KR20120134360A

KR20120134360A - 세포의 역분화 증진용 조성물 및 이를 이용한 유도 만능 줄기세포의 제조방법

Info

Publication number: KR20120134360A
Application number: KR1020110053213A
Authority: KR
Inventors: 이은주
Original assignee: 서울대학교병원
Priority date: 2011-06-02
Filing date: 2011-06-02
Publication date: 2012-12-12
Also published as: WO2012165740A1

Abstract

본 발명은 세포의 역분화 (dedifferentiation) 증진용 조성물 및 이를 이용한 유도 만능 줄기세포의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 엔도텔린 (endothelin) 또는 엔도텔린 유사체를 유효성분으로 포함하는 세포의 역분화 증진용 조성물 및 이를 이용한 유도 만능 줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.

Description

세포의 역분화 증진용 조성물 및 이를 이용한 유도 만능 줄기세포의 제조방법 {Composition for Improving Dedifferentiation of Cells and Method for Producing Induced Pluripotent Stem Cells}

줄기세포 (stem cells)는 무한히 자가 재생할 수 있으면서 신체 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 미분화 세포이다. 줄기세포 연구는 재생의학, 신약 개발과 같은 세포치료제의 개발, 인체 질환의 발병 원인 및 치료, 그리고 인체의 발생 과정을 연구하는 중요한 대상으로 각광받고 있는 연구 분야이다.

만능 줄기세포 (totipotent stem cells)는 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포를 말하며, 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생 가능하다. 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cells)는 수정 4-5일 후 나타나는 배반포 (blastocyte)의 안쪽에 위치한 내세포피 (inner cell mass)에서 유래하며, 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있지만, 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다분화능 줄기세포 (multipotent stem cells)는 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포이다.

줄기세포 중 배아 줄기세포는 착상 전 배아의 내세포피 (inner cell mass)로부터 만들어지며, 적절한 환경 하에서 200가지 이상의 세포로 분화할 수 있고, 기관 전체를 만들 수도 있다 (Nagy et al., Development, 110:815-821, 1990). 그러나 세포치료제로써 배아 줄기세포는 난자를 사용해서 만들어야 하고, 배아를 파괴해야 얻을 수 있다는 윤리적인 문제를 가지며, 또한 면역거부반응이 있어서 임상에 사용하기 어렵다는 것 등과 같은 여러 문제점을 가진다.

최근, 이에 대한 보완책으로 유도 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells)가 보고되고 있다. 유도 만능 줄기세포는 분화가 끝난 세포를 역분화시켜 전분화능 (pluripotency)을 갖는 세포를 지칭하며, 배아 줄기세포와 유사하게 자가재생 할 수 있는 능력을 가지고 신체의 모든 타입의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가진다. 현재까지 유도 만능 줄기세포는 유전자 발현과 분화능에서 만능 줄기세포인 배아 줄기세포와 거의 동일한 성격을 나타내는 것으로 보고되고 있다 (Takahashi and Yamanaka, Cell, 126:663-676, 2006).

유전자 프로모터 (promoter)의 메틸화 (methylation)여부는 유전자의 발현을 조절하는 주된 기전이며, 특정 유전자의 프로모터 부분이 메틸화되면 그 유전자의 발현이 없어지는 것으로 알려져 있다. 발생학적으로, 만능 줄기세포의 전 단계로 분류되는 '원시 생식세포'들은 모든 genomic DNA 메틸화가 백지인 상태로 존재하고, 수정과정을 거치면서 발생,분화하는 과정에서 유전자들의 특이적인 발현의 조절을 위해서 프로모터 메틸화가 이루어진 결과, 분화된 체세포가 형성되고 개체가 완성된다. 따라서, 발생, 분화 과정을 거치면서 이루어진 프로모터 메틸화를 제거하는 것이 세포의 역분화를 위해서 필수적인 관문이 된다.

한편, 유도 만능 줄기세포는 만능성 세포 추출물 처리에 의해 역분화를 유도시키는 방법 또는 역분화 인자를 이용하는 방법 등을 포함한 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.

그러나 만능성 세포의 추출물을 분화된 체세포에 도입하여 체세포를 역분화시키는 방법은 자가 단백질이 아닌 동종 유래 또는 이종 유래이기 때문에, 병원성 감염의 가능성을 배제할 수 없고, 핵심 단백질이 규명되지 않은 상황에서 실험에 따른 조건의 변형이 심하다는 문제가 있다. 더불어, 현재까지 알려진 역분화 유도 방법들과 마찬가지로 낮은 효율을 가지게 되므로, 임상 적용에 있어서 한계점이 있다.

더불어 역분화 유도인자를 이용하여 유도 만능 줄기세포를 제조하는 방법은 역분화 유도인자를 분화된 세포에 전달하는 단계를 필수적으로 포함한다. 구체적으로 유도 만능 줄기세포는 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자들을 레트로 바이러스에 넣어서 체세포에 전달하거나 (Takahashi et al., Cell, 131:861-872, 2007), 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자들을 각각 렌티 바이러스에 넣어 체세포에 전달 (Yu et al., Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cell, Science New York, NY, 2007)하는 방법으로 제조될 수 있다.

그러나 레트로 바이러스나 렌티 바이러스를 사용하여 각각의 유전자를 세포 내부로 도입시켰기 때문에, 상기의 바이러스들이 게놈 상에 불규칙적으로 끼어 들어가 돌연변이를 유발할 수 있고, 발암 유전자를 활성화 시키거나 항암 유전자의 발현을 억제하여 종양을 유발할 수 있다. 더불어 각각 다른 유전자를 발현하는 바이러스들이 동시에 한 세포에 들어갈 확률이 낮기 때문에, 유도 만능 줄기세포 제조 효율이 낮다는 문제점이 있다. 예를 들면, 5×10⁵개의 인간 세포 섬유 아세포로부터 약 10개의 유도 만능 줄기세포가 얻어진다 (Takahashi et al., Cell, 131:861-872, 2007).

이에 본 발명자들은 세포에 엔도텔린을 처리하였을 때, 세포 내에 존재하는 만능성 표지 유전자 뿐만 아니라, 전반적으로 유전자의 발현이 증가되고, 이는 genomic DNA의 디메틸화에 따른 것임을 확인하였으며, 결국 엔도텔린 처리에 의해 기존의 유도 만능 줄기세포 제조방법의 효율을 증진시킬 수 있음을 인지하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 증진된 역분화능을 가지는 세포를 만들 수 있는 역분화 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 증진된 형성 효율을 가지는 유도 만능 줄기세포를 제조하는 방법 및 유도 만능 줄기세포를 유도하는 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엔도텔린 또는 엔도텔린 유사체를 유효성분으로 포함하는 세포의 역분화 증진용 조성물 및 이를 이용한 유도 만능 줄기세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 엔도텔린 또는 엔도텔린 유사체을 유효성분으로 포함하는 유도 만능 줄기세포 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 엔도텔린 또는 엔도텔린 유사체로 세포를 처리하는 경우, 세포 내 다양한 유전자의 프로모터 디메틸화 (demethylation)가 촉진되어, 증진된 역분화능을 가지는 세포를 얻을 수 있어서, 종래 유도 만능 줄기세포의 한계점으로 지적되던 제한된 역분화능을 증진시키는데 유용하다.

도 1은 중배엽 줄기세포에 엔도텔린-1을 처리한 경우, 유전자 발현의 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 중배엽 줄기세포에 엔도텔린-1을 처리한 경우, 유전자 프로모터의 디메틸화 (demethylation)를 나타낸 것이다.
도 3은 중배엽 줄기세포에 엔도텔린-1을 처리한 경우, 만능 줄기세포성 (pluripotency) 유전자의 발현률을 나타낸 것이다.
도 4는 중배엽 줄기세포에 엔도텔린-1을 처리한 경우, Oct-4의 발현률을 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서 사용되는 "엔도텔린"은 혈관 내피세포에서 생성되는 펩타이드로, 21개의 아미노산 잔기로 구성되며 (Yanagisawa M et al.,Nature, 332:411-415, 1988), 혈관 수축 펩타이드로 알려져 있다. 엔도텔린은 한 분자에 2개의 S-S 결합을 가지고 있으며, 엔도텔린 전구체가 변형됨으로써 생성된다.

대부분의 포유류는 엔도텔린-1, 엔도텔린-2 및 엔도텔린-3의 이소펩타이드 엔도텔린을 가지고 있다. 상기 3종류의 이소펩타이드 엔도텔린은 일과성 혈관 확장과 지속적인 혈관 수축 작용에 있어서, 유사한 기능 및 효과를 가진다.

본 발명에서 사용되는 "엔도텔린 유사체 (Endothelin Modifier)"는 21개의 아미노산으로 이루어진 엔도텔린에 있어서, 활성부분인 16번-21번의 아미노산 (서열번호 1)은 포함하되, 1번-15번의 아미노산 중 하나 이상이 변형되거나 결실된 형태를 의미하며, 엔도텔린의 활성을 담당하는 주요부인 16번-21번의 아미노산을 제외한 부분이 변형 또는 결실된 형태를 의미하는 것으로, Endothelin Derivative라고도 불린다. 엔도텔린 유사체는 엔도텔린이 수용체에 binding하는 것과 유사한 기능 및 효과를 가진다 (European Journal of Pharmacology, 174:23-31, 1989; Bioorgmic & Medicinal Chemistry Letters, 4:561-512, 1994).

서열번호 1: His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp

본 발명에서 "변형"이란 엔도텔린을 구성하는 1번-15번의 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 것을 의미하며, "결실"이란 엔도텔린을 구성하는 1번-15번의 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 삭제된 것을 뜻한다.

본 발명에서 "prepro ET (prepro Endothelin)"는 엔도텔린을 coding하는 유전자가 전사되어 최초로 생성되는 212개의 아미노산을 의미하며, prepro ET는 효소의 작용에 의해 38개의 아미노산으로 구성되어진 "big ET (big Endothelin)"을 생성한다. 엔도텔린은 ET 변환 효소 (Endothelin Converting Enzyme : ECM)가 big ET에 작용하여 C-terminal의 아미노산이 떨어져 나가면서 생성된다 (Yanagisawa M et al.,Nature, 332:411-415, 1988).

본 발명에서 사용되는 "세포"는 다양한 유전적 배경 및/또는 기원을 가지는 체세포 또는 줄기세포를 의미한다. 예를 들면 체세포, 중배엽 줄기세포, 외배엽 줄기세포 및 내배엽 줄기세포를 이용하는 것이 가능하며, 바람직하게는 제대혈 유래 줄기세포, 지방유래 줄기세포를 이용하는 것이 가능하다.

"체세포"는 분화가 완료되어, 만능성이 없거나 제한적인 세포를 의미하며, "분화"란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상으로, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 본 발명에서 사용된 체세포는 천연 발생의 체세포 또는 유전자 변형 체세포일 수 있다.

"줄기세포"는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 미분화세포이며 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 분류할 수 있다. "배아 줄기세포"는 분화능력을 가지고 있으나 아직 분화는 일어나지 않은 미분화 세포로, 이러한 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 다양한 조직세포로 분화가 가능한 만능 줄기세포성 (pluripotency)을 가지는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아 줄기세포로부터 유래한 배아체 (embryoid bodies)도 포함한다. "성체 줄기세포"는 모든 조직으로 분화할 수는 없으나 각 표적기관으로는 분화할 수 있는, 제한된 분화능을 가지는 세포를 의미한다. 더불어 "분화능"이란 생물의 초기 발생에서 배의 일부가 주어진 발생 조건에 따라 각종 기관이나 조직으로 분화될 수 있는 능력을 말한다.

본 발명에서는 중배엽 줄기세포에 엔도텔린 또는 엔도텔린 유사체를 처리한 결과, 중배엽 줄기세포의 역분화가 증진되는 것을 확인하였다.

본 발명은 일 관점에서 엔도텔린 또는 엔도텔린 유사체를 유효성분으로 포함하는 세포의 역분화 증진용 조성물 및 세포 내 유전자들의 디메틸화 촉진용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 "역분화 (dedifferentiation)"는 부분 또는 최종 분화된 세포를 만능 또는 다능과 같은 미분화 상태로 되돌려서, 새로운 분화 조직의 형성이 가능하도록 하는 후성학적인 역행 과정을 의미한다. 이러한 역분화 현상은 세포 유전체의 후성학적인 변형 (epigenetic changes)들이 고정되어 있는 것이 아니라 지워지고 다시 형성될 수 있는 가역적인 과정이기 때문에 가능하다. 역분화는 "재프로그램화 (reprogramming)"라고도 불리며, 부분 또는 최종 분화된 세포의 유전적 및 표현적 프로필을 배아줄기세포의 그것과 비슷하도록 변화시키는 과정에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 변화는 메틸화 패턴의 변화, 줄기세포성 유전자의 발현률 변화 등을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서는 중배엽 줄기세포에 엔도텔린-1을 처리하고 24시간 후, vehicle 처리군과 유전자 발현의 차이를 알아보기 위하여 cDNA array를 수행한 결과, 높은 신뢰도 값을 가지는 유전자 표지자 중 97%의 유전자가 turn on되는 것을 확인하였다 (도 1).

본 발명에서 "메틸화 (methylation)"는 염기에 메틸기가 붙는 것을 의미하고 "디메틸화 (demethylation)"는 염기에서 메틸기가 떨어지는 것을 의미한다. 이러한 메틸화에 의해 유전자 발현 패턴이 변화될 수 있다. 유전자의 메틸화는 발현 단백질의 활성을 방해하거나, 발현을 방해하는 효소들을 응집시켜서 (recruiting) 유전자의 발현을 방해한다. 즉, 유전자의 메틸화는 전사 (transcription)를 막아서 유전자를 침묵 (silence)시킨다. 유도 만능 줄기세포에서 Oct 3, Oct 4, Nanog 등의 줄기 세포성과 관련된 유전자의 프로모터는 디메틸화 되어 있는데, 이것은 유도 만능 줄기세포에서 그 프로모터의 활성 및 줄기세포성 관련 유전자의 발현을 입증한다.

본 발명의 다른 실시예에서는 cDNA array결과 대부분의 유전자가 turn on이 되는 기전을 엔도텔린-1에 의한 전반적인 디메틸화 (demethylation)가 유도되는 것으로 보고 이를 증명하기 위해 CpG array를 수행하였다 (도 2).

게놈의 염기서열 중 시토신 (Cytosine)과 구아닌 (Guanine) 두 염기가 연속해서 존재하는 것을 CpG라고 하며, 이 배열에서 시토신이 메틸화되는 경향이 많아 인간게놈의 경우 전체 시토신 중 3~5%는 메틸화되어 있다. 이러한 CpG는 진화과정에서 점차 감소되어 왔으며, 게놈에 존재하는 CpG의 메틸화 정도와 패턴은 포유동물의 종에 따라 다르고 조직에 따라서도 다른 매우 특이적인 양상을 보이고 있다. 인간을 포함한 포유동물의 염기서열에는 CpG가 밀집되어 있는 부위가 존재하는데 이 부위는 0.5~4kb 정도이다. CpG 섬 (CpG island)은 유전자의 전사를 조절하는 영역인 프로모터 부근에 위치하고 있기 때문에 포유동물 게놈의 유전자와 밀접한 연관성을 가지고 있다. 대부분의 CpG 섬은 메틸화되지 않았으며, 만일 특정 유전자의 발현을 개시하게 되는 프로모터 부위의 CpG 섬이 메틸화되어 있다면 특정 유전자의 발현이 억제된 것을 뜻한다. 즉, CpG 섬의 메틸화 현상은 특수한 목적으로 유전자 발현을 조절하는 특수한 분자적 네트워크로 발달된 메커니즘이라고 할 수 있다.

도 2에서 마이너스 값은 디메틸화 영역을 표지하고, 플러스 값은 메틸화 영역을 표지하는데, 24개의 염색체 전 부분에서 마이너스 값으로 표지가 치우친 것을 확인할 수 있으므로, 중배엽 줄기세포에 있어서 디메틸화의 증가로 인한 유전자 발현의 증가는 엔도텔린에 의한 것임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 real-time PCR을 수행하여, 엔도텔린-1을 중배엽 줄기세포에 처리하는 경우, 엔도텔린-1을 처리하지 않은 중배엽 줄기세포 대조군 (naive)에 비하여 만능 줄기세포성 (pluripotency) 유전자로 알려진 E-cadherin, ERAS 및 STAT3의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(도 3).

본 발명에서 사용되는 "만능 줄기세포"는 개체 형성에 필요한 중배엽, 내배엽 및 외배엽을 비롯한 삼배엽 관련 모든 세포로 분화가 가능한 능력을 의미하는 것으로, 줄기세포의 궁극적 능력을 나타낸다. 또한, 만능 줄기세포성 유전자는 이러한 능력을 나타내는 표지자 또는 만능성을 유도할 수 있는 능력을 가진 유전자를 의미하므로, 역분화 유도인자로도 분류되어진다.

E-cadherin은 배아 줄기세포와 유도 만능 줄기세포에서 전분화능과 자가 재생 관련한 신호 경로에 관여하는 것으로 알려져 있으며, ERAS는 줄기세포에서 테라토마 (teratoma)의 생성과 증식을 촉진하는 것으로 이해되고 있다. 테라토마는 여러 종류의 세포와 조직들로 이루어진 종양의 일종이다. 이러한 테라토마는 배아줄기세포의 분화능력을 검증할 때 이용되기도 한다. 모든 조직의 세포로 분화하는 배아줄기세포의 특성 때문에, 쥐와 같은 실험동물에 배아줄기세포를 주사하면, 배아줄기세포가 다양한 종류의 세포와 조직으로 분화하여 테라토마를 형성하게 된다. 그러므로 배아줄기세포를 만드는 마지막 단계에서 테라토마가 만들어진다면 줄기세포가 만들어졌다는 것을 증명한다. 또한 STAT3는 배아 줄기세포의 미분화능을 유지시켜 주는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

아울러, 엔도텔린-1을 중배엽 줄기세포에 처리하는 경우, 대조군 (naive)에 비하여 역분화 유도인자인 Oct-4 유전자의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다 (도 4).

Oct-4 전사인자는 옥타머 전사인자 (Octamer Transcription Factor) 가운데 하나로, 미분화 세포인 배아줄기세포 및 배야종양세포에서만 발현되고 줄기세포의 만능성을 유지하는데 중요한 역할을 한다 (Okamato et al., Cell, 60:461-472, 1990). Oct-4 발현이 정상 수준인 경우 배아 줄기세포의 자가 재생산과 만능성이 유지되지만, 정상 수준 이상으로 증가하게 되면 원시 내배엽과 원시 중배엽으로 분화하고, 반대로 정상 수준 이하로 감소하게 되면 영양 외배엽 세포로 발달한다 (Niwa et al., Nat Genet, 24:372-376, 2000). 그러므로 Oct-4는 배아줄기세포의 만능성을 결정하고 분화를 조절하는 중요한 인자라는 것을 알 수 있다. Oct-4는 Sox2 전사인자와 상호작용을 통해 Oct-4의 하위 유전자인 Fgf4 (Yuan et al., Genes Dev, 9:2635-2645, 1995), Utf-1 (Nishimoto et al., Mol Cell Biol, 19:5453-5465, 2000) 및 Sox2 (Tamioka et al., Nucleic Acids Res, 30:3202-3213, 2002) 유전자들의 발현을 증가시키는 상승효과를 보인다고 알려져 있다. Oct-4와 유사한 구조를 보이는 Oct-1과 Oct-6를 포함한 Oct 패밀리에 속하는 다른 유전자들은 분화된 체세포를 역분화시킬 수 있는 능력이 없고, 유일하게 Oct-4만이 이 과정에 관여하고 있다 (Lowry et al., PNAS, 105:2883-2888, 2008).

이상과 같이, 본 발명에서는 중배엽 줄기세포에 엔도텔린 또는 엔도텔린 유사체를 처리하는 경우, 디메틸화가 촉진되어 세포의 역분화가 증진된다는 것을 예시하였으나, 체세포 및 줄기세포로부터 유도 만능 줄기세포를 제조하는 통상의 방법에 있어서, 세포에 엔도텔린을 처리할 경우, 그 역분화 효율이 증가하리라는 것 역시 당업자에게 자명하다 할 것인바, 본 발명의 범위에 속한다 할 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 세포를 엔도텔린으로 처리하는 단계를 포함하는 유도 만능 줄기세포의 제조방법 및 엔도텔린을 유효성분으로 포함하는 유도 만능 줄기세포 유도용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 "유도 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells)"는 분화된 세포를 재프로그램화 (reprogramming)하여 얻을 수 있는, 만능분화능 (pluripotency)을 가지는 세포를 의미한다.

유도 만능 줄기세포를 제조하는 통상의 방법은 다음과 같다.

만능성 세포의 추출물을 분화된 체세포에 도입하여 체세포를 역분화 시킬 수 있다. 세포를 streptolysin O를 이용해 permeabilization한 후, 만능성 세포 추출물을 처리하고 배양하면 핵의 역분화를 관찰할 수 있다. 인간의 체세포를 Xenopus 난자, 배아생식세포 (embryonic germ cells), 배아암세포 (embryonic carcinoma cell) 또는 배아줄기세포의 추출물에 직접적으로 노출시키면 미분화 마커 유전자가 재발현된다 (Freberg et al., Mol Biol Cell, 18:1543-1553, 2007; Hansis et al., Curr Biol, 14:1475-1480, 2004; Taranger et al., Mol Biol Cell, 16:5719-5735). 만능성 세포의 추출물은 일반적으로 배아 줄기세포 추출물을 뜻하며, 시험관 내에서 배양한 배아 줄기세포를 물리, 화학적 방법을 통하여 잘게 부순 후, 원심분리 등의 방법으로 분리한 물질을 의미한다.

더불어 역분화 인자를 이용하여 유도 만능 줄기세포를 제조할 수 있다. Takahashi와 Yamanaka는 체세포의 만능성을 유도할 가능성이 있는, 선별된 24개의 후보군을 가지고 역분화를 유도하는데 성공하였다. 이들은 Oct-4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 네 가지 인자만을 분리하여 레트로 바이러스 시스템을 통해 생쥐 섬유아세포 내에 발현시키면 후성적 역분화가 일어나고 만능성을 획득하게 되어 배아줄기세포와 유사한 특성이 유도된다는 사실을 밝혔다. 역분화 유도에는 만능성 세포에서만 발현하는 Fbx15 유전자의 프로모터에 의해 네오마이신 항생제 저항성 유전자가 발현되는 생쥐 섬유아세포를 사용하였다. 따라서 역분화된 세포는 네오마이신 항생제를 이용해 쉽게 선별할 수 있다. 더불어 역분화를 위하여 외부에서 도입한 Oct-4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 유전자들의 발현은 역분화가 일어난 후 후성적인 방법에 의해 발현이 억제된다 (Takahashi and Yamanaka, Cell, 126:663-676, 2006).

Yamanaka 그룹은 생쥐에서와 동일한 Oct-4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 네가지 역분화 인자를 사용하여 사람의 체세포를 역분화시키는데 성공하였다. 이때 사용한 사람의 세포는 유전적 조작을 가하지 않은 섬유아세포로, 생성된 역분화 줄기세포는 적절한 분화 조건에서 신경세포나 심장세포로 분화가 가능했다 (Takahashi et al., Cell, 131:861-872, 2007).

또한 인간배아줄기세포를 처음으로 생성하였던 Thomson 그룹의 경우, 인간배아줄기세포와 골수의 전구체 세포를 융합시키면 역분화가 일어난다는 점에 착안하여 골수의 전구체 세포 대비 인간배아줄기세포에서 과발현하는 인자들을 분리해 내었다. 여기에서 얻은 정보를 바탕으로 Oct-4, Sox2, Nanog 및 Lin28의 네 가지 인자를 렌티바이러스 시스템에 도입하여 역분화 줄기세포를 제작하는데 성공하였다 (Yu et al., Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cell, Science New York, NY, 2007).

그러므로 재프로그램화를 위한 유도 만능 줄기세포의 형성을 위해서는, 역분화 유도인자를 체세포 내에 전달하는 단계를 필수적으로 거치게 되며, 구체적으로는 Oct-4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자들을 각각 레트로 바이러스들을 수송체로 사용하여 체세포에 전달하거나 (Takahashi. K. et al, Cell, 131:861-872, 2007), 또는 Oct-4, Sox2, Nanog 및 Lin28의 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자를 각각 렌티바이러스들을 수송체로 사용하여 체세포에 전달하여야 한다.

Sox 패밀리 유전자들은 Oct-4와 유사하게 만능성 유지에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 그러나 Oct-4 유전자가 만능성 줄기세포에만 관여하고 있는 반면 Sox 패밀리 유전자들은 다능성 줄기세포나 단능성 줄기세포와도 관련되어 있다. Sox-2 (SRY-type high mobility group box 2) 전사인자는 Sox 패밀리 단백질 중 유일하게 배아줄기세포의 만능성 유지에 중요한 역할을 한다 (Avilion et al., Genes Dev, 17:126-140, 2003). Oct-4와 마찬가지로 생쥐의 배아줄기세포에서 Sox-2의 발현을 저해하면 분화가 유도된다 (Ivanova et al., Nature, 442:533-538, 2006). 또한 여러 Sox-2 하위 유전자의 프로모터 영역에서 발견되는 Sox-2 결합부위는 종종 Oct-4와 NAnog 결합부위와 인접하게 존재한다 (Boyer et al., Cell, 122:947-956, 2005). 그러므로 Sox-2 전사인자와 Oct-4 전사인자 사이의 상호작용이 유도 만능 줄기세포가 미분화 상태를 유지하고 배아줄기세포의 특성을 나타나게 하는데 기본적인 틀을 제공할 것으로 예상된다 (Lewitzky and Yamanaka, Current Opinion in Biotechnology, 18:467-473, 2007).

c-Myc는 세포 성장, 분화, 증식, 세포 예정사 및 암세포로의 형질 전환 등의 다양한 세포 내 기능을 수행하는 발암 유전자이다. 또한 만능성을 유지하는 주요 기작인 LIF (Leukemia Inhibitory Factor)/STAT3와 Wnt 신호 전달 메커니즘의 하위 유전자로 밝혀졌다 (Sears et al., Genes Dev, 14:2501-2514, 2000). c-Myc 전사인자는 유도 만능 줄기세포 내에서 세포의 증식을 저해하는 것을 막아주는 역할을 하는 것으로 예상되고 있다 (Seoane et al., Nature, 419:729-734, 2002). 또한 c-Myc은 게놈 상에 존재하는 Myc 인식부위에 결합하는 것 뿐만 아니라 염색질 구조를 변화시켜 Oct-4와 Sox-2 가 표적 유전자에 잘 결합할 수 있도록 도와주는 기능을 수행한다 (Lewitzky and Yamanaka, Current Opinion in Biotechnology, 18:467-473, 2007).

Klf4는 성장 억제에 관여하여 세포주기를 조절하는 역할을 한다. 최근 연구에 따르면 c-Myc과 유사하게 배아줄기세포에서 STAT3의 하위 유전자로 작용하며, 과발현시 Oct-4 발현을 유지시켜 생쥐 배아줄기세포의 분화를 억제한다고 밝혀졌다 (Li et al., Blood, 105:635-637, 2005).

Nanog는 배아 특이적인 유전인자로 Oct-4나 Sox-2와 마찬가지로 배아줄기세포의 만능성을 유지하는데 필요한 유전자이다. 또한 LIN28은 mRNA 결합 단백질로 배아줄기세포와 배아종양세포에서 발현되며 분화와 증식에 관여하고 있다고 알려져 있다 (Yu et al., Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cell, Science New York, NY, 2007).

상기와 같이 Oct-4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog 및 Lin28 유전자를 "역분화 유도인자 (reprogramming-inducing gene)"라고 하며, 역분화 유도인자는 분화가 끝난 세포를 재프로그램화 시킬 수 있는 유전자들을 의미한다. 특히 Oct-4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 Yamanaka 인자라고 부른다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 본 실시예에서는 줄기세포에 엔도텔린-1을 처리하는 경우, 디메틸화가 촉진되어 세포의 역분화가 증진된다는 것을 예시하였으나, 체세포 및 줄기세포로부터 유도 만능 줄기세포를 제조하는 통상의 방법에 있어서, 세포에 엔도텔린을 처리할 경우, 그 역분화 효율이 증가하리라는 것 역시 당업자에게 자명하다 할 것인바, 본 발명의 범위에 속한다 할 것이다.

아울러, 본 실시예에서는 줄기세포에 엔도텔린을 처리하는 경우, 디메틸화가 촉진되어 세포의 역분화가 증진된다는 것을 예시하였으나, 체세포 및 줄기세포로부터 유도 만능 줄기세포를 제조하는 통상의 방법에 있어서, 세포에 엔도텔린 유사체를 처리할 경우, 그 역분화 효율이 증가하리라는 것 역시 당업자에게 자명하다 할 것인바, 본 발명의 범위에 속한다 할 것이다.

중배엽 유래 줄기세포의 준비

본 발명에서는 Lonza에서 구매한 인간 중배엽 줄기세포를 사용하였다. 상기 세포는 인간 중배엽 줄기세포 동정 실험을 실시하여 선별된 것으로, 중배엽 줄기세포의 양성 세포 표지자 (CD29, CD44, CD73, CD105, CD166, HLA-ABC) 95% 이상 표현과 음성 세포 표지자 (CD34, CD45, HLA-DR) 5% 미만의 획일적 표현 확인, 및 중배엽 줄기세포의 다중 분화능을 확인한 후, 인간 제대혈 유래 줄기세포로 동정, 분류된 것이다.

cDNA array를 이용한 유전자 발현 차이 분석

상기 중배엽 줄기세포를 α-MEM (Minimum Essential Medium, Invitrogen) + 10% FBS(Fetal Bovine Serum) 배지를 사용하여 부착 배양하였다 (5×10⁵/60@ dish). 배양 24-48시간 후, 0.025㎍/ml의 엔도텔린-1을 배지에 첨가하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양은 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 수행하였고, 세포는 7-9 사이의 계대배양한 상태로 사용하였다. 이후 세포를 샘플링하여 RNA를 채취하고, cDNA array (Aagillent, USA) 를 수행하였다.

먼저, 총 44만 개의 유전자 표지자 중 vehicle을 기준으로 엔도텔린-1 처리 후 1.5배 이상의 유전자 발현 변동 값과 높은 신뢰도 ( < P value 0.05) 값을 보이는 1086개의 유전자를 선별하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 엔도텔린-1 처리시 1053개의 유전자가 turn on 됨을 확인할 수 있었다.

CpG array (Aagillent, USA ) 를 이용한 demethylation 경향 분석

엔도텔린-1 처리군과 비처리군의 genomic DNA를 추출하고, 5-methyl cytosine antibody (Diagenode)를 이용하여 면역 침강시킨 다음, 정제과정을 거쳐 probe가 있는 CpG array (Aagillent, USA)에서 합성을 유도하고 intensity를 비교하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 엔도텔린 처리시 대부분의 유전자가 디메틸화되는 것을 확인하였다. 마이너스 값은 디메틸화 영역을 표지하며 플러스 값은 메틸화 영역을 표지하는데, 24개의 염색체 전 부분에서 마이너스 값으로 표지가 치우친 것을 확인할 수 있으므로, 중배엽 줄기세포에 있어서 디메틸화의 증가로 인한 유전자 발현의 증가는 엔도텔린에 의한 것임을 확인할 수 있었다.

real-time PCR을 이용한 만능 줄기세포성 (Pluripotency) 유전자의 발현량 증가 분석

줄기세포의 역분화를 증진시키는 데 있어서, 만능 줄기세포성(Pluripotency) 유전자 (E-cadherin, ERAS, STAT3)의 발현에 미치는 엔도텔린-1의 영향을 살펴 보았다. RNA 수준에서의 변화를 확인하기 위하여, RT-PCR (Real-time PCR)을 실시하였다. 구체적으로, E-cadherin (서열번호 2 및 3); ERAS (서열번호 4 및 5); 및 STAT3 (서열번호 6 및 7) 유전자 각각에 특이적인 primer들을 제작한 다음, 실시예 1에서 준비된 줄기세포에 엔도텔린-1을 처리하고 24시간 후 RNA를 추출하여 상보적 cDNA를 합성한 다음, 이를 주형으로 하여 RT-PCR을 수행하였다.

서열번호 2: F-GTTCACCATTAACGAGAACA

서열번호 3: R-AATGCCATCGTTGTTCACTG

서열번호 4: F-AACAAAGCCTGGCACCTT

서열번호 5: R-TTCAGAATGCAGTCCCCACT

서열번호 6: F-CCTTTGGAACGAAGGGTACA

서열번호 7: R-GTTGTTCAGCTGCTGCTTTG

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 엔도텔린-1 처리시, 대조군 (naive)과 비교하여 만능 줄기세포성 유전자 (E-cadherin, ERAS, STAT3)의 발현이 증가한 것을 알 수 있었다.

동일한 방법으로, 서열번호 8 및 9의 primer를 이용한 RT-PCR을 수행하여, Oct-4 유전자의 발현에 미치는 엔도텔린-1의 영향을 살펴보았다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군 (naive)과 비교하여 Oct-4의 발현이 증가한 것을 알 수 있었다.

서열번호 8: F-GAGGCAACCTGGAGAATTTG

서열번호 9: R-TAGCCTGGGGTACCAAAATG

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Composition for Improving Dedifferentiation of Cells and Method for Producing Induced Pluripotent Stem Cells <130> P11-B045 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 His Leu Asp Ile Ile Trp 1 5 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-cadherin forward primer <400> 2 gttcaccatt aacgagaaca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-cadherin reverse primer <400> 3 aatgccatcg ttgttcactg 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERAS forward primer <400> 4 aacaaagcct ggcacctt 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERAS reverse primer <400> 5 ttcagaatgc agtccccact 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STAT3 forward primer <400> 6 cctttggaac gaagggtaca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STAT3 reverse primer <400> 7 gttgttcagc tgctgctttg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct-4 foward primer <400> 8 gaggcaacct ggagaatttg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct-4 reverse primer <400> 9 tagcctgggg taccaaaatg 20

Claims

엔도텔린 (endothelin), 엔도텔린 유사체 (Endothelin Modifier), Big ET (Big Endothelin) 및 prepro ET (prepro Endothelin)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 유효성분으로 포함하는 세포의 역분화 증진용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 세포는 체세포 또는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 역분화 증진용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 엔도텔린은 엔도텔린-1, 엔도텔린-2 및 엔도텔린-3으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포의 역분화 증진용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 엔도텔린 유사체는 엔도텔린을 구성하는 21개의 아미노산 중에서, 16번 내지 21번 아미노산에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 그대로 포함하되, 1번 내지 15번의 아미노산 중 하나 이상이 변형되거나 결실된 것임을 특징으로 하는 세포의 역분화 증진용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 prepro ET 및 big ET는 서열번호 1의 아미노산 서열을 순서대로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 역분화 증진용 조성물.
엔도텔린, 엔도텔린 유사체, Big ET 및 prepro ET로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 유효성분으로 포함하는 세포 내 유전자들의 디메틸화 (demethylation) 촉진용 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 유전자는 E-cadherin, ERAS, STAT3, Oct-4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog 및 Lin28으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포 내 유전자들의 디메틸화 촉진용 조성물.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 세포는 체세포 또는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 세포 내 유전자들의 디메틸화 촉진용 조성물.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 엔도텔린은 엔도텔린-1, 엔도텔린-2 및 엔도텔린-3으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포 내 유전자들의 디메틸화 촉진용 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 엔도텔린 유사체는 엔도텔린을 구성하는 21개의 아미노산 중에서, 16번 내지 21번 아미노산에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 그대로 포함하되, 1번 내지 15번의 아미노산 중 하나 이상이 변형되거나 결실된 것임을 특징으로 하는 세포 내 유전자들의 디메틸화 촉진용 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 prepro ET 및 big ET는 서열번호 1의 아미노산 서열을 순서대로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 내 유전자들의 디메틸화 촉진용 조성물.
세포를 엔도텔린, 엔도텔린 유사체, Big ET 및 prepro ET로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 성분으로 처리하는 단계를 포함하는 유도 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells)의 제조방법.
제 12 항에 있어서, 상기 세포는 체세포 또는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 유도 만능 줄기세포의 제조방법.
제 12 항에 있어서, 상기 엔도텔린 처리에 의해 상기 세포내에 존재하는 역분화 유도인자들 (reprogramming-inducing genes)이 디메틸화 (demethylation)되는 것을 특징으로 하는 유도 만능 줄기세포의 제조방법.
제 12 항에 있어서, 상기 세포는 만능성 세포 추출물로 처리된 것임을 특징으로 하는 유도 만능 줄기세포의 제조방법.
제 12 항에 있어서, 상기 세포는 역분화 유도인자가 도입되어 있는 것임을 특징으로 하는 유도 만능 줄기세포의 제조방법.
제 14 항 또는 제 16 항에 있어서, 역분화 유도인자는 Oct-4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin28, E-cadherin, ERAS 및 STAT3 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 유도 만능 줄기세포의 제조방법.
제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도텔린은 엔도텔린-1, 엔도텔린-2 및 엔도텔린-3로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 유도 만능 줄기세포의 제조방법.
제 12 항에 있어서, 상기 엔도텔린 유사체는 엔도텔린을 구성하는 21개의 아미노산 중에서, 16번 내지 21번 아미노산에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 그대도 포함하되, 1번 내지 15번의 아미노산 중 하나 이상이 변형되거나 결실된 것임을 특징으로 하는 유도 만능 줄기세포의 제조방법.
제 12 항에 있어서, 상기 prepro ET 및 big ET는 서열번호 1의 아미노산 서열을 순서대로 포함하는 것을 특징으로 하는 유도 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells)의 제조방법.
엔도텔린, 엔도텔린 유사체, Big ET 및 prepro ET로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 유효성분으로 포함하는 유도 만능 줄기세포 유도용 조성물.
제 21 항에 있어서, 상기 유도 만능 줄기세포는 체세포 또는 줄기세포로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 유도 만능 줄기세포 유도용 조성물.
제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 상기 엔도텔린은 엔도텔린-1, 엔도텔린-2 및 엔도텔린-3로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 유도 만능 줄기세포 유도용 조성물.
제 21 항에 있어서, 상기 엔도텔린 유사체는 엔도텔린을 구성하는 21개의 아미노산 중에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 그대로 포함하되, 1번 내지 15번의 아미노산 중 하나 이상이 변형되거나 결실된 것임을 특징으로 하는 유도 만능 줄기세포 유도용 조성물.
제 21 항에 있어서, 상기 prepro ET 및 big ET는 서열번호 1의 아미노산 서열을 순서대로 포함하는 것을 특징으로 하는 유도 만능 줄기세포 유도용 조성물.