CN104946581A - 一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基及方法，该专用培养基成分包括bFGF、activin A、Y27632、Knockout SR和β-巯基乙醇 。培养方法是将干细胞培养器皿预先用细胞外基质包被；然后将猪囊胚用蛋白酶消化去除透明带，转入干细胞培养器皿中，添加本发明的专用培养基；培养至形成总细胞数为1000~2000个的滋养层干细胞克隆团时，消化成单细胞，转入新的经细胞外基质包被的培养器皿进行细胞的传代培养。本发明的专用培养基成分确定，使用安全性高，避免异源细胞的污染。培养方法简单高效，对猪滋养层干细胞培养具有克隆形成率高、细胞凋亡率低、增殖传代能力强和安全稳定的优点。

Description

一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基及方法

技术领域

本发明属于干细胞技术研究领域，具体涉及一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基及方法。

背景技术

干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。医学界称其为“万用细胞”。

动物胚胎早期发育至囊胚时出现第一次细胞分化，形成两种特征和功能各异的内细胞团和滋养层。滋养层干细胞是胎盘组织细胞的祖细胞，逐步分化为滋养层前体细胞、绒毛膜滋养层、合胞体滋养层和多核巨细胞等。胚胎发育早期的表观重编程过程中DNMTs、TETs、HDACs等相关酶共同作用维持滋养层细胞基因组整体低甲基化水平和绒毛膜滋养层的染色质凝聚，参与调节滋养层的分化、迁移和侵入子宫内膜的能力（Logan et al., 2013）。为了揭示滋养层分化发育中如此复杂的分子机制，从早期胚胎分离纯化滋养层干细胞，建立其体外培养的模型是很有必要的。最早从小鼠囊胚滋养外胚层成功分离得到滋养层干细胞，它们在添加碱性成纤维细胞生长因子bFGF和人白血病抑制因子hLIF的环境下能维持自我更新，注射入小鼠囊胚后能嵌合入小鼠胎盘的各个部位，而并不存在于小鼠胎儿的各胚层中（Tanaka et al., 1998; Takahashi and Yamanaka., 2006; Rielland et al., 2008）。其他一些动物的滋养层细胞系也已经建立，包括牛、羊和猪等，这些细胞能进行连续传代培养，表现上皮细胞的特征。然而，有蹄类大动物的滋养层干细胞的细胞增殖和更新相关的关键信号通路与小鼠存在诸多未知差异，这一经典的小鼠滋养层干细胞的培养体系并不适用于家畜和灵长类等大动物的滋养层干细胞的分离培养。不同种类动物的干细胞分离培养所需的生长因子和调控通路存在较大的差异，目前国内外尚无猪的早期囊胚来源的滋养层干细胞成功建系和干细胞特性鉴定的报道。人和恒河猴等灵长类动物由于早期胚胎获取困难的因素，在摸索适宜的滋养层干细胞培养体系研究上将花费更长的时间。这与至今仍无真正意义上的家畜和灵长类的胚胎干细胞成功建系的情况相似。

滋养层干细胞已经在小鼠着床前期和着床后的胚胎中都能分离获得，然而，国内外尚无报道在猪、牛和羊等有蹄类动物中也能获得类似于小鼠中的这种能够增殖更新、具有多能性的滋养层干细胞。猪胎盘来源的滋养层细胞系已经建立，这些细胞能进行连续传代培养，表现上皮细胞的特征，表达分化标记核纤层蛋白A/C，但没有多能干细胞特征（Flechon et al., 1995; La Bonnardiere et al., 2002）。宋志强等（2013）运用小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层细胞，在基础培养液中添加成纤维细胞生长因子FGF4和人白血病抑制因子LIF，从第6天的孤雌囊胚中分离到猪滋养层干细胞样细胞。其试验中培养效率低，约为30个囊胚能获得1个细胞克隆团，在形态上体现了滋养层干细胞特征，但未能证明其干细胞特性，也就是说还没有获得真正的猪滋养层干细胞。李荣凤等（2013）发明了一种牛滋养层干细胞建系方法，是将牛囊胚接种于小鼠胎儿成纤维细胞和Wnt-3A小鼠皮下***细胞的饲养层中，在培养液中加入小分子抑制剂PD0325901和CHIR99021进行细胞的传代培养。该培养体系是经典的胚胎干细胞培养方法，由此获得的滋养层干细胞是由胚胎干细胞在特定条件下衍生转化而来的一类细胞，与滋养外胚层来源的干细胞可能存在一些本质和潜在特征的区别。

发明内容

为了克服现有技术中的上述问题，本发明提供了一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基。

本发明提供的培养猪滋养层干细胞的专用培养基，成分包括bFGF、activin A、Y27632、Knockout SR和β-巯基乙醇。以上成分均已经商品化，可以直接购买市售商品，例如其中bFGF、activin A、Knockout SR和β-巯基乙醇可购自Gibco品牌，Y27632可购自Sigma品牌。

bFGF：碱性成纤维细胞生长因子，是一种促细胞***的肝素结合蛋白，在胚胎发育和分化的多个生物学反应过程中激活FGF信号通路，是一种在细胞培养中应用广泛的生物活性蛋白。

activin A：激活素A，是细胞因子TGFβ超家族的成员，TGFβ超家族介导的信号通路在维持胚胎干细胞自我更新和特异的分化过程中发生了不同的生物学效应，具体细胞的命运主要依赖细胞接受信号的阶段，以及细胞因子的水平和与其他细胞因子的相互作用。bFGF和activin A 单独长期作用都会诱导干细胞分化，而它们共同作用时却能够维持干细胞的多能性，暗示了它们之间存在着相互调控的机制。

Y27632：化学式C₁₄H₂₁N₃O，是一种Rho蛋白激酶（ROCK）特异性抑制剂，结构式如下：

已有研究表明Y27632 能够引起人胚胎干细胞形态发生改变，由质地紧密的细胞集落变得松散扁平，将Y27632 应用于人胚胎干细胞传代，能够显著提高传代效率。在胚胎干细胞特性维持方面，ROCK抑制剂的作用特点还没有定论，但是在本发明中，通过对猪滋养层干细胞进行形态学观察评定和干细胞标记基因表达水平检测，证明Y27632 不会对干细胞的多能性维持产生不利影响，而能抑制细胞传代过程中出现的凋亡效应，说明它可以安全地用于猪滋养层干细胞的培养。

Knockout SR：Knockout血清替代物，是成分确定的无血清制剂，用于替代胎牛血清，促进未分化多能干细胞生长。传统的胚胎干细胞培养基配方大多需要胎牛血清，血清中含有许多未知的成分和一些诱导细胞分化的因子，且会造成异种血清蛋白的污染问题。因此为了解决这个问题，科学家们提出了无血清培养体系，研发出Knockout SR可以有效维持胚胎干细胞未分化的状态，维持干细胞增殖。

β-巯基乙醇：β-巯基乙醇能诱导细胞增殖，促进DNA合成，同时能避免过氧化物对体外培养细胞的损害，阻碍多能性干细胞的分化趋势。常用于培养胚胎干细胞、诱导多功能干细胞和神经干细胞等。

实验发现bFGF、activin A、Y27632、Knockout SR和β-巯基乙醇的组合能有效维持猪滋养层干细胞的迅速增殖和更新。其中在培养体系中撤掉bFGF、activin A或Knockout SR导致细胞增殖速度显著降低，不添加Y27632则导致细胞在传代后大部分出现凋亡现象，只有约30%的细胞能继续生长。而不添加β-巯基乙醇后干细胞克隆边缘变松散，细胞趋向分化状态。

优选地，上述培养猪滋养层干细胞的专用培养基中，bFGF的浓度为12.5~50ng/mL，activin A的浓度为5~20ng/mL，Y27632 的浓度为 2~10nmol/mL，Knockout SR的体积浓度为2%~5%，β-巯基乙醇的浓度为20~55 nmol/mL。该范围浓度的bFGF、activin A、Y27632、Knockout SR和β-巯基乙醇，能够更加有效地维持干细胞的多能性和增殖更新。

优选地，上述培养猪滋养层干细胞的专用培养基中，还包括DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、N-2 supplement、B-27 supplement、MEM NEAA和L-谷氨酰胺。以上成分均已经商品化，可以直接购买，例如这些成分均可以购自Gibco品牌。

DMEM/F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞的培养。

Neurobasal培养基是用于满足出生前和胎儿神经元细胞特殊需要的基础培养基，适用于神经细胞等上皮类细胞的生长。

N-2 supplement是化学成分确定的，不含血清的添加剂，主要用于Neurobasal培养基。B-27 supplement是无血清添加剂，可以与Neurobasal培养基组合使用。在本发明的培养体系中N-2 supplement和B-27 supplement搭配使用能促进滋养层类上皮细胞贴壁生长。

MEM NEAA包含了甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸。这7种细胞培养所需的非必需氨基酸能有效改善细胞培养基配比，降低细胞培养时细胞自身生产非必需氨基酸的副作用。L-谷氨酰胺是细胞生长的必需氨基酸，脱掉氨基后，为培养的细胞提供重要的能量来源，并参与蛋白质的合成和核酸代谢。在本发明的培养体系中添加MEM NEAA和L-谷氨酰胺有利于维持细胞体外长期培养。

优选地，上述培养猪滋养层干细胞的专用培养基中，以DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基按照1:1的体积比混合作为基础培养液；每20mL基础培养液中，加入N-2 supplement 50~200μL、B-27 supplement 100~400μL、MEM NEAA50~200μL、L-谷氨酰胺100~200μL。

本发明还提供了一种培养猪滋养层干细胞的方法，包括以下步骤：

（1）干细胞培养器皿预先用细胞外基质包被；

（2）猪囊胚用蛋白酶消化去除透明带，转入步骤（1）经细胞外基质包被的干细胞培养器皿，使用以上任一所述的培养猪滋养层干细胞的专用培养基进行培养；

（3）培养至形成总细胞数为1000~2000个的克隆团时，消化成单细胞，转入新的步骤（1）经细胞外基质包被的培养器皿进行细胞的传代培养。

优选地，上述培养猪滋养层干细胞的方法中，所述囊胚为人工授精来源的囊胚、体细胞核移植来源的囊胚、体外受精来源的囊胚或孤雌囊胚。

优选地，上述培养猪滋养层干细胞的方法中，步骤（1）中的细胞外基质为大鼠I型胶原、基质胶Matrigel或纤连蛋白。以上成分均已商品化，可以直接购买，例如这些成分均可以购自Gibco品牌。

大鼠I型胶原是常见的纤维胶原蛋白，它存在于皮肤、骨骼、肌腱以及其他***中，Gibco品牌的大鼠I型胶原可灵活地进行稀释，通过凝胶化步骤生成硬化的明胶。

Gibco品牌的基质胶Matrigel是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取的基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。在室温条件下，Matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质。

纤连蛋白是一种细胞外糖蛋白，分别以可溶形式存在于体液中，或以不可溶形式存在于细胞外基质中。它能与细胞纤维、蛋白多糖相互连接，起粘合作用。

本发明中实验验证使用大鼠I型胶原、基质胶Matrigel或纤连蛋白包被过的培养器皿，能大大增加细胞培养器皿底部的粘附性，促使猪囊胚贴壁，分离出滋养层干细胞，并促进细胞***增殖时与培养皿的附着，保持细胞克隆团贴壁生长。

优选地，上述培养猪滋养层干细胞的方法中，步骤（2）中的蛋白酶为链酶蛋白酶；囊胚在消化前先用猪胚胎培养液PZM-3清洗，再转入培养猪滋养层干细胞的专用培养基中清洗；进行培养的环境温度39℃、CO₂体积浓度5%以及饱和湿度。

优选地，上述培养猪滋养层干细胞的方法中，步骤（3）中传代培养的方法为：用DPBS漂洗后，加适量TRYPLE select胰蛋白酶替代酶（Gibco品牌）消化为单细胞后，加猪滋养层干细胞的专用培养基培养液终止消化，吹打细胞悬浮，收集离心后，用培养猪滋养层干细胞的专用培养基稀释，以1:3的比例传代至用细胞外基质包被的干细胞培养器皿中。

本发明还提供上述培养猪滋养层干细胞的方法培养获得的猪滋养层干细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

传统干细胞培养实验方法中的使用饲养层细胞能分泌某些关键的生长因子，促进全能性细胞的增殖，以及去除体外培养环境中的毒素和抑制其分化。但是，大量未知成分对干细胞鉴定的干扰和存在异源细胞污染的问题都会影响研究人员对干细胞培养体系的研究，所以建立滋养层干细胞的无饲养层培养体系是比有饲养层体系更具优势的。

本发明首次成功开发出家畜类大动物滋养层干细胞的无饲养层培养体系，通过筛选到明确化学成分的生长因子组合培养液代替传统的异源饲养层细胞支持。该专用培养基成分确定，使用安全性高，避免异源细胞的污染，对于研究该类干细胞的生物学机制，以及胚胎早期发育和胎盘分化具有重要意义，并将进一步推进滋养层干细胞在体细胞克隆和大动物转基因研究上的应用。

本发明提供的培养猪滋养层干细胞的方法简单高效，对猪滋养层干细胞培养具有克隆形成率高、细胞凋亡率低、增殖传代能力强和安全稳定的优点。其中人工授精来源囊胚能形成干细胞克隆的效率为38.79%，体细胞核移植来源囊胚能形成干细胞克隆的效率为6.34%（统计结果如表1所示），并且能长期稳定的保持干细胞特性。

附图说明

图1 是猪囊胚的形态（A：人工授精来源的囊胚，B：体细胞核移植来源的囊胚）。

图2 是链酶蛋白酶消化胚胎透明带后的猪囊胚的形态（A：人工授精来源的囊胚，B：体细胞核移植来源的囊胚） 。

图3 是猪囊胚接种于滋养层干细胞专用的培养基中，并贴壁生长的形态（A：接种后第二天的人工授精来源囊胚，B：接种后第二天的体细胞核移植来源囊胚，C：接种后第三天的人工授精来源囊胚贴壁生长，D：接种后第三天的体细胞核移植来源囊胚贴壁生长）。

图4 是F0代和F3代的猪滋养层干细胞的生长形态（A：F0代人工授精来源囊胚分离的猪滋养层干细胞，B：F3代人工授精来源囊胚分离的猪滋养层干细胞，C：F0代体细胞核移植来源囊胚分离的猪滋养层干细胞，D：F3代体细胞核移植来源囊胚分离的猪滋养层干细胞。

图5 是琼脂糖凝胶电泳检测猪滋养层干细胞的相关标志基因的表达情况。AI-TSCs-cDNA为人工授精来源囊胚分离的猪滋养层干细胞cDNA，SCNT-TSCs-cDNA为体细胞核移植来源囊胚分离的猪滋养层干细胞cDNA，Trophoblasts-cDNA为已分化的滋养层细胞系cDNA，Fibroblasts-cDNA为胎儿成纤维细胞系的cDNA。

图6 是细胞免疫荧光染色检测猪滋养层干细胞特异性表达基因 CDX2和Eomes（A列为白光下细胞形态，B列为紫外激发光下显示hoest33342对细胞核染色，C列为用CDX2或Eomes抗体孵育并加入荧光二抗结合后显色，D列为B和C列重叠后的效果图。右侧AI-TSCs表示人工授精来源囊胚分离的猪滋养层干细胞，SCNT-TSCs表示体细胞核移植来源囊胚分离的猪滋养层干细胞。

图7 是猪滋养层干细胞诱导分化后的细胞形态（A：人工授精来源囊胚分离的滋养层干细胞分化后形成多核巨细胞，B：人工授精来源囊胚分离的滋养层干细胞分化后形成滋养层细胞，C：体细胞核移植来源囊胚分离的滋养层干细胞分化后形成多核巨细胞，D：体细胞核移植来源囊胚分离的滋养层干细胞分化后形成滋养层细胞。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明，但不用来限制本发明的实施范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例一：人工授精（Artificial Fertilizing, AI）来源囊胚的猪滋养层干细胞分离培养和鉴定

1. AI来源囊胚的猪滋养层干细胞的培养体系的建立

1.1 囊胚的获取方法：

采用AI的方法对普通发情母猪进行配种，在配种后采用离体冲胚的方法收集囊胚。具体操作为：选用高胎龄的母猪于配种后的第六天或第七天屠宰，取出子宫，用止血钳固定子宫角前端，从输卵管伞部注入冲卵液（DPBS+PVA），用导管在子宫角位置收集，用冲卵液过滤清洗，在体视显微镜下观察收集囊胚，39℃恒温运输至实验室（人工授精来源囊胚形态如图1A）。

1.2 配制猪滋养层干细胞的专用培养基：

以DMEM/F12和Neurobasal培养基按照1:1的体积比混合作为基础培养液；

每20mL基础培养液中，加入N-2 supplement 50~200μL、B-27 supplement 100~400μL、MEM NEAA 50~200μL、L-谷氨酰胺100~200μL 。以及浓度为12.5~50ng/mL bFGF，5~20ng/mL activin A，2~10nmol/mL Y27632 ，20~55nmol/mL β-巯基乙醇和体积浓度为2%~5%的Knockout SR。

1.3 原代滋养层干细胞的分离和培养方法

1.3.1 细胞外基质包被细胞培养器皿

可从以下A，B和C三种方法中选择其中任意一种，作用效果相似。

A：大鼠I型胶原包被培养皿：具体实验步骤为用0.02摩尔乙酸稀释大鼠I 型胶原至50~200μg/mL，然后按5~20μg/cm²加至普通培养皿（Corning品牌），在室温下孵育1小时后小心吸弃，用DPBS清洗三遍，晾干备用。

B：基质胶Matrigel包被培养皿：具体实验步骤为用DMEM/F12把Matrigel的浓度稀释至50~200μg/mL，然后按5~20μg/cm²加至普通培养皿（Corning品牌），在37℃下孵育1小时后小心吸弃，晾干备用。

C：纤连蛋白包被培养皿：具体实验步骤为用DMEM/F12把纤连蛋白稀释至50~200μg/mL，然后按5~20μg/cm²加至普通培养皿（Corning品牌），在室温下孵育1小时后小心吸弃，晾干备用。

1.3.2 接种囊胚和原代干细胞克隆形成：发育至第六天或第七天的猪囊胚用胚胎培养液PZM-3清洗两遍，再用链酶蛋白酶消化去除透明带（去除胚胎透明带后的胚胎形态如图2A），转入干细胞培养基中清洗两遍，然后将透明带完全裂解消失的囊胚吸入本发明专用培养基中。转入39℃，5%CO₂和饱和湿度环境的培养箱中培养（第二天观察接种后的囊胚形态如图3A），第三天观察囊胚的贴壁和细胞克隆生长形态（干细胞贴壁形成克隆形态如图3C）。人工授精来源囊胚分离滋养层干细胞系的最终效率为38.79%，具体实验数据如下表1。

表1

1.4 猪滋养层干细胞的传代和冻存方法

所用传代方法为酶消化法，即在干细胞克隆团密集，细胞出现接触抑制时，用DPBS漂洗两次，加适量TRYPLE select胰蛋白酶替代酶（Gibco品牌)消化为单细胞，加猪滋养层干细胞专用培养基终止消化，用移液枪头吹打细胞悬浮，收集离心后，以1:3的比例传代至新的细胞外基质包被过的培养皿中（F0代和F3代干细胞形态分别如图4A和图4B)。猪滋养层干细胞的冻存方法为消化细胞，离心后，加入商品化的冻存培养基（Gibco品牌），用移液枪头吹打细胞悬浮均匀，转移至冻存管中（corning品牌），放置在4℃中保存30分钟，之后在负20℃中保存30分钟，之后在负80℃中保存16-48小时，之后转移入液氮中长期保存。

2. 猪滋养层干细胞的标志基因表达鉴定

2.1 RT-PCR技术检测基因表达情况

检测包括滋养层干细胞特异表达基因Eomes、Cdx2和Tead4；多能性基因Oct4、Nanog和Sox2；滋养层特异表达基因Cyp17a1、Plet、 Krt8和 Hand1；成纤维细胞生长因子受体2基因Fgfr2，X染色体失活相关基因Xist；以及内参基因Gapdh。

具体实验步骤：步骤1培养的细胞消化后用PBS清洗，采用Qiagen公司的RNA抽提试剂盒提取RNA，用Fermentas公司的反转录试剂盒进行反转录为cDNA保存，针对猪的以上各个基因序列设计特异性引物进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测基因是否表达，实验中使用了已分化的滋养层细胞系和胎儿成纤维细胞系的cDNA扩增作为对照，结果表明人工授精来源的滋养层干细胞高表达Eomes、Cdx2、Tead4、Cyp17a1、Plet、 Krt8、Hand1和Fgfr2，弱表达Oct4、Nanog和Sox2（电泳检测干细胞基因表达情况如图5所示）。

检测所有基因表达所用的PCR引物序列如下表2：

表2

2.2细胞免疫荧光染色法检测滋养层干细胞特异性表达基因 CDX2和Eomes

本发明的专用培养基培养的F3代的猪滋养层干细胞在长至汇合度约80%时，用DPBS清洗两遍，加4%多聚甲醛固定5分钟，之后通过TritonX-100对细胞膜穿孔，然后加山羊血清封闭30分钟，再加1:200稀释后的CDX2或Eomes一抗孵育过夜，用DPBS清洗三遍以上，之后避光加1:1000稀释后的Alexa Fluor^® 568荧光标记二抗，显示红色荧光。之后DAPI核染色，封片，镜检，倒置荧光显微镜下拍照，结果显示CDX2蛋白在细胞质和细胞核中均大量表达，Eomes蛋白在细胞核中大量表达（CDX2和Eomes的表达情况如图6所示）。

3. 猪滋养层干细胞的多向分化功能鉴定

3.1实验中设计向多核巨细胞分化的诱导培养基为90%DMEM/F12和10%胎牛血清（Gibco品牌）。具体实验步骤为F3代滋养层干细胞培养24小时后撤掉干细胞培养液，用DPBS清洗两遍，更换为分化培养基继续培养。每隔两至三天换液。

实验中发现在分化培养基中培养三天以后，约5%的细胞已开始分化成为多核巨细胞，持续诱导分化15天后，约50%的细胞已分化成为典型的多核巨细胞（多核巨细胞形态如图7A所示）。

3.2 实验中设计向滋养层细胞系分化的诱导培养基为95%DMEM/F12、5%胎牛血清FBS和0.1Unit/mL 牛胰岛素。具体实验步骤为F3代滋养层干细胞培养24小时后撤掉干细胞培养液，用DPBS清洗两遍，更换为以上诱导培养基继续培养。每隔两至三天换液。实验中发现在诱导培养基中培养一个星期以后，细胞克隆松散，生长速度缓慢，片状生长，呈扁平的上皮细胞特征（分化后的滋养层细胞形态如图7 B 所示）。

实施例二：体细胞核移植（Somatic cell nuclear transfer, SCNT）囊胚来源的猪滋养层干细胞分离培养和鉴定

1. SCNT囊胚来源分离的猪滋养层干细胞的培养体系的建立

1.1 SCNT囊胚的获取：采用显微操作仪进行猪成纤维细胞核移植获得克隆胚胎，猪***的获得和成熟培养，供核成纤维细胞的培养，***的去核和注核，***和体细胞的融合及激活均按照已有文献标准操作（Li et al., 2013，PMID：24033142）胚胎培养液PZM-3培养重构胚至第六天或第七天，收集囊胚。与AI来源囊胚相比较，它的体积较小，囊胚内总细胞数目较少，胚胎质量较差（SCNT囊胚形态如图1B）。

1.2 SCNT来源囊胚的猪滋养层干细胞的培养体系的其余建立方法与实施例一中所述的AI来源囊胚的猪滋养层干细胞的培养体系的建立方法一致，SCNT囊胚分离滋养层干细胞系的最终效率为6.34%。（去除胚胎透明带后的胚胎形态如图2B，第二天观察接种后的囊胚形态如图3B，SCNT来源的干细胞贴壁形成克隆形态如图3D，F0代和F3代SCNT来源的干细胞形态分别如图4C和图4 D，SCNT囊胚分离滋养层干细胞系的效率的具体实验数据如表1）。

2. SCNT来源的滋养层干细胞的相关标志基因鉴定

2.1 SCNT来源的滋养层干细胞的相关标志基因鉴定方法与实施例一中所述方法一致（SCNT来源干细胞的基因表达情况如图5所示）。

2.2 细胞免疫荧光染色法检测滋养层干细胞特异性表达基因 CDX2和Eomes：基本方法与实施例一中一致，更改所采用的二抗为Alexa Fluor 488标记的荧光抗体，显示绿色荧光（CDX2和Eomes的表达情况如图6所示）。

3. SCNT来源的滋养层干细胞的多向分化功能鉴定方法与实施例一中所述一致（SCNT来源滋养层干细胞分化后的多核巨细胞形态如图7C所示，分化后的滋养层细胞形态如图7D所示）。

本发明在国内外属首次成功开发出家畜类大动物滋养层干细胞的无饲养层细胞的培养体系，通过筛选到明确化学成分的生长因子组合培养液代替传统的异源饲养层支持，避免异源细胞的污染，对于研究该类干细胞的生物学机制，以及胚胎早期发育和胎盘分化具有重要意义，并将进一步推进滋养层干细胞在体细胞克隆和大动物转基因研究上的应用。

Claims (10)

1.一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基，其特征在于，成分包括bFGF、activin A、Y27632、Knockout SR和β-巯基乙醇。

2.根据权利要求1所述的培养猪滋养层干细胞的专用培养基，其特征在于， bFGF的浓度为12.5~50ng/mL，activin A的浓度为5~20ng/mL，Y27632 的浓度为 2~10nmol/mL，Knockout SR的体积浓度为2%~5%，β-巯基乙醇的浓度为20~55 nmol/mL。

3.根据权利要求1或2所述的培养猪滋养层干细胞的专用培养基，其特征在于，还包括DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、N-2 supplement、B-27 supplement、MEM NEAA和L-谷氨酰胺。

4.根据权利要求3所述的培养猪滋养层干细胞的专用培养基，其特征在于，

以DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基按照1:1的体积比混合作为基础培养液；

每20mL基础培养液中，加入N-2 supplement 50~200μL、B-27 supplement 100~400μL、MEM NEAA 50~200μL、L-谷氨酰胺100~200μL。

5.一种培养猪滋养层干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）干细胞培养器皿预先用细胞外基质包被；

（2）猪囊胚用蛋白酶消化去除透明带，转入步骤（1）经细胞外基质包被的干细胞培养器皿，使用权利要求1~4任一所述的培养猪滋养层干细胞的专用培养基进行培养；

（3）培养至形成总细胞数为1000~2000个的克隆团时，消化成单细胞，转入新的步骤（1）经细胞外基质包被的培养器皿进行细胞的传代培养。

6.根据权利要求5所述的培养猪滋养层干细胞的方法，其特征在于，所述囊胚为人工授精来源的囊胚、体细胞核移植来源的囊胚、体外受精来源的囊胚或孤雌囊胚。

7.根据权利要求5所述的培养猪滋养层干细胞的方法，其特征在于，步骤（1）中的细胞外基质为大鼠I型胶原、基质胶Matrigel或纤连蛋白。

8.根据权利要求5所述的培养猪滋养层干细胞的方法，其特征在于，步骤（2）中的蛋白酶为链酶蛋白酶；囊胚在消化前先用猪胚胎培养液PZM-3清洗，再转入培养猪滋养层干细胞的专用培养基中清洗；进行培养的环境温度39℃、CO₂体积浓度5%以及饱和湿度。

9.根据权利要求5所述的培养猪滋养层干细胞的方法，其特征在于，步骤（3）中传代培养的方法为：用DPBS漂洗，加适量TRYPLE select胰蛋白酶替代酶消化为单细胞后，加猪滋养层干细胞的专用培养基终止消化，吹打细胞悬浮，收集离心后，用培养猪滋养层干细胞的专用培养基稀释，以1:3的比例传代至用细胞外基质包被的干细胞培养器皿中。

10.权利要求5~9所述的培养猪滋养层干细胞的方法培养获得的猪滋养层干细胞。