CN105907705A - 一种多能干细胞培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种多能干细胞培养基，包括基础培养基和以下添加组分：L‑抗坏血酸‑2磷酸镁、***钠、人胰岛素、柠檬酸铁、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子beta1。本发明成功地将柠檬酸铁引入多能干细胞培养基***，替代人脱铁转铁蛋白，可降低多能干细胞培养基的生产成本；降低了外源性致病风险；该多能干细胞培养基，在培养多能干细胞过程中，不仅能保证细胞的正常增殖，还能够维持干细胞的多能性。

Description

一种多能干细胞培养基
技术领域
本发明涉及一种多能干细胞培养基,属于生物工程技术领域。
背景技术
多能干细胞(Pluripotency stem cell，PSC)具有自我更新能力和多能性，它能够向胚胎三个胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的任何组织和细胞进行分化，因此PSC在再生医学、发育生物学等领域起到重要的作用。PSC包括胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESC)和诱导多能干细胞(induced pluripotency stem cell,iPSC)。无论是ESC还是iPSC，他们都具有类似的基因表达谱、自我更新能力、多能性、表观遗传谱，前者来自于囊胚时期的内细胞团，后者来自于成体细胞导入重编程因子诱导并纯化出来的多能干细胞。
人的iPSC培养过程经历了使用饲养层细胞培养、无饲养层细胞培养以及无动物源性无饲养层细胞培养的三个阶段。饲养层细胞通常来源于小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，其批间差、动物源性、各类感染源性、成分不确定性等影响实验研究的判断和进一步深入地应用研究。
2001年Chunhui Xu使用MEF-conditioned medium在matrigel或者其他基质蛋白包被条件下进行无feeder hESC培养(NatBiotechnol.2001 Oct；19(10):971-4.)，发现MEF分泌的许多因子参与iPSC的自我更新，后续发现TGFB1/ActivinA/Nodal/bFGF等存在条件下可以维持iPSCs的自我更新能力。基于此Thomson实验室于2006年公开无feeder无血清无KSR成分明确的iPSCs培养基mTeSR1(Nat Methods.2006 Aug；3(8):637-46)。后来，StemCell公司使用人血清白蛋白(HSA)替代mTeSR1的BSA，以及使用人源的细胞因子，开发出TeSRTM2，该培养基不含任何动物源性物质，适合临床科研相关工作，后续许多各类其他公司也相应开发出各自特色的的IPSCs培养基。但是TeSRTM2以及其他同类的培养基仍然包含大量的细胞因子、蛋白质，成分复杂，且使用效果差于mTeSR1,不能广泛满足基础科研和临床科研的需求，亦使研究发育和分化的不确定性增加。
2011年Thomson实验室确定了八种mTeSR1中的主要成分的培养基即E8培养基(Nat Methods.2011 May；8(5):424-9.)。随着全球相关领域广泛使用E8，大家逐步发现E8有许多不足之处：
1.E8培养基中的人脱铁转铁蛋白，通常为基因工程产物，其价格昂贵等严重限制了科学研究，因此急需寻找替代物；
2.E8培养基中如果添加促进重编程的小分子化合物或者β-巯基乙醇等细胞会表现明显的细胞毒性，不能在高效诱导重编程尤其是极限条件重编程过程中进行应用，影响加入不同的各种小分子化合物的分化实验，也限制低密度条件下培养hiPSC；
3.E8所包含的细胞因子浓度很高，所需成本仍然很高。因此研发具有大多数小分子或β-巯基乙醇耐受性以及低密度hiPSC耐受性且成本低的高性能无feeder hiPSC培养基十分迫切。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种无动物源性的多能干细胞培养基。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种多能干细胞培养基，包括基础培养基和以下添加组分：L-抗坏血酸-2磷酸镁、***钠、人胰岛素、柠檬酸铁、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子beta1。
作为优选，所述添加组分还包括肝素钠、Dorsomorphindihydrochloride和NaHCO3。
作为优选，所述肝素钠的浓度为1～400ng/mL；所述Dorsomorphin dihydrochloride的浓度为25～250nM；所述NaHCO3的浓度为520～570μg/mL。
作为优选，所述多能干细胞培养基的Fe3+浓度为1.2～3.8mM。
作为优选，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
作为优选，所述柠檬酸铁的浓度为1～300ng/mL。
作为优选，所述多能干细胞培养基的葡萄糖浓度为16-18mmol/L。
作为优选，所述多能干细胞培养基的渗透压为280～350mosmol/L。
作为优选，所述L-抗坏血酸-2磷酸镁的浓度为60～70μg/mL；所述***钠的浓度为10～20ng/mL；所述人胰岛素的浓度为15～25μg/mL；所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为1～100ng/mL；所述转化生长因子-beta1的浓度为0.1～2.0ng/mL。
作为优选，所述L-抗坏血酸-2磷酸镁的浓度为64μg/mL；所述***钠的浓度为13.6ng/mL；所述人胰岛素的浓度为20μg/mL；所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为40ng/mL；所述转化生长因子-beta1的浓度为0.5ng/mL。
作为优选，所述多能干细胞培养基还包括BSA或HSA。
作为优选，所述BSA的含量为0.05-4w.t.％；HSA的含量为0.05-4w.t.％。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1)本发明成功地将柠檬酸铁引入多能干细胞培养基***，替代人脱铁转铁蛋白，降低多能干细胞培养基的生产成本；
2)本发明提供的多能干细胞培养基无饲养层、无血清、无动物源性蛋白，降低了外源性致病风险；
3)本发明提供的多能干细胞培养基，在培养多能干细胞过程中，不仅能保证细胞的正常增殖，还能够维持干细胞的多能性；
4)本发明提供的多能干细胞培养基，在人胚胎干细胞H1长达35代的培养过程中依然能够维持干细胞的快速增殖和形态不发生改变。
附图说明
图1为实施例2中iPSC培养的试验时间与增殖倍数的函数关系图；
图2为实施例2中H1培养的试验时间与增殖倍数的函数关系图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
以下实施方式中，如未特殊说明，所采用的试剂均可通过市售的途径获得。本发明使用的人胚胎干细胞Hi和诱导多能干细胞iPSC均来源于伦理委员会通过的广州市搏克肿瘤研究所实验室。所述人胰岛素或人脱铁转铁蛋白可以是天然的或经过基因工程产物获得，均可通过市售途径获得。
以下具体实施方式中，如未特殊说明，所采用的检测方法均为通用的标准检测方法。
以下具体实施方式中，所列明的渗透压为采用冰点渗透压仪、在低于17.5℃测试的。
以下具体实施方式中，所述基础培养基为购买自Gibco或ThermoFisher公司的DMEM/F12培养基，或购买自Gibco公司的KnockOutTMDMEM培养基，其货号为10829018；或购买自Gibco公司的DMEM,LowGlucose,Pyruvate培养基，货号为11885092。所述基础培养基也可以由其它能满足使该多能干细胞培养基的葡萄糖浓度为16-18mmol/L并含有干细胞生长所需的必须氨基酸的基础培养基代替。
其中，可采用MTT法和AP染色法检测各实施例的培养基对人多能干细胞的存活效果的影响：
MTT法的具体操作如下：
消化、计数好细胞后，用培养基母液吹匀细胞，铺到96孔板中，每个孔中种2000个细胞，种5个复孔，然后分别补入对应的培养基至终体积150uL，每天都要换相应的培养基，细胞放置37℃，5％CO2培养箱中培养，于day1和day5测MTT值。
AP染色法的具体操作如下：
消化、计数好细胞后，用培养基母液吹匀细胞，铺到96孔板中，每个孔中种1个细胞，每组种2000个单细胞孔，然后分别补入对应的培养基至终体积150ul，培养基中加入0.5uM thiazovivin(后续的培养基中都不添加thiazovivin)。细胞放置37℃，5％CO2培养箱中培养。前2～3天，不换液，day4～day10是隔一天换液，day11～day14，每天换液，day15 AP染色检测单克隆数量。
本发明提供一种多能干细胞培养基，该培养包括基础培养基和以下添加组分：L-抗坏血酸-2磷酸镁、***钠、人胰岛素、柠檬酸铁、碱性成纤维细胞生长因子(简称bFGF)和转化生长因子beta1(简称TGF-β1)，培养基组分配比范围如下表所示；所述多能干细胞培养基的渗透压为280～350mosmol/L。
表1 培养基组分配比范围
组分 用量范围
L-抗坏血酸-2磷酸镁(ug/mL) 60～70
***钠(ng/mL) 10～20
人胰岛素(ug/mL) 15～25
柠檬酸铁(ng/mL) 1～300
碱性成纤维细胞生长因子(ng/mL) 1～100
转化生长因子beta1(ng/mL) 0.1～2.0
氯化钠(调节渗透压mosmol/L) 280～350
DMEM/F12培养基 补足至1L
在此基础上，该培养基更优化的配方如表2所示，还包括肝素钠、Dorsomorphin dihydrochloride和碳酸氢钠。为方便区分，下文中，将本多能干细胞培养基命名为hPLWI培养基。
该hPLWI培养基组分配比范围如表2所示：
表2 hPLWI培养基组分配比范围
组分 用量范围
L-抗坏血酸-2磷酸镁(ug/mL) 60～70
***钠(ng/mL) 10～20
人胰岛素(ug/mL) 15～25
柠檬酸铁(ng/mL) 1～300
碱性成纤维细胞生长因子(ng/mL) 1～100
转化生长因子beta1(ng/mL) 0.1～2.0
Dorsomorphin dihydrochloride(nM) 25～250
碳酸氢钠(μg/mL) 520～570
肝素钠(ng/mL) 1～400
氯化钠(调节渗透压mosmol/L) 280～350
DMEM/F12培养基 补足至1L
本发明还提供一种优化的多能干细胞培养基，在上述hPLWI培养基的基础上，还增加一牛血清白蛋白(简称BSA)或人血清蛋白(简称HAS)组分，该BSA或HSA的组分配比范围为0.05w.t.％～4w.t.％，为方便区分，将该优化的多能干细胞培养基命名为hPLWII培养基。
以下具体实施例中，该hPLWI培养基的配制方法包括以下步骤：
1、称取L-抗坏血酸-2磷酸镁、***钠、人胰岛素、柠檬酸铁、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子beta1；
2、将步骤1)的上述组分加入DMEM/F12培养基，搅拌均匀；
3、向步骤2)的培养基中加入氯化钠调节渗透压至280～350mosmol/L；
4、用DMEM/F12培养基定容，得到hPLWII培养基。
所述基础培养基除了上述的DMEM/F12培养基外，还可以是其它基础细胞培养基，所述基础细胞培养基应满足：使该多能干细胞培养基的葡萄糖浓度为16-18mmol/L；含有干细胞生长所需的必须氨基酸。
本发明中，该多能干细胞培养基的Fe3+优选浓度为1.2～3.8mM。
以下具体实施例中，采用以下两种培养基进行比较实验：
1、BioCI培养基，其包括基础培养基和以下添加组分：L-抗坏血酸-2磷酸镁、***钠、人胰岛素、人脱铁转铁蛋白、碱性成纤维细胞生长因子(简称bFGF)、转化生长因子beta1(简称TGF-β1)、肝素钠、Dorsomorphin dihydrochloride和碳酸氢钠；
2、BioCISO培养基，其包括基础培养基和以下添加组分：L-抗坏血酸-2磷酸镁、***钠、人胰岛素、人脱铁转铁蛋白、碱性成纤维细胞生长因子(简称bFGF)、转化生长因子beta1(简称TGF-β1)、肝素钠、Dorsomorphin dihydrochloride、碳酸氢钠和BSA。
实施例1：
一种多能干细胞培养基，该培养包括基础培养基和以下添加组分：L-抗坏血酸-2磷酸镁、***钠、人胰岛素、柠檬酸铁、碱性成纤维细胞生长因子(简称bFGF)和转化生长因子beta1(简称TGF-β1)，培养基组分配比范围如下表所示；
表3 实施例培养基组分及含量
组分 用量范围
L-抗坏血酸-2磷酸镁(ug/mL) 64
***钠(ng/mL) 13.6
人胰岛素(ug/mL) 20
柠檬酸铁(ng/mL) 40
碱性成纤维细胞生长因子(ng/mL) 20
转化生长因子beta1(ng/mL) 0.5
氯化钠(调节渗透压mosmol/L) 280～350
DMEM/F12培养基 补足至1L
MTT检测的具体实验操作如下：
1)前期培养：用Matrigel包被iPSC，在BioCI培养基中培养3-15天；
2)取样：用96孔板，5个复孔为一组，取步骤1)中存活iPSC，分别种入具有新的BioCI培养基、1-11号hPLWI培养基和对照培养基；种板量为3000细胞/孔，培养基用量为200ul/孔；
3)换液检测：以种板时间计为Day0，于Day1开始每天换液，于Day1和Day5进行MTT检测，每孔重复检测3次。
其AP染色检测的具体操作为：
1)前期培养：在Matrigel包被过的6孔板中种上30万iPSC细胞/孔，用BioCI培养基培养5天；
2)取样：用6孔板，3个复孔为一组，取步骤1)中存活iPSC，分别种入具有新的BioCI培养基、1～11号hPLWI培养基和对照培养基；种板量为30万细胞/孔；
3)换液检测：以种板时间计为Day0，于Day1开始每天换液，4天传一次，传代前拍照，传5代，进行AP染色检测，每孔重复检测3次。
MTT和AP检测的结果下表如示:
表4 实施例1MTT检测结果和AP检测结果
实验结果表明，实施例1提供的培养基能使iPSC正常地增殖。
实施例2：
本实施例中，采用BioCI培养基和hPLWⅠ培养基进行试验，以比较柠檬酸铁对细胞增殖的影响。
本实施例中，使用BioCI培养基1份、对照培养基1份、hPLWⅠ培养基11份(分别命名为1-11号),其组分和渗透压信息如下表所示：
表5 实施例2培养基的成分和渗透压信息
注：a)采用氯化钠调节渗透压。
1-11 号hPLWⅠ培养基的柠檬酸铁的含量和渗透压信息如下表所示：
表6 1-11号hPLWI培养基的信息
其MTT检测的具体实验操作如下：
1)前期培养：用Matrigel包被iPSC，在BioCI培养基中培养3-15天；
2)取样：用96孔板，5个复孔为一组，取步骤1)中存活iPSC，分别种入具有新的BioCI培养基、1-11号hPLWI培养基和对照培养基；种板量为3000细胞/孔，培养基用量为200ul/孔；
3)换液检测：以种板时间计为Day0，于Day1开始每天换液，于Day1和Day5进行MTT检测，每孔重复检测3次。
MTT检测结果如下表所示：
表7 实施例2培养基的MTT检测结果
其AP染色检测的具体操作为：
1)前期培养：在Matrigel包被过的6孔板中种上30万iPSC细胞/孔，用BioCI培养基培养5天；
2)取样：用6孔板，3个复孔为一组，取步骤1)中存活iPSC，分别种入具有新的BioCI培养基、1～11号hPLWI培养基和对照培养基；种板量为30万细胞/孔；
3)换液检测：以种板时间计为Day0，于Day1开始每天换液，4天传一次，传代前拍照，传5代，进行AP染色检测，每孔重复检测3次。
AP染色检测结果如下表所示：
表8 实施例2培养基的AP染色检测结果
结合表7和表8进行分析，从2～10号hPLWI培养基的MTT检测结果和AP染色检测结果可知，1～300ng/mL范围内的柠檬酸铁对细胞增殖有比较有利的影响；其中，6号hPLWI培养基MTT值和AP值相对最高，说明该柠檬酸铁浓度下的hPLWI培养基能有效促进iPSC的增殖；
由1号hPLWI培养基的MTT检测结果和AP染色检测结果可知，柠檬酸铁浓度低于1～300ng/mL范围，iPSC的增殖较慢；由11号hPLWI培养基的检测结果可知，大于300ng/mL时，会对iPSC增殖造成影响。
另外，在渗透压为340mosmol/L恒定情况下，随着柠檬酸铁浓度的增加(0～40ng/ml范围内)，iPSC增殖能力随之增强，当柠檬酸铁浓度为40ng/ml时，iPSC增殖能力最强。
实施例3：
根据实施例2的结果，我们选择最适的柠檬酸铁浓度40ng/mL，分别取用Matrigel包被、BioCI培养基培养过3～15天的诱导多能干细胞iPSC和人胚胎干细胞H1进行培养试验，种入含下表所示培养基的板孔，分别进行培养和AP染色检测。
表9 实施例3培养基的组分及含量信息
诱导多能干细胞的AP染色检测结果如下表所示，试验时间与增殖倍数的函数关系如图1所示，
表10 不同培养下iPSC的增殖情况
由图1和表10的结果比较我们可以得知，iPSC在BioCI培养基和hPLWI培养基中的增殖速率基本相当；同样，iPSC在BioCISO培养基和hPLWII培养基中的增殖速率也基本相当；
iPSC在hPLWII培养基中的增殖速率显著高于其在hPLWI培养基中增殖速率；同样地，iPSC在BioCISO培养基中的增殖速率显著高于其在BioCI培养基中的增殖速率。
人胚胎干细胞H1的AP染色检测结果如下表所示，试验时间与增殖倍数函数关系如图2所示。
图1和表10的结果显示：柠檬酸铁替代人脱铁转铁蛋白是可行的；BSA对iPSC增殖能力起到促进作用。
表11 不同培养基下H1的增殖情况
结合表11和图2可知，从BioCI培养基和hPLWI培养基的结果比较我们可以得知，在传第1-3代时，H1在BioCI培养基的增殖速率大于其在hPLWI的增殖速率；然而，在传第4-5代时，H1在hPLWI培养基上的增殖速率反超其在BioCI培养基上的增殖速率；H1在BioCISO培养基和hPLWII培养基中的增殖速率基本相当；
从hPLWI培养基和hPLWII培养基的结果比较我们可以得知，BSA组分能有效促进H1细胞的增殖；这种规律同样适用于BioCI培养基。
综上所述，柠檬酸铁作为人脱铁转铁蛋白的一种良好替代品，其不会对多能干细胞或人胚胎干细胞的增殖造成影响；另外，BSA的加入也可有效促进多能干细胞或人胚胎干细胞的增殖。
hPLWII培养基中的BSA组分也可以由HSA替代。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种多能干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和以下添加组分：L-抗坏血酸-2磷酸镁、***钠、人胰岛素、柠檬酸铁、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子beta1。
2.如权利要求1所述的多能干细胞培养基，其特征在于，所述添加组分还包括肝素钠、Dorsomorphin dihydrochloride和NaHCO3。
3.如权利要求2所述的多能干细胞培养基，其特征在于，所述肝素钠的浓度为1～400ng/mL；所述Dorsomorphin dihydrochloride的浓度为25～250nM；所述NaHCO3的浓度为520～570μg/mL。
4.如权利要求1所述的多能干细胞培养基，其特征在于，所述多能干细胞培养基的Fe3+浓度为1.2～3.8mM。
5.如权利要求1所述的多能干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
6.如权利要求5所述的多能干细胞培养基，其特征在于，所述柠檬酸铁的浓度为1～300ng/mL。
7.如权利要求1所述的多能干细胞培养基，其特征在于，所述多能干细胞培养基的葡萄糖浓度为16-18mmol/L。
8.如权利要求1所述的多能干细胞培养基，其特征在于，所述多能干细胞培养基的渗透压为280～350mosmol/L。
9.如权利要求1-8任一项所述的多能干细胞培养基，其特征在于，所述L-抗坏血酸-2磷酸镁的浓度为60～70μg/mL；所述***钠的浓度为10～20ng/mL；所述人胰岛素的浓度为15～25μg/mL；所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为1～100ng/mL；所述转化生长因子-beta1的浓度为0.1～2.0ng/mL。
10.如权利要求1-8任一项所述的多能干细胞培养基，其特征在于，所述L-抗坏血酸-2磷酸镁的浓度为64μg/mL；所述***钠的浓度为13.6ng/mL；所述人胰岛素的浓度为20μg/mL；所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为40ng/mL；所述转化生长因子-beta1的浓度为0.5ng/mL。
11.如权利要求1-8任一项所述的多能干细胞培养基，其特征在于，所述多能干细胞培养基还包括BSA或HSA。
12.如权利要求11所述的多能干细胞培养基，其特征在于，所述BSA的含量为0.05-4w.t.％；HSA的含量为0.05-4w.t.％。
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