CN109536412B - 一株异常球菌h-1及其在产生红色素中的应用 - Google Patents

一株异常球菌h-1及其在产生红色素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种异常球菌H‑1及其在产生红色素中的应用。通过在南极腐殖土壤中分离筛选并经过系列鉴定获得一株新菌种异常球菌（Deinococcus sp.）H‑1 CGMCC N0.16333，利用分离出的菌种能够产生红色素，应用到生产红色素中，具有快速和稳定的生产效果，提取得到的红色素粗提物具有在482nm处有最大吸收峰，对DPPH的自由基清除率为30.4%，良好的热稳定性，自然光照射下较稳定的特点，对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。

Description

一株异常球菌H-1及其在产生红色素中的应用
技术领域
本发明涉及微生物菌种及其应用的技术领域，具体的涉及一种新的异常球菌及其在产生红色素中应用的技术领域。
背景技术
随着现代社会整体生活水平的提高，人们对健康更加关注，天然色素以其安全、绿色、无毒、保健而备受青睐。目前，天然色素的获取主要有3条途径：一是直接提取，二是人工合成，三是利用生物技术生产。发酵生产红色素、类胡萝卜素等已成为现实，但远不能满足现代食品工业发展的需要。但色素的提取大多仍然集中在植物材料上，而从微生物细胞中提取色素，除红曲色素外所见报道不多，微生物生产色素具有生长周期短，生产速度快，提取工艺比较简单等优势，利用以上优势可以很好地满足现代食品工业发展的需要。因此，从自然资源中筛选具有产天然色素能力的微生物，开发新的天然色素，具有广阔的前景。
现有的国内外专利或非专利文献中都没有披露异常球菌生产红色素的报道，也没有提供一种能够有生产红色素的异常球菌菌株，因此需要进一步探究异常球菌的特性，提供能够用于生产红色素的方法，对于微生物利用开发技术领域具有现实意义。
发明内容
针对目前未见通过南极腐殖土壤中分离筛选新的异常球菌的现状，本发明提供一种新菌种异常球菌(Deinococcus sp.)H-1及其应用。本发明通过从南极腐殖土壤中分离筛选出一株异常球菌(Deinococcus sp.)H-1 CGMCC NONO.16333，利用分离出的菌种能够产生红色素，应用到生产红色素中，具有快速和稳定的生产效果，对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。
本发明采用的主要技术方案：
本发明具体提供一种异常球菌(Deinococcus sp.)H-1 CGMCC NO.16333。通过从南极腐殖土壤中筛选、分离出一株编号为H-1的异常球菌(Deinococcus sp.)，通过目前常见的菌种鉴定手段获悉异常球菌H-1是一株新菌种，并对通过采用发酵技术收集的菌体进行有机溶剂提取获得红色素粗提物，红色素粗提物在482nm处具有最大吸收峰，对DPPH的自由基清除率为30.4％，对热稳定性较高，90℃时损失率仅为5.3％，且具有在自然光照射下较稳定的特性，体现了筛选该菌种具有鲜明的应用价值导向。
具体的，本发明根据南极地理环境的特殊性，通过从南极腐殖土壤中进行微生物菌种的培养、分离，筛选一批优良菌种，并从中分离筛选出一株编号为H-1的异常球菌(Deinococcus sp.)，经微生物学分类与鉴定，属于异常球菌属，该菌株最适生长条件为：最适温度15℃，最高生长温度为20℃，最适生长培养基为TGY，可生长培养基为1/5 TSA、2/5TSA、TGY、1/10 PCA、1/5 TGY，pH值为7.0，可在NaCl浓度为0-1％范围内生长。参照《伯杰氏***细菌学鉴定手册》(第九版)等常见的菌种鉴定手册对编号为H-1菌株进行形态学、生理生化试验，确定H-1菌株为异常球菌属中成员，但是具有与常见的异常球菌属成员菌种不同的特点，具有一些新菌种的特性。
进一步，本发明通过对上述编号为H-1的菌种进行基因测序，序列参见附后提供的SEQ ID NO:1所示，所得序列经常见网站进行比对分析，结果发现，菌株H-1的16S rRNA基因序列与Deinococcus alpinitundrae ME-04-04-52T的同源性最高，仅为95.7％，菌株H-1与Deinococcus alpinitundrae ME-04-04-52T的亲缘关系最近。利用本领域常见采用的MEGA5.0软件通过Neighbor-Joining方法建立***进化树，结果经比对分析发现，菌株H-1与Deinococcus alpinitundrae LMG 24283T菌株来源于同一分支的可信度为100％，表明该菌种作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种鉴定可知该菌株H-1确定其为异常球菌(Deinococcus sp.)新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为异常球菌(Deinococcus sp.)H-1。
具体的，该菌株H-1已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2018年08月22日，菌种保藏号为CGMCCNo.16333。经微生物学鉴定暂命名为异常球菌(Deinococcus sp.)H-1。
菌株在1/5 TSA培养基上，红色，表面突起，光滑，粘稠，直径1-2mm，革兰氏染色结果为G+，符合异常球菌菌落特征。显微镜下观察，菌株细胞呈球形。
同时，本发明进一步提供一种利用异常球菌(Deinococcus sp.)H-1 CGMCCNo.16333提取红色素的方法，具体步骤如下：
从斜面保藏菌株中挑取异常球菌H-1菌种，接种于TGY液体培养基中，15℃摇床培养7天后，12000rpm离心10min，收集菌体，无菌去离子水洗涤菌体一次，然后按照菌体量与95％乙醇溶液1:5的比例加入95％乙醇混匀，4℃超声处理30min，12000rpm离心10min收集上清。所获得的上清即为红色素提取液，将红色素粗提取液于60℃恒温条件下真空浓缩成为干物质，所得即为红色素粗提物。
进一步，本发明提供异常球菌(Deinococcus sp.)H-1 CGMCC No.16333提取的红色素粗提物，在482nm处有最大吸收峰，对DPPH的自由基清除率为30.4％，具有较强的热稳定性，在90℃时损失率仅为5.3％，在自然光照射下较为稳定的特点，具有广泛的应用价值。
通过实施本发明提供上述具体技术方案，实施本发明内容，可以达到以下有益效果：
(1)本发明提供的异常球菌(Deinococcus sp.)H-1 CGMCC No.16333是一种典型的新菌种最适生长培养基为TGY，可在1/5 TSA、2/5 TSA、TGY、1/10 PCA、1/5 TGY培养基上良好生长，最适生长温度为15℃，最高生长温度为20℃，最适pH值为7.0，可在NaCl浓度为0-1％范围内生长，具有产生红色素特性，同时具有培养条件简单，繁殖快的特点，初步确定其为异常球菌(Deinococcus sp.)新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为异常球菌(Deinococcus sp.)H-1。
(2)将本发明分离筛选的异常球菌(Deinococcus sp.)H-1CGMCC No.16333通过发酵技术产生大量红色素，将培养液中的红色素提纯，获得的红色素粗提物在482nm处有最大吸收峰，对DPPH的自由基清除率为30.4％，具有较强的热稳定性，在90℃时损失率仅为5.3％，在自然光照射下较为稳定的特点，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1所示为基于菌株异常球菌(Deinococcus sp.)H-1的16S rDNA序列建立的N-J***进化树图。
图2所示为异常球菌(Deinococcus sp.)H-1形态特征图，图中，A为菌种H-1在1/5TSA平板生长形态图，B为菌体在10x100光学显微镜形态图。
图3所示为异常球菌(Deinococcus sp.)H-1的革兰氏染色图。
图4所示为红色素溶液的波长扫描曲线图。
图5所示为自然光对红色素粗提物的影响图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
本发明采用的样品：南极腐殖土壤。
本发明实施例中采用如下基础培养基：1/5胰蛋白胨大豆琼脂(1/5 TSA)培养基包括胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1.0L，pH 7.3±0.2；TGY培养基包括蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖1g，蒸馏水1.0L，pH7.8；PCA培养基包括胰蛋白胨5.0g、酵母浸粉2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1.0L、pH 7.0±0.2。
实施例一：异常球菌(Deinococcus sp.)H-1的分离、筛选及鉴定
(一)分离、筛选：从南极腐殖土壤中分离得到。称取1g土壤样品置于无菌离心管里，利用60Coγ-射线(剂量8KGy，剂量率剂量率298.7KGy)处理样品，然后加9mL无菌0.9％的生理盐水和适量玻璃珠，于室温下振荡30min，梯度稀释后，每个梯度吸取0.1mL稀释液加至1/5 TSA培养基平板上并涂布，平板置15℃恒温培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。从中优选出一株编号为H1的菌株，保藏待用。
(二)分类、鉴定：
1、PCR模板DNA的提取：
将纯化后的菌种H1斜面菌接种到1/5 TSA液体培养基中，15℃摇床培养5天，收集菌体，采用DNA抽提试剂盒提取基因组总DNA，进行异常球菌(Deinococcus sp.)H-1 16SrDNA序列测定与分析。
采用特异性引物:
27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
采用16SrDNA特异性引物进行目的片段的PCR扩增，扩增产物连接入pGM-T载体中、并转化至宿主菌DH5α，涂布于LB/Amp+/X-Gal/IPTG平板上进行蓝白筛，挑选白色克隆进行PCR，PCR反应体系总体积30μL，PCR扩增条件为，95℃5min；95℃45s，58℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min，PCR验证后，回收目的片段进行测序。
通过对上述菌种H1基因测序，序列参见附后提供的SEQ ID NO:1所示，所得序列经常见的NCBI网站进行比对分析，经比对分析发现，菌株H-1的16S rRNA基因序列与Deinococcus alpinitundrae ME-04-04-52T的同源性最高，仅为95.7％，菌株H-1与Deinococcus alpinitundrae ME-04-04-52T的亲缘关系最近。利用MEGA 5.0软件通过Neighbor-Joining方法建立***进化树，***进化树结果如附图1所示，结果经比对分析发现，菌株H-1与Deinococcus alpinitundrae LMG 24283T菌株来源于同一分支的可信度为100％，表明该菌种作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种分子水平鉴定可知该菌株H-1确定为异常球菌(Deinococcus sp.)新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为异常球菌(Deinococcus sp.)H-1。
2、生理生化测定
(1)通过生长条件研究结果显示异常球菌H1可生长温度为15-20℃之间，最适培养温度为15℃，属于低温菌；异常球菌H1最适生长培养基为TGY，可生长培养基为1/5 TSA、2/5TSA、TGY、1/10 PCA；1/5 TGY；可在pH 6.0–8.0范围内生长，最适pH为7.0；可在NaCl浓度为0-1％范围内生长。
(2)氧化酶试验：阴性；过氧化氢酶试验：阳性；水解淀粉试验：阴性。
(3)使用GEN III微孔板测试，结果显示：D-松二糖，蔗糖，D-果糖，D-半乳糖，D-甘露糖，D-***糖，D-果糖-6-磷酸，e氨基乙酰-L-脯氨酸，果胶，乙酸，甲酸，乙酰乙酸，糊精，D-海藻糖，吐温40是可被利用的碳源。
使用API ZYM试剂条测试细胞酶活性，其中阳性反应有：酯酶，类脂酯酶，类脂酶，脱氨酸芳氨酶，胰蛋白酶，α-半乳糖苷酶，β-糖醛酸苷酶，N-乙酰-葡萄糖胺酶，α-甘露糖苷酶，β-岩藻糖苷酶。
在API 50CH检测中，除了七灵叶显示阳性外，其余检测均为阴性。
在API 20NE检测中，结果呈阳性的有七灵叶和对硝基-D-甲基半乳糖。
采用主要的甲基萘醌是MK-8。
(4)DNA G+C含量为61.32mol％。
综合16S rDNA序列分析、***发育分析、微生物学特性分析结果，表明本发明提供的异常球菌H-1确为异常球菌属的一株细菌新种，将其暂命名为异常球菌(Deinococcussp.)H-1。该菌于2018年08月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No.16333。
菌株H-1在1/5 TSA培养基上，菌落形态为：红色，表面突起，光滑，粘稠，直径1-2mm，草酸铵-结晶紫染色后观察H1形态为球状，革兰氏染色结果为G+。异常球菌H-1的形态特征如附图2所示，革兰氏染色结果如附图3所示。
实施例二：利用异常球菌(Deinococcus sp.)H-1制备红色素粗提物的方法
利用异常球菌(Deinococcus sp.)H-1 CGMCC No.16333制备红色素粗提物的方法，具体步骤如下：
从斜面保藏菌株中挑取菌种异常球菌(Deinococcus sp.)H-1CGMCC No.16333，接种于TGY液体培养基中，15℃摇床培养7天后，12000rpm离心10min，收集菌体，无菌去离子水洗涤菌体一次，然后按照菌体量与95％乙醇溶液1:5的比例加入95％乙醇混匀，4℃超声处理30min，12000rpm离心10min收集上清。所获得的上清即为红色素提取液，将红色素粗提取液于60℃恒温条件下真空浓缩成为干物质，所得即为红色素粗提物。
实施例三：红色素粗提物特性实验
1、红色素粗提物最大吸收峰的确定
将实施例二所获得的红色素粗提物溶解于95％的乙醇溶液中，利用紫外分光光度计进行300-600nm波长的扫描分析，分析结果如附图4所示。结果表明，从菌种异常球菌(Deinococcus sp.)H-1CGMCC No.16333中提取的红色素在482nm处有最大吸收峰。
2、红色素粗提物抗氧化实验
精确称取1,1-二苯-3-苦基肼(DPPH)10mg，使用无水乙醇溶解并且定容至50mL，从而配制成0.2g/L的DPPH标准溶液(避光保存)。将通过实施例二得到的红色素粗提物配制成0.1mg/mL的乙醇溶液，分别吸取2mL色素溶液和2mL DPPH标准溶液，快速混匀后置于扫描分光光度计上，517nm光波下进行时间-吸光值扫描(扫描时间为10min)，记录起始吸光值Ai和10min后吸光值At；同时分别吸取2mL无水乙醇和2mL DPPH标准溶液作对照，记录AO，通过以下公式计算自由基消除率。
公式：消除率＝[1-(Ai-At)/A0]×100％
其中：Ai为色素与DPPH溶液混匀后的吸光值；At色素与DPPH溶液混匀，反应10min后的吸光值；A0为乙醇与DPPH溶液混匀后的吸光值。
通过测定计算可知，在本反应浓度和反应10min条件下，0.lmg/mL色素溶液对0.2g/L的DPPH标准溶液的自由基消除率为30.4％
517nm下检测反应前后OD值变化，计算消除率。
公式：消除率＝[1-(Ai-At)/A0]×100％
菌株异常球菌(Deinococcus sp.)H-1 CGMCC No.16333获得的红色素对DPPH的自由基清除率＝[1-(2.915-2.753)/2.757]×100％＝30.4％
3、红色素粗提物热稳定性检测
将通过实施例二得到的红色素粗提物配制成0.1mg/mL水溶液，各吸取10mL密闭分装于玻璃比色管中，置于4℃、20℃、40℃、60℃、80℃、90℃水浴2h时，迅速冷却至室温，于室温下测定482nm下的收光值，以未作保温处理的样本为对照计算色素的残余量，结果如表1所示。由表1可以看出温度对色素的稳定性影响不大，在90℃时损失率仅为5.3％。
表1：不同温度对色素稳定性的影响
处理温度/℃ 4 20 40 60 80 90
损失率/％ 0 0.5 1.6 3.6 4.8 5.3
4、红色素粗提物光稳定特性
将通过实施例二得到的红色素粗提物配制成0.2mg/mL乙醇溶液，密闭分装于玻璃试管中，置于自然光下照射0-6天，每天分别测定其482nm下的吸光值，计算色素残余率。
由附图5所示，制得的红色素乙醇溶液在自然光下放置2d后仍有90％左右的残余率，表现出一定的光稳定性，6d后的残余率仍有70％，因此，本色素在自然光照射下较为稳定。
通过上述系列实施例提供的异常球菌(Deinococcus sp.)H-1CGMCC No.16333是一种典型的新菌种，该菌株最适生长条件为：温度15℃，最高生长温度为20℃，pH值为7.0，可在NaCl浓度为0-1％范围内生长，该菌株具有较好的生产红色素能力，同时具有培养条件简单，繁殖快的特点。将异常球菌H-1通过发酵技术产生的红色素经过提取获得红色素粗提物，红色素粗提物具有在482nm处有最大吸收峰，对DPPH的自由基清除率为30.4％，对热稳定性较高，90℃时损失率仅为5.3％，且在自然光照射下较稳定的特点，对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 陕西省微生物研究所
<120> 一株异常球菌H-1及其在产生红色素中的应用
<141> 2018-12-21
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1415
<212> DNA
<213> 异常球菌(SEQ ID NO:1)
<400> 1
ggcggcgtgc ttaagacatg caagtcgaac gggaagagct tgctcttcta gtggcgcacg 60
ggtgagtaac gcgtaactga cctacctcca agttcagcat aacgtctcga aagagacgct 120
aattctgaat gtgatcccac ctcgtgtggt gtgattaaag aatttcgctt ggagatgggg 180
ttgcgttcca tcagctagat ggtggggtaa aggcctacca tggcgacgac ggataaccgg 240
cctgagaggg tggccggtca caggggcact gagacacggg tcccactcct acgggaggca 300
gcagttagga atcttccaca atgggcgcaa gcctgatgga gcgacgccgc gtgagggatg 360
aaggttttcg gatcgtaaac ctctgaatca gggacgaaag accagcttga ctggggatga 420
cggtacctga gtaatagcac cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt 480
gcaagcgtta cccggaatca ctgggcgtaa agggcgtgta ggcggtttgc caagtctgac 540
tttaaagacc gaagctcaac ttcgggaatg ggttggagac tggcagacta gacggatgga 600
gaggtcactg gaattcctgg tgtagcggtg gaatgcgtag ataccaggag gaacaccaac 660
ggcgaaggca ggtgactgga catttagtga cgctgaggcg cgaaagtgtg gggagcaaac 720
cggattagat acccgggtag tccacaccct aaacgatgta cgttggctag gcgcaggatg 780
ctgtggttgg cgaagttaac acgataaacg taccgcctgg gaagtacggc cgcaaggttg 840
aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 900
caacgcgaag aaccttacca gatcttgaca tgtcccaaac ccaccggaac cggtggggtg 960
cccttcgggg aatgggaaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ctaccttttg ttgctaacgg ttcggccgag 1080
aactcaagag gaactgccta tgaaagtagg aggaaggcgg ggatgacgtc tagtcagcat 1140
ggtccttacg gtctgggcta cacacgtgct acaatggccg atacaacgcg cagcaagcac 1200
gtgagtgcaa gccaatcgct aaaagtcggc cccagttcag atcggagtct gcaactcgac 1260
tccgtgaagt tggaatcgct agtaatcgtg aatcagcatg tcgcggtgaa tacgttcccg 1320
ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagttgatt gcagctcaaa ccgccgggag 1380
ccgaaaggca ggcgtctagg ctgtggttgg tgact 1415

Claims (3)

1.一株异常球菌(Deinococcus sp.)H-1，其特征在于，所述的异常球菌(Deinococcus sp.)H-1的保藏编号为CGMCC No.16333。
2.如权利要求1所述的一株异常球菌(Deinococcus sp.)H-1在生产红色素中的应用。
3.如权利要求2所述的一株异常球菌(Deinococcus sp.)H-1在生产红色素中的应用，其特征在于，从斜面保藏菌株中挑取异常球菌H-1菌种，接种于TGY液体培养基中，15℃摇床培养7天后，12000rpm/min离心10min，收集菌体，无菌去离子水洗涤菌体一次，然后按照菌体量与95％乙醇溶液1:5的比例加入95％乙醇混匀，4℃超声处理30min，12000rpm/min离心10min收集上清，所获得的上清即为红色素粗提取液，将红色素粗提取液于60℃恒温条件下真空浓缩成为干物质，制备获得红色素粗提物。
CN201811568440.1A 2018-12-21 2018-12-21 一株异常球菌h-1及其在产生红色素中的应用 Active CN109536412B (zh)

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