CN111679008B - 一种同时检测烟叶、烟丝中挥发及半挥发酸、醇、酚的gc-ms-ms方法 - Google Patents

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Abstract

一种同时检测烟叶、烟丝中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC‑MS‑MS方法，特征是：烟叶晾干粉碎经酸性缓冲液泡发并用溶剂涡旋提取，提取液经DMF稀释后加入混合吸附剂进行净化，离心后取上清液，过有机相滤膜。取滤液，加入硅烷化试剂进行衍生，最后采用GC‑MS‑MS进行分析。突出优点是：可同时准确定量分析烟草中挥发半挥发的酸类、醇类、酚类香气成分118种。采用酸性缓冲液浸泡，一方面使烟草中结合态的酸、醇、酚转化为游离态，可同时测定烟草中游离态和结合态的总量，提高定量准确度；另一方面降低烟碱溶出量，减少烟碱这一高含量物质对其它痕量成分的干扰。采用混合吸附剂对样品进行净化，操作简单重复性好，准确度高，可进行快速分析。

Description

一种同时检测烟叶、烟丝中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS- MS方法
技术领域
本发明属于烟草香味成分检测技术领域，具体涉及一种用酸性缓冲液浸泡、有机溶剂提取、DMF稀释、混合吸附剂净化、硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)同时测定烟草中挥发半挥发酸类、醇类、酚类的分析方法。
背景技术
烟叶中挥发、半挥发性的酸类、醇类、酚类物质，是烟气中重要的致香物质。挥发酸多为C12以下的低级脂肪酸和部分芳香酸，这些酸在卷烟抽吸过程中直接进入烟气，对香味有显著的影响。烟草中醇类化合物包含脂肪醇、脂环醇、芳香族醇、萜醇等，一些醇如薄荷醇、苯甲醇、苯乙醇等对卷烟香味作用明显，已用于烟草加香中。烟叶中含有少量的简单酚，在烟支燃吸期间，这些化合物通过蒸发等途径进入烟气，对烟气香味产生直接影响，有些具有特定的香气，有些则使烟气增加奇异的味道，且不易被其他致香剂所减轻(参见：毛细多孔介质干燥过程中传热传质模型研究及应用[D].大连理工大学,2003)。这些成分的含量水平和相互比例对烟叶和卷烟的风格、品质具有关键影响，是影响烟草香气质、香气量及香型的重要化学组分，因此也受到越来越多的关注。
目前烟草、烟气中酸类、醇类、酚类等香味成分的提取方法主要有同时蒸馏萃取法(参见：同位素稀释一气相色谱一质谱联用法分析烟气中性香味成分[J].质谱学报，2019，40(6)：566-573)、超声波提取法(参见：超声波提取一气相色谱/质谱联用分析烟叶中挥发性和半挥发性有机酸[J].分析科学学报，2011，27(1)：35-38)等，提取过后，也有用液相色谱进一步分离制备，收取不同馏分再进一步分析(CN 108627600A)。采用的仪器一般为GC-FID或GC-MS。其中，同时蒸馏萃取法实际应用最为广泛，但其存在低沸点物质损失严重、副产物多、提取效率低、耗时长等问题。而且由于化合物极性的不同，一般酸类成分采用极性分析柱单独分析，部分酚类与醇类化合物与烟叶中其它醛、酮、酯等中性香味成分采用非极性柱一同分析(参见：不同成熟度烟叶中香味成分分析[J].食品科学，2007，23(2)：98-102])。部分酸类、酚类、醇类由于难挥发性及强极性，可分析成分较少，最多只有几十种。而且大部分分析方法中采用化合物的峰面积与内标的峰面积比例计算，只能得到相对含量。由于分析方法中前处理条件及分析仪器性能的限制，难以揭示烟叶及卷烟风格特征的物质基础。近期已有烟草中多种有机酸分析的专利(参见CN109406704A，CN109212066A)，但没有将醇类、酚类一同分析。因此，迫切需要建立高通量、易操作、准确度高、灵敏度好的同时分析烟叶中酸类、醇类、酚类的高效分析方法。
由于酸类、醇类、酚类物质极性的不同，往往需要应用不同的色谱柱，不能同时进行分析，而硅烷化反应可解决这一问题。硅烷化气相色谱法的原理是通过硅烷化衍生反应使三甲基硅烷基取代衍生对象的羟基、羧基、巯基、氨基及亚氨基的活泼氢，提高衍生对象挥发性，从而扩大气相色谱的测定范围，克服气相色谱对极性强、挥发性低、热稳定性差的物质不能直接进样分析的缺点，此外，转化为衍生物的方法还具有改善结构近似化合物的分离选择性，克服载体、柱壁对高极性、低挥发性样品的吸附，改善样品峰形等优点(参见：烟丝硅烷化GC指纹图谱在卷烟质量判别中的应用[J].中国烟草学报，2007，13(3)：18-20)。硅烷化技术已应用于烟气中酚的分析、挥发酸的分析(参见：硅烷化-GC/MS联用测定卷烟主流烟气中7种酚类化合物J].烟草科技，2017，50(6)：54-60)。目前尚未见有硅烷化反应同时测定烟草中酸类、醇类、酚类物质的报道。
发明内容
本发明的目的旨在建立操作简单、通用性强、成本低、环境友好、能满足烟叶、烟丝中挥发半挥发酸类、醇类、酚类同时提取的通用、高效型的前处理方法，并结合气相色谱-串联质谱技术，寻找最佳色谱条件及串接质谱MRM多反应监测模式参数，实现对烟草中挥发半挥发酸类、醇类、酚类香味成分的同时分析。在本发明中，将样品进行硅烷化，结合灵敏度更高、选择性更好的GC-MS-MS仪器，建立了烟叶、烟丝中同时分析酸类、醇类、酚类物质的高通量分析方法，满足了对烟草中酸类、醇类、酚类香味成分同时进行快速、高通量分析研究的需要。该方法简单、准确、易操作、通量高，可同时对118种香味成分进行测定，为烟草化学成分研究提供了技术支持。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种同时检测烟草中挥发半挥发酸类、醇类、酚类香味成分的方法，首先用酸性缓冲液浸泡待测烟样，然后加入有机溶剂提取，提取液经DMF稀释后加入混合吸附剂对样品进行净化，离心后取上清液，过有机相滤膜。取滤液，加入硅烷化试剂进行衍生，最后采用GC-MS-MS进行分析。具体步骤如下：
(1)烟叶的粉碎：将烤烟烟叶晾干，粉碎过筛至40-60目，室温保存；
(2)烟叶样本pH值调整：将60g含两个结晶水的磷酸二氢钠加入90mL去离子水中，然后滴加9.5g磷酸，摇匀待用。称取2g烟粉，加入3mL配制好的酸性缓冲溶液，用细玻璃棒搅拌均匀，泡发30min.
(3)样品萃取：加入10mL提取溶剂(二氯甲烷)及50μL内标工作液(反二己烯酸的二氯甲烷溶液，浓度为100μg/mL)，以2500r/min涡旋1～5min，5000～8000r/min离心3～5min；
(4)样品净化：取500μL有机相溶液于2mL离心管中，加入500μLDMF，摇匀，然后加入5～10mg吸附剂(C18和GCB，粒度40～60μm，质量比1:1)，立即以2500r/min涡旋1～5min，5000～8000r/min离心3～5min；上清液经0.22μm有机相滤膜。
(5)样品衍生：取500μL过滤液，于1ml衍生瓶中，加入衍生化试BSTFA20μL，水浴60℃，衍生40min。
(6)样品分析：将待测液用气相色谱-串联质谱分析，采用标准工作溶液制作标准曲线，用标准曲线定量；
GC-MS/MS分析条件如下：
色谱柱：弹性石英毛细管色谱柱，固定相为5％苯基-甲基聚硅氧烷，规格60m×0.25mm×0.25μm，进样口端串联预柱(1m×0.25mm×0.25μm)；
进样口温度：280℃；
进样量：0.8～1.0μL；
进样方式：分流进样，分流比：10:1；
载气：氦气，恒流模式，流速1.0mL/min；
程序升温；初温40℃，然后以4℃/min的升温速度升到280℃，再以10℃/min的升温速率升至290℃，保持20min。
电离模式：电子轰击电离，电离能70eV；
灯丝电流：35μA；
离子源温度：280℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：280℃；
Q2碰撞气：氮气(纯度99.999％)，流量1.5mL/min；淬灭气：氦气(纯度为99.999％)，流量2.25mL/min；扫描方式：多反应监测(MRM)模式。MRM参数包括保留时间的确定，母离子、子离子和碰撞能量的优化。首先将各化合物进行全扫描(Full Scan)(扫描范围m/z40～500)，确定保留时间，并筛选2～3个质荷比及丰度较大的离子作为备选母离子；再将上述各母离子在不同的碰撞能量下(5、10、15、20、25、30eV)进行产物离子扫描(ProductIon Scan)，并筛选2个质荷比及丰度较大的离子作为子离子，每个化合物筛选出2～3对离子对及相应的最优碰撞能量；最后，用MRM模式对标准溶液、基质提取液、添加标准品的基质提取液进行分析，选择无基质干扰、灵敏度高的两对离子对分别作为定量及定性离子对。目标物的MRM参数如表1所示。
表1 118种目标物的检测质谱条件
Figure BDA0002548918800000041
Figure BDA0002548918800000051
Figure BDA0002548918800000061
Figure BDA0002548918800000071
本发明的突出优点在于：
1、本发明中，将样品用所配制的磷酸盐缓冲溶液按所述比例进行泡发，一方面使样本体系pH调至3左右，使结合态的酸类、醇类、酚类化合物大部分游离出来，以便检测。一方面降低了样本中烟碱的萃取量，避免了大量烟碱降低色谱柱柱效的影响。最后，样本经缓冲盐溶液泡发后，密度增大，后续经有机溶剂萃取后，样本可与二氯甲烷良好分层，沉积于底部，便于取样。
2、本发明用二氯甲烷提取、C18和GCB净化，硅烷化衍生后进GC-MS-MS分析，操作简单快速，通量高，溶剂用量少，能满足烟草中挥发半挥发酸类、醇类、酚类的同时提取、净化；与目前烟草香味成分常用的同时蒸馏萃取法相比，由于没有加热环节，不存在低沸点物质损失严重、有副产物生成的问题，并且用时短、成本低、溶剂用量少、通量高。
3、本发明中采用的净化吸附剂为C18和GCB质量比为1:1的混合物，C18对非极性化合物的吸附很好，GCB主要的吸附样本中的色素。二者配合使用，达到非常理想的净化效果，提供了较为干净的上机溶液，减少了仪器在使用过程中的维护。
4、本发明中二氯甲烷萃取液经DMF稀释后，体系极性增强，增加了大分子化合物及非极性化合物在净化材料(C18和GCB质量比为1:1的混合物)上的吸附量，降低了酸类、醇类、酚类等极性目标物的吸附，即增加了净化效果又提高了方法准确度。
5、本发明中对样本进行硅烷化，使性质不同挥发半挥发的酸类、醇类、酚类中羧基、羟基上的活泼氢均被三甲基硅烷基取代，提高衍生对象挥发性，将非挥发性物质转为挥发性衍生物，克服气相色谱对极性强、挥发性低、热稳定
性差的物质不能直接进样分析的缺点，克服载体、柱壁对高极性、低挥发性样品的吸附，改善了样品峰形。实现了一套色谱***对烟草中挥发半挥发酸类、醇类、酚类等117种化合物的同时测定。是一种高通量的分析方法。
6、本发明中，所述的预柱的作用如下：使样品中高分子量杂质沉积在预柱中，减少分析柱前端的污染，延长柱寿命；以获得更好的峰形及实验稳定性。
7、本发明用气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)同时测定烟草中119种挥发半挥发酸类、醇类、酚类香味成分，和以往方法相比，每个化合物都选择优化了相应的定量离子对和定性离子对，无需标准谱库检索，化合物的定性更准确；且方法灵敏度更高、精密度和重复性更好。考察了119种化合物的基质效应，实验结果显示，该方法中，基质效应不明显，可采用溶剂配制标准曲线进行定量。119种化合物均通过内标法建立标准工作曲线，采用根据各目标物面积相应及各目标物的标准曲线计算相应成分的含量；而目前的香味成分的定量方法大多是根据化合物选择离子的峰面积与内标选择离子峰面积比例及内标化合物的量进行估算，是半定量方法。因此本发明的准确度更高。
附图说明
图1为本发明中标准溶液在GC-MS/MS上的总离子流图。
图2为具有显著性差异的香味成分判别分析结果。
具体实施方式
本发明以下结合实施例(附图)做进一步描述，但并不限制本发明。
含量测定实例：
(1)烟叶样品的制备
烟叶晾干后粉碎，过40目筛室温装于封口袋中备用。
(2)样品前处理
称取2g烟粉，加入3mL配制好的酸性缓冲溶液，用细玻璃棒搅拌均匀，泡发30min。加入10mL二氯甲烷及50μL内标工作液，以2500r/min涡旋5min，8000r/min离心3min；取500μL有机相溶液于2mL离心管中，加入500μLDMF，摇匀，然后加入10mg吸附剂(C18和GCB，粒度40～60μm，质量比1:1)，以2500r/min涡旋3min，8000r/min离心3min；上清液经0.22μm有机相滤膜。取500μL过滤液，于1ml衍生瓶中，加入衍生化试BSTFA20μL，水浴60℃，衍生40min。
(3)气相色谱仪条件及质谱条件
色谱条件：色谱柱：弹性石英毛细管色谱柱，固定相为5％苯基-甲基聚硅氧烷，规格60m×0.25mm×0.25μm，进样口端串联预柱(1m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度：280℃；进样量：1.0μL；进样方式：分流进样，分流比：10:1；载气：氦气，恒流模式，流速1.0mL/min；程序升温；初温40℃，然后以4℃/min的升温速度升到280℃，再以10℃/min的升温速率升至290℃，保持20min。
质谱条件：电离模式：电子轰击电离，电离能70eV；灯丝电流：35μA；
离子源温度：280℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：280℃；Q2碰撞气：氮气(纯度99.999％)，流量1.5mL/min；淬灭气：氦气(纯度为99.999％)，流量2.25mL/min；扫描方式：多反应监测(MRM)模式。MRM参数见表1。
(4)工作曲线与检测限的测定
通过以下公式考察了119种香味成分的基质效应：ME＝B/A，其中，A为溶剂标准工作溶液标准曲线的斜率，B为基质匹配标准工作溶液标准曲线的斜率。
其中的内标物反-2-己烯酸的浓度为500ng/mL。根据样品中目标物的含量，含量较低的化合物共112种，6级标线浓度分别为10、20、50、100、200、500ng/mL；含量较高的化合物共7种，分别是甲酸、乙酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸，6级标线浓度分别为2、4、10、20、40、100μg/mL。以各目标物的峰面积与内标的峰面积之比与各目标物浓度与内标浓度之比进行线性回归分析，得到标准工作曲线，实验结果表明：118种目标物的基质效应不明显(0.9<ME<1.1)，因此本实验可采用溶剂直接制作标准曲线。在线性浓度范围内，各标准曲线的线性关系良好，适合定量分析。以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)，所有目标物的检出限在1～34ng/g之间，定量限在3～103ng/g之间，完全满足烟叶中挥发半挥发酸性成分的定量分析需求。
表2化合物的标准工作曲线
Figure BDA0002548918800000091
Figure BDA0002548918800000101
Figure BDA0002548918800000111
Figure BDA0002548918800000121
(4)回收率与精密度
称取2g烟粉，加入3mL配制好的酸性缓冲溶液，加入标准品溶液，使低含量目标物添加水平为0.5μg/g，高含量目标物添加量为5μg/g,用细玻璃棒搅拌均匀，泡发30min。其余操作如(2)所述，进行日内6次，日间6次平行实验，考察了方法的精密度，并在高、中、低三个含量水平上进行了样品加标回收率的测定(添加量以样品中含量为参考，添加含量的0.5倍、1倍、2倍)。结果表明，118种化合物测定结果的日内RSD％在1.03％～8.22％，日间RSD％1.27％～10.64％；三水平方法回收率的结果在77.95％～119.27％之间。结果表明，该方法具有良好的回收率，精密度、灵敏度、稳定性较好，可满足分析检测需要。
表3 119种化合物的回收率及精密度
Figure BDA0002548918800000122
Figure BDA0002548918800000131
Figure BDA0002548918800000141
Figure BDA0002548918800000151
(5)样品测定
采用所建方法，分析了清甜香、焦甜香、木香蜜甜香四种风格特征的烟叶，共检出目标物59种目标物，以P值小于0.05为标准，采用F检验筛选出19种具有显著性差异的成分(表4)。将差异成分进行威尔克(Lambda)判别分析，不同风格的卷烟在判别图上(见图2)呈现显著性差异，表明筛选出的指标能够较好的区分不同风格特征的烟叶。
表4 19种差异化合物的P值
显著性P值 显著性P值
甲酸 .015 苯甲醇 .022
乙酸 .003 @3甲基糠酸 .011
丁酸 .016 苯乙醇 .006
戊酸 .043 紫丁香醇 .021
正己醇 .000 水杨酸甲醚 .002
叶醇 .005 癸酸 .009
反式2甲基2丁烯酸 .015 @4氧代壬酸 .003
@13丁二醇 .035 月桂醇 .018
@2乙基己醇 .044 二十烷醇 .022
正辛醇 .026

Claims (5)

1.一种同时检测烟叶、烟丝中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS/MS方法，其特征在于：烟叶晾干粉碎经酸性缓冲液泡发并用提取溶剂涡旋提取，提取液经DMF稀释后加入混合吸附剂进行净化，离心后取上清液，过有机相滤膜，取滤液，加入硅烷化试剂进行衍生，最后采用GC-MS/MS进行分析，具体步骤如下：
(1)烟叶的粉碎：将烤烟烟叶晾干，粉碎过筛至40-60目，室温保存；
(2)烟叶样本pH值调整：将60g含两个结晶水的磷酸二氢钠加入90mL去离子水中，然后滴加9.5g磷酸，摇匀待用；称取2g烟粉，加入3mL配制好的酸性缓冲溶液，用细玻璃棒搅拌均匀，泡发30min；
(3) 样品萃取：加入10mL提取溶剂及50µL内标工作液，以2500r/min涡旋1～5min，5000～8000r/min离心3～5min，所述内标工作液为反二己烯酸的二氯甲烷溶液，所述提取溶剂为二氯甲烷；
(4) 样品净化：取500µL有机相溶液于2mL离心管中，加入500µLDMF，摇匀，然后加入5～10mg吸附剂，立即涡旋离心以2500r/min涡旋1～5min，5000～8000r/min离心3～5min；上清液经0 .22μm有机相滤膜；吸附剂包括C18和GCB，粒度40~60μm，质量比1:1；
(5) 样品衍生：取500µL过滤液，于1ml衍生瓶中，加入衍生化试BSTFA20µL，水浴60℃，衍生40min；
(6) 样品分析：将待测液用GC-MS/MS分析，采用标准工作溶液制作标准曲线，用标准曲线定量；
GC-MS/MS分析条件如下：
色谱柱：弹性石英毛细管色谱柱，固定相为5％苯基-甲基聚硅氧烷，规格60m×0.25mm×0 .25μm，进样口端串联预柱，规格1m×0.25mm×0.25μm；
进样口温度：280℃；
进样量：0 .8～1 .0μL；
进样方式：分流进样，分流比：10:1；
载气：氦气，恒流模式，流速1.0mL/min；
程序升温：初温40℃，然后以4℃/min的升温速度升到280℃，再以10℃/min的升温速率升至290℃，保持20min；
电离模式：电子轰击电离，电离能70eV；
灯丝电流：35μA；
离子源温度：280℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：280℃；
Q2碰撞气：氮气，流量1.5mL/min；淬灭气：氦气，流量2.25mL/min；扫描方式：多反应监测(MRM)模式。
2.根据权利要求1所述的同时检测烟叶、烟丝中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS/MS方法，其特征在于：步骤（2）中的pH值调整为3。
3.根据权利要求1所述的同时检测烟叶、烟丝中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS/MS方法，其特征在于：所述内标工作液反二己烯酸的二氯甲烷溶液的浓度为100µg/mL。
4.根据权利要求1所述的同时检测烟叶、烟丝中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS/MS方法，其特征在于：所述MRM参数包括保留时间的确定，母离子、子离子和碰撞能量的优化，具体为：首先将各化合物进行全扫描(Full Scan)，确定保留时间，并筛选2～3个质荷比及丰度较大的离子作为备选母离子；再将上述各母离子在不同的碰撞能量下包括5、10、15、20、25、30eV进行产物离子扫描(Product Ion Scan)，并筛选2个质荷比及丰度较大的离子作为子离子，每个化合物筛选出2～3对离子对及相应的最优碰撞能量；最后，用MRM模式对标准溶液、基质提取液、添加标准品的基质提取液进行分析，选择无基质干扰、灵敏度高的两对离子对分别作为定量及定性离子对。
5.根据权利要求1所述的同时检测烟叶、烟丝中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS/MS方法，其特征在于：所述同时检测烟叶、烟丝中挥发及半挥发酸、醇、酚的数量共118种。
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