CN110208414B - 一种定量测定烟草中超多靶标香味成分的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种定量测定烟草中超多靶标香味成分的分析方法，属于烟草成分检测技术领域，其特征在于：烟草样品用酸性缓冲液浸泡、有机溶剂提取后，以多壁碳纳米管作为逆固相分散吸附剂，通过涡旋、离心对样品进行净化，结合气相色谱‑串联质谱联用技术实现对烟草中345种香味成分的同时检测。本发明具有操作简单快速、通量高、成本低、溶剂用量少、环境友好、可分析化合物范围广、准确度高、精密度好、灵敏度高、重复性好等优点，可满足对烟草香味成分进行快速分析检测的需要。

Description

一种定量测定烟草中超多靶标香味成分的分析方法
技术领域
本发明属于烟草香味成分检测技术领域，具体涉及一种酸性条件浸泡、有机溶剂提取、多壁碳纳米管净化、气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)同时测定烟草中345种香味成分的分析方法。
背景技术
烟草香味成分包括醛、酮、醇、酚、酸、醚、酯、内酯、烯、吡啶、吡咯、吡嗪等多类挥发、半挥发性成分。这些成分的含量水平和相互比例对烟叶和卷烟的风格、品质具有关键影响，是影响烟草香气质、香气量及香型的重要化学组分。随着分析技术的进步，香味成分对于烟叶感官品质的影响受到越来越多的关注。然而香味成分性质的差异性和烟草基质的复杂性决定了对其关键香味成分的分析研究富有挑战性。
目前烟草香味成分的检测主要基于非靶标GC/MS方法，首先进行全扫描(Scan)分析，通过谱库检索定性，因此仅能测定可准确定性的化合物。受样品基质干扰、GC/MS灵敏度不足等分析方法问题制约，既往研究覆盖的烟叶微量香味成分数量极为有限。如，在国内外烟草添加剂中使用的香吃味独特、感官阈值低的微量烟草/烟气成分高达500余种，但既往研究限于分析技术只能覆盖几十种，因此造成风格、特征相关烟叶物质基础揭示不全。而且，目前的方法并非用标准曲线定量，整个分析过程中不涉及目标物的标准品，而是采用半定量的方法，即用谱库定性检索出的各化合物的峰面积与内标的峰面积比例计算。此外，文献报道的烟草中香味成分的提取方法主要有同时蒸馏萃取法、水蒸气蒸馏法、固相微萃取法、吹扫捕集法、超临界萃取法、顶空萃取法等，其中，同时蒸馏萃取法实际应用最为广泛，已成为烟草香味成分分析最常用的提取方法，但其存在低沸点物质损失严重、副产物多、提取效率低、耗时长等问题。因此，迫切需要建立一种烟草香味成分超多靶标、操作简单、准确快速、高通量、高灵敏、高效率、绝对定量的分离分析方法。
发明内容：
本文发明的目的旨在寻找操作简单、通用性强、成本低、环境友好、能满足性质差异较大的多种目标物的同时提取的通用型和高效型的烟草样品前处理方法，并结合气相色谱-串联质谱技术，寻找最优色谱条件及MRM(多反应监测模式)参数，实现对烟草中超多靶标香味成分的检测。该方法快速、准确、灵敏、成本低、易操作、通量高，可同时对345种香味成分进行测定，可满足对大批量样品进行快速分析检测的需要。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种检测烟草中多种香味成分的方法，首先向待测烟草样品中加入酸性缓冲液浸泡，有机溶剂提取，然后在盐析作用下，用干燥剂除水，再以多壁碳纳米管作为逆固相分散吸附剂，对样品进行净化，结合气相色谱-串联质谱联用技术实现对烟草中多种香味成分的同时检测，具体步骤如下：
(1)样品制备：烟叶样品30℃烘干、粉碎、低温避光保存；
(2)样品提取：将样品用磷酸盐缓冲液调节pH值至3，加入提取溶剂及内标工作液，涡旋，冷冻，取出后再加无水硫酸镁、氯化钠并迅速剧烈摇晃，涡旋、离心；
具体过程为：称取2g烟末样品于50mL具塞离心管中，加入10mL磷酸盐缓冲液调节pH值至3，涡旋使样品完全浸润，静置20～30min；加入10mL提取溶剂及内标工作液，以2500r/min涡旋1～5min，而后放入-18℃的冰箱中冷冻10～30min；取出后加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠并迅速剧烈摇晃，再以2500r/min涡旋1～5min，5000～8000r/min离心3～5min；
(3)样品净化：取步骤2)最后离心的有机相，加入无水硫酸镁和多壁碳纳米管，涡旋、离心，上清液过滤后待测；
具体过程为：取1mL有机相溶液于2mL离心管中，加入150～200mg无水硫酸镁和5～10mg多壁碳纳米管，立即以2500r/min涡旋1～5min，5000～8000r/min离心3～5min；上清液经0.22μm有机相滤膜过滤后待测；
(4)样品检测：将待测液用气相色谱-串联质谱分析，采用基质匹配标准工作溶液制作标准曲线，用标准曲线定量；
GC-MS/MS分析条件如下：
色谱柱：弹性石英毛细管色谱柱，固定相为5％苯基-甲基聚硅氧烷，规格60m×0.25mm×0.25μm，进样口端串联预柱(5m×0.25mm)；进样口温度：280℃；进样量：0.8～1.0μL；进样方式：不分流进样，不分流时间1min；载气：氦气，恒流模式，流速1.5mL/min；程序升温；电离模式：电子轰击电离，电离能70eV；灯丝电流：35μA；离子源温度：280℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：280℃；Q2碰撞气：氮气(纯度99.999％)，流量1.5mL/min；淬灭气：氦气(纯度为99.999％)，流量2.25mL/min；扫描方式：多反应监测(MRM)模式。
本发明中，所述的香味成分包括醛、酮、醇、酚、醚、酯、内酯、烯、吡啶、吡咯、吡嗪、硫化物、酰胺、酰亚胺等多类成分。
本发明中，所述的磷酸盐缓冲液的配制方法为分别称取0.28g磷酸、1.0g磷酸二氢钠，加入10mL超纯水，超声、搅拌至溶解。
本发明中，所述的提取溶剂为乙腈，提取溶剂还可使用二氯甲烷。
本发明中，所述的内标为d8-苯乙酮，配成浓度为30mg/L的d8-苯乙酮乙腈溶液，每个样品的加入量为80μL；内标还可使用苯己酮、苯戊酮、4-溴苯戊酮、丙酸-2-苯乙酯、3-丙酸苯乙酯、氘代萘、蒽、苯并芘。
本发明中，所述的多壁碳纳米管为：外径10～20nm，长度10～20μm，比表面积>165m2/g，纯度>95％。
本发明中，所述的基质匹配标准工作溶液的配制方法如下：：将烟草样品按照相同的前处理方式处理后作为基质提取液，但提取时不添加内标，用该基质提取液稀释标准工作溶液，加入的待稀释溶剂标准工作溶液的体积不超过总体积的5％。
本发明中，所述的标准曲线定量是选择标准加入法、内标法等方法建立标准工作曲线，根据检测结果及各目标物的标准曲线计算相应成分的含量。
本发明中，所述的预柱的作用如下：减少分析柱前端的污染，延长柱寿命；有助于在柱前端聚焦样品，以获得更好的峰形。
本发明中，所述的GC-MS/MS分析条件中的程序升温过程如下：初始温度75℃，保持5min后以1℃/min升至150℃，保持1min，然后以2℃/min升至260℃，保持1min，最后以10℃/min升至280℃，保持10min。
本发明中，所述的GC-MS/MS分析条件中的MRM参数包括保留时间的确定，母离子、子离子和碰撞能量的选择优化。首先将各化合物进行全扫描(Full Scan)分析(扫描范围m/z20～330)，确定保留时间及一级质谱图，并筛选2～4个质荷比及丰度较大的离子作为备选母离子；再将上述各母离子在不同的碰撞能量下(5、10、15、20、25、30、35、40eV)进行产物离子扫描(Product Ion Scan)，每个化合物筛选出4～8对离子对及最优碰撞能量；最后，用MRM模式对标准溶液、基质提取液、添加标准品的基质提取液进行分析，选择抗干扰能力强、灵敏度高的两对离子对分别作为定量及定性离子对。目标物的MRM参数如表1所示。
表1目标物及其内标的MRM参数
Figure BDA0002104365630000031
Figure BDA0002104365630000041
Figure BDA0002104365630000051
Figure BDA0002104365630000061
Figure BDA0002104365630000071
Figure BDA0002104365630000081
Figure BDA0002104365630000091
Figure BDA0002104365630000101
Figure BDA0002104365630000111
Figure BDA0002104365630000121
与现有技术相比，本发明方法具有如下优良效果：
(1)本发明用乙腈或二氯甲烷提取、无水硫酸镁除水、多壁碳纳米管分散固相萃取净化，操作简单快速，通量高，成本低，溶剂用量少，环境友好，能满足性质差异较大的多种目标物的同时提取、净化；与目前烟草香味成分常用提取方法同时蒸馏萃取法相比，由于没有加热环节，不存在低沸点物质损失严重、有副产物生成的问题，并且用时更短、成本更低、溶剂用量更少、通量更高。
(2)烟碱分子中含有两个氮杂环和一个不对称碳原子，是弱二级碱，最多可以捕获两个质子，因此烟碱可以以游离态、单质子态和双质子态三种形态存在，游离态烟碱的比例随着pH值的增大而上升，因此不调pH直接提取，有机溶剂提取出的游离态的烟碱含量高，大量烟碱的存在会降低色谱柱柱效，并导致烟碱附近出峰物质保留时间漂移。本发明采用降低pH值的方式(即pH值调为3)来降低提取液中烟碱的含量，从而消除了其对目标物检测的影响。
(3)本发明用多壁碳纳米管作为逆固相分散吸附剂，多壁碳纳米管是由多层碳石墨片卷曲而成的无缝中空管，具有特殊的物理化学性质、独特的结构和巨大的比表面积，对烟草杂质具有很强的吸附能力，净化效果好，在降低基质效应的同时，亦排除了常用的吸附剂如PSA、GCB、C18对目标分析物吸附而造成的影响，并提供更干净的上机溶液，减少了仪器在使用过程中的维护。
(4)目前烟草香味成分的分析集中在气相色谱质谱法(GC/MS)上，即，前处理完成后，首先进行全扫描(Scan)分析，通过检索标准质谱图库定性，受样品基质干扰、GC/MS灵敏度不足等分析方法问题制约，能准确定性的化合物数量极为有限，既往研究覆盖的烟叶微量香味成分仅为六十余种。本发明用气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)可同时测定烟草中345种香味成分，和以往方法相比可分析化合物范围更广、数量更多；每个化合物都选择优化了相应的定量离子对和定性离子对，无需标准谱库检索，化合物的定性更准确；且方法灵敏度更高、精密度和重复性更好。
(5)目前的气相色谱质谱法是将全扫描分析中能准确定性的化合物用选择离子监测(SIM)定量，定量方式为用各化合物选择离子的峰面积与内标选择离子峰面积比例作为该化合物响应值，是半定量方法。而本发明用基质匹配标准工作液建立标准曲线进行绝对定量，因此本发明的准确度更高。
(6)基质效应是气相色谱质谱分析时普遍存在的问题，主要表现为基质增强效应，即基质成分的存在减少了色谱***活性位点与待测物分子作用的机会，从而造成待测物信号有所增强。基质溶液的pH值、共提物的种类和数量均会对待测物的响应产生影响。本发明采用基质匹配标准工作液可以校正基质效应引入的定量误差，定量结果更准确。
附图说明
图1标准溶液在GC-MS/MS上的总离子流图；
图2具有显著性差异的香味成分PLS-DA分析结果。
具体实施方式
本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。
实例1：
通过以下公式考察了345种香味成分(共361个色谱峰)的基质效应：ME＝B/A，其中，A为溶剂标准工作溶液标准曲线的斜率，B为基质匹配标准工作溶液标准曲线的斜率。标准工作溶液的浓度分别为0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5和1μg/mL。
GC-MS/MS分析条件如下：
气相色谱条件：色谱柱：弹性石英毛细管色谱柱，固定相为50％苯基-甲基聚硅氧烷，规格60m×0.25mm×0.25μm，进样口端串联预柱(5m×0.25mm)；进样口温度：280℃；进样量：0.8μL；进样方式：不分流进样，不分流时间1min；载气：氦气，恒流模式，流速1.5mL/min；程序升温：初始温度75℃，保持5min后以1℃/min升至150℃，保持1min，然后以2℃/min升至260℃，保持1min，最后以10℃/min升至280℃，保持10min。
质谱条件：电离模式：电子轰击电离，电离能70eV；灯丝电流：35μA；离子源温度：280℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：280℃；Q2碰撞气：氮气(纯度99.999％)，流量1.5mL/min；淬灭气：氦气(纯度为99.999％)，流量2.25mL/min；扫描方式：多反应监测(MRM)模式。MRM参数见表1。
基质效应越接近1，说明基质效应越不明显。结果表明，125种目标物的基质效应不明显(0.9<ME<1.1)，有97种目标物存在明显基质减弱效应(ME<0.9)，139种目标物存在明显基质增强效应(ME>1.1)，其中106种目标化合物存在很强的基质效应，表现为：在溶剂标准工作溶液标准曲线中除高浓度点外其他较低浓度点无信号响应，但其基质匹配标准工作溶液线性关系良好。详见表2。因此，本发明采用基质匹配标准工作液以校正基质效应引入的定量误差。
表2香味成分提取液的基质效应
ME ＜0.5 0.5-0.9 0.9-1.1 1.1-1.5 ＞15 ∞
香味成分数目 2 95 125 26 7 106
实例2：
称取2g烟末样品于50mL具塞离心管中，加入10mL磷酸盐缓冲液调节pH值至3，涡旋使样品完全浸润，静置20min；加入10mL乙腈以及80μL 30.0mg/L d8-苯乙酮内标工作液，以2500r/min涡旋2min，而后放入-18℃的冰箱中冷冻10min；取出后加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠并迅速剧烈摇晃，再以2500r/min涡旋2min，8000r/min离心3min；取1mL上清液于2mL离心管中，加入150mg无水硫酸镁和10mg多壁碳纳米管，立即以2500r/min涡旋2min，8000r/min离心3min；上清液经0.22μm有机相滤膜过滤后进行GC-MS/MS分析；
GC-MS/MS分析条件如下：
气相色谱条件：色谱柱：弹性石英毛细管色谱柱，固定相为50％苯基-甲基聚硅氧烷，规格60m×0.25mm×0.25μm，进样口端串联预柱(5m×0.25mm)；进样口温度：280℃；进样量：0.8μL；进样方式：不分流进样，不分流时间1min；载气：氦气，恒流模式，流速1.5mL/min；程序升温：初始温度75℃，保持5min后以1℃/min升至150℃，保持1min，然后以2℃/min升至260℃，保持1min，最后以10℃/min升至280℃，保持10min。
质谱条件：电离模式：电子轰击电离，电离能70eV；灯丝电流：35μA；离子源温度：280℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：280℃；Q2碰撞气：氮气(纯度99.999％)，流量1.5mL/min；淬灭气：氦气(纯度为99.999％)，流量2.25mL/min；扫描方式：多反应监测(MRM)模式。MRM参数见表1。
基质匹配标准工作溶液的浓度分别为0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5和1μg/mL。分别对这些标准溶液进行GC-MS/MS检测并进行线性回归分析，各标准曲线的线性关系良好。进行了0.05，0.5和5μg/g三个水平的添加回收率试验，282个目标物在三个添加水平下平均回收率均在70～120％之间，且RSD小于20％。以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)，所有目标物的检出限在0.3～40ng/g之间，定量限在1～133ng/g之间，其中有327个化合物的定量限在1～50ng/g之间，18个化合物的定量限在51～133ng/g之间。方法表征数据见表3。结果表明，该方法具有良好的回收率，精密度、灵敏度、稳定性较好，可满足分析检测需要。
表3 345种目标物的相关系数、回收率(n＝5)、相对标准偏差、检测限和定量限
Figure BDA0002104365630000151
Figure BDA0002104365630000161
Figure BDA0002104365630000171
Figure BDA0002104365630000181
Figure BDA0002104365630000191
Figure BDA0002104365630000201
Figure BDA0002104365630000211
Figure BDA0002104365630000221
Figure BDA0002104365630000231
注：*因烟草中含量较高，添加回收率在0.25、2.5、25μg/g三个水平下考察
实例3：
称取2g烟末样品于50mL具塞离心管中，加入标准品溶液，使目标物添加水平为0.5μg/g，加入10mL磷酸盐缓冲液调节pH值至3，涡旋使样品完全浸润，静置20min；加入10mL乙腈以及80μL 30.0mg/L d8-苯乙酮内标工作液，以2500r/min涡旋2min，而后放入-18℃的冰箱中冷冻10min；取出后加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠并迅速剧烈摇晃，再以2500r/min涡旋2min，8000r/min离心3min；取1mL上清液于2mL离心管中，加入150mg无水硫酸镁和10mg多壁碳纳米管，立即以2500r/min涡旋2min，8000r/min离心3min；上清液经0.22μm有机相滤膜过滤后进行GC-MS/MS分析；GC-MS/MS分析条件参考实例2。
按照上述操作进行日内5次平行和日间5次平行试验，计算测定结果的日内精密度和日间精密度，如表4所示，日内精密度和日间的精密度分别为0.1～21.6％、0.7～30.5％，其中330个目标物的日内精密度在10％以下，317个目标物的日间精密度在10％以下。结果表明，该方法具有良好的精密度，稳定性较好，可满足分析检测需要。
表4 345种目标物的日内精密度和日间精密度
Figure BDA0002104365630000241
Figure BDA0002104365630000251
Figure BDA0002104365630000261
Figure BDA0002104365630000271
Figure BDA0002104365630000281
Figure BDA0002104365630000291
实例4：
用实例2的方法检测了15个不同风格的卷烟样品，其中，清香风格、苔香风格、焦甜风格卷烟各5个。共检出240种目标物，以P值小于0.01为标准，采用t检验筛选出33种具有显著性差异的成分(表5)。33种差异成分涵盖醛、酮、醇、酚、醚、酯、内酯、烯、吡啶、吡咯、吡嗪、酰胺。将差异成分进行偏最小二乘法判别分析，不同风格的卷烟在PLS-DA图上(见图2)呈现显著性差异，表明筛选出的指标能够较好的区分不同风格的卷烟样品。
表5 33种差异化合物的P值
序号 差异化合物 P值 序号 差异化合物 P值
1 异丁香酚甲醚 0.000 18 丁香酚 0.002
2 2,3-二甲基吡嗪 0.000 19 十一醛 0.002
3 2,3-二甲基-5-乙基吡嗪 0.000 20 正戊醇 0.003
4 糠醛 0.000 21 2-丙酰基吡咯 0.003
5 2-乙酰吡啶 0.000 22 异戊酸异戊酯 0.003
6 苯丙酮 0.000 23 2-乙酰吡咯 0.003
7 二苯醚 0.000 24 5-羟基-3-甲基-2-戊烯酸内酯 0.003
8 4-羟基-2-甲基-2-丁烯酸内酯 0.000 25 d-柠檬烯 0.004
9 3-糠醛 0.000 26 麝香酮 0.005
10 2-苯基-2-丁烯醛 0.000 27 藏红花醛 0.006
11 甲酸茴香酯 0.001 28 异戊醇 0.006
12 戊基肉桂醛 0.001 29 α-当归内酯 0.007
13 乙酸丁酯 0.001 30 3,4-二甲酚 0.007
14 糠基甲硫醚 0.001 31 n-(3-甲基丁基)乙酰胺 0.008
15 四甲基吡嗪 0.001 32 乙酰吡嗪 0.008
16 三甲基吡嗪 0.001 33 3-甲基-2,5-呋喃二酮 0.010
17 苯乙醇 0.001

Claims (7)

1.一种定量测定烟草中超多靶标香味成分的分析方法，其特征在于：烟草样品用磷酸盐缓冲液浸泡、提取溶剂提取后，以多壁碳纳米管作为逆固相分散吸附剂，通过涡旋、离心对样品进行净化，结合气相色谱-串联质谱联用技术实现对烟草中345种香味成分的同时检测，具体步骤如下：
(1)样品制备：烟叶样品30℃烘干、粉碎、低温避光保存；
(2)样品提取：将样品用磷酸盐缓冲液调节pH值至3，加入提取溶剂及内标工作液，涡旋，冷冻，取出后再加无水硫酸镁、氯化钠并迅速剧烈摇晃，涡旋、离心；所述的提取溶剂为乙腈或二氯甲烷，所述内标为d8-苯乙酮；
(3)样品净化：取步骤2)最后离心的有机相，加入无水硫酸镁和多壁碳纳米管，涡旋、离心，上清液过滤后待测；
(4)样品检测：将样品进行气相色谱-串联质谱检测，采用基质匹配标准工作溶液制作标准曲线，用标准曲线定量；
GC-MS/MS分析条件：色谱柱：弹性石英毛细管色谱柱，固定相为50％苯基-甲基聚硅氧烷，规格60m×0.25mm×0.25μm，进样口端串联5m×0.25mm预柱；进样口温度：280℃；进样量：0.8～1.0μL；进样方式：不分流进样，不分流时间1min；载气：氦气，恒流模式，流速1.5mL/min；程序升温过程如下：初始温度75℃，保持5min后以1℃/min升至150℃，保持1min，然后以2℃/min升至260℃，保持1min，最后以10℃/min升至280℃，保持10min；电离模式：电子轰击电离，电离能70eV；灯丝电流：35μA；离子源温度：280℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：280℃；Q2碰撞气：氮气，纯度99.999％，流量1.5mL/min；淬灭气：氦气，纯度为99.999％，流量2.25mL/min；扫描方式：多反应监测MRM模式；
所述的GC-MS/MS分析条件中的MRM参数包括保留时间的确定，母离子、子离子和碰撞能量的选择优化；首先将各化合物进行全扫描分析，扫描范围m/z 20～330，确定保留时间及一级质谱图，并筛选2～4个质荷比及丰度较大的离子作为备选母离子；再将上述各母离子在不同的碰撞能量下进行产物离子扫描，每个化合物筛选出4～8对离子对及最优碰撞能量；最后，用MRM模式对标准溶液、基质提取液、添加标准品的基质提取液进行分析，选择抗干扰能力强、灵敏度高的两对离子对分别作为定量及定性离子对；GC-MS/MS分析条件中的MRM参数如下表所示：
Figure FDA0003226326540000011
Figure FDA0003226326540000021
Figure FDA0003226326540000031
Figure FDA0003226326540000041
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Figure FDA0003226326540000061
Figure FDA0003226326540000071
Figure FDA0003226326540000081
Figure FDA0003226326540000091
Figure FDA0003226326540000101
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液的配制方法为分别称取0.28g磷酸、1.0g磷酸二氢钠，加入10mL超纯水，超声、搅拌至溶解。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的提取溶剂为乙腈。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的内标工作液为d8-苯乙酮配成浓度为30mg/L的d8-苯乙酮乙腈溶液，每个样品的内标加入量为80μL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的多壁碳纳米管为：外径10～20nm，长度10～20μm，比表面积>165m2/g，纯度>95％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的基质匹配标准工作溶液的配制方法如下：将烟草样品按照相同的前处理方式处理后作为基质提取液，但提取时不添加内标，用该基质提取液稀释标准工作溶液，加入的待稀释溶剂标准工作溶液的体积不超过总体积的5％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的标准曲线定量是选择标准加入法、内标法建立标准工作曲线，根据检测结果及各目标物的标准曲线计算相应成分的含量。
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