CN111849814B - 一种降解透明质酸的不动杆菌及其培养方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种降解透明质酸的不动杆菌及其培养方法和应用，属于化妆品生物技术领域。本发明中不动杆菌(Acinetobacter sp.)于2019年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18660。本发明首次利用该不动杆菌制备透明质酸酶，可用于制备低分子透明质酸的工艺。以0.2％终浓度分子量为1200kDa的透明质酸钠为底物测得该菌株胞内酶活可达到3854U/mL。该酶的最适温度和最适pH分别为37℃和pH 6.0，对透明质酸特异性高，可应用于工业化生产，从而替代价格高昂的动物组织提取到的透明质酸酶。在医药及化妆品等领域具有广阔的应用前景。

Description

一种降解透明质酸的不动杆菌及其培养方法和应用
技术领域
本发明涉及一种降解透明质酸的不动杆菌及其培养方法和应用，属于化妆品生物技术领域。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种高分子酸性粘多糖。由重复的β-D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺二糖单元组成，通过交替的β-1,3糖苷键和β-1,4糖苷键相连，构成的一种直链多糖。
低分子量透明质酸(分子量为10～500kDa)以其独特的良好穿透性，优异的生物学相容性和易于吸收等特点，越来越引起人们的注意。高分子量透明质酸能够抑制新血管生成，相反地低分子量透明质酸可刺激主动脉及毛细血管，内皮细胞的增生与迁移，促进新生血管的生成。近年来大量的有关透明质酸与肿瘤相关性研究发现，肿瘤发生可能与人体内的HA平衡发生显著改变相关，这种显著改变不仅包括HA含量的变化，更重要的是HA分子量大小的差异。目前越来越多证据显示，内源性低分子量HA与肿瘤恶性程度高呈正相关，但外源性低分子量HA却具有抗肿瘤活性。
目前低分子量HA制备主要是通过物理、化学和酶等降解方法将大分子透明质酸降解为低分子量HA。物理降解法包括加热、机械剪切、紫外线、超声波、γ-射线辐射和高压均质等。物理降解法具有原理清晰，在降解过程中无需加入任何试剂，后处理过程简化，所得低分子量的HA的Mr分布范围窄，热稳定性好等优点，但通常得不到超低分子量的HA且损失严重。HA的化学降解法主要包括碱水解、酸水解和氧化降解。化学降解法成本较低，易于大规模生产，但产品中可能会有化学试剂的残留，此外，化学降解尤其是氧化降解，可能会对透明质酸单体中醛酸或羟基基团产生修饰作用，因此化学法制得的低分子量HA生物活性可能会差别较大。
酶解法由于其专一性强，反应条件温和，且多糖的结构未发生变化，可通过控制不同降解时间，得到不同分子量HA的目的，是制备低分子量HA理想的方法。由于透明质酸酶和硫酸软骨素酶的来源非常有限，价格昂贵，在很大程度上限制了它们的应用。目前文献已报道的透明质酸酶微生物主要来源是链球菌，而至今为止有关不动杆菌(Acinetobactersp.)来源的透明质酸酶则从未见报道。
发明内容
技术问题：为了克服现有技术中存在的不足，透明质酸酶资源短缺，本发明提供一种降解透明质酸的不动杆菌及其培养方法和应用。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明的提供的不动杆菌(Acinetobacter sp.)BDGJ001是从自然界中土样中经分离筛选获得的一株细菌，因为无法重复得到，所以该菌种已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.18660，保藏时间：2019年10月10日。
一种上述透明质酸酶产生菌的分子鉴定方法，其步骤如下：
以不动杆菌(Acinetobacter sp.)BDGJ001基因组DNA为模板，利用16S rDNA扩增引物P1、P2进行PCR扩增获得其16S rDNA序列，经测定，如SEQ1DNO.1所示，其16s rDNA的基因序列通过使用美国生物工程信息中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)BLAST程序比对，本发明的菌株的16S rRNA的基因序列与NCBI注册的不动杆菌株(MN490071.1 99.7％、MT186756.1 99.7％、MF462969.1 99.7％)部分的16S rRNA的基因序列具有较高的同源性。但是不动杆菌株未见能够降解透明质酸的报道。
其中PCR扩增引物为：
P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
P2：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
上述不动杆菌BDGJ001菌液的培养方法，步骤如下：
(1)取不动杆菌BDGJ001菌种接种至液体种子培养基中，在温度为25～40℃、转数为150～300rpm的条件下，摇床培养18～28小时，制得种子液；
(2)取步骤(1)所获得的种子液，划线于固体培养基，在温度为25～40℃条件下培养24～48h，制得单菌落；
(3)挑取步骤(2)中制得的单菌落，接种于液体发酵培养基中，在温度为25～40℃，150～300rpm的条件下扩大培养18～28小时，制得不动杆菌BDGJ001菌液。
根据本发明优选的，步骤(1)所述液体种子培养基每升组分如下：
1～10g蛋白胨、1～10g酵母粉、1～10g透明质酸钠(分子量为1200kDa)、0.1～1g七水硫酸镁、1～5g磷酸三钾三水、0.1～1000mL水，pH值为6～8。
根据本发明优选的，步骤(2)所述固体培养基每升组分如下：
1～10g蛋白胨、1～10g酵母粉、1～10g透明质酸钠(分子量为1200kDa)、0.1～1g七水硫酸镁、1～5g磷酸三钾三水、水1000mL，15～25g琼脂粉，pH值为6～8。
根据本发明优选的，步骤(3)所述液体发酵培养基每升组分如下：
1～10g蛋白胨、1～10g酵母粉、1～10g透明质酸钠(分子量为1200kDa)、0.1～1g七水硫酸镁、1～5g磷酸三钾三水、0.1～1000mL水，pH值为6～8。
采用盐酸、氢氧化钠和磷酸中的一种或一种以上调节种子培养基、固体培养基和发酵培养基的pH。
利用上述不动杆菌BDGJ001菌液制得胞内透明质酸粗酶液，步骤如下：
(A)取上述菌液制备步骤(3)制得的不动杆菌BDGJ001菌液，8000rpm离心20～30min获得菌体；
(B)轻轻弃去上述离心液的上清，因该菌体容易漂浮，可重复步骤(A)，等体积加入PBS溶液，在震荡仪上震荡1min，重悬菌体；
(C)将上述重悬菌体利用细胞破碎仪进行超声破碎20min，制得透明质酸粗酶液。
上述PBS溶液每升组分如下：
0.5～2g无水磷酸氢二钠，2～3g磷酸二氢钠，5～10g氯化钠，1000mL水，调节pH5～7。
采用盐酸、氢氧化钠调节上述PBS溶液的pH。
上述透明质酸粗酶液的酶活测定方法采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定透明质酸酶分解透明质酸产生的还原糖的量。
上述测酶活的原理具体是：在碱性条件下加热3,5-二硝基水杨酸与还原糖反应，3,5-二硝基水杨酸被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，该红色物质有特异吸收峰，在540nm下能被仪器检测到，同时还原糖被氧化成糖酸及其他物质。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅程度呈线性关系。
采用上述DNS法测得本发明的不动杆菌BDGJ001，酶活达到3854U/mL。
有益效果：本发明提供的一种降解透明质酸的不动杆菌及其培养方法和应用，与现有技术相比，具有以下优势：本发明首次利用不动杆菌BDGJ001产透明质酸酶，可用于制备低分子透明质酸的工艺。该酶的最适温度和最适pH分别为37℃和pH6.0，对透明质酸特异性高，可应用于工业化生产，从而替代价格高昂的动物组织提取到的透明质酸酶。在医药及化妆品等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为不动杆菌BDGJ001菌株的基本形态学特征；其中，A为菌株在固体培养基上的菌落形态；B为菌株的光学显微镜照片，C为菌株的电镜照片；
图2为粗酶液的最适温度；
图3为粗酶液的最适pH；
图4为GPC检测酶解透明质酸钠结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：不动杆菌BDGJ001的富集筛选过程
采集自然界河边水壤交接处的潮湿泥土，取样约50g密封好，记录时间、地点、环境情况。取5g新鲜土样溶于45g无菌水中，搅拌均匀，静置1h，至澄清状，取1mL上清并移入到预先准备好的含有9mL无菌生理盐水的试管中，在漩涡震荡器上震荡摇匀制成10-1浓度的样品悬浮液；按此方法依次继续操作，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等不同浓度的样品悬浮液。将稀释后的悬浮液，取0.1mL涂布于固体筛选培养基，每一浓度涂布两块，30℃，220rpm培养72h。挑取单菌落接种于液体培养基，摇床培养48h。取培养物0.9mL加入0.9mL60％的甘油，混匀后于-80℃冰箱长期保存。
上述固体筛选培养基每升组分如下：
5g透明质酸钠(分子量为1200kDa)，2g K3PO4·3H2O、0.5g MgSO4·7H2O，1000mL蒸馏水，20g琼脂。
上述液体培养基每升组分如下：
5g蛋白胨、5g酵母粉、5g透明质酸钠(分子量为1200kDa)、2g K3PO4·3H2O、0.5gMgSO4·7H2O、1000mL蒸馏水，pH值为6～8。
实施例2：菌株形态和分子鉴定
上述不动杆菌BDGJ001为革兰阴性杆状菌，在固体培养基平板上观察到，菌落呈圆形，表面湿润，光滑，菌落易连结在一块，颜色呈乳白色，如图1A所示的培养24h的结果。在固体平板生长时间过度，菌株颜色会发黄。在普通光学显微镜观察到，细菌呈短杆状，无芽孢，如图1B所示。在电子显微镜观察到，该菌呈短棒状，细胞表面光滑，如图1C所示，该菌株可在以透明质酸为唯一碳源的培养基上生长。
上述用于菌株基因扩增的通用引物为：
正向引物为27f：5’-AGTTTGATCCTG GCT CAG-3’；
反向引物为1492r：5’-GCTTACCTTGTTACGACTT-3’。
Figure BDA0002591317260000041
并挑取上述固体培养基上的不动杆菌BDGJ001单菌落混匀于该体系。
上述用于菌株基因扩增的程序为95℃预变性10min，95℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸90S，共34个循环，72℃延伸15min，4℃保温。测序由金唯智生物科技有限公司完成。所用基因扩增试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
不动杆菌(Acinetobacter sp.)BDGJ001菌株，经测定，其16s rRNA的基因序列长度为1001bp，如SEQ1DNO.1所示。通过使用美国生物工程信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)BLAST程序比对，经比对，本发明的菌株的16S rRNA的基因序列与NCBI注册的不动杆菌株(MN490071.1 99.7％、MT186756.1 99.7％、MF462969.199.7％)部分的16S rRNA的基因序列具有较高的同源性。但是不动杆菌株未见能够降解透明质酸的报道。
实施例3：不动杆菌BDGJ001菌液的培养方法
(A)取-80℃保藏的不动杆菌BDGJ001，按照1％接种量，接种至液体种子培养基中，在温度为30℃、转数为220rpm的条件下，摇床培养24小时，制得种子液；
(B)取步骤(A)所获得的种子液，划线于固体培养基，在温度为30℃条件下培养36h，制得单菌落；
(C)挑取步骤(B)固体培养基表面生长良好的单菌落，接种于液体发酵培养基中，在温度为30℃，转数为220rpm的条件下，扩大培养24小时，制得不动杆菌BDGJ001菌液。
根据本发明优选的，步骤A所述液体种子培养基每升组分如下：
5g蛋白胨、5g酵母粉、5g透明质酸钠(分子量为1200kDa)、2g K3PO4·3H2O、0.5gMgSO4·7H2O、1000mL蒸馏水，pH值为6～8，本实施例优选为6.8。
根据本发明优选的，步骤B所述固体培养基每升组分如下：
5g蛋白胨、5g酵母粉、5g透明质酸钠(分子量为1200kDa)、2g K3PO4·3H2O、0.5gMgSO4·7H2O、1000mL蒸馏水，琼脂粉20g，pH值为6～8，本实施例优选为6.8。
根据本发明优选的，步骤C所述液体发酵培养基每升组分如下：
5g蛋白胨、5g酵母粉、5g透明质酸钠(分子量为1200kDa)、2g K3PO4·3H2O、0.5gMgSO4·7H2O、1000mL蒸馏水，pH值为6～8，本实施例优选为6.8。
实施例4：不动杆菌BDGJ001菌液制备透明质酸粗酶
(i)取上述步骤(C)制得的不动杆菌BDGJ001菌液离心获得菌体，所述离心的条件为：8000rpm离心30min；
(ii)弃去上述离心液上清，等体积加入PBS溶液重悬菌体；
(iii)将上述重悬菌体进行超声细胞破碎20min，8000rpm离心10min，取上清制得透明质酸粗酶液。
上述PBS溶液每升组分如下：2.5g磷酸二氢钠，1.0g无水磷酸氢二钠与8.2g氯化钠，水1000mL，调节pH至6。
采用盐酸、氢氧化钠调节上述PBS溶液的pH。
上述超声破碎仪参数设置为：工作时间20min，破4S停6S，总时间为50min，功率为300W。
实施例5：测透明质酸粗酶液的酶活具体方法
配制DNS溶液：称取3，5—二硝基水杨酸(10土0.1)g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠10g，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸钾钠200g、苯酚2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。(轻工业部标准DNS试剂的配制)
反应体系共3mL，2mL DNS溶液中分别加入0，50，100，150，200μL的葡萄糖标准液(2mg/mL)，加水补足到3mL，沸水浴煮沸10min，冷却至室温，加水补足到10mL，在540nm下测定吸光度，以吸光度为横坐标，以葡萄糖质量浓度为纵坐标制作标准曲线。
透明质酸粗酶液样品的测定步骤如下：
需要配置如下试剂：2mg/mL透明质酸钠(分子量为1200kDa)溶液，50mmol/L、pH6.0PBS缓冲液。反应体系1mL：800μL透明质酸钠、100μL的透明质酸粗酶液、PBS缓冲液补足1mL，37℃水浴锅中反应1h，用1mL反应的样品代替葡萄糖标准液，测定吸光值代入标准曲线求得还原当量的葡萄糖质量浓度。
一个单位酶活(Unit)定义为：在上述实验条件下，每1h产生1μg葡萄糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位。
采用上述DNS法测得本发明的不动杆菌BDGJ001，酶活达到3854U/mL。
实施例6：粗酶的相关性质考察
(1)粗酶的最适反应温度探究
取5mL EP管，实验组依次加入100μL粗酶液，100μL pH6.0的PBS缓冲液，0.2mg/mL的透明质酸钠(分子量为1200kDa)溶液。对照组依次加入100μL蒸馏水，100μL pH6.0的PBS缓冲液，0.2mg/mL的透明质酸钠(分子量为1200kDa)溶液。做三个平行，分别放入35、37、39、41、43℃的水浴锅中反应1h，取出放入100℃水浴锅中2min灭活。分别加入2ml DNS试剂，放入100℃水浴锅中反应10min。取出放置至室温。紫外分光光度计540nm下测定吸光度。
相对酶活定义为：各组平均吸收值与最大吸收值的百分比。最大吸收值对应的为粗酶液的最适反应温度。
粗酶液的最适反应温度结果如图2所示，粗酶液的最适反应温度为37℃。
(2)酶的最适反应pH探究
分别用pH为4、5、6、7、8的磷酸盐缓冲液配制浓度为2mg/mL的透明质酸钠(分子量为1200kDa)溶液，待透明质酸钠完全溶解后，置于最适温度37℃中孵育，然后向每900μL不同pH的透明质酸钠溶液中加入100μL粗酶液，混匀后开始反应，37℃水浴锅中反应1h，每个条件下设置3个平行样品。反应结束，取出放入100℃水浴锅中2min灭活。加入2ml DNS试剂，放入100℃水浴锅中反应10min。取出放置至室温。紫外分光光度计540nm下测定吸光度。
相对酶活定义为：各组平均吸收值与最大吸收值的百分比。最大吸收值对应的为粗酶液的最适pH。
粗酶液的最适反应pH结果如图3所示，粗酶液的最适反应pH为6。
实施例7透明质酸酶制备透明质酸分子量的测定
以0.2％的透明质酸钠(分子量为1200kDa)为底物，取50mL，按照10％的比例，加入制备的透明质酸粗酶液，于37℃水浴锅中反应。在反应0、2、4、6、8、10h，取出3mL反应液，在100℃水浴锅中灭活3min。所得样品用于GPC检测分子量。
GPC检测条件：色谱柱为SB-806M HQ，柱温为25℃，检测器为RID检测器，流动相为0.1M NaNO3，进样量为20μL，检测时间为25min。
GPC检测结果如图4所示。该粗酶液可在酶解30min将分子量1200kDa的透明质酸钠底物降解为分子量110kDa左右的低分子量透明质酸钠，并可在后续继续降解为分子量低于10kDa的透明质酸钠。
综上，本发明首次利用该不动杆菌制备透明质酸酶，可用于制备低分子透明质酸以及超低分子寡聚透明质酸的工艺。以0.2％终浓度的分子量为1200kDa透明质酸钠为底物测得该菌株胞内酶活可达到3854U/mL。该酶的最适温度和最适pH分别为37℃和pH6.0，对透明质酸特异性高。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种降解透明质酸的不动杆菌及其培养方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1001
<212> DNA
<213> 不动杆菌(Acinetobacter sp.)
<400> 1
ggcacctcgg ccaccgtggt aaccgccctc tttgcagtta ggctagctac ttctggtgca 60
acaaactccc atggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 120
attctgatcc gcgattacta gcgattccga cttcatggag tcgagttgca gactccaatc 180
cggactacga tcggcttttt gagattagca tcctatcgct aggtagcaac cctttgtacc 240
gaccattgta gcacgtgtgt agccctggcc gtaagggcca tgatgacttg acgtcgtccc 300
cgccttcctc cagtttgtca ctggcagtat ccttaaagtt cccgacatta ctcgctggca 360
aataaggaaa agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 420
acgacagcca tgcagcacct gtatgtaagt tcccgaaggc accaatccat ctctggaaag 480
ttcttactat gtcaaggcca ggtaaggttc ttcgcgttgc atcgaattaa accacatgct 540
ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattca tttgagtttt agtcttgcga ccgtactccc 600
caggcggtct acttatcgcg ttagctgcgc cactaaagcc tcaaaggccc caacggctag 660
tagacatcgt ttacggcatg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc cccatgcttt 720
cgcacctcag cgtcagtgtt aggccagatg gctgccttcg ccatcggtat tcctccagat 780
ctctacgcat ttcaccgcta cacctggaat tctaccatcc tctcccacac tctagctaac 840
cagtatcgaa tgcaattccc aagttaagct cggggatttc acattttgac ttaattagcc 900
gcctacgcgc gctttacgtc cagtaaatcc gattaacgct tgcaccctct gtattaccgc 960
ggctgctggc acagagtaag ccggtgctta ttctgcgagt a 1001

Claims (10)

1.一种不动杆菌BDGJ001，其特征是，于2019年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.18660，保藏名称为不动杆菌(Acinetobacter sp)BDGJ001。
2.一种透明质酸粗酶液的生产方法，其特征是，采用权利要求1中所述的不动杆菌BDGJ001，经平面培养、种子培养、发酵培养制得透明质酸粗酶液。
3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征是，具体包括以下步骤：
(1)将不动杆菌BDGJ001菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在25～40℃、150～300rpm的条件下培养18～28h，得种子液；
(2)将不动杆菌BDGJ001种子液划线于固体培养基中进行平板培养，在25～40℃，静置培养24～48h，得平板划线菌种；
(3)挑取平板上生长良好的不动杆菌BDGJ001单菌落接种到已灭菌的发酵培养基中，在25～40℃、150～300rpm的条件下培养18～28h，扩大培养，得透明质酸粗酶液。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征是：步骤(1)中，每升种子培养基含有以下成分：透明质酸钠1～10g，K3PO4·3H2O 1～5g，MgSO4·7H2O 0.1～1g，调节pH至6～8。
5.根据权利要求3所述的生产方法，其特征是：步骤(2)中，每升固体培养基含有以下成分：透明质酸钠1～10g，K3PO4·3H2O 1～5g，MgSO4·7H2O 0.1～1g，蛋白胨1～10g，酵母粉1～10g，琼脂粉15～20g，调节pH至6～8。
6.根据权利要求3所述的生产方法，其特征是：步骤(3)中，每升发酵培养基含有以下成分：透明质酸钠1～10g，K3PO4·3H2O 1～5g，MgSO4·7H2O 0.1～1g，蛋白胨1～10g，酵母粉1～10g，调节pH至6～8。
7.根据权利要求4-6任一所述的生产方法，其特征是：所述透明质酸钠为高分子透明质酸钠，分子量为1200kDa。
8.根据权利要求3所述的生产方法，其特征是：采用盐酸、氢氧化钠和磷酸中的一种或一种以上调节种子培养基、固体培养基和发酵培养基的pH。
9.根据权利要求3所述的生产方法，其特征是：步骤(3)获得的透明质酸粗酶液的菌液经离心，洗涤，重悬，除去培养基，获得菌悬液；所述菌悬液经超声破碎，离心去除不溶物质，获得胞内透明质酸酶的粗酶液。
10.根据权利要求2-6任一所述的生产方法制备的透明质酸粗酶液，其特征是：用于制备低分子透明质酸。
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