CN110484493A - 小分子化合物诱导鸡胚成纤维细胞CEFs成iPSCs的体系建立方法 - Google Patents

小分子化合物诱导鸡胚成纤维细胞CEFs成iPSCs的体系建立方法 Download PDF

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Abstract

小分子化合物诱导鸡胚成纤维细胞CEFs成iPSCs的体系建立方法，其特征是，设置不同浓度的小分子化合物组合体系，细胞形态学观察、毒性试验及qRT‑PCR检测相关基因的表达，验证小分子化合物在鸡CEFs诱导重编程中是否适用及其适宜诱导浓度；然后利用剔除法结合qRT‑PCR、间接免疫荧光、细胞流式分析技术、AKP染色、EDU细胞增值技术手段优化诱导体系，建立适宜鸡CEFs重编程诱导体系。本发明解决了器官来源及免疫排斥问题，同时为个体发育及遗传修饰与保存的研究提供了新方法；为后续诱导多能干细胞的使用奠定理论和技术基础，也为其他物种的化学诱导重编程研究提供参考。

Description

小分子化合物诱导鸡胚成纤维细胞CEFs成iPSCs的体系建立 方法
技术领域
本发明涉及小分子化合物诱导鸡胚成纤维细胞CEFs成iPSCs的体系建立方法，属于生物技术领域。
背景技术
体细胞重编程为iPSCs(induced pluripotent stem cells)在器官移植、新药筛选、动物种质资源保护等方面具有巨大的潜在价值。Shinya Yamanaka等人利用Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因病毒载体将小鼠成纤维细胞诱导成多能干细胞iPSCs，但存在原癌基因的致癌性、诱导效率低等问题。邓宏魁研究组利用小分子化合物将体细胞重编程为多潜能干细胞(chemically induced pluripotent stem cells,CiPSCs)开辟了体细胞重编程的新途径，为未来细胞治疗及人造器官应用提供了理想的细胞来源，给未来应用再生医学治疗重大疾病带来了新的可能。但诱导效率低，周期长。
之后裴端卿课题组报道了一种经过优化的化学诱导iPSCs的方案，能够简单高效获得化学诱导的多能干细胞(chemical induction of pluripotency，CIP)，但相对于转录因子诱导体细胞重编程的方式，诱导效率仍较低，周期也较长,有待于进一步优化体系，提高重编程效率，缩短诱导周期。而且，体细胞重编程研究多数是在小鼠上进行，家禽体细胞重编程体系仍需进一步研究。
因此急需建立一种小分子化合物诱导体系应用于鸡的体细胞重编程研究。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的不足，使用小分子化合物替代山中伸弥四因子诱导鸡胚成纤维细胞成iPSCs，为鸡体细胞重编程研究提供了一种新的方法—小分子化合物诱导鸡胚成纤维细胞CEFs成iPSCs的体系建立方法。
本发明的技术方案如下：
小分子化合物诱导鸡胚成纤维细胞CEFs成iPSCs的体系建立方法，其特征是，首先，设置不同浓度的小分子化合物组合体系，细胞形态学观察、毒性试验及qRT-PCR检测相关基因的表达，验证12种小分子化合物在鸡CEFs诱导重编程中是否适用及其适宜诱导浓度；然后利用剔除法结合qRT-PCR、间接免疫荧光、细胞流式分析技术、AKP染色、EDU细胞增值技术等检测手段优化诱导体系，建立适宜鸡CEFs重编程诱导体系。
小分子化合物诱导鸡胚成纤维细胞CEFs成iPSCs的体系建立方法，其特征是，具体步骤如下：
1)CEFs的分离及培养
取孵化7-11d的受精蛋，新洁尔灭和75％酒精消毒后送入超净台，高压灭菌处理的镊子敲击受精蛋钝端取出鸡胚，放入加有双抗的PBS中；去除头和四肢及内脏器官；收集肌肉组织，剪碎，胰酶消化五分钟后终止；400目滤布过滤，并离心；细胞重悬后种入培养皿，用含10％FBS的DMEM培养基进行CEFs的培养，取F1-F3代CEFs进行后续实验；
2)小分子化合物体外诱导CEFs形成iPSCs初始体系建立
A不同细胞铺板密度的筛选以不同细胞密度铺板，根据已报道(根据2018年中科院广州生物医药与健康研究院发表的的《Chromatin Accessibility Dynamics duringChemical Induction of Pluripote ncy》)小分子化合物体外诱导体细胞重编程为iPSCs的体系A0(bFGF(10ng/ml)+CHIR99021(3μM)+RepSox(5μM)+Forskolin(10μM)+DZNep(0.05μM)+5-Brdu(10μM)+AM580(0.05μM)+BMP4(10ng/ml)+Vc(50μg/ml)+EPZ-5676(5μM)+SGC0946(5μM)+VPA(0.1μM))进行不传代诱导，筛选适宜的初始细胞铺板密度；
所述细胞铺板密度为2*104、4*104、6*104、8*104、10*104个/孔；
结果发现，6*104个/孔的细胞密度铺板最好，诱导过程中细胞形态改变，最终产生iPSCs团，选定6*104个/孔作为诱导初始铺板密度；
B不同诱导剂浓度的筛选
以上述诱导体系A0为基础，设置浓度梯度A1、A2，筛选适用于鸡体细胞诱导重编程的体系；配置不同浓度的小分子化合物诱导培养基进行细胞不传代诱导，每天观察细胞形态，确定各组iPSCs的形成时间和变化规律；
实验分组:
A0：
A1：
bFGF(5ng/ml)+CHIR99021(1.5μM)+RepSox(2.5μM)+Forskolin(5μM)+DZNep(0.025μM)+5-Brdu(5μM)+AM580(0.025μM)+BMP4(5ng/ml)+Vc(25μg/ml)+EPZ-5676(2.5μM)+SGC0946(2.5μM)+VPA(0.05mM)；
A2:
bFGF(15ng/ml)+CHIR99021(4.5μM)+RepSox(7.5μM)+Forskolin(15μM)+DZNep(0.075μM)+5-Brdu(15μM)+AM580(0.075μM)+BMP4(15ng/ml)+Vc(76μg/ml)+EPZ-5676(7.5μM)+SGC0946(7.5μM)+VPA(0.15mM)；
结果显示三个诱导组中A2组最早出现圆形致密细胞团，其次是A0组，最后是A1组；
C诱导重编程过程中的检测
①EDU细胞增殖实验检测小分子化合物的毒性
CEFs诱导过程中通过EDU实验检测细胞的增殖能力，评估小分子化合物诱导体系对细胞的毒性；实验发现诱导组相比于空白对照组细胞死亡数目均有所增加，且增殖速度减慢；
②qRT-PCR、FACS、IF、AKP染色检测多能性基因表达变化
诱导细胞每隔2d取样，提取RNA，检测Sall4、Gata6、SSEA-1、Oct4、Sox2、Nanog多能性基因启动表达的时间及表达量的变化，同时孵育SSEA-1抗体并结合流式细胞分选技术检测蛋白水平的变化；
AKP染色检测诱导过程中碱性磷酸酶含量，初步确定各小分子化合物组合体外诱导CEFs重编程的时间及其能力；
结果显示A2组多能性基因最早开始表达，其次为A0组，最后是A1组；AKP染色结果与定量结果趋势一致；综合以上实验选定A2组为鸡CEFs诱导重编程为iPSCs的初始体系，在此基础上进行优化，以期提高诱导效率、缩短诱导周期；
3)小分子化合物体外诱导CEFs形成iPSCs体系的优化
A删除法筛选CEFs体外诱导重编程必需的小分子化合物组合
根据每种小分子化合物的最小致死量设计浓度梯度，配置单个小分子化合物缺失的培养基，分组见表1，并检测；
表1为小分子化合物初始浓度和浓度梯度
名称 初始浓度 浓度梯度设置
RepSox 5uM 0-7.5uM
CHIR99021 3uM 0-4.5uM
DZNep 0.05uM 0-0.075uM
Forskolin 10uM 0-15uM
VPA 0.1mM 0-0.15mM
Vc 50ug/ml 0-75ug/ml
5-Brdu 10uM 0-15uM
SGC0946 5uM 0-7.5uM
BMP4 10ng/ml 0-15ng/ml
bFGF 10ng/ml 0-15ng/ml
AM580 0.025μM 0-0.075uM
EPZ-5676 7.5μM 0-7.5uM
结果显示，与初始体系诱导组相比，缺失5-Brdu与CHIR99021组多能性基因开始表达时间较晚，诱导第6d细胞形态变化不明显，前者在诱导18d有圆形致密细胞团出现，后者在诱导12d细胞有此形态变化；
而缺失AM580、Forskolin、SGC0946组，多能性基因开始表达时间及趋势与初始体系诱导组相同，且诱导第6d细胞形态有明显变化，诱导12d出现圆形致密细胞团，诱导18d细胞团大量增多。EDU检测显示其增殖能力较强，AKP染色检测有碱性磷酸酶表达，SSEA-1抗体标记呈阳性，间接免疫荧光检测Oct4、Nanog蛋白均表达；
说明5-Brdu与CHIR99021在鸡CEFs诱导重编程为iPSCs的体系中发挥重要作用，不可缺失；而AM580、Forskolin、SGC0946三种小分子化合物的作用弱于前两者；且诱导过程大致可以分为三个阶段；0-6d、7-12d、13-24d；
初步确定鸡CEFs诱导重编程为iPSCs的体系为：bFGF(10ng/ml)+CHIR99021(3μM)+RepSox(5μM)+DZNep(0.05μM)+5-Brdu(10μM)+BMP4(10ng/ml)+Vc(50μg/ml)+EPZ-5676(5μM)+VPA(0.1mM)。
裴端卿课题组报道的两步化学诱导iPSCs细胞方案能够较高效地获得多能干细胞，且申请人前期有小鼠和山羊iPSCs制备的成功案例，以此为参考，本发明提供了研究家禽体细胞重编程的化学诱导体系。
本发明简便可行，应用广泛。由于小分子化合物作用于动物细胞无种属差异，且微量高效，其诱导体细胞重编程得到的iPSCs在再生医学及种质资源保护等方面具有重要的应用价值，解决了器官来源及免疫排斥问题，同时为个体发育及遗传修饰与保存的研究提供了新方法。因此，本发明建立的诱导体系不仅可用于鸡体细胞诱导重编程，也可应用于其他物种的重编程研究。本发明筛选出小分子化合物诱导鸡CEFs重编程为iPSCs的体系，为后续诱导多能干细胞的使用奠定理论和技术基础，也为其他物种的化学诱导重编程研究提供参考。
具体实施方式
1.CEFs的分离及培养
取孵化7-11d的受精蛋，新洁尔灭和75％酒精消毒后送入超净台，高压灭菌处理的镊子敲击钝端取出鸡胚，放入加有双抗的PBS中。去除头和四肢及内脏器官。收集肌肉组织，剪碎，胰酶消化五分钟后终止。400目滤布过滤，并离心。细胞重悬后种入培养皿，用含10％FBS的DMEM培养基进行CEFs的培养，取F1-F3代CEFs进行后续实验。
2.小分子化合物体外诱导CEFs形成iPSCs初始体系建立
2.1不同细胞铺板密度的筛选
以不同细胞密度铺板(2*104、4*104、6*104、8*104、10*104个/孔)，根据已报道小分子化合物体外诱导体细胞重编程为iPSCs的体系A0(bFGF(10ng/ml)+CHIR99021(3μM)+RepSox(5μM)+Forskolin(10μM)+DZNep(0.05μM)+5-Brdu(10μM)+AM580(0.05μM)+BMP4(10ng/ml)+Vc(50μg/ml)+EPZ-5676(5μM)+SGC0946(5μM)+VPA(0.1μM))进行不传代诱导，筛选适宜的初始细胞铺板密度。
结果发现，6*104个/孔铺板密度最好，诱导过程中细胞形态改变，最终产生iPSCs团。2*104、4*104个/孔密度铺板诱导剂处理后存活的细胞长势差，无法进行后续实验。因此选定6*104个/孔作为诱导初始铺板密度。
2.2不同诱导剂浓度的筛选
以上述诱导体系为基础(A0)设置浓度梯度(A1、A2)，筛选适用于鸡体细胞诱导重编程的体系。配置不同浓度的小分子化合物诱导培养基进行细胞不传代诱导，每天观察细胞形态，确定各组iPSCs的形成时间和变化规律。
实验分组:
A1：
bFGF(5ng/ml)+CHIR99021(1.5μM)+RepSox(2.5μM)+Forskolin(5μM)+DZNep(0.025μM)+5-Brdu(5μM)+AM580(0.025μM)+BMP4(5ng/ml)+Vc(25μg/ml)+EPZ-5676(2.5μM)+SGC0946(2.5μM)+VPA(0.05mM)
A2:
bFGF(15ng/ml)+CHIR99021(4.5μM)+RepSox(7.5μM)+Forskolin(15μM)+DZNep(0.075μM)+5-Brdu(15μM)+AM580(0.075μM)+BMP4(15ng/ml)+Vc(76μg/ml)+EPZ-5676(7.5μM)+SGC0946(7.5μM)+VPA(0.15mM)
结果显示三个诱导组中A2组最早出现圆形致密细胞团，其次是A0组，最后是A1组。
2.3诱导重编程过程中的检测
2.3.1EDU细胞增殖实验检测小分子化合物的毒性
CEFs诱导过程中通过EDU实验检测细胞的增殖能力，评估小分子化合物诱导体系对细胞的毒性(EDU孵育样品，细胞固定，最后进行荧光检测)。实验发现诱导组相比于空白对照组细胞死亡数目均有所增加，且增殖速度减慢。
2.3.2qRT-PCR、FACS、IF、AKP染色检测多能性基因表达变化
诱导细胞每隔2d取样，提取RNA，检测Sall4、Gata6、SSEA-1、Oct4、Sox2、Nanog等多能性基因启动表达的时间及表达量的变化，同时孵育SSEA-1抗体并结合流式细胞分选技术(FACS)检测蛋白水平的变化。AKP染色检测诱导过程中碱性磷酸酶含量，初步确定各小分子化合物组合体外诱导CEFs重编程的时间及其能力。
结果显示A2组多能性基因最早开始表达，其次为A0组，最后是A1组。AKP染色结果与定量结果趋势一致。综合以上实验选定A2组为鸡CEFs诱导重编程为iPSCs的初始体系，在此基础上进行优化，以期提高诱导效率、缩短诱导周期。
3.小分子化合物体外诱导CEFs形成iPSCs体系的优化
3.1删除法筛选CEFs体外诱导重编程必需的小分子化合物组合
根据每种小分子化合物的最小致死量设计浓度梯度，配置单个小分子化合物缺失的培养基(分组见表1)，并检测。
表1为小分子化合物初始浓度和浓度梯度
结果显示，与初始体系诱导组相比，缺失5-Brdu与CHIR99021组多能性基因开始表达时间较晚，诱导第6d细胞形态变化不明显，前者在诱导18d有圆形致密细胞团出现，后者在诱导12d细胞有此形态变化。而缺失AM580、Forskolin、SGC0946组，多能性基因开始表达时间及趋势与初始体系诱导组相同，且诱导第6d细胞形态有明显变化，诱导12d出现圆形致密细胞团，诱导18d细胞团大量增多。EDU检测增殖能力较强，AKP染色检测有碱性磷酸酶表达，SSEA-1抗体标记呈阳性，间接免疫荧光检测Oct4、Nanog蛋白均表达。说明5-Brdu与CHIR99021在鸡CEFs诱导重编程为iPSCs的体系中发挥重要作用，不可缺失。而AM580、Forskolin、SGC0946三种小分子化合物的作用弱于前两者。且诱导过程大致可以分为三个阶段；0-6d、7-12d、13-24d。
初步确定鸡CEFs诱导重编程为iPSCs的体系为：bFGF(10ng/ml)+CHIR99021(3μM)+RepSox(5μM)+DZNep(0.05μM)+5-Brdu(10μM)+BMP4(10ng/ml)+Vc(50μg/ml)+EPZ-5676(5μM)+VPA(0.1mM)。
注：诱导开始时(0-6d)以含10％FBS的DMEM为基础培养基(DMEM中加入不同的小分子化合物)；细胞形态发生改变出现圆形致密细胞团后(7-24d)基础培养基换成KO-DMEM培养基，iPSCs鉴定后(≥25d)换成2i-KO-DMEM培养基)。
10％FBS的DMEM培养基：45mlDMEM+5ml FBS；
KO-DMEM培养基:43.5ml+5ml FBS+0.2μlβ-巯基乙醇+200μl非必需氨基酸+1ml鸡血清+bFGF(10ng/ml)+hSCF(5ng/ml)+mLIF(1ng/ml)+500μl核酸添加剂+500μlGlutaMAX-ISupplement；
2i-KO-DMEM培养基：KO-DMEM培养基+3μMCHIR99021+1μM PD0325901。

Claims (2)

1.小分子化合物诱导鸡胚成纤维细胞CEFs成iPSCs的体系建立方法，其特征是，首先，设置不同浓度的小分子化合物组合体系，细胞形态学观察、毒性试验及qRT-PCR检测相关基因的表达，验证小分子化合物在鸡CEFs诱导重编程中是否适用及适宜诱导浓度；然后利用剔除法结合qRT-PCR、间接免疫荧光、细胞流式分析技术、AKP染色、EDU细胞增值技术手段优化诱导体系，建立适宜鸡CEFs重编程诱导体系。
2.根据权利要求1所述的小分子化合物诱导鸡胚成纤维细胞CEFs成iPSCs的体系建立方法，其特征是，具体步骤如下：
1)CEFs的分离及培养
取孵化7-11d的受精蛋，新洁尔灭和75％酒精消毒后送入超净台，高压灭菌处理的镊子敲击受精蛋钝端取出鸡胚，放入加有双抗的PBS中；去除头和四肢及内脏器官；收集肌肉组织，剪碎，胰酶消化五分钟后终止；400目滤布过滤，并离心；细胞重悬后种入培养皿，用含10％FBS的DMEM培养基进行CEFs的培养，选取F1-F3代CEFs进行后续实验；
2)小分子化合物体外诱导CEFs形成iPSCs初始体系建立
A不同细胞铺板密度的筛选
以不同细胞密度铺板，根据已报道小分子化合物体外诱导体细胞重编程为iPSCs的体系A0(bFGF(10ng/ml)+CHIR99021(3μM)+RepSox(5μM)+Forskolin(10μM)+DZNep(0.05μM)+5-Brdu(10μM)+AM580(0.05μM)+BMP4(10ng/ml)+Vc(50μg/ml)+EPZ-5676(5μM)+SGC0946(5μM)+VPA(0.1μM))进行不传代诱导，筛选适宜的初始细胞铺板密度；
所述细胞铺板密度为2*104、4*104、6*104、8*104、10*104个/孔进行铺板；
结果发现，6*104个/孔的细胞铺板密度最好，诱导过程中细胞形态改变，最终产生iPSCs团，选定6*104个/孔作为诱导初始铺板密度；
B不同诱导剂浓度的筛选
以上述诱导体系A0为基础，设置浓度梯度A1、A2，筛选适用于鸡体细胞诱导重编程的体系；配置不同浓度的小分子化合物诱导培养基进行细胞不传代诱导，每天观察细胞形态，确定各组iPSCs的形成时间和变化规律；
实验分组:
A0:
A1：
bFGF(5ng/ml)+CHIR99021(1.5μM)+RepSox(2.5μM)+Forskolin(5μM)+DZNep(0.025μM)+5-Brdu(5μM)+AM580(0.025μM)+BMP4(5ng/ml)+Vc(25μg/ml)+EPZ-5676(2.5μM)+SGC0946(2.5μM)+VPA(0.05mM)；
A2:
bFGF(15ng/ml)+CHIR99021(4.5μM)+RepSox(7.5μM)+Forskolin(15μM)+DZNep(0.075μM)+5-Brdu(15μM)+AM580(0.075μM)+BMP4(15ng/ml)+Vc(76μg/ml)+EPZ-5676(7.5μM)+SGC0946(7.5μM)+VPA(0.15mM)；
结果显示三个诱导组中A2组最早出现圆形致密细胞团，其次是A0组，最后是A1组；
C诱导重编程过程中的检测
①EDU细胞增殖实验检测小分子化合物的毒性
CEFs诱导过程中通过EDU实验检测细胞的增殖能力，评估小分子化合物诱导体系对细胞的毒性；实验发现诱导组相比于空白对照组细胞死亡数目均有所增加，且增殖速度减慢；
②qRT-PCR、FACS、IF、AKP染色检测多能性基因表达变化
诱导细胞每隔2d取样，提取RNA，检测Sall4、Gata6、SSEA-1、Oct4、Sox2、Nanog多能性基因启动表达的时间及表达量的变化，同时孵育SSEA-1抗体结合流式细胞分选技术检测蛋白水平的变化；
AKP染色检测诱导过程中碱性磷酸酶含量，初步确定各小分子化合物组合体外诱导CEFs重编程的时间及其能力；
结果显示A2组多能性基因最早开始表达，其次为A0组，最后是A1组；AKP染色结果与定量结果趋势一致；综合以上实验选定A2组为鸡CEFs诱导重编程为iPSCs的初始体系，在此基础上进行优化，以期提高诱导效率、缩短诱导周期；
3)小分子化合物体外诱导CEFs形成iPSCs体系的优化
A删除法筛选CEFs体外诱导重编程必需的小分子化合物组合
根据每种小分子化合物的最小致死量设计浓度梯度，配置单个小分子化合物缺失的培养基，分组见表1，并检测；
表1为小分子化合物初始浓度和浓度梯度
结果显示，与初始体系诱导组相比，缺失5-Brdu与CHIR99021组多能性基因开始表达时间较晚，诱导第6d细胞形态变化不明显，前者在诱导18d有圆形致密细胞团出现，后者在诱导12d细胞有此形态变化；
而缺失AM580、Forskolin、SGC0946组，多能性基因开始表达时间及趋势与初始体系诱导组相同，且诱导第6d细胞形态有明显变化，诱导12d出现圆形致密细胞团，诱导18d细胞团大量增多。EDU检测显示其增殖能力较强，AKP染色检测有碱性磷酸酶表达，SSEA-1抗体标记呈阳性，间接免疫荧光检测Oct4、Nanog蛋白均表达；
说明5-Brdu与CHIR99021在鸡CEFs诱导重编程为iPSCs的体系中发挥重要作用，不可缺失；而AM580、Forskolin、SGC0946三种小分子化合物的作用弱于前两者；且诱导过程大致可以分为三个阶段；0-6d、7-12d、13-24d；
初步确定鸡CEFs诱导重编程为iPSCs的体系为：bFGF(10ng/ml)+CHIR99021(3μM)+RepSox(5μM)+DZNep(0.05μM)+5-Brdu(10μM)+BMP4(10ng/ml)+Vc(50μg/ml)+EPZ-5676(5μM)+VPA(0.1mM)。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111534481A (zh) * 2020-05-18 2020-08-14 扬州大学 一种提高鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程为iPS细胞效率的方法
CN111690594A (zh) * 2020-07-16 2020-09-22 扬州大学 一种鸡两性cef的体外分离和培养方法
CN112538458A (zh) * 2020-11-26 2021-03-23 北京赛尔湃腾科技咨询合伙企业(有限合伙) 用于重编程细胞的方法
CN117487743A (zh) * 2023-12-27 2024-02-02 广东省农业科学院动物科学研究所 一种诱导鸡胚成纤维细胞为鸡多能干细胞的化学诱导剂及诱导方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105838791A (zh) * 2016-04-21 2016-08-10 扬州大学 一种挖掘鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中关键lncRNA 的分析方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105838791A (zh) * 2016-04-21 2016-08-10 扬州大学 一种挖掘鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中关键lncRNA 的分析方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AURÉLIE FUET等: "NANOG Is Required for the Long-Term Establishment of Avian Somatic Reprogrammed Cells", 《STEM CELL REPORTS》 *
SHANGTAO CAO等: "Chromatin Accessibility Dynamics during Chemical Induction of Pluripotency", 《CELL STEM CELL》 *
周学亮: "三黄鸡体细胞重编程及iPSC培养体系的优化", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)农业科技辑》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111534481A (zh) * 2020-05-18 2020-08-14 扬州大学 一种提高鸡胚成纤维细胞体外诱导重编程为iPS细胞效率的方法
CN111690594A (zh) * 2020-07-16 2020-09-22 扬州大学 一种鸡两性cef的体外分离和培养方法
CN112538458A (zh) * 2020-11-26 2021-03-23 北京赛尔湃腾科技咨询合伙企业(有限合伙) 用于重编程细胞的方法
CN117487743A (zh) * 2023-12-27 2024-02-02 广东省农业科学院动物科学研究所 一种诱导鸡胚成纤维细胞为鸡多能干细胞的化学诱导剂及诱导方法
CN117487743B (zh) * 2023-12-27 2024-03-29 广东省农业科学院动物科学研究所 一种诱导鸡胚成纤维细胞为鸡多能干细胞的化学诱导剂及诱导方法

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