CN114606178B - 用于制备脑/神经类器官的培养基及其应用、脑/神经类器官及其制备方法 - Google Patents

用于制备脑/神经类器官的培养基及其应用、脑/神经类器官及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114606178B
CN114606178B CN202210321881.1A CN202210321881A CN114606178B CN 114606178 B CN114606178 B CN 114606178B CN 202210321881 A CN202210321881 A CN 202210321881A CN 114606178 B CN114606178 B CN 114606178B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nerve
brain
culture medium
induction
organoids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210321881.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114606178A (zh
Inventor
刘特
聂小丽
黄永毅
陈川
郁志华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI GERIATRIC INSTITUTE OF CHINESE MEDICINE
Original Assignee
SHANGHAI GERIATRIC INSTITUTE OF CHINESE MEDICINE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI GERIATRIC INSTITUTE OF CHINESE MEDICINE filed Critical SHANGHAI GERIATRIC INSTITUTE OF CHINESE MEDICINE
Priority to CN202210321881.1A priority Critical patent/CN114606178B/zh
Publication of CN114606178A publication Critical patent/CN114606178A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114606178B publication Critical patent/CN114606178B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C12N2501/91—Heparin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于类器官制备技术领域，具体涉及用于制备脑/神经类器官的培养基及其应用、脑/神经类器官及其制备方法。本发明提供的培养基可以对NE‑4C细胞诱导，制备脑/神经类器官，丰富了制备脑/神经类器官的种子细胞种类；NE‑4C细胞经本发明培养基诱导10～12d即可以分化出含有神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等的复合脑/神经类器官，缩短了脑/神经类器官的制备周期，提高了效率。

Description

用于制备脑/神经类器官的培养基及其应用、脑/神经类器官 及其制备方法
技术领域
本发明属于类器官制备技术领域，具体涉及用于制备脑/神经类器官的培养基及其应用、脑/神经类器官及其制备方法。
背景技术
类器官属于三维(3D)细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性。此类体外培养***包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关***。目前，脑/神经类器官，即类脑器官，主要由多能干细胞如，诱导多能分化干细胞(iPS)、胚胎干细胞(ES)通过体外的三维培养方法，在特定的试剂诱导下分化而来。但是，无论是iPS还是ES细胞，其对于培养环境和培养技术的要求非常高，且培养试剂昂贵，而且制备脑/神经类器官的周期较长，步骤较为繁琐，给脑/神经类器官的制备带来了一定的不便。
发明内容
本发明的目的提供用于制备脑/神经类器官的培养基及其应用、脑/神经类器官及其制备方法，缩短脑/神经类器官的制备周期，提高脑/神经类器官的制备效率。
本发明提供了一种用于制备脑/神经类器官的培养基，包括第一诱导培养基和第二诱导培养基；
所述第一诱导培养基包括DMEM、FBS、青霉素-链霉素混合液、L-谷氨酰胺、B27supplement、N2 supplement、ActivinA、bFGF、EGF、视黄酸、vEGF和抗坏血酸；
所述第二诱导培养基包括DMEM、FBS、青霉素-链霉素混合液、L-谷氨酰胺、B27supplement、N2 supplement、ActivinA、bFGF、EGF、vEGF、抗坏血酸、R3-IGF-1、皮质醇和肝素。
优选的，所述第一诱导培养基中各成分的浓度为：FBS 15％V/V、青霉素-链霉素混合液1％V/V、L-谷氨酰胺1％V/V、B27 supplement 2％V/V、N2supplement 1％V/V、ActivinA 10ng/mL、bFGF 10ng/mL、EGF 10ng/mL、视黄酸10ng/mL、vEGF 10ng/mL、抗坏血酸50ng/mL和余量的DMEM。
优选的，所述第二诱导培养基中各成分的浓度为：FBS 15％V/V、青霉素-链霉素混合液1％V/V、L-谷氨酰胺1％V/V、B27 supplement 2％V/V、N2supplement 1％V/V、ActivinA 10ng/mL、bFGF 10ng/mL、EGF 10ng/mL、vEGF10ng/mL、抗坏血酸50ng/mL、R3-IGF-110ng/mL、皮质醇10ng/mL、肝素10ng/mL和余量的DMEM。
本发明还提供了上述技术方案所述的培养基在制备脑/神经类器官中的应用。
本发明还提供了一种脑/神经类器官，利用上述技术方案所述的培养基诱导NE-4C细胞制备得到。
本发明还提供了一种脑/神经类器官的制备方法，包括如下步骤：
依次上述技术方案所述的第一诱导培养基和第二诱导培养基对NE-4C细胞进行第一诱导和第二诱导。
优选的，所述第一诱导的时间为2d；所述第二诱导的时间为6d。
优选的，所述第一诱导和第二诱导的条件均为37℃、5％CO2培养。
优选的，还包括所述NE-4C细胞的基础培养。
本发明提供了一种用于制备脑/神经类器官的培养基，添加了vEGF、抗坏血酸、R3-IGF-1、皮质醇和肝素等细胞因子，其中抗坏血酸有助于细胞存活和抗氧化应激作用；vEGF帮助诱导分化出血管；R3-IGF-1促进细胞糖代谢和能量代谢的转化，增强细胞的活力；肝素有助于增加bFGF的稳定性，使成其活性增强，促进神经干细胞分化和伪足的产生；皮质醇通过促进糖异生、减慢葡萄糖分解，提高蛋白质的分解代谢，增加培养基中氨基酸和氮的排放量，造成负氮平衡。利用本发明诱导分化细胞能够提高细胞分化效率和细胞质量，以及存活率。
本发明以NE-4C细胞制备脑/神经类器官，丰富了制备脑/神经类器官的种子细胞种类；NE-4C细胞经上述培养基诱导10～12d即可以分化出含有神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等的复合脑/神经类器官，缩短了脑/神经类器官的制备周期，提高了效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1制备的脑/神经类器官克隆球的形态图；
图2为本发明制备的脑/神经类器官克隆球与NE-4C细胞Nanog、Ki67、PAX6、MAP2、GFAP、CD31、18S rRNA表达量比较图；
图3为实施例1制备的脑/神经类器官克隆球免疫荧光染色结果；
图4为实施例1制备的脑/神经类器官克隆球苏木精-伊红染色结果。
具体实施方式
本发明提供了一种用于制备脑/神经类器官的培养基，包括第一诱导培养基和第二诱导培养基；
所述第一诱导培养基包括DMEM、FBS、青霉素-链霉素混合液、L-谷氨酰胺、B27supplement、N2 supplement、ActivinA、bFGF、EGF、视黄酸、vEGF和抗坏血酸；
所述第二诱导培养基包括DMEM、包括FBS、青霉素-链霉素混合液、L-谷氨酰胺、B27supplement、N2 supplement、ActivinA、bFGF、EGF、vEGF、抗坏血酸、R3-IGF-1、皮质醇和肝素。
在本发明中，所述第一诱导培养基中各成分的浓度优选为：FBS 15％V/V、青霉素-链霉素混合液1％V/V、L-谷氨酰胺1％V/V、B27 supplement 2％V/V、N2 supplement 1％V/V、ActivinA 10ng/mL、bFGF 10ng/mL、EGF 10ng/mL、视黄酸10ng/mL、vEGF 10ng/mL、抗坏血酸50ng/mL和余量的DMEM。本发明所述抗坏血酸有助于提高细胞存活和抗氧化应激作用；所述vEGF能够帮助诱导分化出血管。本发明将DMEM、FBS、青霉素-链霉素混合液、L-谷氨酰胺、B27supplement、N2 supplement、ActivinA、bFGF、EGF、视黄酸、vEGF和抗坏血酸混合配制第一诱导培养基，在制备脑/神经类器官的过程中，有助于诱导细胞由增殖向分化转化。
在本发明中，所述第二诱导培养基中各成分的浓度为：FBS 15％V/V、青霉素-链霉素混合液1％V/V、L-谷氨酰胺1％V/V、B27 supplement 2％V/V、N2supplement 1％V/V、ActivinA 10ng/mL、bFGF 10ng/mL、EGF 10ng/mL、vEGF10ng/mL、抗坏血酸50ng/mL、R3-IGF-110ng/mL、皮质醇10ng/mL、肝素10ng/mL和余量的DMEM。本发明所述抗坏血酸有助于提高细胞存活和抗氧化应激作用；所述vEGF能够帮助诱导分化出血管；所述R3-IGF-1能够促进细胞糖代谢和能量代谢的转化，增强细胞的活力；所述肝素有助于增加bFGF的稳定性，使成其活性增强，促进神经干细胞分化和伪足的产生；所述皮质醇通过促进糖异生、减慢葡萄糖分解，还能提高蛋白质的分解代谢，增加培养基中氨基酸和氮的排放量，造成负氮平衡。本发明将DMEM、FBS、青霉素-链霉素混合液、L-谷氨酰胺、B27 supplement、N2 supplement、ActivinA、bFGF、EGF、vEGF、抗坏血酸、R3-IGF-1、皮质醇和肝素混合配制第二诱导培养基，在制备脑/神经类器官的过程中，有助于诱导细胞定向分化成各种神经元。
本发明所述培养基通过添加vEGF、抗坏血酸、R3-IGF-1、皮质醇和肝素等细胞因子，大大提高了细胞分化效率、细胞质量以及存活率，能够用于制备脑/神经类器官。本发明对所述培养基中各组分的来源没有严格要求，常规购买即可。
本发明还提供了一种脑/神经类器官，利用上述技术方案所述的培养基诱导NE-4C细胞制备得到。本发明以NE-4C细胞代替原代胚胎干细胞ES或诱导多能分化干细胞iPS作为种子细胞制备脑/神经类器官，丰富了制备脑/神经类器官的种子细胞种类；NE-4C细胞经上述培养基诱导10～12d即可以分化出含有神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等的复合脑/神经类器官，缩短了脑/神经类器官的制备周期，提高了效率。本发明对NE-4C细胞的来源没有严格要求，常规购买即可。本发明具体实施过程中，使用的NE-4C细胞具体为NE-4C C57Bl/Sv129品系小鼠神经干细胞株，购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
本发明还提供了一种脑/神经类器官的制备方法，包括：依次利用上述技术方案所述的第一诱导培养基和第二诱导培养基对NE-4C细胞进行第一诱导和第二诱导。
本发明利用上述技术方案所述第一诱导培养基对NE-4C细胞进行第一诱导。本发明所述第一诱导的时间优选为2d。所述第一诱导的条件优选为37℃、5％CO2培养。本发明利用所述第一培养基诱导NE-4C细胞2d即可使NE-4C细胞由增殖向分化转化。本发明所述第一诱导培养基的组成和浓度同上述内容，在此不作赘述。
所述第一诱导后，本发明对第一诱导所得NE-4C细胞进行第二诱导。本发明所述第二诱导的时间优选为6d。所述第二诱导的条件优选为37℃、5％CO2培养。本发明优选在利用所述第二培养基诱导3d后更换一次新鲜的第二培养基继续诱导。本发明利用所述第二培养基诱导NE-4C细胞6d即使NE-4C细胞定向分化成神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等的复合脑/神经类器官。本发明所述第二诱导培养基的组成和浓度同上述内容，在此不作赘述。
本发明在进行所述第一诱导前，优选对所述NE-4C细胞进行基础培养。
本发明所述基础培养优选包括：将消化处理后的NE-4C细胞置于包含10％V/V的细胞外基质的基础培养基中培养2d。本发明所述基础培养基优选为DMEM 83％V/V、FBS 15％V/V、青霉素-链霉素混合液1％V/V和L-谷氨酰胺1％V/V。
本发明所述消化处理优选使用Accutase酶。本发明利用Accutase酶对贴壁的NE-4C细胞进行消化处理，相比胰酶，胶原酶，中性酶等可快速温和的消化解离细胞，保持更高的细胞活力。
消化处理后，本发明优选使用预冷的包含50％V/V的细胞外基质的基础培养基重悬NE-4C细胞，得到NE-4C细胞悬液。本发明所述细胞外基质优选为Matrigel。所述包含50％V/V的细胞外基质的基础培养基的体积优选为1mL。本发明按照1:1的体积比将预冷的Matrigel与预冷的基础培养基混合重悬NE-4C细胞，能够保持细胞悬浮，防止细胞贴壁。
得到NE-4C细胞悬液后，本发明优选按照0.1mL/滴的滴加速度，将NE-4C细胞悬液滴加到非粘附细胞培养皿中，滴加完毕后，立即放入37℃、5％CO2的细胞培养箱内孵育15min。本发明通过控制滴加速度能够避免细胞过多使培养基营养过快消耗。
孵育结束后，本发明优选加入4倍NE-4C细胞悬液体积的基础培养基进行基础培养。本发明所述基础培养的时间优选为2d。所述基础培养的条件优选为37℃、5％CO2培养。
利用本发明提供的制备方法，10～12d后即可将NE-4C细胞分化出含有神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等的复合脑/神经类器官，缩短了脑/神经类器官的制备周期，提高了效率。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.培养基的制备
1.1试剂来源
Advanced DMEM-F12(Invitrogen，cat.no.12634-010)；
Matrigel(Basement membrane matrix；Corning，cat.no.354234)；
Fetalbovine serum(FBS；Hyclone，cat.no.SH30070.02)；
L-谷氨酰胺L-glutamine(100x；Life Technologies，cat.no.25030-081)；
青霉素-链霉素混合液Penicillin-streptomycin(100x；Life Technologies，cat.no.15140-122)；
B27 supplement(50x without vitaminA；Thermo Fisher Scientific，cat.no.12587-010)；
N2 supplement(100x；Invitrogen，cat.no.17502-048)；
HEPES buffer(1M；Life Technologies，cat.no.15630-080)；
抗坏血酸ASCORBICACID(Lonza；cat.no.CC-4116A)；
R3-IGF-1(Lonza；cat.no.CC-4115A)；
皮质醇HYDROCORTISONE(Lonza；cat.no.CC-4112A)；
肝素HEPARIN(Lonza；cat.no.CC-4396A)；
Accutase(Thermo Fisher Scientific，cat.no.A11105-01)；
ActivinA(Cell Guidance Systems，cat.no.GFH6)；
Fibroblast growth factor 2(bFGF；R&D Systems，cat.no.235-F4)；
Epidermal growth factor(EGF；R&D Systems，cat.no.236-EG-01M)
Retinoic acid(RA；SigmaAldrich，cat.no.R2625)；
Vascular endothelial growth factor(vEGF；MedChemExpress，cat.no.HY-P72430)；
TrIzol Reagent(Invitrogen CO.，LTD)；
ReverTraAce-αFirst Strand cDNA Synthesis Kit(TOYOBACO.，LTD)；
SyBR Green RealTime PCRMasterMIX(TOYOBA CO.，LTD)；
AlexaFluor donkey anti-mouse 568(Thermo Fisher Scientific,cat.no.A10037)；
AlexaFluor donkey anti-rabbit 488(Thermo Fisher Scientific,cat.no.A21200)；
DAPI(Sigma-Aldrich,cat.no.D9542-10MG)；
Fluoromount-G fluorescent mounting medium(Southern Biotech,cat.no.0100-01)。
1.2培养基组成
基础培养基：Advanced DMEM-F1283mL+FBS 15mL+Penicillin-streptomycin1mL+L-glutamine 1mL；
第一诱导培养基(以总体积为100mL计)：FBS 15mL+Penicillin-streptomycin1mL+L-glutamine 1mL+B27 supplement 2mL+N2 supplement 1mL+Activin A10ng/mL+bFGF10ng/mL+EGF 10ng/mL+RA 10ng/mL+vEGF10ng/mL+ASCORBICACID 50ng/mL+余量的Advanced DMEM-F12(ActivinA、bFGF、EGF、RA、vEGF和ASCORBIC ACID均以Advanced DMEM-F12为溶剂进行配制)；
第二诱导培养基(以总体积为100mL计)：FBS 15mL+Penicillin-streptomycin1mL+L-glutamine 1mL+B27 supplement 2mL+N2 supplement 1mL+Activin A10ng/mL+bFGF10ng/mL+EGF 10ng/mL+vEGF 10ng/mL+ASCORBIC ACID50ng/mL+R3-IGF-1 10ng/mL+HYDROCORTISONE 10ng/mL+HEPARIN10ng/mL+余量的Advanced DMEM-F12(ActivinA、bFGF、EGF、RA、vEGF和ASCORBICACID均以Advanced DMEM-F12为溶剂进行配制)。
2.制备过程
2.1取一支冻存于液氮中的NE-4C细胞株(NE-4C C57Bl/Sv129品系小鼠神经干细胞株购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，于42℃水中完全融化，将细胞悬液接种于的细胞培养皿中，并加入10mL基础培养基于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养，24小时后更换一次细胞培养基，之后依据细胞生长状态进行换液，直至细胞长满培养皿；
2.2弃原细胞培养液，用PBS清洗细胞表面2次；
2.3加入5mLAccutase，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内孵育3分钟；
2.4显微镜下观察细胞均悬浮于消化液时，加入5mL基础培养基终止消化，吹打皿底细胞，使其完全悬浮；
2.5细胞悬液于10℃、1500rpm离心5分钟，丢上清液，细胞沉淀用0.5mL冰预冷的基础培养基重悬，并加入0.5mL冰预冷的Matrigel，并在冰上充分吹打混匀；
2.6将细胞悬液滴加到非粘附细胞培养皿中，每滴细胞悬液控制在0.1mL左右，全部滴加完毕，立刻放入37℃、5％CO2的细胞培养箱内孵育15分钟；
2.7随后，缓缓加入4mL 37℃预热的基础培养基，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养；
2.8步骤2.7培养2天后，弃原培养基，重新加入4mL第一诱导培养基，重新置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养；
2.9步骤2.8培养2天后，弃原培养基，重新加入4mL第二诱导培养基，重新置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养；
2.10步骤2.9培养3天后，弃原培养基，重新加入4mL第二诱导培养基，重新置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养；
2.11步骤2.10培养3天后，弃原培养基，重新加入4mL第二诱导培养基，重新置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养，可见明显的细胞克隆球形成，具体如图1所示，图1左侧为贴壁的NE-4C细胞形态，右侧为实施例第二诱导结束后的NE-4C细胞形态。根据图1可以看出，在制备脑/神经类器官之前，NE-4C细胞呈现贴壁状上皮样细胞紧密排列生长，通过我们特殊的培养方法诱导之后，在大约第10天开始，可以见悬浮的脑/神经类器官克隆球出现，随着继续培养，克隆球会逐渐变大，球内部会变成更加紧致和厚实。
测试例1
利用荧光定量PCR实验测定实施例1类器官细胞克隆球和正常生长的NE-4C细胞干细胞标志物(Nanog)、细胞增殖因子(Ki67)、神经元标志物(PAX6、MAP2)、神经胶质细胞标志物(GFAP)、血管标志物(CD31)和细胞增殖因子(Ki67)的表达量，涉及的定量引物列于下表3。
表3实时荧光PCR定量引物
具体步骤如下：
1.取实施例1类器官细胞克隆球和正常生长的NE-4C细胞，分别加入1mL TrIzolReagent并混匀，将悬液移至RNase-free的2mL Eppendorf离心管内，剧烈震荡15秒，常温下放置5分钟；
2.每管加入200μL三氯甲烷及少许糖原，颠倒充分混匀数次，4℃、13000rpm离心15分钟；
3.将上清转移至另一个干净的2mL Eppendorf离心管(RNase-free)内，加入1.5倍体积冰预冷的异丙醇(RNase-free)及200μL乙醇(RNase-free)，颠倒混匀，-20℃下放置30分钟；
4.于4℃、13000rpm离心20分钟，弃上清，用冰预冷的70％乙醇(RNase-free)清洗沉淀2次，4℃、13000rpm离心5分钟；
5.弃残液，37℃下使RNA沉淀充分干燥，然后每管加入35μL的DEPC-ddH2O溶解沉淀；
6.取2μL RNA溶液稀释30倍，然后检测OD260/D280的吸光度并且计算其浓度，其余的RNA溶液-80℃保存。
7.确定抽提的Total RNA其OD260/D280在1.8以上，然后利用DEPC-ddH2O稀释至适当浓度，按照表4的体系和逆转录PCR反应程序进行逆转录反应，获得相应的cDNA；
表4PCR反应体系和程序
8.逆转录PCR结束后，将cDNA稀释1/5，作为实时荧光定量PCR的模板，其余-20℃保存。
9.取cDNA模板，按照表4的体系和程序利用实时荧光定量PCR检测目标基因mRNA表达情况，每组待测样本均设立三个重复，以18S rRNA作为内参；
表5 PCR反应体系和程序
10.全部反应结束之后，mRNA的变化值按公式Ratio＝2-△△Ct︱△△Ct＝[△Ct_Sample-△Ct_Control]来计算，结果如表6和图2所示。
表6实时荧光定量PCR结果
基因 NE-4C 实施例1
Nanog 1.01±0.10 0.03±0.01
Ki67 1.01±0.10 2.02±0.47
PAX6 1.00±0.07 93.91±15.02
MAP2 1.01±0.08 85.60±9.56
GFAP 1.04±0.19 121.43±12.94
CD31 1.02±0.15 52.19±8.10
18SrRNA 1.01±0.09 1.01±0.10
注：表6中NE-4C为空白对照。
根据表6和图2记载内容可以看出，NE-4C只表达干细胞标志物(Nanog)和细胞增殖因子(Ki67)，而脑/神经类器官克隆球高表达神经元标志物(PAX6、MAP2)、神经胶质细胞标志物(GFAP)、血管标志物(CD31)和细胞增殖因子(Ki67)，说明本发明制备方法可以分化出含有神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等的复合脑/神经类器官。
测试例2
免疫荧光染色实验
1.取实施例1类器官细胞克隆球，并制备细胞涂片，并用4％多聚甲醛于常温下固定30分钟；
2.用PBS(0.02mol/L，pH＝7.4)漂洗2次，每次5分钟；
3.用封闭液(0.02mol/LPBS中加入0.2％Triton-100和5％的正常山羊血清)在37℃下封闭1小时；
4.弃废液，用PBST(0.02mol/LPBS中加入0.2％Triton-100)漂洗3次，每次5分钟；
5.弃废液，加入一抗，37℃下孵育2小时；
6.弃废液，用PBST(0.02mol/LPBS中加入0.2％Triton-100)漂洗3次，每次5分钟；
7.弃废液，加入荧光标记二抗以及DAPI，37℃下避光孵育1小时；
8.弃废液，用PBST(0.02mol/LPBS中加入0.2％Triton-100)漂洗3次(须避光)，每次5分钟；
9.用Fluoromount-G fluorescent mounting medium封片，荧光显微镜观察拍照，结果如图3所示。
根据图3可以看出，实施例1制备得到的脑/神经类器官克隆球高表达神经元标志物(CHAT、NeuN、PAX6、TUJ1、MAP2)和神经胶质细胞标志物(GFAP)。
测试例3
苏木精-伊红染色实验
1.取实施例1类器官细胞克隆球，并制备细胞涂片，并用4％多聚甲醛于常温下固定30分钟；
2.95％乙醇固定细胞15分钟；
3.PBS洗2次，每次1分钟；
4.浸入苏木精染料染色5-10分钟，然后自来水清洗；
5.浸入稀盐酸-乙醇溶液(75％乙醇与1％盐酸混合)分色数秒钟，然后自来水清洗；
6.浸入淡氨水溶液(400μL氨水溶于400mL ddH2O)使细胞核蓝化3-5分钟，然后自来水清洗；
7.浸入伊红染料染色5-10分钟，然后自来水清洗；
8.分别经过70％、80％、90％乙醇溶液各1次，进行逐级脱色；
9.经过90％乙醇2次，每次1分钟；
10.经过无水乙醇3次，每次1分钟；
11.中性树胶封片，显微镜下观察并拍照，结果如图4所示，图4左侧为100倍放大图，右侧为左侧选中区域400倍放大图。
根据图4可以看出，本发明实施例1制备的脑/神经类器官克隆球内部分布着细胞丛，多数细胞核呈深蓝色，且存在细长的伪足，形态与神经元相似。
本发明通过对NE-4C细胞诱导，制备脑/神经类器官，丰富了制备脑/神经类器官的种子细胞种类；NE-4C细胞经上述培养基诱导10～12d即可以分化出含有神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等的复合脑/神经类器官，缩短了脑/神经类器官的制备周期，提高了效率。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 上海市中医老年医学研究所
<120> 用于制备脑/神经类器官的培养基及其应用、脑/神经类器官及其制备方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcttcctggt ccccacagtt t 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaagaatag ttctcgggat gaa 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcattgacc gctcctttag gt 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctcgccttg atggttcct 19
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgagacagat tacttcgcaa cc 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgaaatgagt cttgcatagg cag 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gccagcctca gaacaaacag 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaggtcttgg gagggaagaa c 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggagacgca tcacctctg 19
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agggagtgga ggagtcattc g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctgccagtcc gaaaatggaa c 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cttcatccac cggggctatc 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atcattgacc gctcctttag gt 22
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gctcgccttg atggttcct 19

Claims (7)

1.培养基在制备脑/神经类器官中的应用，其特征在于，所述培养基由第一诱导培养基和第二诱导培养基组成；
所述第一诱导培养基由DMEM、FBS、青霉素-链霉素混合液、L-谷氨酰胺、B27supplement、N2supplement、ActivinA、bFGF、EGF、视黄酸、vEGF和抗坏血酸组成；
所述第二诱导培养基由DMEM、FBS、青霉素-链霉素混合液、L-谷氨酰胺、B27supplement、N2supplement、ActivinA、bFGF、EGF、vEGF、抗坏血酸、R3-IGF-1、皮质醇和肝素组成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一诱导培养基中各成分的浓度为：FBS15％V/V、青霉素-链霉素混合液1％V/V、L-谷氨酰胺1％V/V、B27supplement2％V/V、N2supplement1％V/V、ActivinA10ng/mL、bFGF10ng/mL、EGF10ng/mL、视黄酸10ng/mL、vEGF10ng/mL、抗坏血酸50ng/mL和余量的DMEM。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二诱导培养基中各成分的浓度为：FBS15％V/V、青霉素-链霉素混合液1％V/V、L-谷氨酰胺1％V/V、B27supplement2％V/V、N2supplement1％V/V、ActivinA10ng/mL、bFGF10ng/mL、EGF10ng/mL、vEGF10ng/mL、抗坏血酸50ng/mL、R3-IGF-110ng/mL、皮质醇10ng/mL、肝素10ng/mL和余量的DMEM。
4.一种脑/神经类器官的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
依次利用第一诱导培养基和第二诱导培养基对NE-4C细胞进行第一诱导和第二诱导；
所述第一诱导培养基由DMEM、FBS、青霉素-链霉素混合液、L-谷氨酰胺、B27supplement、N2supplement、ActivinA、bFGF、EGF、视黄酸、vEGF和抗坏血酸组成；
所述第二诱导培养基由DMEM、FBS、青霉素-链霉素混合液、L-谷氨酰胺、B27supplement、N2supplement、ActivinA、bFGF、EGF、vEGF、抗坏血酸、R3-IGF-1、皮质醇和肝素组成。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一诱导的时间为2d；所述第二诱导的时间为6d。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述第一诱导和第二诱导的条件分均为37℃、5％CO2培养。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括所述NE-4C细胞的基础培养。
CN202210321881.1A 2022-03-28 2022-03-28 用于制备脑/神经类器官的培养基及其应用、脑/神经类器官及其制备方法 Active CN114606178B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210321881.1A CN114606178B (zh) 2022-03-28 2022-03-28 用于制备脑/神经类器官的培养基及其应用、脑/神经类器官及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210321881.1A CN114606178B (zh) 2022-03-28 2022-03-28 用于制备脑/神经类器官的培养基及其应用、脑/神经类器官及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114606178A CN114606178A (zh) 2022-06-10
CN114606178B true CN114606178B (zh) 2023-08-22

Family

ID=81867240

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210321881.1A Active CN114606178B (zh) 2022-03-28 2022-03-28 用于制备脑/神经类器官的培养基及其应用、脑/神经类器官及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114606178B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107427537A (zh) * 2015-03-03 2017-12-01 哈佛学院院长及董事 产生功能性人体组织的方法
CN109136185A (zh) * 2017-06-28 2019-01-04 中国科学院生物物理研究所 一种类脑器官器的制备方法和应用
WO2019058140A1 (en) * 2017-09-25 2019-03-28 Oxford University Innovation Ltd. GENERATION OF CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS FROM PLURIPOTENT STEM CELLS FOR MODELING THE HUMAN HEMATIC BRAIN BARRIER AND THE NEUROVASCULAR UNIT

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107427537A (zh) * 2015-03-03 2017-12-01 哈佛学院院长及董事 产生功能性人体组织的方法
CN109136185A (zh) * 2017-06-28 2019-01-04 中国科学院生物物理研究所 一种类脑器官器的制备方法和应用
WO2019058140A1 (en) * 2017-09-25 2019-03-28 Oxford University Innovation Ltd. GENERATION OF CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS FROM PLURIPOTENT STEM CELLS FOR MODELING THE HUMAN HEMATIC BRAIN BARRIER AND THE NEUROVASCULAR UNIT

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Generation of Cerebral Organoids From Human Pluripotent Stem Cells;Madeline A Lancaster等;Nat Protoc;第9卷(第10期);2329-2340 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114606178A (zh) 2022-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2694644B1 (en) Priming of pluripotent stem cells for neural differentiation
US9115342B2 (en) Method for purifying cardiomyocytes or programmed cardiomyocytes derived from stem cells or fetuses
CN106795487A (zh) 胰腺祖细胞的增殖方法
WO2011044684A1 (en) Manipulation of osmolality for differentiating stem cells
CN100465268C (zh) 人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基
CN103555661B (zh) 一种无血清、无饲养层的多能干细胞培养方法
CN106032527A (zh) 一种耐受低密度的无饲养层人多能干细胞培养基
CN110607277A (zh) 一种人类多能干细胞分化巨噬细胞的方法
CN105002143A (zh) 一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为血管内皮样细胞的方法
CN101294146B (zh) 诱导神经干细胞分化的***及诱导方法
A Baghbaderani et al. A review of bioreactor protocols for human neural precursor cell expansion in preparation for clinical trials
CN114606178B (zh) 用于制备脑/神经类器官的培养基及其应用、脑/神经类器官及其制备方法
CN112553147A (zh) 一种促进肌肉干细胞增殖的生长因子组合物及其应用
CN106350490B (zh) 利用无血清培养基从成纤维细胞中获得神经细胞的方法
CN105624116A (zh) 利用多能干细胞制备神经前体细胞的方法
CN115885037A (zh) 中脑类器官及其高速大规模制造方法、利用它筛选神经毒性物质和筛选多巴胺能神经元相关疾病药物的方法
CN114350599B (zh) 一种增强牛胚胎干细胞的多能性和代谢活力的培养体系和培养方法
CN114181889B (zh) 一种原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法
CN117487743B (zh) 一种诱导鸡胚成纤维细胞为鸡多能干细胞的化学诱导剂及诱导方法
CN108085316B (zh) 一种通过抑制微小核糖核酸来促进小鼠视网膜前体细胞体外扩增的方法
AU2012227337B2 (en) A method for purifying cardiomyocytes or programmed cardiomyocytes derived from stem cells or fetuses
CN109182269B (zh) 一种使精原干细胞高效向神经细胞分化的培养体系和方法
CN111235093B (zh) 一种胚胎干细胞培养基及其应用
CN108315304A (zh) 一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法
KR101636966B1 (ko) 배아줄기세포로부터 신경교전구세포, 성상세포 및 희소돌기 아교세포로의 분화방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant