CN111500788A

CN111500788A - 用于人类疱疹病毒感染检测的试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN111500788A
Application number: CN202010472509.1A
Authority: CN
Inventors: 毛花英; 夏江
Original assignee: Pilot Gene Technologies Hangzhou Co ltd
Current assignee: Pilot Medical Technology Shenzhen Co ltd
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2040-05-29
Also published as: CN111500788B

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于人类疱疹病毒感染检测的试剂盒及其检测方法。首先公开了一种同时检测多种疱疹病毒的试剂盒，所述试剂盒包括用于人类疱疹病毒感染检测的引物探针***，所述引物探针***包括如SEQ ID N0：1‑21所示的核苷酸序列组。使用该试剂盒进行疱疹病毒检测，检测周期缩短至3‑4小时，能够快速、高效、准确的测定临床上常见的病毒感染。并且本发明中的检测方法可实时、快速监测病毒感染患者体内的特定病毒的拷贝数变化，及时评估并为临床医生提供辅助治疗建议。本发明中公开的高效的多重多色数字PCR实验方案，相对于传统的多重PCR方案，检测方法更加高效、准确。

Description

用于人类疱疹病毒感染检测的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于人类疱疹病毒感染检测的试剂盒及其检测方法。

背景技术

病毒是一类寄生类生物，一旦到达宿主细胞内，可对宿主细胞正常功能造成严重影响，部分病毒还可感染宿主体内免疫功能细胞，对宿主免疫***造成严重损害，同时也可引发一系列炎性反应。病毒感染对人体危害较大，且增殖速度较快，因而要尽早检出病毒，及时治疗控制病毒增殖。病毒感染是众多疾病的主要病因，目前临床尚无抗病毒治疗的高效药物，临床治疗手段十分有限，但早期治疗可有效控制病情，因而及早检出病毒对于改善患者预后意义重大。

在一项全球的疾病死亡率调查中，急性呼吸道感染是造成死亡人数排在第三的原因，仅次于心、脑血管疾病，其中大部分由下呼吸道感染所引起。引起急性下呼吸道感染的病原谱十分复杂，除了细菌、真菌及不典型病原体外，据统计，有接近50％的患者由病毒感染所致，如流感病毒及其各种亚型、腺病毒等，并且其中多种病毒都具有潜伏期短、致病性强及传播迅速的特点。同时，原有的病毒感染继续流行，值得关注的是新的呼吸道病毒亚型不断出现，变异性大，种类繁多。快速全面且准确的病原体检测技术对于感染诊疗及预防抗生素的滥用至关重要，也是及时使用抗病毒药物的关键。

当前病毒感染检测主要依赖于各类免疫检验手段，随着免疫检验技术的成熟和优化，病毒感染检测准确性不断提升。但是需要指出的是分离培养并不总是成功的。有时病毒生长产生的可见病变效应出现很慢，甚至始终不出现细胞病变效应。疱疹病毒对宿主或组织细胞有各自严格的种属特异性，培养条件非常苛刻，例如HSV和VZV病毒可以在非洲绿猴肾原细胞、人的纤维母细胞及胚胎组织细胞内生长，人类CMV病毒只能在人成纤维细胞培养中增殖，不能在其他动物细胞中生长。病毒在细胞培养中增殖非常缓慢，初次分离时常需一个多月才引起细胞病变。另外，随着抗病毒药物的广泛应用，病毒培养的阳性率呈逐年降低趋势。

病毒分离是诊断病毒感染的金标准。将患者尿液、唾液、血细胞或活检组织等标本，接种于人胚胎成纤维细胞，培养4～6周，培养时间长，不能满足临床的早期检测。抗原血症检测快速、敏感、特异，动态检测抗原血症水平可以预测疾病的发生和判断药物治疗的效果，但该方法仍有以下不足之处：①仅适合于血标本，不适合于脑脊液、尿液、羊水等标本；②标本要求及时处理(一般在4h内)，延迟处理可影响检测结果；③骨髓移植术后早期白细胞缺乏或使用抗病毒药物影响白细胞计数时，抗原检测也受到限制。壳瓶培养改进了传统的细胞培养，加快了检测速度，能用于早期诊断，但对实验技术人员的要求高，工作量大。血清学检测虽然简便，但不适于免疫低下患者的早期检测，通常用于移植前供者、受者感染状况的评价。

疱疹病毒是一类具有包膜的DNA病毒，主要侵犯外胚层来源的组织，包括皮肤、粘膜和神经组织。其感染部位和引起的疾病多种多样，并有潜伏感染的趋向，严重威胁人类的健康。目前已知的人类疱疹病毒包括单纯疱疹病毒(人类疱疹病毒I型和II型，即HSV1和HSV2)、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒等。

目前应用较多的诊断病毒感染的方法包括利用特异性的抗病毒血清检测法、检测病毒抗原的免疫荧光法(FIA)和改进的酶免疫法(EIA)，改进的酶免疫法不需要荧光显微镜，更加简易、快速，但敏感性较低。此外，还包括酶联免疫吸附试验(ELISA)法，该法是目前应用最广、速度最快的方法，但当抗原被稀释时敏感度降低，影响检出率。另外，许多检测抗原的抗体不易获得。尤其是病毒基因组发生变异时，免疫法就可能出现假阴性。

一些研发人员发现应用PCR技术能检测出病毒滴度很低的临床标本中的病毒，还可以对病毒浓度进行定量分析，用于抗病毒疗效的评价，对临床治疗及预后判断具有重要意义，更可以及时了解到病毒的复制状态及传染性。然而，如何应用多重数字PCR技术，从样本中快速准确的检测出多种疱疹病毒含量鲜有报道。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种用于人类疱疹病毒感染检测的引物探针***、试剂盒及检测方法，解决传统的疱疹病毒检测方法培养时间长等问题。

本发明中，采集临床患者体液样本，通过样本的核酸提取后，我们可以简便、快速地针对特定的病毒进行检测，同时数字PCR检测平台可实时对血浆中菌体核酸片段拷贝数进行定量检测，达到临床治疗方案效果实时评估，防止抗生素滥用。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种同时检测多种疱疹病毒的试剂盒，所述试剂盒包括用于人类疱疹病毒感染检测的引物探针***；

所述引物探针***包括：

用于检测HSV1的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：1所示；

用于检测HSV1的反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：2所示；

用于检测HSV1的探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0：3所示；

用于检测HSV2的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：4所示；

用于检测HSV2的反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：5或SEQ ID N0：6所示；

用于检测HSV2的探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0：7或SEQ ID N0：8所示；

用于检测VZV的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：9或SEQ ID N0：10所示；

用于检测VZV的反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：11所示；

用于检测VZV的探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0：12所示；

用于检测EBV的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：13所示；

用于检测EBV的反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：14所示；

用于检测EBV的探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0：15所示；

用于检测CMV的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：16或SEQ ID N0：17所示；

用于检测CMV的反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：18或SEQ ID N0：19所示；

用于检测CMV的探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0：20或SEQ ID N0：21所示。

优选的，所述试剂盒还包括：AceTaq PCR缓冲液、MgCl₂和dNTP mix。

应当理解，本发明中公开的试剂盒成分并不限于以上几种，本领域技术人员可以根据需要添加或替换其他的成分，且均在本发明的保护范围之内。

优选的，所述MgCl₂的浓度为40-60mM；更优选的，所述dNTP mix的浓度为5-10mM。

在本发明的一些具体实施例中，所述MgCl₂的浓度为50mM；所述dNTP mix的浓度为10mM。

优选的，所述试剂盒中，每种人类疱疹病毒的正向引物、反向引物和探针的浓度比为4：4：1。

本发明第二个方面公开了一种检测疱疹病毒的方法，所述方法使用上述的试剂盒对疱疹病毒进行检测。

优选的，所述方法包括：

富集待测样本中的核酸后，使用所述试剂盒，用数字PCR技术进行检测。

更优选的，所述数字PCR技术包括以下步骤：

(1)提取样本核酸；

(2)配置数字PCR反应液；

(3)制备液滴芯片；

(4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出。

需要强调的是，根据本发明的教导，本领域技术人员有能力选择合适的方法，而不限于如上描述的方案。

更优选的，所述数字PCR技术为多种数字PCR技术。

术语“多重数字PCR”是指在同一数字PCR反应体系里加上两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的数字PCR反应。将多重PCR技术与数字PCR技术有机结合而形成的多重数字PCR，根据DNA探针不同荧光度、DNA扩增不同循环数及多种标记荧光同时使用，便可大幅提高数字PCR多重性，多重性可达20-50以上，即同时在一个PCR反应单元内进行20-50个以上的数字PCR反应。

优选的，检测样本类型为肺泡灌洗液、痰液、血液或尿液。

优选的，所述扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性15秒，60℃退火30秒，循环40次。

应当理解，扩增程序并不限于上述程序，本领域技术人员可以根据需要，选择任意合适的扩增程序完成本发明，且均在本发明的保护范围之内。

本发明第三个方面公开了上述的试剂盒或上述的方法在临床领域中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

1.临床中用于检测病毒感染的金标准依然为细胞培养法，该方法培养时间长，且病毒体外培养要求高，很大程度上限制临床治疗方案的实施。本发明中利用肺泡灌洗液、血液、脑脊液、痰液和分泌物等作为临床检测标本，检测周期缩短至3-4小时，能够快速、高效、准确的测定临床上常见的病毒感染，为后续的治疗提供有力的依据，争取宝贵的时间。

2.临床患者的治疗过程中，由于不能确定是哪种病毒感染，常常使用广谱抗病毒药物，造成抗生素滥用。本发明中的检测方法可实时、快速监测病毒感染患者体内的特定病毒的拷贝数变化，及时评估并为临床医生提供辅助治疗建议。

3.数字PCR平台是新型的技术平台，利用数字PCR平台可最大限度地发挥其低拷贝样本中靶基因定量检测性能。本发明中设计、实施高效的多重多色数字PCR实验方案，相对于传统的多重PCR方案，检测方法更加高效、准确。

附图说明

图1为本发明实施例中CMV-CY5结果图；

图2为本发明实施例中EBV-ROX结果图；

图3为本发明实施例中HSV1-FAM结果图；

图4为本发明实施例中VZV-VIC结果图；

图5为本发明实施例中HSV2-FAM+VIC结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

一、核酸提取实验步骤如下：

1.将临床全血样本(10mL)于2950rpm离心15min，取2mL上层血浆于自动提取仪试剂仓孔1中，剩余样本用15mL离心管保存于-80℃。

2.于仓孔1中分别加入200μl Proteinase K，30μl磁珠，1μl Carrier RNA。

3.于仓孔2中加入1mL缓冲液GDF。

4.于仓孔3和4中分别加入1mL漂洗液PWG。

5.于仓孔7中加入50μl洗脱缓冲液TBC。

6.启动自动提取仪进行核酸提取，提取好的核酸转移至1.5mL离心管中，于-80℃保存。

其中，仓孔5和6中未加入溶液，仓孔5和6为提取程序中为了优化步骤预留出的孔槽，可选择使用也可不用。

二、靶基因检测方案

数字PCR检测流程(配置数字PCR反应液、液滴芯片生成及扩增过程)

1、配制20μl的液滴PCR检测体系，具体体系配方分别见表1；

表1

组分	体积(μl)
		10x AceTaq PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	2
MgCl<sub>2</sub>(50mM)	0.4
		dNTP mix(10mM)	0.5
Forward Primer(100μM)	0.2
		Reverse Primer(100μM)	0.2
Probe(25μM)	0.24
		模板	5
总体积	20

备注：表1中反应体系为单引物探针对反应体系，同样适用于多重检测体系。

2、将血浆提取的游离核酸模加入到不同体系中并混匀，模板加入量为5μl，同时配制实验的阳性对照和阴性对照；其中阳性对照使用标准品做模板，阴性对照用水做模板。

3、按照SOP流程将配制好的反应体系加入到液滴芯片加样孔中；将芯片放入样本制备仪，启动仪器生成液滴。

将芯片放入芯片扩增仪中；设置液滴芯片扩增程序，并运行；反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性15秒，60℃退火30秒，循环40次。反应时间大约1小时。

三、液滴芯片阅读、结果分析及报告流程

1、扩增结束后，将芯片架拿出放至数字PCR阅读仪的芯片放置台上，打开GenePMS软件，将芯片放置台的温度调至50℃，并设置软件相应参数；

2、芯片放置5分钟后，选择相应的荧光检测通道，开始芯片扫描并分析结果；

试验结果如图1-图5所示。

3、数据分析与报告输出。

其中本实施例涉及到的引物探针组合序列如表2所示。

表2引物探针组合序列

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 领航基因科技（杭州）有限公司

<120> 用于人类疱疹病毒感染检测的试剂盒及其检测方法

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taccgcgtct acgtccgaag 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatggccggg cagaagtt 18

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacaggtacg acagcac 17

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcatcatcac cgacaaggtc a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcgcggtag ctcagatcct t 21

<210> 7

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgacggcgtt cagc 14

<210> 8

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgacggcgtt cagc 14

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcggctcaag aacggtttg 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

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<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caaggcgggt gcatatctca 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gttcgacttt gccagcctct a 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gttcgacttt gccagccttt a 21

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggggtccac agggtactc 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cggggtccac ggggtactc 19

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctcacaacct ctgctactc 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctcacaacct ttgctactc 19

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgagtccgta gaagggtcct c 21

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctggagaggt caggttactt accc 24

<210> 21

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccgcttacca cctcc 15

Claims

1.一种同时检测多种疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于人类疱疹病毒感染检测的引物探针***；

所述引物探针***包括：

用于检测HSV1的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：1所示；

用于检测HSV1的反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：2所示；

用于检测HSV1的探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0：3所示；

用于检测HSV2的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：4所示；

用于检测VZV的反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：11所示；

用于检测VZV的探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0：12所示；

用于检测EBV的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：13所示；

用于检测EBV的反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0：14所示；

用于检测EBV的探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0：15所示；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：AceTaq PCR缓冲液、MgCl₂和dNTP mix。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述MgCl₂的浓度为40-60mM；优选的，所述dNTP mix的浓度为5-10mM。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，每种人类疱疹病毒的正向引物、反向引物和探针的浓度比为4：4：1。

5.一种检测疱疹病毒的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1-4中任一项所述的试剂盒对疱疹病毒进行检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述数字PCR技术包括以下步骤：

(1)提取样本核酸；

(2)配置数字PCR反应液；

(3)制备液滴芯片；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，检测样本类型为肺泡灌洗液、痰液、血液或尿液。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性15秒，60℃退火30秒，循环40次。

10.根据权利要求1-4所述的试剂盒或权利要求5-9所述的方法在临床领域中的应用。