CN111534481A - 一种提高鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程为iPS细胞效率的方法 - Google Patents

一种提高鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程为iPS细胞效率的方法 Download PDF

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Abstract

一种提高鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程为鸡iPS细胞效率的方法，属于生物技术领域。前期研究发现通过OSNL体系可将鸡CEF诱导重编程为iPS，但效率较低，在此基础上，研究体细胞诱导重编程过程中糖酵解代谢发挥的作用并对诱导体系进行进一步的优化。本发明操作简单，切实可行，应用广泛。由于鸡诱导多能干细胞具有发育的全能性，在适当条件下可被诱导分化为多种细胞组织，因此可作为一种新的干细胞来源，也为珍稀动物的保种、转基因动物的生产等研究开辟了新思路。本发明将小分子化合物和细胞代谢联系在一起，将为禽类体细胞诱导重编程研究提供了更多的理论基础和技术支撑，也有利于为家禽细胞和胚胎工程研究提供更多的实验材料。

Description

一种提高鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程为iPS细胞效率的 方法
技术领域
本发明涉及一种提高鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程为鸡iPS细胞效率的方法，属于生物技术领域。
背景技术
2006年Yamanaka首次将OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC (OSKM) 四个转录因子通过逆转录病毒载体导入小鼠成纤维细胞，获得了与胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）类似的多能干细胞，称之为诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS)，具有发育的全能性，在适当条件下可被诱导分化为多种细胞组织。诱导体细胞重编程技术的诞生, 不仅给人们带来了新的干细胞来源, 也为珍稀动物的保种、转基因动物的生产等研究开辟了新思路。
在小鼠、人等多个物种中iPS的诱导技术已相当成熟，但家禽体细胞诱导重编程研究进程仍较为缓慢。直至2012 年，Lu 等利用NANOG、OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC 和 LIN28（OSKMNL）慢病毒过表达载体才首次将非哺乳动物鹌鹑的体细胞重编程为 iPS。
申请人前期研究发现，通过OCT4、SOX2、NANOG、LIN28（OSNL）体系可将鸡CEF诱导重编程为iPS，但效率较低。尽管目前已能够通过体细胞诱导重编程技术产生鸡iPS，但是由于诱导体系仍不稳定、诱导效率较低且重编程机制尚不明确等原因，限制了鸡iPS的广泛应用。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种提高鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程为鸡iPS细胞效率的方法。
本发明的技术方案如下：
前期研究发现通过OSNL体系可将鸡CEF诱导重编程为iPS，但效率较低，在此基础上，研究体细胞诱导重编程过程中糖酵解代谢发挥的作用并对诱导体系进行进一步的优化。
为研究诱导重编程过程中糖酵解代谢如何变化，首先通过qRT-PCR检测糖酵解相关基因表达变化，利用葡萄糖摄取和乳酸产生量检测糖酵解水平的变化。再通过双荧光素酶***研究外源转录因子OSNL是否影响糖酵解相关基因的表达，同时通过在DF1/ESCs中激活/抑制糖酵解来研究糖酵解是否能够影响核心多能基因的表达。
通过前期的研究来确定糖酵解在鸡体细胞诱导重编程过程中的作用，并在此研究基础上筛选合适的糖酵解激活剂或抑制剂，将其添加到OSNL诱导重编程体系中，观察iPS克隆形成数，同时通过流式检测iPS的诱导效率。
本发明的有益效果如下：
本发明操作简单，切实可行，应用广泛。由于鸡诱导多能干细胞具有发育的全能性，在适当条件下可被诱导分化为多种细胞组织，因此可作为一种新的干细胞来源，也为珍稀动物的保种、转基因动物的生产等研究开辟了新思路。
此外，鸡是非哺乳动物中研究遗传学最重要的模式生物之一。因此本发明的实验方法不仅在家禽上研究体细胞诱导重编程中可行，在脊椎动物的其他研究领域也可应用。本发明将小分子化合物和细胞代谢联系在一起，将为禽类体细胞诱导重编程研究提供了更多的理论基础和技术支撑，也有利于为家禽细胞和胚胎工程研究提供更多的实验材料。
具体实施方式
鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程过程中糖酵解变化研究
为了将鸡CEF重编程为iPS，选择OCT4/SOX2/NANOG/LIN28四因子组合构成OSNL体系对鸡CEF进行诱导重编程。诱导过程中投稿qRT-PCR检测内源多能性基因Oct4，Sox2，Nanog，Lin28及体细胞标记基因Thy-1的表达。对诱导产生的iPS进行SSEA-1免疫荧光染色和碱性磷酸酶染色鉴定。
为检测鸡体细胞诱导重编程过程中糖酵解水平的变化，通过qRT-PCR检测糖酵解相关基因Hk1, Pkm2, Pfkp, Ldha，Glut1的mRNA的表达，同时对重编程过程中葡萄糖摄取和乳酸产生量进行检测。
鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程过程中糖酵解功能研究
为了研究外源转录因子是否能够调控糖酵解，利用生物信息学预测发现，转录因子OCT4，SOX2，NANOG在糖酵解关键基因Hk1、Pfkp、Ldha的启动子区有共同的结合位点，并进一步通过双荧光素酶实验检测转录因子OCT4，SOX2，NANOG对糖酵解关键基因Hk1、Pfkp和Ldha等基因的转录活性的调控作用。
为了研究糖酵解是否能够通过影响核心多能性因子的表达来调控重编程，首先在DF1/ESCs细胞中分别添加糖酵解激活剂DASA-58/抑制剂VK3，处理后0h,1h,2h,3h检测多能性基因的瞬时表达变化。为了进一步研究糖酵解对鸡iPS诱导的作用，在鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程体系中添加抑制剂VK3，检测葡萄糖摄取和乳酸产生量，并通过流式检测iPS的诱导效率。
添加糖酵解激活剂“2i”优化鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程体系
前期的研究表明糖酵解在鸡体细胞诱导重编程过程中起正向的调控作用，在此研究基础上筛选到合适的小分子化合物“糖酵解激活剂”——2i（PD0325901,MEK/ERK inhibitor和SB431542,TGF-β inhibitor）。
为了研究2i是否能够激活糖酵解，首先在DF1细胞中添加2i进行培养，分别在处理后0，12，24，48h收集细胞，qRT-PCR检测Hk1，Ldha，Pkm2等糖酵解相关基因的表达。为了研究2i是否能在鸡体细胞诱导重编程过程中发挥作用，在OSNL体系中添加2i对CEF进行诱导，qRT-PCR检测糖酵解相关基因的表达变化，检测葡萄糖摄取量和乳酸产生量，观察鸡iPS克隆形成数，同时通过流式检测鸡iPS细胞的诱导效率。

Claims (3)

1.一种提高鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程为iPS细胞效率的方法，其特征是，通过OSNL体系可将鸡CEF诱导重编程为iPS，筛选合适的糖酵解激活剂，将其添加到OSNL诱导重编程体系中，观察iPS克隆形成数，同时通过流式检测iPS的诱导效率。
2.根据权利要求1所述的一种提高鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程为iPS细胞效率的方法，其特征是，在筛选合适的糖酵解激活剂或抑制剂前，对糖酵解在鸡体细胞诱导重编程过程中的作用进行研究：
首先通过qRT-PCR检测糖酵解相关基因表达变化，利用葡萄糖摄取和乳酸产生量检测糖酵解水平的变化；再通过双荧光素酶***研究外源转录因子OSNL是否影响糖酵解相关基因的表达，同时通过在DF1/ESCs中激活/抑制糖酵解来研究糖酵解是否能够影响核心多能基因的表达。
3.根据权利要求1所述的一种提高鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程为iPS细胞效率的方法，其特征是，筛选到的糖酵解激活剂为2i ，即PD0325901和SB431542。
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