中，用流式细胞仪检测GFP阳性率。阳性细胞即为所得的EGFRvIIICAR-树突状细胞。
五、体外共培养测定CAR-DC细胞的活化及激活T细胞作用
5.1分析树突状细胞活化
5.1.1细胞处理：分别对EGFRvIIICAR-DC细胞及EGFRvIII+U87细胞(简称U87vIII)进行计数；
5.1.2将EGFRvIIICAR-DC细胞与EGFRvIII+U87细胞按3：1比例混合，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养48小时；
5.1.3收集细胞后，1000rpm离心10min，PBS洗涤1次，用PBS重悬细胞，分别使用抗人MHC-I/MHC-II/CD86/CD80抗体染色，检测DC细胞表面的活化标志MHC-I/MHC-II/CD86/CD80的表达水平。结果见图3，EGFRvIIICAR-DC细胞的活化程度显著升高。
5.2分析T细胞激活
5.2.1T细胞的分离培养，用T细胞分选试剂盒(购自STEM CELL公司)将T细胞从外周血单核细胞(PBMC)中分选出来；
5.2.2用含10％FBS的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至1×10^6/ml，将细胞接种到预先用抗人CD3和CD28抗体包被的细胞培养瓶中，再加入200IU/ml重组人白细胞介素2(rhIL-2)，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养；
5.2.3将EGFRvIIICAR-DC细胞、EGFRvIII+U87细胞和T细胞按3：1：3的比例混合，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养48小时；
5.2.4收集细胞后，1000rpm离心10分钟，PBS洗涤1次，用PBS重悬细胞，分别使用抗人CD3/CD25抗体染色，检测T细胞表面的活化标志CD25的表达水平。结果见图4，仅EGFRvIIICAR-DC细胞有效活化T细胞。
六、体内CAR-DC细胞的抗肿瘤作用
将20只6-8周龄的NSG小鼠在皮下植入5x10^5EGFRvIII+U87细胞，观察和测量肿瘤生长情况，直至肿瘤生长至200mm3，将小鼠随机分为4组，分别通过尾静脉注射10^6EGFRvIIICAR-DC细胞、pCDH空载体-DC细胞+T细胞、pCDH-EGFRvIIICAR’-DC细胞+T细胞、pCDH-EGFRvIIICAR-DC细胞+T细胞(T细胞数为10^6/只)。
CAR-DC细胞治疗脑胶质瘤小鼠模型效果测定：在用CAR-DC细胞治疗后，观察和测量肿瘤的生长，并记录小鼠存活率。肿瘤体积的测量结果参见图5，pCDH-EGFRvIIICAR-DC细胞+T细胞的实验组中，肿瘤体积增长缓慢，且一段时间后逐渐缩小直至消失。存活率参见图6，EGFRvIIICAR-DC细胞+T细胞组的荷瘤小鼠治疗后28天生存率为100％，只用DC细胞治疗及空载体DC细胞组小鼠全部死亡，EGFRvIIICAR’-DC细胞+T细胞组小鼠治疗后28天部分存活，肿瘤生长速度相对减缓。证实了CD40共刺激分子在DC细胞激活T细胞，启动免疫应答中的关键作用。
序列表
<110> 时力生物科技（北京）有限公司
<120> 治疗脑胶质瘤的嵌合抗原受体修饰的树突状细胞及其制备方法
<130> 无
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 391
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFRvIIICAR的氨基酸序列
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe
35 40 45
Asn Ile Glu Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys
65 70 75 80
Tyr Gly Pro Ile Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
85 90 95
Ile Asn Thr Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
145 150 155 160
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
165 170 175
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln
180 185 190
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys
195 200 205
Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
210 215 220
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly
245 250 255
Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
275 280 285
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
290 295 300
Ala Cys Asp Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys
305 310 315 320
Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val
325 330 335
Gly Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp Thr
340 345 350
Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly Asp Pro His His His
355 360 365
Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly Leu Ser Gln Lys
370 375 380
Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln
385 390
<210> 2
<211> 1173
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFRvIIICAR的核酸序列
<400> 2
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
cccgagattc agctcgtgca atcgggagcg gaagtcaaga agccaggaga gtccttgcgg 120
atctcatgca agggtagcgg ctttaacatc gaggattact acatccactg ggtgaggcag 180
atgccgggga agggactcga atggatggga cggatcgacc cagaaaacga cgaaactaag 240
tacggtccga tcttccaagg ccatgtgact attagcgccg atacttcaat caataccgtg 300
tatctgcaat ggtcctcatt gaaagcctca gataccgcga tgtactactg tgctttcaga 360
ggaggggtct actggggaca gggaactacc gtgactgtct cgtccggcgg aggcgggtca 420
ggaggtggcg gcagcggagg aggagggtcc gacgtcgtga tgacccagag ccctgacagc 480
ctggcagtga gcctgggcga aagagctacc attaactgca aatcgtcgca gagcctgctg 540
gactcggacg gaaaaacgta cctcaattgg ctgcagcaaa agcctggcca gccaccgaag 600
cgccttatct cactggtgtc gaagctggat tcgggagtgc ccgatcgctt ctccggctcg 660
ggatcgggta ctgacttcac cctcactatc tcctcgcttc aagcagagga cgtggccgtc 720
tactactgct ggcagggaac ccactttccg ggaaccttcg gcggagggac gaaagtggag 780
atcaagacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 840
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 900
gggctggact tcgcctgtga tgtcctgcac cgctcatgct cgcccggctt tggggtcaag 960
cagattgcta caggggtttc tgataccatc tgcgagccct gcccagtcgg cttctccaat 1020
gtgtcatctg ctttcgaaaa atgtcaccct tggacaaggt ccccaggatc ggctgagagc 1080
cctggtggtg atccccatca tcatcttcgg gatcctgttt gccatcctct tggtgctggt 1140
ctttctcaaa aaggtggcca agaagccaac caa 1173
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD8α信号肽基因序列
<400> 3
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
ccc 63
<210> 4
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFRvIIIscFv轻链的核酸序列
<400> 4
gagattcagc tcgtgcaatc gggagcggaa gtcaagaagc caggagagtc cttgcggatc 60
tcatgcaagg gtagcggctt taacatcgag gattactaca tccactgggt gaggcagatg 120
ccggggaagg gactcgaatg gatgggacgg atcgacccag aaaacgacga aactaagtac 180
ggtccgatct tccaaggcca tgtgactatt agcgccgata cttcaatcaa taccgtgtat 240
ctgcaatggt cctcattgaa agcctcagat accgcgatgt actactgtgc tttcagagga 300
ggggtctact ggggacaggg aactaccgtg actgtctcgt cc 342
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头区的核酸序列
<400> 5
ggcggaggcg ggtcaggagg tggcggcagc ggaggaggag ggtcc 45
<210> 6
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFRvIIIscFv重链的核酸序列
<400> 6
gacgtcgtga tgacccagag ccctgacagc ctggcagtga gcctgggcga aagagctacc 60
attaactgca aatcgtcgca gagcctgctg gactcggacg gaaaaacgta cctcaattgg 120
ctgcagcaaa agcctggcca gccaccgaag cgccttatct cactggtgtc gaagctggat 180
tcgggagtgc ccgatcgctt ctccggctcg ggatcgggta ctgacttcac cctcactatc 240
tcctcgcttc aagcagagga cgtggccgtc tactactgct ggcagggaac ccactttccg 300
ggaaccttcg gcggagggac gaaagtggag atcaag 336
<210> 7
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD8α铰链区的核酸序列
<400> 7
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD40跨膜区
<400> 8
gtcctgcacc gctcatgctc gcccggcttt ggggtcaagc agattgctac aggggtttct 60
gatacc 66
<210> 9
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD40胞内信号区的核酸序列
<400> 9
atctgcgagc cctgcccagt cggcttctcc aatgtgtcat ctgctttcga aaaatgtcac 60
ccttggacaa ggtccccagg atcggctgag agccctggtg gtgatcccca tcatcatctt 120
cgggatcctg tttgccatcc tcttggtgct ggtctttctc aaaaaggtgg ccaagaagcc 180
aaccaa 186
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR正向因为
<400> 10
gctctagaat ggccctgcct gtg 23
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR反向引物
<400> 11
ggaattctca ggtatcagaa acccctgtag 30
<210> 12
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFRvIIICAR’的核酸序列
<400> 12
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
cccgagattc agctcgtgca atcgggagcg gaagtcaaga agccaggaga gtccttgcgg 120
atctcatgca agggtagcgg ctttaacatc gaggattact acatccactg ggtgaggcag 180
atgccgggga agggactcga atggatggga cggatcgacc cagaaaacga cgaaactaag 240
tacggtccga tcttccaagg ccatgtgact attagcgccg atacttcaat caataccgtg 300
tatctgcaat ggtcctcatt gaaagcctca gataccgcga tgtactactg tgctttcaga 360
ggaggggtct actggggaca gggaactacc gtgactgtct cgtccggcgg aggcgggtca 420
ggaggtggcg gcagcggagg aggagggtcc gacgtcgtga tgacccagag ccctgacagc 480
ctggcagtga gcctgggcga aagagctacc attaactgca aatcgtcgca gagcctgctg 540
gactcggacg gaaaaacgta cctcaattgg ctgcagcaaa agcctggcca gccaccgaag 600
cgccttatct cactggtgtc gaagctggat tcgggagtgc ccgatcgctt ctccggctcg 660
ggatcgggta ctgacttcac cctcactatc tcctcgcttc aagcagagga cgtggccgtc 720
tactactgct ggcagggaac ccactttccg ggaaccttcg gcggagggac gaaagtggag 780
atcaagacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 840
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 900
gggctggact tcgcctgtga tgtcctgcac cgctcatgct cgcccggctt tggggtcaag 960
cagattgcta caggggtttc tgatacc 987
<210> 13
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFRvIIICAR’的氨基酸序列
<400> 13
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe
35 40 45
Asn Ile Glu Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys
65 70 75 80
Tyr Gly Pro Ile Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
85 90 95
Ile Asn Thr Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
145 150 155 160
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
165 170 175
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln
180 185 190
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys
195 200 205
Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
210 215 220
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly
245 250 255
Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
275 280 285
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
290 295 300
Ala Cys Asp Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys
305 310 315 320
Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr
325

Claims (9)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、抗EGFRvIII的单链抗体(EGFRvIIIscFv)、人CD8α铰链区、人CD40的跨膜区和胞内信号区顺次拼接构成，称为EGFRvIIICAR，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.表达载体，其含有并且能表达氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的嵌合抗原受体的编码基因。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其中，所述表达载体为慢病毒表达载体pCDH-EGFRvIIICAR。
5.一种工程化的树突状细胞，其含有权利要求3所述的表达载体。
6.权利要求5所述的工程化的DC细胞在制备用于***的药物中的用途，其中所述肿瘤选自：脑胶质瘤、非小细胞肺癌和乳腺癌。
7.制备权利要求5所述的树突状细胞的方法，其特征在于使得所述嵌合抗原受体的表达载体进入树突状细胞。
8.权利要求7所述的方法，其中所述嵌合抗原受体为权利要求1所述的嵌合抗原受体。
9.权利要求7所述的方法，其中所述表达载体为权利要求3或4所述的表达载体。
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