CN111183229A - 使用有限核苷酸组成的引物的数字扩增 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使用有限的核苷酸组成的引物的数字扩增方法。有限的核苷酸组成是指在至少一个核苷酸类型中引物未被充分代表。这些引物具有大大降低的彼此引发的能力或在不同于目标核酸中的想要的引物结合位点通过错误引发启动扩展的能力。

Description

使用有限核苷酸组成的引物的数字扩增
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年8月11日提交的美国申请US 62/544,605的权益，该美国申请的全部内容通过引用并入本文，用于所有目的。
序列表
本申请包括文件名为517594WOSL，大小为4千字节，于2018年8月10日创建的txt形式的序列表，其通过引用并入本文。
背景技术
聚合酶链反应(PCR)通过使用DNA聚合酶扩增核酸分子而对核酸进行定量。传统的PCR基于扩增是指数形式扩增这一理论而进行。因此，通过将扩增循环数和PCR终产物的量与参比样品的扩增循环数和PCR终产物的量进行比较可对核酸进行定量。
数字PCR(或dPCR)是PCR的一种变型形式，其中，样品被分区，使得样品中单个核酸分子被定位且浓缩于许多离散的区域中，例如，微孔板中，毛细血管中，油乳液中和微型腔室阵列中。每个区域进行单独的PCR。将PCR溶液分至较小的反应中并且随后独立地进行PCR。在多次PCR扩增循环之后，检测带有二进制读数(0或1)的样品荧光。荧光样品的数量提供了初始样品中目标分子数量的指示。虽然目前已对dPCR产生了越来越多的关注，但是，对dPCR结果的解释可能比较复杂，这是由于不期望的扩增产物产生了预期的二进制读数之间的中间值而造成的。
发明内容
本发明提供一种在样品中的目标核酸上进行数字扩增的方法，所述方法包括：将包含目标核酸的样品分为等份，在各个等份中进行扩增反应，其中，如果等份中存在目标核酸的话，那么，目标核酸的扩增片段通过在目标核酸上扩展一对正向引物和反向引物而形成，其中，所述引物在四种标准核苷酸类型中的一种或多种中未被充分代表，所述引物中的未被充分代表的核苷酸类型是相同的；以及检测每等份中扩增的片段(如果有的话)。任选地，扩增的片段是通过扩展正向和/或反向引物形成的主要扩增产物。
任选地，目标核酸的拷贝数由包含或缺乏扩增片段的等份数来确定，例如，根据泊松分布(Poisson distribution)来确定。任选地，样品包含多种目标核酸，并且扩增采用与各个靶点对应的多个正向和反向引物来进行。
任选地，样品包含多种目标核酸，并且扩增采用与各个靶点对应的多个正向和反向引物来进行，所述靶点中的每一个在相同的标准核苷酸类型中未被充分代表，任选地，其中，所述多种核酸为至少2种，至少3种，至少4种，至少5种，至少6种，至少7种，至少8种，至少9种或至少10种。任选地，引物对中的每一个在同一种且仅一种标准核苷酸类型中未被充分代表。
任选地，目标核酸来自不同的染色体或相同的染色体。任选地，目标核酸是DNA,RNA,cDNA，不含细胞的DNA，不含细胞的胎儿DNA或循环肿瘤DNA。任选地，样品是组织或体液。任选地，各个等份中的扩增反应是聚合酶链反应。任选地，各个等份中的扩增反应是等温扩增反应。任选地，各个等份中的扩增反应是等温反应和聚合酶链反应的组合。
在一些方法中，在将包含目标核酸的样品分配至各个等份之前或之后预先扩增目标核酸。在一些方法中，在将包含目标核酸的样品分配至各个等份之前或之后，用化学试剂、蛋白质或酶处理目标核酸。在一些方法中，用亚硫酸氢盐处理目标核酸以确定目标核酸的甲基化状态。
任选地，检测表明预先界定的遗传异常是否存在于目标核酸中。任选地，预先界定的遗传异常是染色体非整倍性，单核苷酸多态性(SNP)，***或删除。任选地，染色体非整倍性是21三体性，18三体性，13三体性，三倍体X或单体性X。任选地，染色体非整倍性基于两个染色体上目标核酸的拷贝数的比例来确定。
任选地，染色体非整倍性基于两个染色体上目标核酸的拷贝数的比例来确定，其中一个染色体产生了非整倍性而另一染色体没有。任选地，本发明的方法在多个目标核酸上进行，所述多个目标核酸包括来自染色体21的目标核酸，来自染色体18的目标核酸和来自染色体13的目标核酸，其中，检测显示目标核酸中的一种包括非整倍性。任选地，本发明的方法在来自种群的样品上进行，其中，所述方法识别包含染色体非整倍性的样品，缺乏非整倍性的染色体和无结果的样品，并且所述方法还包括对来自无结果的样品的DNA进行测序以确定待通过数字扩增确定结果的样品是否具有染色体非整倍性。任选地，所述测序是第二代测序。任选地，所述样品是无细胞核酸样品。任选地，所述无细胞核酸样品来自怀孕的女性并且所述目标核酸是胎儿核酸。任选地，所述胎儿核酸是Y染色体的片段或由Y染色体编码的片段。任选地，所述胎儿核酸相比于相应的母体核酸差异性地甲基化。任选地，所述方法采用包括胎儿核酸靶点和相应的母体核酸靶点的多个目标核酸进行。任选地，所述方法采用包括由溶解的血细胞释放的基因组靶点和无细胞核酸靶点的多个目标核酸进行。
任选地，所述目标核酸包括单核苷酸多态性(SNP)位点，***位点或删除位点。任选地，数字PCR是液滴数字PCR(ddPCR)。任选地，扩增的片段采用***染料进行检测。任选地，DNA***染料是
Figure BDA0002437945330000031
任选地，扩增的片段采用荧光团标记的寡核苷酸探针进行检测。任选地，所述荧光团标记的寡核苷酸探针是Taqman探针，分子信标探针或阴阳探针(ying yang probe)。任选地，荧光团是FAM或HEX。任选地，所述多个目标核酸在单个液滴反应中进行检测。任选地，所述多个目标核酸基于扩增子信号强度进行检测。任选地，所述多个目标核酸的扩增子信号强度由于扩增子的尺寸和/或引物的浓度的不同而是可区别的。任选地，扩增的片段使用DNA***染料和荧光团标记的寡核苷酸探针进行检测。任选地，两个目标核酸是相同的连续核酸的成分。任选地，正向引物和/或反向引物在其5’端连接至核苷酸中未被充分代表的人工序列。任选地，多个目标核酸采用相同的或不同的人工序列进行扩增，所述人工序列在连接至引物对的核苷酸中未被充分代表。任选地，扩增的片段由熔融曲线分析进行检测。
在一些方法中，正向和反向引物在四种标准核苷酸类型中的仅一种中未被充分代表。在一些方法中，正向引物和反向引物包含未被充分代表的核苷酸类型中的不超过两种核苷酸。在一些方法中，正向引物和反向引物的引物结合位点通过搜寻目标核酸的在正向和反向引物中未被充分代表的核苷酸类型的补体中的未被充分代表的引物结合位点来识别。在一些方法中，扩增的片段是通过扩展正向和/或反向引物形成的主要扩增产物。
在一些方法中，引物具有一个且唯一一个未被充分代表的标准核苷酸类型并且未被充分代表的标准核苷酸类型的补体在引物中的至少一个的3’终点位置出现。在一些方法中，未被充分代表的标准核苷酸类型的补体在每个引物的3’终点位置出现。在一些方法中，引物具有且具有唯一一个未被充分代表的标准核苷酸类型，并且所述未被充分代表的核苷酸类型在引物中的一个的5’终点位置出现。在一些方法中，未被充分代表的核苷酸类型在所有引物的5’终点位置出现。
附图说明
图1显示了目标核酸和示例性的三种核苷酸引物和引物结合位点。上图显示了目标核酸的含有与反向引物结合位点(ATG位点)相邻的正向引物结合位点(ATC核苷酸)的补体的目标核酸的一个链。下图显示了与相对链上的各个结合位点结合的引物。可在存在dTTP,dATP,和dGTP(以及其他典型PCR成分)的条件下进行扩增，但是dCTP不是必须的，因为在扩增的目标核酸的链中没有G核苷酸。图1中的序列是(从上至下)SEQ ID NO:72,SEQ IDNO:73(图示的反方向以显示SL中的5’至3’)，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75(图示的反方向以显示SL中的5’至3’)。
图2显示了其中引物结合位点显示了三种核苷酸类型的组成的引物的三个错配(正向引物)或两个错配(反向引物)的模板。图2中序列(从上至下)是SEQ ID NO:76(图示的反方向以显示SL中的5’至3’),SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78(图示的反方向以显示SL中的5’至3’),SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81(图示的反方向以显示SL中的5’至3’),SEQ ID NO:82,SEQ ID NO:83(图示的反方向以显示SL中的5’至3’)。
图3显示了错配结合试剂的实例。图3中的序列是(从上至下)SEQ ID NO:84(图示的反方向以显示SL中的5’至3’)；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:86(图示的反方向以显示SL中的5’至3’)；和SEQ ID NO:87。
图4显示了三种核苷酸类型的引物结合位点被包括所有四种核苷酸类型的片段分隔开的模板的扩增。扩增在所有四种核苷酸类型的单核苷三磷酸存在的条件下进行。
图5显示了带有连接至适于数字扩增的荧光团的未被充分代表的核苷酸类型的引物。
图6A和图6B显示了使用三种核苷酸类型的引物未被充分代表的引物的两步dPCR扩增方法。
图7A和图7B比较了数字PCR平台中三种核苷酸引物和四种核苷酸引物之间的背景荧光。
图8显示了用于区分三体型样品和整倍性样品的5-多路复用dPCR反应结果。
图9显示了用于检测或定量cffDNA中拷贝数变化的14-多路复用dPCR反应的结果。
图10显示了用于检测或定量cffDNA中拷贝数变化的15-多路复用dPCR分析的结果。
具体实施方式
释义
除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属的技术领域中通常理解的含义相同的含义。下列释义是对本领域中的那些释义的补充并且涉及本申请，但不外推至任何相关或非相关的情况，例如，任何常规使用的专利或申请。虽然在实践测试本发明时可使用与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但是本文所述的材料和方法是优选的。因此，本文使用的术语意在仅仅描述特定实施方式，无意对本发明进行限制。使用单数形式冠词“a”或“an”的实体是指该实体的一个或多个，例如，单数形式的核酸“a nucleic acid”代表了一个或多个核酸。因此，冠词“a”(或“an”)，术语“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”可在本文中互换使用。
核酸包括DNA和RNA并且DNA-RNA嵌合体可以是双链的或单链的。DNA可以是基因组的，cDNA，甲基化的DNA或合成的DNA。RNA可以是mRNA，miRNA，tRNA，rRNA，hnRNA，甲基化的RNA等等。术语“核酸”包括单体单元的任何物理串，其可对应于核苷酸串，包括核苷酸的聚合物(例如，典型的DNA或RNA聚合物)，肽核酸(PNA)，修饰的寡核苷酸(例如，包含对于溶液中的生物RNA或DNA非典型的碱基的寡核苷酸，例如，2’-O-甲基化的寡核苷酸)，等等。核酸可以是例如单链或双链的。
四种传统核苷酸碱基是A,T/U,C和G，其中，T存在于DNA中并且U存在于RNA中。在靶点中发现的核苷酸通常是天然核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)。这也是形成引物的核苷酸的情况。
核酸链的互补性是指链由于其核碱基组之间的氢键合而形成稳定的双倍体。DNA中互补的碱基是A和T，C和G，RNA中互补的碱基是C和G，U和A。当链进行最大比对时，各个链中的核苷酸形成这些链中的一个链时，各个链中的核苷酸是互补的(沃森-克里克配对)。在对链进行最大比对时，当核苷酸没有形成互补对时，核苷酸发生了错配。链的互补可以是完全的或大量的。两个链之间的完全互补是指两个链可形成如下双倍体，该双倍体中的每个碱基通过沃森-克里克配对原则与互补碱基结合。大量互补是指大多数碱基配对但不必链中的所有碱基均形成沃森-克里克配对，从而在杂交条件下(例如，盐浓度和温度)形成稳定的杂交复合物。例如，一些引物可以是带有引物结合位点的双倍体，尽管其带有1个，2个或3个错配位置，只要这些错配不位于3’端并且优选地不靠近3’端(例如，位于距3’端的4个核苷酸的位置)。这些条件可通过使用序列和预计杂交的链的Tm的标准数学计算方法来预测，或者使用常规方法通过经验确定Tm来预测。Tm是指两个核酸链之间形成的杂交复合物群的50％发生变性的温度。在低于Tm的温度条件下，有利于杂交复合物的形成，而在高于Tm的温度条件下，有利于杂交复合物中的链的熔融或分离。可以使用例如Tm＝81.5+0.41(％G+C)-675/N-％错配来估算1M NaCl水溶液中具有已知的G+C含量的核酸的Tm，其中，N＝总碱基数。
错配是指核酸的一个链中的核苷酸没有或无法通过沃森-克里克碱基配对原则与相对互补的核酸链中的核苷酸配对。错配的实例为，但不限于：AA,AG,AC,GG,CC,TT,TG,TC,UU,UG,UC,和UT碱基对。错配可发生在DNA和DNA分子之间，DNA和RNA分子之间，RNA和RNA分子之间，其他天然的或人工核酸类似物之间。
错配结合试剂是未被充分代表的引物中的任何分子或任何修饰，所述未被充分代表的引物可通过化学相互作用或物理相互作用稳定未被充分代表的引物与未被充分代表的引物结合位点的杂交。未被充分代表的引物的修饰可以任何方式进行修饰，只要给定的修饰与给定的未被充分代表的引物的易于测定的期望的功能相容。修饰包括碱基修饰，糖修饰或骨架修饰。一些小分子可通过氢键结合至错配的碱基，其可能与未配对的碱基中的那些小分子互补，并且一些小分子可以较高的碱基选择性稳定双倍体。金属离子已显示出与核酸发生相互作用，用于形成核酸结构和折叠。Ono A.,Togashi H.(Ono&Togashi,2004,Angewandte Chemie(International Ed.in English),43(33),4300–4302)显示了将汞离子加至溶液中会使得带有T-T错配的DNA双倍体的Tm提高5℃。Torigoe H.,Okamoto I.等人，(Torigoe et al.,2012,Biochimie,94(11),2431–2440)显示了银离子选择性结合并稳定C-C错配。Cordier C.,Pierre V.C.等人(Cordier,Pierre,&Barton,2007,Journal ofthe American Chemical Society,129(40),12287–12295)已设计并合成了一系列能够以高选择性识别错配位点的铑复合物。Nakatani K.,Sando S.,等人(Nakatani,Sando,Kumasawa,Kikuchi,&Saito,2001,Journal of the American Chemical Society,123(50),12650–12657)已研发出一系列选择性识别错配的DNA的基于萘啶的小分子。
杂交条件或重组条件包括包含核酸的水溶液或有机溶液的化学成分及其浓度(例如，盐，螯合剂，甲酰胺)以及一个核酸链通过互补链相互作用与另一核酸链结合产生杂交复合物的混合物的温度。
样品是可能存在一个或多个目标核酸的组合物，包括病人样品，植物或动物材料，废品材料，用于法医分析的材料，环境样品，循环肿瘤细胞(CTC)，无细胞DNA，液体活检样品，等等。样品包括任何组织、细胞或衍生自可能含有目标核酸的活体或死亡的生物体的提取物，例如，外周血，骨髓，血浆，血清，包括***，呼吸***组织或渗出物，胃肠组织，尿液，粪便，***或其他体液在内的活检组织样品。特定的目标样品是来自具有或怀疑具有疾病或病症(特别是被病毒感染)的人或动物的组织样品(包括体液)。其他目标样品包括工业样品，例如，用于水测试，食物测试，污染控制等等的样品。样品的成分可包括目标核酸和非目标核酸以及其他材料(例如，盐类，酸类，碱类，清洁剂，蛋白质，碳水化合物，脂质和其他有机或无机材料)。样品在扩增前可以经过或不经过纯化目标核酸的处理过程。进一步的处理可以是用清洁剂或变性剂进行处理以从细胞或病毒中释放核酸，除去或惰化非核酸成分以及浓缩核酸。
“目标核酸”是指存在于或可能存在于样品中的核酸分子或相关核酸分子群。目标核酸可包括由引物结合位点界定的待扩增的片段。所述片段可以是整个核酸或其长度可进行扩增的任何片段。目标核酸可以是整个染色体，基因或cDNA并且目标片段可以是例如，仅40-500个这些核苷酸。目标片段可存在于结构的任何链上(正义或反义)。目标核酸可以是RNA(例如，病毒RNA，微小RNA，mRNA，cRNA，rRNA，hnRNA，cfRNA)或DNA(基因组，人体，cfDNA，cffDNA或cDNA)等等。
目标核酸可以来自病原微生物，例如，病毒，细菌或真菌，或者可以是患者内源性的。病毒核酸(例如，基因组，mRNA)形成用于病毒序列分析的有用的靶点。可被检测的病毒的一些实例包括：HIV，肝炎病毒(A，B或C)，疱疹病毒(例如，VZV,HSV-1,HAV-6,HSV-II,CMV和爱泼斯坦巴尔(Epstein Barr)病毒)，腺病毒，XMRV，流感病毒，虫媒病毒，埃可病毒，鼻病毒，柯萨奇病毒，冠状病毒，呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒，轮状病毒，麻疹病毒，风疹病毒，细小病毒，牛痘病毒，HTLV病毒，登革病毒，MLV-相关病毒，***瘤病毒，软疣病毒，脊髓灰质炎病毒，狂犬病病毒，JC病毒和虫媒性脑炎病毒。这些细菌的实例包括：衣原体，立克次体菌，分歧杆菌，葡萄球菌，连锁球菌(treptocci)，肺炎链球菌，脑膜炎球菌和conococci，克雷伯氏菌，变形杆菌，沙雷氏菌，假单胞菌，军团杆菌，白喉，沙门氏菌，杆菌，霍乱，破伤风，肉毒梭菌(botulism)，炭疽，鼠疫，钩端螺旋体病，莱姆氏病细菌，链球菌或奈瑟氏菌。rRNA是用于对细菌进行分型的特别有用的目标核酸。对人或动物基因的检测对于检测疾病的存在或疾病的易感性而言非常有用。可进行检测的基因的实例包括癌症基因融合，BRACA-1或BRAC-2,p53,CFTR，细胞色素P450，用于基因分型(例如，法医识别，父本检测，当作为纯合体发挥作用时基因的杂合载体，HLA分型)，确定个体上的药效(例如，伴随诊断)以及其他用途。
未被充分代表的核苷酸类型是存在于引物或引物结合位点中不超过20％的位置上的核苷酸。通常，如果引物中一种核苷酸类型未被充分代表，那么在引物结合位点上其补体也未被充分代表(反之亦然)。虽然，在本发明的方法中，可能不存在标准核苷酸类型中的一种或多种，但是通常，引物具有A,G,C,T或,A,G,C,U的核苷酸组合。引物可包括非中性核苷酸，例如，Iso C和IsoG,deaza G或deaza A。这些核苷酸与对应的标准核苷酸在确定未被充分代表的核苷酸的数量或百分含量中采用相同的方式。如果类似物与其他天然核苷酸具有相同的相对配对亲和性，那么类似物与天然核苷酸相对应。因此，deazaG或肌苷是G的类似物，这是因为与其他天然核苷酸中的任一种相比它们更强地与C配对。作为一个实例，如果G是未被充分代表的核苷酸类型，为了确定引物中未被充分代表的核苷酸类型的百分含量，deazaG被包括在分子中(也包括在分母中)并且deaza A仅包括在分母中。因此，包含一个G，一个deaza G并且总量为20个核苷酸的引物中的未被充分代表的核苷酸的百分含量为10％。通常，在内部位置，未被充分代表的核苷酸的类型存在于0个单元，1个单元或2个单元中并且任选地，在每个引物中，一个未被充分代表的核苷酸类型存在于5’末端位置或者在每个引物结合位点处，一个未被充分代表的核苷酸类型存在于0个，1个，2个，3个或4个单元中，并且，在人工序列中，一个未被充分代表的核苷酸类型存在于0个单元中。理想地是，一个且唯一一个未被充分代表的核苷酸类型存在于5’末端位置。如果四个核苷酸类型中的一个且唯一一个是未被充分代表的，那么其是四种标准核苷酸类型中被最少代表的(包括无代表)。如果引物包含简并位置，那么该位置被计算为未被充分代表的核苷酸类型位置(即，在分子和分母中)(如果简并包括未被充分代表的核苷酸类型，否则仅包括在分母中)。在结合至天然核苷酸类型中并未优先结合的核苷酸类似物以与具有简并位置的情况相同的方式进行处理。包含未被充分代表的核苷酸类型的引物被称为未被充分代表的引物。包含未被充分代表的核苷酸类型的探针被称为未被充分代表的探针。
术语“dNTP”通常是指包含磷酸酯，糖和三磷酸盐形式的有机碱的单个脱氧核苷酸或包含磷酸酯，糖和三磷酸盐形式的有机碱的脱氧核苷酸的组合，所述脱氧核苷酸提供用于DNA合成的DNA聚合酶所需的前体。dNTP混合物可包括天然生成的脱氧核苷酸中的每一种(即，腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))。在一些实施方式中，天然生成的脱氧核苷酸中的每一个可被合成的类似物(例如，肌苷，isoG,IsoC,deaza G,deaza A，等等)取代或补充。当在引物或探针中核苷酸未被充分代表时，核苷酸被称为未被充分代表的核苷酸。所述未被充分代表的核苷酸可以脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸或核糖核苷酸的形式被包括在反应体系中。它们的补体被称为未被充分代表的核苷酸的互补核苷酸。术语“ddNTP”通常是指包含磷酸酯，糖和三磷酸盐形式的有机碱的单个双脱氧核苷酸或包含磷酸酯，糖和三磷酸盐形式的有机碱的双脱氧核苷酸的组合，所述双脱氧核苷酸提供用于DNA合成的DNA聚合酶所需的前体。ddNTP混合物可包括天然生成的双脱氧核苷酸中的每一个(即，腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))。在一些实施方式中，天然生成的双脱氧核苷酸中的每一个可被合成的类似物(例如，肌苷，isoG,IsoC,deazaG,deaza A，等等)取代或补充。术语“NTP”通常是指包含磷酸酯，糖和三磷酸盐形式的有机碱的单个核糖核苷酸或包含磷酸酯，糖和三磷酸盐形式的有机碱的核糖核苷酸的组合，所述核糖核苷酸提供用于RNA合成的RNA聚合酶所需的前体。NTP混合物可包括天然生成的核糖核苷酸中的每一个(即，腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，尿嘧啶(U))。在一些实施方式中，天然生成的核糖核苷酸中的每一个可被合成的类似物(例如，肌苷，isoG,IsoC,deazaG,deaza A，等等)取代或补充。
在本发明中，引物结合位点或探针结合位点可与未被充分代表的引物结合位点或未被充分代表的探针结合位点互换使用。引物结合位点是目标核酸中与引物杂交的完全位点或部分位点。部分位点可通过提供小支点和结合序列来补充，其还包含WO2016/172632中描述的部分引物结合位点。来自小支点或结合序列的部分结合位点可与目标核酸上的部分引物结合位点结合以形成完全引物结合位点。
在本发明中，术语“引物”或“探针”与未被充分代表的引物或未被充分代表的探针互换使用。引物或探针是与分布在整个目标核酸或部分目标核酸上的引物或探针结合位点互补的寡核苷酸。引物或探针可在其5’端与在目标核酸未发现的或不与目标核酸互补的另一核酸连接(有时称为尾部)。5’尾部具有人工序列。对于与引物或探针结合位点完全互补的引物或探针而言，引物或探针与尾部之间的界限易于出现在从引物或探针的3’端开始移动遇到的第一个非互补核苷酸开始的尾部。对于与引物结合位点基本互补的引物而言，引物的最后一个核苷酸是从引物的3’端开始遇到的与引物结合位点互补的最后一个核苷酸，引物的3’端有助于引物与目标核酸结合(即，带有5’核苷酸的引物相对于不带有5’核苷酸的引物对目标核酸具有更高的TM)。引物和引物结合位点中的核苷酸之间的互补或未互补由沃森-克里克碱基配对原则决定或不依赖于各个序列之间的最大比对。
引物或探针是寡核苷酸。术语“寡核苷酸”包含单数形式的“寡核苷酸”以及复数形式的“寡核苷酸”并且是指核苷酸，核苷，核碱基或在本发明的扩增方法以及后续的检测方法中用作试剂的相关化合物中的两个或多个的任何聚合物。寡核苷酸可以是DNA和/或RNA和/或其类似物和/或DNA RNA嵌合体。术语寡核苷酸不表示试剂的任何特定功能，其通常用于涵盖本文所述的所有这些试剂。寡核苷酸可发挥各种不同的功能，例如，如果其能够与互补链杂交并可在和核酸聚合酶存在的条件下进一步扩展的话，其可作为引物；如果其包含被RNA聚合酶识别的序列并且能够发生转录，其可提供启动子；其可包含用于信号产生/扩增的检测试剂并且如果其处于合适的条件下和/或被适当地修饰，其可阻止杂交或防止引物扩展。本发明中的特定寡核苷酸在下文中更加详细地描述。本文使用的寡核苷酸几乎可以是任何长度，该长度仅由其在扩增反应中或在检测扩增反应的扩增产物中的特定功能来限定。界定了序列和化学结构的寡核苷酸可由传统技术(例如，通过化学合成或生物化学合成)以及重组核酸分子(例如，细菌或病毒载体)的体外或体内表达来生产。如本文公开的内容所预期的，寡核苷酸不是由单独的野生型染色体DNA或其体内转录产物构成。寡核苷酸可以任何方式进行修饰，只要给定的修饰与给定的寡核苷酸的期望的易于测定的功能相容。修饰包括碱基修饰，糖修饰或骨架修饰。碱基修饰包括但不限于：使用除了腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶之外的下列碱基：C-5丙炔，2-氨基腺嘌呤，5-甲基-胞嘧啶，肌苷和dP以及dK碱基。核苷亚单元的糖基团可以是核糖，脱氧核糖及其类似物，包括例如：具有取代核糖呋喃基团的2’-O-甲基(2’-O-ME)的核糖核苷。参见“Method for AmplifyingTarget Nucleic Acids Using Modified Primers,”(Becker,Majlessi,&Brentano,2000,美国专利US6,130,038)。其他糖修饰包括但不限于：2’-氨基，2’-氟代，(L)-α-苏糖呋喃(threofuranosyl)和pentopuranosyl修饰。核苷亚单元可通过诸如磷酸二酯键之类的连接键，修饰的连接键连接或通过不会阻碍寡核苷酸与其互补的目标核酸序列杂交的非核苷酸基团连接。修饰的连接键包括标准磷酸二酯键被不同的连接键(例如硫代磷酸酯连接键或甲基磷酸酯连接键)取代的那些连接键。核碱基亚单元可通过例如采用假肽骨架取代DNA的天然脱氧核糖核酸骨架来连接，例如，通过羧甲基连接体将核碱基连接至中心二级胺的2-氨基乙基甘氨酸骨架。(具有假肽骨架的DNA类似物通常被称为“肽核酸”或“PNA”，其在Nielsen et al.,“Peptide Nucleic Acids,”(Nielsen,Buchardt,Egholm,&Berg,1996,美国专利5,539,082)中公开)。其他连接键修饰包括但不限于：吗啉键。寡核苷酸或本发明所考虑到的寡聚体的非限定性实例包括：含有双环和三环核苷和核苷酸类似物(LNA)的核酸类似物。参见，Imanishi et al.,“Bicyclonucleoside and OligonucleotideAnalogues,”(Imanishi&Obika,2001,美国专利USNo.6,268,490)；以及Wengel et al.,“Oligonucleotide Analogues,”(Wengel&Nielsen,2003,美国专利US6,670,461)。本发明考虑到了任何核酸类似物，条件是修饰的寡核苷酸可发挥其预期的功能，例如，在严格杂交条件下或扩增条件下与目标核酸杂交或与DNA或RNA聚合酶发生相互作用，从而启动扩展或转录。在检测探针的情况下，修饰的寡核苷酸还必须能够在严格杂交条件下优先与目标核酸杂交。寡核苷酸(或其他核酸)的3’末端可使用下文所述的阻断基团通过多种方式被阻断。“被阻断的”寡核苷酸无法通过在其3’-末端添加核苷酸，通过DNA或RNA依赖性DNA聚合酶进行有效扩展，从而产生DNA的互补链。这样，“被阻断的”寡核苷酸可能不是“引物”。
术语“简并的引物”是指在不同的位置具有不同的碱基的类似引物的混合物(Mitsuhashi,J.Clin.Lab.Anal.,10(5):285 93(1996)；von Eggeling et al.,Cell.Mol.Biol.,41(5):653 70(1995)；(Zhang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5847 5851(1992)；Telenius et al.,Genomics,13(3):718 25(1992))。这些引物可包括肌苷，因为肌苷能够与腺苷，胞嘧啶，鸟嘌呤或胸腺嘧啶进行碱基配对。简并的引物能够使多种可能相关的目标序列重组并扩增多种可能相关的目标序列。使目标DNA重组的简并的引物可充当进一步扩增的引发位点。简并的区域是引物发生改变的区域，而引物的其他区域可保持相同。简并的引物(或区域)表示多于一个引物并且可以是随机的。随机引物(或区域)表示未被选择的序列，并且其可以是简并的但尚未被简并。在一些实施方式中，3’目标特异性区域具有约5℃至50℃的Tm。在一些实施方式中，15-mer具有低于60℃的Tm。
引物“3’片段或3’结合区域或3’结合位点或3’杂交区域”能够结合至以特定频率出现在基因组中的基因组序列或其他核酸序列。在一些实施方式中，该频率为约0.01％至2.0％，例如，约0.05％至0.1％或约0.1％至0.5％。在一些实施方式中，引物的“结合位点”的长度主要取决于基于生物信息学计算的预期的PCR产物的长度。“结合位点”的长度的定义包括但不限于：长度为约4个至12个碱基的“结合区域”。在更加具体的实施方式中，3’结合区域的长度可以为例如约4个至20个碱基，或约8个至15个碱基。具有约10℃至60℃Tm的结合区域包括在该定义中。本文使用的术语“引物结合片段”是指指定序列的引物。
聚合酶是可使杂交至模板的引物进行模板定向扩展的酶。其可以是DNA聚合酶，RNA聚合酶或逆转录酶。DNA聚合酶的实例包括：大肠杆菌DNA聚合酶I，Taq DNA聚合酶，肺炎链球菌DNA聚合酶，Tfl DNA聚合酶，抗辐射奇异球菌DNA聚合酶I，Tth DNA聚合酶，Tth XLDNA聚合酶，结核杆菌DNA聚合酶I，甲烷杆菌(M.thermoautotrophicum)DNA聚合酶I，单纯性疱疹-1DNA聚合酶，T4 DNA聚合酶，thermosequenase或野生型或修饰的T7 DNA聚合酶，Φ29聚合酶，Bst聚合酶，Vent聚合酶，9°Nm聚合酶，DNA聚合酶I的Klenow片段。逆转录酶的实例：AMV逆转录酶，MMLV逆转录酶，HIV逆转录酶。RNA聚合酶的实例包括：T7 RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶，细菌RNA聚合酶和真核RNA聚合酶。
扩增是指通过模板定向引物扩展(靶向扩增)产生额外的拷贝或所有目标核酸的拷贝或目标核酸的片段的拷贝或者扩增检测信号用于定性/定量测量(信号扩增)或这两者。扩增可在温度循环条件下或等温条件下或组合的条件下进行。扩增可以是线性的或指数型的。
核酸靶向扩增的许多已知的方法需要进行热循环以可选地使双链核酸变性并使引物进行杂交，然而，核酸扩增的其他已知的方法是等温的。聚合酶链反应(通常称为PCR，Mullis,1987U.S.Patent No.4,683,202；Saiki et al.,1985,Science(New York,N.Y.),230(4732),1350–1354)使用多个变性循环，使引物对重组至相对链以及使引物扩展以指数的方式增加目标序列的拷贝数。在称为RT-PCR的改变的实施方式中，将逆转录酶(RT)用于从mRNA产生互补的DNA(cDNA)并随后通过PCR扩增cDNA以产生DNA的多个拷贝(Gelfand etal.,“Reverse Transcription with Thermostable DNA Polymerases—HighTemperature Reverse Transcription,”(Gelfand,1994,U.S.Pat.Nos.5,322,770；Gelfand&Myers,1994,U.S.Pat.Nos.5,310,652)。扩增核酸的另一方法称为LCR方法(连接酶链反应，Laffler,Carrino,&Marshall,1993,Annales De Biologie Clinique,51(9),821–826)。LCR(Laffler et al.,1993,Annales De Biologie Clinique,51(9),821–826)基于两个相邻的探针与目标序列杂交并通过连接酶彼此连接的反应。两个探针在不存在目标核苷酸序列的条件下不发生连接，因此，连接的产生的存在代表了目标核苷酸序列。LCR方法还需要控制互补链从模板上分离的温度。另一方法是置换扩增(George T.Walker,Little,&Nadeau,1993,U.S.Pat.No.5,270,184；George T.Walker,1995,U.S.Pat.No.5,455,166；G.T.Walker et al.,1992,Nucleic Acids Research,20(7),1691–1696,1992,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,89(1),392–396)，其通常称为SDA，将引物序列对的重组循环用于目标序列的相对链，在dNTP存在的条件下扩展引物以产生双倍体半硫代磷酸酯化引物扩展产物，半修饰的限制核酸内切酶识别位点的核酸内切酶介导的切口以及从切口的3’端开始的聚合酶介导的引物扩展，从而取代已存在的链并产生用于下一轮引物重组的链(切口和链置换)，这产生产物的基因组扩增。在基本相同的方法中，嗜热SDA(tSDA)在较高的温度下使用嗜热核酸内切酶和聚合酶(Fraiser,Spargo,Van,Walker,&Wright,2002,European Pat.No.0 684315)。其他扩增方法包括：基于核酸序列的扩增(Compton,1991,Nature,350(6313),91–92,Malek,Davey,Henderson,&Sooknanan,1992)，其通常称为NASBA，一种这样的方法使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子自身(Lizardi,Guerra,Lomeli,Tussie-Luna,&Russell Kramer,1988,Nature Biotechnology,6(10),1197–1202)；基于转录的扩增方法(Kwoh et al.,1989,Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,86(4),1173–1177)；自我维持的序列复制(3SR)(Guatelli etal.,1990,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America,87(5),1874–1878；Landgren(1993)Trends in Genetics9,199-202；and Lee,H.et al.,NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TECHNOLOGIES(1997))；以及转录介导的扩增(Kwoh et al.,1989,Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,86(4),1173–1177；Kacian&Fultz,1995,美国专利US5,480,784；Kacian&Fultz,1996,美国专利US5,399,491)，其通常被称为TMA。对于已知的扩增方法的进一步讨论请参见Persing,David H.,1993,“In Vitro Nucleic Acid AmplificationTechniques”in Diagnostic Medical Microbiology:Principles and Applications(Persing et al.,Eds.),pp.51-87(American Society for Microbiology,Washington,D.C.)。适用于本发明的其他示例性的扩增方法还包括滚环扩增(RCA)(Fire&Xu,1995,Proceedings of the National Academy of Sciences,92(10),4641–4645；Lizardi,1998,美国专利US5,854,033)；使用切口试剂的核酸扩增(Van Ness,Galas,&Van Ness,2006,美国专利US7,112,423)；切口和扩展扩增反应(NEAR)(Maples et al.,2009,US2009-0017453A1)；解旋酶依赖性扩增(HDA)(Kong,Vincent,&Xu,2004,US 2004-0058378A1；Kong,Vincent,&Xu,2007美国专利申请US2007/0254304A1)；以及环介导的等温扩增(LAMP)(Notomi&Hase,2002,美国专利US6,410,278)，以及四重引物扩增(Quadruplexpriming amplification，Analyst,2014,139,1644-1652)；Expar扩增(PNAS April 15,2003 100,4504–4509)，交叉引物扩增(Sci Rep.2012；2:246)，SMAP扩增(Nature Methods04/2007；4(3):257-62)，多置换扩增(MDA,Proceedings of the National Academy ofSciences 2005,102(48):17332–6)，重组酶聚合酶扩增(Journal of Clinical Virology54(4):308–12)，单引物等温扩增(SPIA)(clinical chemistry,2005vol.51no.10 1973-1981)。
扩增的另一方面是信号扩增。当提供足够量的待检测的核酸时，直接检测该序列而非产生该靶点的更多的拷贝(例如，如PCR和LCR产生的)是具有优势的。传统的直接检测方法包括Northern和Southern印迹法以及RNase保护分析法，其通常需要使用放射性并且不适用于自动化操作。其他技术想要消除对放射性的使用和/或改善自动化形式的灵敏度。循环探针反应(CPR)(Duck,Alvarado-Urbina,Burdick,&Collier,1990b,BioTechniques,9(2),142–148)使用长嵌合寡核苷酸，其中，中心部分由RNA构成而两个末端由DNA构成。探针与目标DNA的杂交并暴露于热稳定的RNase H使得RNA部分被消化。这使得双倍体中剩余的DNA部分不稳定，从而从目标DNA中释放出探针的剩余部分并使得另一探针分子重复该过程。分支的DNA(bDNA，在Urdea et al.,1987,Gene,61(3),253–264中描述)涉及带有分支结构的寡核苷酸，该寡核苷酸使得每个单独的寡核苷酸带有35至40个标签(例如，碱性磷酸酶)。虽然这提高了杂交事件的信号，但是非特异性结合的信号也类似地得到提高。其他信号扩增包括：核酸的侵入性裂解(Prudent,Hall,Lyamichev,Brow,&Dahlberg,2006,美国专利US7,011,944)，杂交链反应(HCR)(R.M.Dirks&Pierce,2004,Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,101(43),15275–15278,R.Dirks&Pierce,2012,U.S.Pat.No.8,105,778)以及G-四重基于DNA酶的比色检测，CHA扩增(J.Am.Chem.Soc.,2013,135(20),pp 7430–7433)，SMART信号扩增(Biotechniques2002Mar；32(3):604-6,608-11)。
可定性(即，相对于对照的阳性信号)或定量(与绝对值相关信号强度或产生扩增产物的分析物的相对量)地检测扩增产物。检测可包括但不必需进行进一步的分析，例如，对扩增产物进行测序。本发明提供的方法还可包括直接检测捕获的反应产物或扩增反应产物中的特定核酸，例如，特定目标扩增子或扩增子组。因此，本发明的混合物可包含包括TAQMANTM在内的指定的探针组，其中，TAQMANTM使用包含可检测的报告体和淬灭基团的可水解的探针，该可水解的探针以5'->3'核酸外切酶活性由DNA聚合酶释放(Livak,Flood,&Marmaro,1996,U.S.Pat.No.5,538,848)，分子信标，其使用带有报告体以及位于相对末端的淬灭基团的发夹探针(Tyagi,Kramer,&Lizardi,1999,U.S.Patent No.5,925,517)；荧光共振能量转移(FRET)引物，其使用分别带有荧光供体和受体基团的一对相邻的引物(Wittwer,Ririe,&Rasmussen,2001,美国专利US6,174,670)；以及LIGHTUPTM，其是单个的短探针，其在与靶点结合使仅发射荧光(Kubista&Svanvik,2001,美国专利US 6,329,144)。类似地，SCORPIONTM(Whitcombe,Theaker,Gibson,&Little,2001,美国专利US 6,326,145)和SIMPLEPROBESTM(Wittwer et al.,2003,美国专利US 6,635,427)使用单个报告体/染料探针。扩增子检测探针可根据上述参考文献中使用且讨论的特定检测形式来设计。其他检测方法包括：凝胶电泳，质谱或毛细管电泳，熔融曲线，基于核酸的荧光螯合染料(例如，SYBRTM绿)或使用荧光探针和水溶性淬灭剂检测扩增产品(Will,Gupta,&Geyer,2014,美国专利US8,658,366)。
术语“多重扩增”是指多于一个目标核酸的扩增。例如，其可以是指来自相同样品的多个序列的扩增或某个样品中的若干个序列中的一个的扩增，如George T.Walker,Nadeau,&Little,1995美国专利US 5,422,252；和George T.Walker,Nadeau,Spears,etal.,1995,美国专利US 5,470,723中所讨论的，这两篇参考文献提供了多链置换扩增的实例。该术语也是指存在于多个样品中的一个或多个序列的同时或逐步扩增。
术语“数字聚合酶链反应”或“dPCR”是指用于直接定量和克隆扩增包括DNA，cDNA或RNA在内的核酸的传统聚合酶链反应(PCR)方法的精炼版本，其可以直接定量测量目标核酸的量。数字PCR通过将存在于样品中的单独的目标核酸分子划分为多个单独的反应腔室中的多个等份来实现这种直接定量测量，所述多个单独的反应腔室能够定位并浓缩扩增产物至可检测的水平。优选地，样品被划分为以最多的等份(例如，至少50％，75％，90％，95％或99％)接受待检测的每个目标核酸的0个或一个分子。在PCR扩增之后，任何腔室中存在的信号是目标核酸存在的指示并且包含PCR终产物的腔室的计数是对绝对核酸定量的直接测量结果。通常通过稀释的方式在毛细管中，微乳液中，微型腔室阵列中或核酸结合表面上捕获或分离单个核酸分子可能会受到影响。数字PCR的基本方法在例如Sykes et al.,Biotechniques 13(3):444-449,1992；and Vogelstein and Kinzler,Proc Natl AcadSci U S A 1999；96:9236-41中描述。本文所述的扩增的其他形式(例如转录介导的扩增)可以数字的方式类似地进行。
术语“实时扩增”是指随着反应的进行监控反应产物(即，扩增子)的量的扩增反应。实时扩增的形式主要在用于监控反应产物的检测机理上发生改变。检测方法的综述请参见Mackay,Arden,&Nitsche,2002,Nucleic Acids Research,30(6),1292–1305，其通过引用并入本文。
术语“检测标签”是指可用于提供或有助于提供可检测的信号(优选地可以量化的信号)并且可连接至核酸或蛋白质的任何原子或分子。标签可提供可由荧光、放射性、比色法、重量分析法、磁性、酶活性等检测的信号。检测标签可以如下多种方式被合并：(1)引物包含标签，例如，连接至碱基，核糖，磷酸酯或核酸类似物中的类似结构；(2)使用标签修饰碱基或核糖(或核酸类似物中的类似结构)处的核苷酸三磷酸酯；随后将标签修饰的核苷酸通过诸如聚合酶之类的扩展酶并入新合成的链；(3)(酶反应之后)使用包含可用于添加可检测的标签的官能团的修饰的核苷酸；(4)使用包含可用于以类似的方式添加可检测的标签的官能团的修饰的引物；(5)可使用直接标记部分增强子并与部分增强子杂交的标签探针；(6)可并入扩增的产物中的标签；(7)可与扩增反应的副产物发生反应的标签。
术语“热循环(“thermally cycling,”“thermal cycling”,“thermal cycles”或“thermal cycle”)”是指从总的变性温度至重组(或杂交)温度，至扩展温度并回到总的变性温度的温度变化的重复循环。该术语也是指变性温度和扩展温度的重复循环，其中，重组温度和扩展温度合并在一个温度中。总的变性温度将所有双链片段解开成单链。重组温度使得引物与核酸模板的单个链的互补序列杂交或重组。扩展温度允许扩增子的初始DNA链进行合成。
术语“反应混合物”，“扩增混合物”或“PCR混合物”是指从核酸模板扩增至少一个扩增子所必需的成分的混合物。所述混合物可包含核苷酸(dNTP)，热稳定聚合酶，引物以及多个核酸模板。混合物可还包括Tris缓冲液，单价盐和Mg2+。各个成分的浓度是本领域已知的并且可被进一步优化。
术语“扩增的产物”或“扩增子”是指使用诸如PCR之类的扩增方法中的引物对由聚合酶扩增的DNA的片段。
术语“荧光团”是指吸收限定激发波长下的光能量并发射不同的限定波长下的光能量的基团。
术语“淬灭剂”包括任何如下基团，当该基团位于靠近荧光标签的位置时其能够吸收被激发的荧光标签的能量并且能够耗散该能量。淬灭剂可以是荧光淬灭剂或非荧光淬灭剂，其也被称为暗淬灭剂。上文列出的荧光团若靠近另一荧光团可发挥淬灭剂的作用，其中，可发生FRET淬灭或接触淬灭。优选地是，使用不发射任何可见光的暗淬灭剂。暗淬灭剂的实例包括但不限于：DABCYL(4-(4’-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸)琥珀酰亚胺酯，二芳基罗丹明羧酸，琥珀酰亚胺酯(QSY-7)，和4’,5’-二硝基荧光素羧酸，琥珀酰亚胺酯(QSY-33)，淬灭基团(quencherl)，或黑洞淬灭剂Black Hole
Figure BDA0002437945330000191
(BHQ-1,BHQ-2和BHQ-3)，核苷酸类似物，核苷酸G残基，纳米颗粒和金颗粒。
术语“突变”是指目标核酸序列中与指定的野生型目标核酸的典型形式不同的一个或多个核苷酸。指定的野生型序列是序列的最常见的等位基因形式，该序列首次发现的形式和/或与正常表型(非患病的表型)相关的序列形式。单个核苷酸多态性(SNP)是突变的一种形式。
术语“表面”是指核酸可共价连接于其上的任何固体表面，例如，乳胶小珠，葡聚糖小珠，聚苯乙烯，聚丙烯表面，聚丙烯酰胺凝胶，金表面，玻璃表面和硅胶晶圆。优选地，固体支撑体是玻璃表面。
术语“连接至表面”是指包括通过化学方式可修饰的官能团在内的任何化学或非化学的连接方法。“连接”涉及通过共价连接或不可逆的主动吸收或通过两个分子之间的亲和性使核酸固定在固体支撑体上(例如，通过生物素化的分子固定在亲和素包被的表面上)。连接必须具有足够的强度，不会通过DNA-变性条件下的水洗涤或水性缓冲液的洗涤而被除去。
粘性末端是与核酸的双链片段相邻的核酸的单链末端。带有互补序列的粘性末端的核酸可通过粘性末端进行重组并彼此连接。
人工序列是缺乏与已知存在于样品中或怀疑可能存在于样品中的天然生成的目标核酸的互补性的序列或至少无意具有该互补性的序列。人工序列可用作连接与目标核酸杂交的片段的连接体，或用作标记的引物的尾部，等等。
术语“染色体非整倍性”是指表现出异常数量的染色体的任何遗传缺陷。例如，染色体非整倍性可包括但不限于：具有多于或少于任何一个染色体的正常数量，以及除了正常对之外还具有任何一个染色体的额外部分，或在正常对中缺少任何一个染色体的一部分。在一些情况下，异常可包括多于一个染色体，或多于一个或多个染色体的一个部分。常见的染色体非整倍性疾病包括但不限于：三体型，例如，21三体型，其中，患病的患者的基因组具有三个染色体21，而非正常的两个(即，一对)染色体21。在较为罕见的情况下，患者除了具有正常一对染色体21之外还可能具有染色体21的额外的碎片(小于全长)。在其他情况下，部分染色体21可移动至另一染色体，例如，染色体14。在该实施例中，染色体21被称为“与染色体非整倍性相关的染色体”并且另一不相关的染色体(即，存在于患者的基因组的正常对中的染色体，例如，染色体1)是“参比染色体”。还有一些情况是相关染色体的数量小于正常数量2。特纳综合症(Turner syndrome)是染色体非整倍性的一个实例，其中，女性体内的X染色体的数量从2减少至1。
“基因标志物”是指多核苷酸序列或对参比染色体的基因序列中存在的多核苷酸序列进行的修饰，所述参比染色体具有已知的允许识别的物理位置。一些基因标志物的实例包括但不限于：基于多核苷酸序列的差异(例如，多态性)待彼此区分的不同的等位基因(例如，来自两个不同的个体的等位基因，例如，来自胎儿的等位基因和来自孕妇的等位基因)，或存在序列或完全不存在序列(例如，存在于男性胎儿的Y染色体上但不存在于孕妇的基因组中的序列)。在本文中，位于与染色体非整倍性相关的染色体上的“甲基化标志物”是指具有异常数量的染色体上的基因多核苷酸序列，或者在具有染色体的额外碎片或缺乏部分染色体的情况下，“甲基化标志物”位于相关染色体的碎片中或部分相关染色体中。甲基化标志物的甲基化特性方面的差异使得能够区分来自两个不同的个体(例如，胎儿和孕妇)的相应的甲基化标志物。
术语“单核苷酸多态性”或“SNP”是指相同基因的不同等位基因中单个核苷酸残基处存在的多核苷酸序列变化，所述基因可以是位于来自相同个体的相同染色体的两个拷贝上的相同基因(例如，来自胎儿的两个等位基因)或可以是来自两个不同个体(例如，胎儿和孕妇)的相同基因。该变化可发生在基因的编码区域或非编码区域(例如，启动子区域或其附近，或内含子)或者位于基因间区域中。检测一个或多个SNP能够区分单个基因的不同的等位基因。
术语“简单串联重复多态性”是指相同基因的不同等位基因中核苷酸序列的串联重复(例如，一个或多个核苷酸的串联重复)的改变量中显示的多核苷酸序列的改变，所述相同基因可以是位于来自相同个体(例如，胎儿)的相同染色体的两个拷贝上的相同基因或可以是来自两个不同个体(例如，胎儿和孕妇。)的相同基因。这种改变通常出现在基因的非编码区域(例如，启动子区域或其附近区域，或内含子)中，或出现在基因间区域中。串联重复数量的差异的检测能够区分单个基因的不同等位基因。
术语“***-删除多态性”是指在相同基因的不同等位基因之间以存在或不存在短核苷酸序列(例如，1至3个核苷酸)所表示的多核苷酸序列的变化，所述相同基因可以是位于相同个体(例如胎儿)的相同染色体的两个拷贝上的相同基因或可以是来自两个不同个体(例如，胎儿和孕妇)的相同基因。这种变化既可发生在基因的编码区域中也可发生在基因非编码区域(例如，启动子区域或其邻近区域，或内含子)中，或发生在基因间区域中。检测是否存在短核苷酸序列能够区分单个基因的不同等位基因。
术语“血液”是指血液样本。该术语包含全血或血液的任何部分，例如，传统定义的血清，血浆中的无细胞DNA以及血浆。血液样本的实例包括但不限于：来自孕妇或待检测可能怀孕的妇女的制剂，带有监测可能的疾病或感染的个体的制剂。
术语“亚硫酸盐”是指所有类型的亚硫酸盐，例如，亚硫酸钠，其能够在不对甲基化的胞嘧啶进行化学修饰的情况下通过化学方法将胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)并且因此可用于基于DNA的甲基化状态差异性地修饰DNA序列。
术语“基因座”是指由参比基因组组装(例如，在UCSC基因组浏览器上人基因组2006年3月的组装(hg18))的染色体(即，基因组位置或染色***置)上起始核苷酸位置至终点核苷酸位置界定的DNA片段。基因座可能与基因、CpG岛或转录/翻译的任何产物的基因组位置重叠或可能不与基因、CpG岛或转录/翻译的任何产物的基因组位置重叠。例如，基因座通常可包括但不限于：由实验数据(例如，MeDIP芯片数据集)和后续的包含不同的DNA甲基化水平的数据分析(例如，MAT，TAS)识别的连续DNA片段。基因座可包含一个或多个CpG位点。基因座可以被再分为适于进行分析(例如，Epityper分析，亚硫酸盐测序，多核苷酸扩增和测定)的更短的片段(例如，含有CpG的基因组序列，片段或区域)。基因座可发展为一个或多个胎儿表观遗传标志物。在本申请中，基因座也是指由一些生物信息学标准识别的连续DNA片段。
术语“分子计数”是指能够对分子数或分子复合物的数量进行定量测量的任何方法，通常测量不同特征的其他共存的分子或复合物中的相对数量。分子计数的各种不同的方法在如下参考文献中描述，例如，Leaner et al.,Analytical Chemistry 69:2115-2121,1997；Hirano and Fukami,Nucleic Acids Symposium Series No.44:157-158,2000；Chiu等人,Trends in Genetics 25:324-331,2009；和美国专利US 7,537,897。
I.概述
WO2016/172632中描述了使用有限核苷酸组成的引物的扩增方法，其要求2015年4月24日提交的美国专利US62/152,752的权益，该美国专利和该PCT申请的全部内容均通过引用并入本文，用于所有目的。本文公开了这些引物在数字扩增(例如，数字PCR)中的使用。
II.引物设计
本发明使用通过有限核苷酸组成的单个引物或一对正向和反向引物的扩增方法。有限核苷酸组成是指在至少一种核苷酸类型中未被充分代表的引物。这些引物具有大大降低的由在目标核酸的非预期的引物结合位点上的错误引导而启动的彼此引发或扩展的能力。这些用于靶点特异性扩增的引物的使用需要识别目标核酸中的引物结合位点，所述引物结合位点支持引物结合和扩增。在一些目标核酸中，可识别对有限核苷酸组成的引物具有完全互补性的引物结合位点。更加通常地，目标核酸中的有限核苷酸组成的片段自身太短而无法用作引物结合位点。然而，这些位点可适于通过有限核苷酸组成的引物由下文所述的多种技术进行扩增，所述多种技术包括使用辅助小支点或连接寡核苷酸，与引物结合位点错配杂交的引物，错配稳定试剂和引物中有限量的未被充分代表的核苷酸的存在，其在WO2016/172632中进一步描述。
a.基本原理
本发明的方法以引物的有限核苷酸组成的基本概念开始，在所述引物中，一种或多种核苷酸类型(例如，A,T,C但没有G)未被充分代表并随后选择目标核酸中的最佳引物结合位点，用于与所述组成(例如，A，T和G)的引物配对。基于所选择的引物结合位点，引物的核苷酸组成可随后被进一步调节(例如，产生有限数量的未被充分代表的核苷酸的单元)以改善其与引物结合位点的互补性。
优选的引物设计为四种标准核苷酸类型中的一种且唯一一种在正向和反向引物这两者中未被充分代表。换言之，这些引物可由A,T/U和C以及未被充分代表的G构成，由A,T/U,G和未被充分代表的C构成，A,G和C以及未被充分代表的T构成，或T,G和C以及未被充分代表的A构成。未被充分代表的核苷酸类型优选地为G或C。如果未被充分代表的核苷酸类型都存在于引物中，优选地是，其存在于非3’核苷酸的位置上，最优选地，其存在于5’核苷酸的位置或连接至引物的5’核苷酸的5’尾部核苷酸的位置。将5’未被充分代表的核苷酸包括在引物内能够提高引物结合的熔融温度(TM)，而不会显著增加不想要的扩增产物。
优选地，引物的3’核苷酸由未被充分代表的核苷酸类型的补体占据。例如，如果未被充分代表的核苷酸类型为G，那么3’核苷酸优选地为C，反之亦然。末端C或G抑制引物二聚体扩展，这是因为引物上没有与其配对的互补碱基。一种核苷酸类型的消除或未被充分代表基本上限制了可在引物之间形成沃森-克里克碱基对的核苷酸的数量或可在引物和错配的引物结合位点之间形成沃森-克里克碱基对的核苷酸的数量。引物的3’核苷酸的正确的碱基配对对于其支持模板依赖性扩展的能力而言是最为重要的。在该位置使用未被充分代表的核苷酸类型的补体大大减少了引物二聚体和引物错配扩展。
引物设计的其他特性与传统引物类似。引物具有与其引物结合位点互补的序列。一些引物的长度为至少15个核苷酸，至少20个核苷酸，至少25个核苷酸，至少30个核苷酸，至少35个核苷酸或至少40个核苷酸。一些引物的长度为不超过25个核苷酸，不超过30个核苷酸，不超过40个核苷酸，不超过50个核苷酸或不超过75个核苷酸。引物可具有这些下限长度和上限长度的任何排列组合，例如，长度为15至50个核苷酸，20至30个核苷酸或30至40个核苷酸。引物与其引物结合位点的熔融温度可以是例如45至80℃，或优选地55至65℃。根据惯例，对于与其中一个链是编码链的相对链结合的引物而言，正向引物与非编码链互补，因此，扩展的产物是编码链，反向引物与编码链互补，因此，扩展的产物是非编码链。对于不具有编码链和非编码链的目标核酸而言，任意指定正向引物和反向引物。这也是正向引物和反向引物结合至相同链上的引物结合位点的情况。引物可具有不与目标核酸互补的5’尾部。这些尾部可用于连接荧光团或淬灭剂，或可包含识别编码，或可连接与其目标核酸互补的引物的非连续片段。
扩增条件在缓冲液、Mg2+、酶、温度等方面通常与传统引物类似。传统扩增采用作为dNTP单体存在的所有四种标准核苷酸类型进行。可进行使用有限核苷酸组成的引物的扩增，但是还可在不存在未被充分代表的核苷酸类型的补体的条件下或在存在较低浓度的未被充分代表的核苷酸类型的补体的条件下或在存在作为ddNTP提供的未被充分代表的核苷酸类型的补体的条件下进行扩增。
通常但非一成不变地，正向和反向引物结合至目标核酸的相对链。因此，目标核酸的一个链包含例如正向引物结合位点的补体和反向引物结合位点，并且另一链包含正向引物结合位点和反向引物结合位点的补体。在一些形式中，正向和反向引物结合位点位于相同链上。例如，连接的正向和反向引物可结合至相同链上的结合位点并且通过滚环机制进行扩增。一些三向结合引物对也可结合至相同的核酸链上的位点，这样一个引物用作其他引物的模板。
因为引物结合位点应当与引物互补，因此，在目标核酸中寻找合适的引物结合位点由引物设计原理来说明。例如，对于使用在单个核苷酸类型中未被充分代表的引物而言，一个引物可寻找用于正向引物结合位点和反向引物结合位点的目标核苷酸，所述正向引物结合位点和反向引物结合位点在引物中未被充分代表的核苷酸类型的补体中未被充分代表。优选地，识别其中不存在未被充分代表的核苷酸类型的补体的正向引物结合位点和反向引物结合位点。然而，如果没有发现这些位点，那么也可使用其他引物结合位点，优选地是未被充分代表的核苷酸类型的补体的单元数被最小化的那些引物结合位点。通常，引物中未被充分代表的核苷酸类型的补体其自身是在引物结合位点中未被充分代表的，但这不是必须的。一些正向和反向结合位点均具有不超过4个，3个，2个或1个的引物中未被充分代表的核苷酸的补体单元。
对于ATC引物而言，软件可用于寻找连续的或邻近的ATC和ATG区域，其分别代表了正向引物结合位点的补体和反向引物结合位点。为了使用ATG引物，软件可寻找ATG和ATC区域，其分别用于正向引物结合位点的补体和反向引物结合位点。为了使用CGA引物，软件可寻找CGA和CGT区域，其分别代表正向引物结合位点的补体和反向引物结合位点。为了使用CGT引物，软件可寻找CGT和CGA区域，其分别用于正向引物结合位点的补体和反向引物结合位点。
正向引物结合位点的补体(或如果其与反向引物位于相同的链上，为正向引物结合位点)和反向引物结合位点可彼此相邻或由在目标核酸的链中介入的核苷酸分隔开。所述介入的核苷酸(如果有的话)可不包括引物及其补体中的未被充分代表的核苷酸，或可包括这些核苷酸中的一个或两个以及四种标准核苷酸类型中的其他两个中的任一个。如果正向引物结合位点的补体(或如果其与反向引物位于相同的链上，为正向引物结合位点)和反向引物结合位点不是相邻的，正向引物结合位点的补体(或正向引物结合位点其自身)和反向引物结合位点应当足够靠近(例如，不超过100个核苷酸，不超过500个核苷酸，不超过1000个核苷酸或不超过10000个核苷酸)在一起以引发与扩增技术相容的扩展。
图1显示了正向和反向引物分别由A，T和C核苷酸以及位于3’位置的C核苷酸构成的方法的简要示意图。换言之，G是未被充分代表的核苷酸类型。反向引物结合位点由A，T和G(C的补体并且在引物中未被充分代表)构成。所显示的正向引物结合位点的补体由A，T和C构成，这暗示了正向引物结合位点(类似于反向引物结合位点)由A，T和G构成。正向和反向引物优选地分别与正向和反向引物结合位点互补。正向引物结合位点的补体和反向引物结合位点是相邻的。扩增产物可在由与正向或反向引物，A，T和G中的三种核苷酸类型互补的三种核苷酸三磷酸酯单体提供反应时形成。如本文所述的，引物二聚体的形成以及错误引发会被抑制，这是因为引物之间和/或引物与错配的引物结合位点之间几乎没有碱基发生配对。但是，即便引物可充分地结合至足以启动扩展的不期望的引物结合位点，也没有扩增产物形成，这是因为无论何时扩展的链需要合并C时扩增混合物中被省略的核苷酸三磷酸酯单体将扩增进行至终止子。
可选地，如图4所示，引物结合位点可以是不相邻的并且可被包括所有四种标准核苷酸在内的区域分隔开。在这样的情况下，使用所有四种标准核苷酸三磷酸酯单体进行扩增。
b.引物结合位点和引物之间的错配
图2显示了更加典型的情形，其中，对目标核酸的正向和反向引物结合位点的寻找显示没有合适的具有与由A,T,C核苷酸构成的引物完全互补的正向和反向引物结合位点对(即，没有其中完全不存在未被充分代表的核苷酸类型的引物结合位点)。最长的ATC区域包含7个核苷酸(CATCCTC)并且最长的ATG区域(CGATTGGTATG)包含12个核苷酸。这些区域不足够长以用作引物，因为它们的Tm太低。在这种情况下，可使用与引物结合位点错配的引物。在图2中，正向引物结合位点具有三个C单元并且反向引物结合位点具有与引物中的C-核苷酸比对的两个C单元。因此，当这些引物和引物结合位点彼此杂交时，在正向引物及其结合位点之间存在三个错配位置并且在反向引物及其结合位点之间存在两个错配。尽管如此，仍然出现杂交和扩展，虽然效率较低。如果反应混合物中提供有错配稳定试剂，那么可增加杂交和扩展。错配结合或稳定试剂是未被充分代表的引物中的任何分子或任何修饰，所述未被充分代表的引物可稳定未被充分代表的引物通过化学相互作用或物理相互作用与未被充分代表的引物结合位点的杂交(参见图3)。可以任何方式对未被充分代表的引物进行修饰，只要给定的修饰与给定的未被充分代表的引物的易于确定的期望功能相容。修饰包括碱基修饰，糖修饰或骨架修饰，例如，PNA，LNA或2’氟2’甲氧基。作为错配稳定试剂的实例的铑金属***物在Ernst et al.J.Am.Chem.Soc.131,2359–2366(2009)中描述。诸如铑金属***物之类的化学试剂可特异性结合DNA错配并且在CC错配下具有2.0x 107M-1的结合常数。铑金属***物的结合可使得包括错配的双链DNA的熔融温度提高18.7℃。因此，该错配结合试剂可添加至三种核苷酸类型引物PCR反应中，从而特异性稳定错配并且提高PCR效率。T-C或A-C错配以及C-C错配可通过这些试剂稳定，也有其他可能的试剂。使用了这些稳定试剂，错配的引物可以略微降低的效率与模板杂交，但是可进行扩增。
c.包括若干未被充分代表的核苷酸单元
可选地，或除了使用错配稳定试剂之外，通过在引物的降低引物与其引物结合位点的错配数的位置引入有限数量的未被充分代表的核苷酸类型单元(通常高达两个内部位置)可降低错配的数量。未被充分代表的核苷酸还可在引物的5’位置使用或就在5’至引物的5’末端的尾部使用。例如，在具有图2所示的引物和引物结合位点的条件下，在正向和反向引物中均引入两个G会使正向引物中的错配降低至一个并使反向引物中没有错配。
对是否使用错配稳定试剂的选择或对是否在引物中包括一个或多个未被充分代表的核苷酸类型的单元的选择取决于假设的正向和反向引物完全缺乏未被充分代表的核苷酸类型及其各自的结合位点之间的错配位置数量。如果在这样的引物及其结合位点之间存在多于两个错配或者在接近(例如，4个核苷酸之内)引物的3’末端出现错配，那么优选地通过在引物中包括一个或多个未被充分代表的核苷酸来消除一个或多个错配。
在ATC引物的情况下，可选地，可引入一个或多个非天然碱基，而非将G引入未被充分代表的引物，只要该非天然碱基可有助于相对于传统ATGC引物降低引物二聚体的相互作用。非天然碱基的实例是肌苷。引入G不仅会提高引物与其结合位点的杂交效率，而且还会提高引物间和引物内相互作用，这是因为目前存在CG对。另一方面，肌苷在侧面碱基对的帮助下维持引物与其结合位点的杂交效率。但是，引物之间或引物内的单个C和I对或若干个C和I对几乎不会有助于结合并且不会导致大量引物二聚体形成。优选地，这样的引物由仅包含最小化错配对引物扩展效率的影响的A，T和C的3’片段和仅包括任何数量的肌苷残基(例如，1-10)的5’片段构成。
在引物结合位点不与引物(其中完全不存在未被充分代表的核苷酸类型)完全匹配的情况下，可在作为核苷酸三磷酸酯单体提供的引物中不存在未被充分代表核苷酸类型的补体的条件下仍然出现扩增，但是如果提供这种类型的核苷酸类型，可更加有效地进行扩增。然而，该核苷酸类型可以相对于四种标准核苷酸中的其他几种降低的浓度提供(例如，小于其他核苷酸三磷酸酯单体中的每一种的浓度的10倍，100倍或1000倍)，或者可作为双脱氧NTP提供该核苷酸类型。由错误引发产生的扩展由双脱氧NTP终止。任一种策略(降低核苷酸浓度或使用ddNTP)的使用会降低错误引发或引物二聚体产生的不想要的扩增产物。带有肌苷取代的引物在有效扩展肌苷碱基的反应中需要dCTP。然而，dCTP可以相对于其他类型的核苷酸三磷酸酯单体降低的浓度提供。
当目标序列来自多种类型或基因分型的生物体时，模板是多于一种等位基因的混合物。带有未被充分代表的核苷酸的引物可包括某些位置的简并碱基，从而匹配不同序列的变化。
在扩增反应中，带有错配或肌苷取代的未被充分代表的引物可与其原始序列的传统引物(即，没有错配或肌苷取代)联合使用。然而，传统引物的浓度应当较低，为未被充分代表的引物的浓度的0.1％至50％。传统引物比未被充分代表的引物更加有效地与其结合位点杂交并且其扩展产物提供具有更多模板的未被充分代表的引物。如上所述，以降低的浓度提供作为未被充分代表的核苷酸的补体的dNTP的类型或者基于未被充分代表的引物的组成完全省略该dNTP类型。传统引物和未被充分代表的引物的组合促进了通过未被充分代表的引物的扩增并且维持了低引物-引物相互作用。
d.在多于一种核苷酸类型中未被充分代表的引物
用于引物和单个未被充分代表的核苷酸类型的策略和原理可应用于多个引物或者两个或甚至三个未被充分代表的核苷酸可应用于引物(换言之，引物完全由单个核苷酸构成或主要由单个核苷酸构成)。单个核苷酸中未被充分代表的引物的使用在天然目标核酸中具有更宽的适用性，这是因为这些引物的结合位点以统计学上更高的频率出现。然而，一些形成的扩增(例如，免疫-PCR)扩增人工序列的核酸。这些人工序列可被设计为由带有两个甚至三个未被充分代表的核苷酸类型的引物扩增，如由带有一个未被充分代表的核苷酸类型的引物进行扩增那样。
在两个核苷酸类型未被充分代表的引物中，两个未被充分代表的核苷酸类型应当彼此不互补。换言之，未被充分代表的核苷酸类型可以是A和C，A和G，T/U和C或T/U和G。这使得引物完全由或主要由相同的两个非互补的核苷酸类型构成。这些引物具有较低的支持引物-二聚体或引物-错配扩展的能力。引物具有三个未被充分代表的核苷酸，换言之，完全由或基本由单个核苷酸类型构成的引物也具有较低的支持引物二聚体或错配的引物扩展的能力。引物结合位点由与上述原理类似的原理来选择，并且引物序列可被调节为适于少量未被充分代表的核苷酸(如果必须的话)。还可使用WO2016/172632中描述的小支点和连接引物策略。使用这些引物的扩增至少采用引物中不是未被充分代表的核苷酸的补体进行，任选地，也使用未被充分代表的核苷酸的补体进行，如上所述，所述未被充分代表的核苷酸以较低的浓度提供或作为双脱氧核苷酸提供。
III.样品制备
目标核酸可由各种不同的目标生物样品制备。样品的实例包括但不限于：胎儿或母体遗传材料，母体血浆或血液，患有癌症或怀疑患有癌症的受治者的生物活检样本，已知或未知遗传改变的任何人类，血细胞，富含特定细胞类型的血细胞，骨髓衍生的单核细胞，胎盘细胞，脐带样本，胎儿组织，胎儿成纤维细胞或血细胞，来自婴儿或儿童的组织，新生组织，包含核酸的非细胞实体(例如，病毒)，基于细胞生物体(例如，植物，真菌，真细菌，古菌，原生生物或动物)，植物或食品产品。
在使用本文提供的方法分析样品之前，理想的是，在样品上进行一个或多个样品准备操作。样品准备操作的实例可包括：从细胞，组织，血液或微生物中提取细胞内材料。提取的细胞内材料可包括核酸，蛋白质或来自样品的其他大分子。在一些应用中，使用***固定，石蜡包埋(FFPE)或冷冻切片来制备样品。在一些应用中，使用激光对样品进行显微切割，随后使用任何提取方法。样品制备操作的另一实例可包括从血浆或血液中提取无细胞DNA。
生物样品可通过本领域已知的方法获取，包括擦拭，切碎，采血，生物活检(例如，切除活检，细针吸取活检，切***检，核心针活检)，或任何其他对于患有或怀疑患有疾病或感染的受治者特别合适的方法。在一些应用中，从患病的组织或器官中获取连续的活检样品。
生物样品可获自本文提供的任何组织。生物样品的实例包括但不限于：肺，呼吸道，鼻腔，胃肠道，嘴，皮肤，心脏，肺，肾脏，乳腺，胰腺，肝脏，血液，肌肉，平滑肌，膀胱，胆囊，结肠，小肠，脑，***，食管或甲状腺。
a.核酸提取
对于待分析的全细胞，病毒或其他组织样品而言，核酸通常提取自这些样品。
目标核酸可使用本领域已知的任何技术从生物样品中分离出来。在一些应用中，可从生物样品中提取DNA或RNA，随后通过物理方法，化学方法或这两者的组合进行分析。提取可使用如下方式进行，包括但不限于：使用洗涤剂溶解产物，超声处理或带有玻璃小珠的涡动。在特定实施方式中，DNA可根据标准方法从血液中提取，例如，使用Qiagen UltraSensDNA提取试剂盒。在一些应用中，核酸分子可使用梯度离心(例如，氯化铯梯度，蔗糖梯度，葡萄糖梯度)，离心操作，煮沸，纯化试剂盒(例如，Qiagen纯化***；Promega纯化***；Amersham纯化***；Invitrogen生物技术纯化；Mo-Bio实验室纯化***)进行分离。提取核酸的方法还可包括使用Trizol或DNAzol的液体提取。
RNA可分离自各种不同的体液。从血液、血浆和血清中分离RNA分析的方法参见例如，Tsui N B等人,Clin.Chem.48,1647-53,2002。
在一些应用中，目标核酸使用RT-PCR由RNA制备。在一些应用中，目标核酸由RT-PCR以及随后的dPCR制备，RT-PCR和dPCR可在两个不同的步骤中进行或在单个步骤中进行。在一些应用中，目标核酸在单独的反应中进行预扩增，从而特异性地或非特异性地富集目标序列。
IV.扩增方法
本文所述的策略和原理可并入任何涉及通过单个引物或成对的引物进行模板定向扩展的扩增方法中。聚合酶链反应是任选地包括RT-PCR在内的一种实施方式。PCR的特征在于：进行温度循环以允许进行引物重组，引物扩展和来自引物模板的扩展的链的变性。
转录介导的扩增(TMA)是可选的等温形式的扩增，其中，引物中的一个或两个引物连接至启动子的5’端，所述启动子通常为T7启动子。一旦形成双链启动子，RNA聚合酶开始进行转录扩增。扩增产物是单链RNA分子。TMA还可连接至逆转录。
可使用本发明的引物进行的另一等温扩增形式是切口扩增反应(NEAR)。NEAR在恒定温度下使用聚合酶和切口酶以指数方式扩增DNA。用于切口扩增的引物连接至人工片段的5’端，该人工片段是包含用于切口酶的裂解位点的5’片段。在第一循环中，两个引物与模板进行杂交并进行扩展。在下一循环中，两个引物可与第一循环的产物进行杂交并且进行扩展以在人工尾部形成完全切口位点。一旦形成了切口位点，切口酶切断并释放一个链。在下一循环中重复扩展和切断。
可使用本发明的引物进行的另一等温扩增工艺是环介导的等温扩增或(LAMP)。LAMP使用具有根据本发明的未被充分代表的核苷酸的一种或多种引物。在LAMP中，使用两组或三组引物和除了具有复制活性还具有较高的链置换活性的聚合酶在60至65℃的恒定温度下扩增目标序列。通常，将四种不同的引物用于识别目标基因上的6个不同的区域，所述目标基因添加较高的特异性。额外的“环引物”对可进一步加快反应。
另一等温扩增形式是重组酶聚合酶扩增(RPA)，其是聚合酶链反应(PCR)的一种单管等温备选扩增方式。RPA方法使用三种核心酶——重组酶、单链DNA结合蛋白质(SSB)和链置换聚合酶。重组酶能够使双倍体DNA中的寡核苷酸引物和同源序列进行配对。SSB结合至DNA的置换的链并且防止引物发生置换。最后，链置换酶启动DNA合成，其中，引物已结合至目标DNA。通过使用两种相对的引物，非常类似于PCR，如果确实存在靶向序列，那么启动指数DNA扩增反应。两种引物均可以是带有上述未被充分代表的核苷酸类型的引物。
可使用本发明的引物的另一扩增形式包括链置换分析方法，基于转录的扩增***，自维持序列复制(3SR)，连接链反应(有时称为寡核苷酸连接酶扩增OLA)，循环探针技术(CPT)，滚环扩增(RCA)，重组酶聚合酶扩增(RPA)，核酸序列碱基扩增(NASBA)，入侵性裂解技术，解旋酶依赖性扩增(I)，指数扩增(EXPAR)，杂交链反应(HCR)和催化的发卡结构组装(CHA)。
另一扩增形式是免疫PCR，其中，分析物连接至核酸(所述核酸可具有人工序列)并且所述分析物通过核酸的扩增进行检测。这样的扩增可使用带有与未被充分代表的核苷酸的补体中未被充分代表的引物结合位点互补的未被充分代表的核苷酸类型(例如，完全不存在)的引物对进行。
上述方法扩增由所选择的引物及其互补的引物结合位点确定的具体预先确定的目标核酸或其片段(换言之，目标特异性扩增)。通过结合至其预期的引物结合位点的引物对产生的扩增产品占由相同的引物对通过目标序列上的引物二聚体结合或错误引发而引发的任何或所有其他扩增产品的主导地位。优选地，由结合至其期望的引物结合位点的引物产生扩增产品是引物对引发产生的任何或所有其他扩增产生的至少10倍，50倍，100倍或1000倍(通过摩尔计算、质量计算或拷贝数计算)。在一些方法中，在扩增中使用单个引物对。在其他方法中，在多重扩增中使用多个引物对。引物对的数量可以是例如，2-50或更多，优选地为5-25或10-20，或至少为2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20。当使用多个引物对时，引物对与其期望的引物结合位点结合中的每个引物对的预期的扩增产品是该引物对引发产生的任何其他扩增产品或所有其他扩增产品的至少10倍，50倍，100倍或1000倍(通过摩尔计算、质量计算或拷贝数计算)。当在相同的反应中存在多个引物对时，优选地，每个引物对中的每个引物具有相同的未被充分代表的标准核苷酸类型。优选地，在每个引物对的每个引物中一个且只有一个标准核苷酸类型是未被充分代表的。在这些方法中使用的引物不是随机引物，其中，大多数或所有引物位置被引物之间不同的核苷酸的随机选择或简并选择占据。而每个引物对被设计为与目标核酸中的特定引物结合位点杂交，并且通常，如被检测的目标核酸中的不同引物结合位点所需要的，不同的引物对彼此不相关。例如，一个引物对可设计为与一个病原体中的目标核酸上的引物结合位点结合，并且另一引物对于不同的病原体中的不同的目标核酸上的引物结合位点结合。除非巧合，不同的目标核酸和引物结合位点以及引物彼此不相关。
V.数字扩增
数字扩增(例如，数字PCR或dPCR)是一种高灵敏度的核酸定量方法。该方法可通过直接测量目标分子的数量而不依赖于任何归一化标准或外部标准检测并定量核酸。在该方法中，可确定目标分子的绝对数量，其下限为单个分子拷贝。
dPCR的使用策略或数字扩增的类似其他形式可称为“分而治之(Divide andConquer)”策略，其中，首先可对样品进行稀释并将其分配至数千至数万个微反应腔室中，这样，大多数反应腔室(例如，至少50％，75％<90％,95％或99％)仅包含零拷贝的目标基因序列或一个拷贝的目标基因序列(少数反应腔室可能包含多个拷贝)。通过对带有阳性扩增结果的反应腔室的数量的进行计数，可确定原始样品中目标基因分子的绝对数量。
在整个分区中目标分子的分布可被看作是泊松过程(Poisson process，目标以固定的比率在分区中独立结束)。因此，泊松统计通过阳性和阴性分区的数量更加准确地计算出起始目标数量，其中考虑到了一些反应腔室接收了多个拷贝。
与传统PCR技术相比，dPCR或其他数字扩增方法被认为具有多种优势，包括：较低的样品需要量，较低的试剂消耗量，核酸分子的绝对定量，样品中不同拷贝间较低的干扰以及极好的灵敏度和特异性。而且，数字扩增中的反应体系的标准划分过程可大大降低与目标序列竞争的背景序列的浓度，因此，数字扩增尤其适用于检测复杂生物背景中罕见的突变，例如，来自循环肿瘤细胞的DNA和用于NIPT(无创产前检查)应用的cffDNA。
a.数字扩增引物
数字扩增对模板的单个拷贝进行扩增。像传统PCR或第一代PCR那样，数字扩增还需要在反应混合物中具有高浓度的引物。然而，具有高浓度的引物导致非目标产物的产生，例如，引物二聚体或非特异性扩增。
非目标引物-二聚体产物意在具有比预期的扩增产物更小的尺寸，并且由于其尺寸较小，其以比预期的产物更高的效率被扩增。这在这些产物的反应中产生竞争，并且在很多情况下，预期的扩增产物无法与非目标引物-二聚体产物区分开，其中，反应由DNA***染料来监控。因此，引物二聚体的形成妨碍了数字扩增的效率、灵敏度和特异性。而且，引物-二聚体的形成以及非特异性扩增这些问题因为较多的引物在高通量数字扩增中多路复用而更加明显。
这类问题可通过进行数字PCR或其他使用本文所述的有限组成引物的其他扩增而减轻或避免。这些引物可提高数字扩增的效率、灵敏度和特异性。
本文所述的引物中的任一种可用于数字扩增。图5显示了具有未被充分代表的核苷酸类型的引物的实例，所述未被充分代表的核苷酸类型包含由可在数字扩增中使用的探针标记的荧光团。
在一些应用中，带有本文提供的未被充分代表的核苷酸类型的引物可连接至肽核酸(PNA)，以产生更高的灵敏度。
在一些应用中，与使用传统引物的可比较的其他反应相比，有限核苷酸组成的引物使单个或多路复用数字扩增中引物二聚体的形成降低了高于70％,75％,80％,90％,95％,97％,或99％。
b.dPCR平台
本文所述的组合物、方法和试剂盒可用于目前已知的或将来被研发得到的各种不同的商售dPCR平台。
基于应用情况，临床医生或研发人员可选择满足其所需的生产量的技术需求和准确要求或其应用情况的dPCR平台。例如，基于微流体芯片的dPCR可在每个板上具有多达数百个分区。基于液滴的dPCR通常具有大约20,000个分区的液滴，但是其可具有高达10,000,000个分区。
在一些应用中，本文提供的dPCR组合物和方法可用于基于微流体芯片的dPCR。在一些应用中，本文提供的dPCR组合物和方法可用于基于液滴的dPCR。
在一些应用中，本文提供的dPCR组合物和方法可用于来自Fluidigm的基于微流体腔室的
Figure BDA0002437945330000351
dPCR。在一些应用中，本文提供的dPCR组合物和方法可用于基于微孔芯片的QuantStudio12k flex dPCR。在一些应用中，本文提供的dPCR组合物和方法可用于来自Life Technologies的3D dPCR。在一些应用中，本文提供的dPCR组合物和方法可用于来自Bio-
Figure BDA0002437945330000352
的基于液滴的ddPCR(ddPCR)QX100和QX200。在一些应用中，本文提供的dPCR组合物和方法可用于来自
Figure BDA0002437945330000353
的RainDrop。
在一些应用中，与使用不含未被充分代表的核苷酸的传统引物的其他可比较的分析方法相比，本文提供的方法使dPCR反应中的定量精确度或检测精确度提高高于70％,75％,80％,90％,95％,97％,或99％。在一些应用中，相对于使用传统引物的其他可比较的分析方法而言，本文提供的方法使dPCR反应中的定量灵敏度或检测灵敏度提高高于70％,75％,80％,90％,95％,97％,或99％。
可使用相同或类似的平台进行其他形式的数字扩增。
c.多路复用dPCR分析方法
数字PCR或其他扩增可作为多路复用而进行。多路复用分析方法在生物材料有限或非常少的应用中特别有用，在生物材料有限或非常少的应用中，拆分样品用于不同的分析不可行或非常困难。在一些情况下，多路复用扩增分析方法能够定量检测至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21个不同的遗传变异，例如，单核苷酸多态性(SNP)，***，倒置，重新排布，转换，删除，***删除(indel)，微卫星重复序列，小卫星重复序列，短串联重复序列，转座元件，大尺寸结构染色体变体，甲基化，以及它们的组合。在一些应用中，所分析的遗传变异是不同遗传变异的组合。
在一些应用中，多路复用dPCR能够在单个反应管中检测到至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,40,50,60,70,80,90,或100个不同的遗传改变。在一些应用中，多路复用dPCR能够在单个反应管中检测到至少100,200,300,400,500,600,700,800,900,或1000个不同的遗传改变。
d.检测方法
使用本文所述的方法、组合物和试剂盒的扩增反应可产生一个或多个信号。在一些应用中，在扩增反应中或扩增反应之后使用标签以产生信号。在一些应用中，在扩增反应中或扩增反应之后使用染料以产生信号。
在一些应用中，使用DNA***染料检测目标核酸。可用于本发明的***染料的实例包括但不限于：溴化乙锭，碘化丙啶，吖啶橙，9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)，SYBRTM绿,SYBRTM绿II,SYBRTM金,YO(恶唑黄)，TO(噻唑橙)，PG
Figure BDA0002437945330000361
或
Figure BDA0002437945330000362
阳性dPCR反应通过其相对于引物产生的背景信号较高的信号强度而与阴性dPCR反应相区别。
在一些应用中，在一个dPCR反应中同时检测多个目标核酸或遗传变异。在一些应用中，多个目标是相同目标基因座中的两个或多个等位基因。在一些情况下，多路复用目标是不同的目标基因座。反应混合物包含两个或多个引物对，每个引物对包含正向引物和反向引物。通过扩增的产品的长度的变化和/或引物浓度的变化，可通过扩增产物的信号强度来区分不同的目标。由单独的引物产生的背景信号和由dPCR机器限定的饱和信号强度之间的空间可在一个dPCR反应中多路复用。三种核苷酸类型的引物(3N引物)大大降低了引物-引物相互作用，由此降低了背景信号，这产生了可被多路复用的更多的目标。在一些实施方式中，检测到多个扩增子，用于定量一个目标。三核苷酸类型引物(3N引物)大大提高了dPCR的多重性，这能够在生物样本量极低的条件下对目标核酸进行准确定量。
在一些应用中，dPCR的目标核酸使用荧光团标记的探针(例如，Taqman探针，分子信标和带有淬灭剂标记的互补寡核苷酸的荧光团标记的引物(图5))进行检测。在另一实施方式中，dPCR的目标核酸使用DNA***染料和荧光团标记的探针的组合进行检测。
“荧光标记”或“荧光团”可以是最大荧光发射波长为350nm至900nm的化合物。
本文使用的荧光团的实例包括但不限于：5-FAM(也称为5-羧基荧光素，也称为Spiro(异苯并呋喃-1(3H)’9’-(9H)氧杂蒽)-5-羧酸,3’6’-二羟基-3-氧-6-羧基荧光素)；5-六氯代-荧光素；([4,’,2’,4’,5’,7'-六氯代’(3’,6'-二特戊酰基-荧光素)-6-羧酸])；6-六氯代-荧光素；([4,’,2’,4’,5’,7'-六氯代’(3’,6'-二特戊酰基荧光素)-5-羧酸])；5-四氯代-荧光素；([4,’,2’,7'-四氯代’(3’,6'-二特戊酰基荧光素)-5-羧酸])；6-四氯代-荧光素；([4,’,2’,7'-四氯代’(3’,6'-二特戊酰基荧光素)-6-羧酸])；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)；Xanthylium,9-(2,4-二羧基苯基)-3,6-双(二甲基-氨基)；6-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)；9-(2,5-二羧基苯基)-3,6-双(二甲基氨基)；EDANS–5-((2-氨基乙基)氨基)萘–l–磺酸)；1,5-IAEDANS(5-((((2-碘乙酰基)氨基)乙基)氨基)萘–l–磺酸)；Cy5(吲哚双碳菁-5)；Cy3(吲哚双碳菁-3)；和BODIPY FL(2,6-二溴代-4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂diaza-s-indacene-3-丙酸)；QuasarTM-670染料(Biosearch Technologies)；Cal FluorTM橙色染料(Biosearch Technologies)；Rox染料；Max染料(Integrated DNATechnologies)，以及它们的衍生物。
“淬灭剂”可以是在与供体连接或接近供体时能够降低来自荧光供体的荧光发射的化合物的一部分或分子。淬灭可以若干机制中的任一种发生，所述机制包括：荧光共振能量转移，光诱导电子转移，以及系间窜跃的顺磁提高，Dexter交换偶联，以及诸如暗复合物形成之类的激发偶联。
当荧光团发射的荧光相对于不存在淬灭剂时的荧光降低了至少10％(例如，至少15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％,或更多)时，荧光被“淬灭”。淬灭剂的选择取决于对荧光团的特性。本文使用的淬灭剂的实例包括但不限于：DABCYL,Black HoleTM淬灭剂(BHQ-1,BHQ-2,和BHQ-3),Iowa BlackTM FQ以及Iowa BlackTM RQ。
在一些应用中，使用本领域已知的方法将荧光团和淬灭剂均连接至引物。总体而言，荧光团可连接至裂解位点的热-起始引物5’的5’部分。可在寡核苷酸合成过程中，通过标准亚磷酰胺化学添加荧光团。它们也可在合成之后通过在合成寡核苷酸的过程中引入带有合适的官能团的连接体而添加。合成之后，荧光团可连接至寡核苷酸官能团。对于较长的序列而言，为了产生有效淬灭，荧光团的3’紧邻的序列和引物的目标区域外部的序列可制备成部分互补，从而允许发卡的茎部形成(即，分子信标)。因此，荧光团可保留在引物中，同时引物与目标多核苷酸杂交并通过聚合酶进行扩展。淬灭剂可连接至裂解位点的热-起始引物3’的3’部分。因此，淬灭剂可从引物中释放出来，同时引物与目标多核苷酸杂交，因此，不再淬灭仍然与引物连接的荧光团。荧光团与淬灭剂的合适的连接位点以及荧光团与淬灭剂之间的距离可以是本领域已知的。在一些情况下，荧光团位于自引物中的淬灭剂开始的约10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,或50个碱基处，大于10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,或50个碱基处，小于10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,或50个碱基处或至少10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,或50个碱基处。
在一些应用中，可使用图6A至图6B所示的两步方法实现目标核酸的删除。在一种实施方式中，正向三核苷酸类型的引物连接至通用人工3N序列(C1)的5’端，并且其他逆向三核苷酸类型的引物连接至不同的通用人工3N序列(C2)的5’端。接着，向dPCR反应提供一对常用引物(CF和CR)。CF引物具有与C1相同的序列，并且CR引物具有与C2相同的序列。在反应的起始阶段，具体的引物C1-F和C2-R与模板杂交并且在两端部产生带有C1和C2的扩增子。在反应的后续阶段，常用引物CF和CR参与并主导反应。在检测单个反应溶液中的多个目标的一些应用中，用于每个具体目标的特定引物具有相同或不同的连接在其5’端的常用序列。单个反应中的多个目标可由图5所示的常用引物组中的一组或多于一组，通过使用与常用正向引物序列(CF)或常用反向引物序列(CR)相关的检测探针来检测。
e.分析方法
本文所述的组合物，方法和试剂盒可用于分析与疾病状态或其他表型相关的各种不同的遗传改变。
本文所述的方法可用于对特定疾病的多种基因的染色体异常或全部染色体进行分析。代表性的步骤可包括将目标染色体(或其片段)的拷贝数与参比染色体或其片段的拷贝数或相对于野生型等位基因的突变等位基因的拷贝数进行比较。这些分析方法可在例如三体型检测或性别测定中使用。
本文所述的方法可用于进行特定疾病的单个基因分析，例如，删除或点突变(例如，单个核苷酸的改变)。用于检测基因中的点突变或小删除的代表性的步骤可包括将突变等位基因的数量和野生型等位基因进行比较。用于检测单个基因的删除的代表性的步骤可包括将靶向删除的基因的拷贝数与参比基因的拷贝数进行比较。
本文所述的方法可用于进行特定疾病的SNP-相关分析。代表性的步骤可包括将父本或母本遗传的单核苷酸多态性(SNP)的剂量与相关参比单倍型剂量进行比较。在一些应用中，代表性步骤可包括优势等位基因非平衡分析(preferential allelic imbalanceanalysis，PAI)。PAI在相对于野生型等位基因优先保留疾病相关可遗传SNP时发生。PAI分析可包括将带有疾病相关可遗传SNP的等位基因的拷贝数与野生型等位基因进行比较。
本文所述的方法可用于进行表观遗传学分析。DNA甲基化在癌症和神经退行性疾病中发挥重要作用。代表性步骤可包括将患病样品的目标区域中的甲基化水平与对照样品的目标区域中的甲基化水平进行比较。
可用于本文公开的内容的其他分析方法在如下参考文献中描述或可参考如下参考文献：Butchbach,M.E.R.Biomolecular Detection and Quantification 10:9–14(2016)。
VI.计算机实施方式
对引物结合位点和引物的选择可通过由非暂时性计算机可读存储介质编程的计算机中对目标核酸进行计算机实施的分析来进行。目标核酸(单链或双链)的序列容纳于计算机中。计算机还存储或容纳用户输入的引物的期望核苷酸组成(例如，A，T，C)。随后，将计算机编程为搜索目标序列以识别与扩增相容的正向和反向引物结合位点的某一距离内的正向和反向引物结合位点，所述扩增最密切地对应于引物组成。如果引物组成是A，T，C，那么正向和反向引物结合位点应当最密切地对应于A，T和G。计算机可识别相对链上的正向和反向引物结合位点或可识别相同链上的正向引物结合位点的补体和反向引物结合位点并且通过该补体计算正向引物结合位点。计算机随后可提供候选的引物结合位点对的输出，其可与理想的组成在不同程度上有所不同。计算机还可显示出与引物结合位点对中的每一个杂交的引物设计。多个引物设计可显示出相同的引物结合位点对，但是具有不同的未被充分代表的核苷酸单元数和不同的错配数。
计算机***可包括将主要子***(例如，中央控制器，***存储器，输入/输出控制器，外部设备(例如，经由平行端口的打印机，经由显示适配器的显示屏，串行端口，键盘，固定磁盘驱动器，和网络连接))相互连接的总线。可连接许多其他设备，例如，经由I/O控制器的扫描仪，连接至串行端口或网络界面的鼠标。可以类似方式连接许多其他设备或子***。而且，如下文所讨论的，为了实践本发明不必须体现出所有设备。设备和子***可以以不同的方式相互连接。实施本发明的源代码可以可操作地设置在***存储器中或存储在诸如固定磁盘，压缩磁盘等的存储介质中。计算机***可以是大型机，PC，台式机或手机等等。
VII.试剂盒
本发明提供用于实施本文所述的方法和应用的试剂盒。
试剂盒通常可包括组合物，试剂，设备和如何实施本发明的方法或对特定生物样品类型进行测试的说明书。基于所期望的方法，试剂盒可包括下列要素中的一个或多个：试剂、引物、反应混合物、缓冲剂、酶(例如，核酸内切酶，核酸外切酶，连接酶，聚合酶，RNA聚合酶，DNA聚合酶，热启动聚合酶，逆转录酶，拓扑异构酶，激酶，磷酸酶)，抗体，引物，探针，染料，实验标准品(例如，核酸，DMR-核酸等等)，驱动和指示设备的计算机软件(例如，指示处理的计算机可执行的逻辑运算)，以及用户或技术人员(例如，研发人员或临床医生)实施本文提供的方法的说明书。DNA聚合酶和在分析方法中使用的未被充分代表的引物可以其显示出长期稳定性的状态存储，例如，存储在合适的存储缓冲液中或存储在冻干或冷冻干燥的状态中。此外，所述试剂盒可还包括用于DNA聚合酶的缓冲液。
在一些实施方式中，所述试剂盒可还包含能够由其他下游方法检测到的试剂或设备，所述其他下游方法可提高或添加至其他临床检测、诊断、药物反应测定和患病患者的诊断中。
在其他实施方式中，试剂盒可还包括用于遗传特性的数据分析的软件包，其可包括用于对比的参比遗传特性。在一些应用中，试剂盒软件包包括与中央处理器的连接，以进行数据分析，并且，其中产生包括对疾病状态的建议，药物相互作用或对医疗服务人员的治疗建议的报告。在一些应用中，试剂盒所提供的报告可以是纸质报告或电子报告。所述报告可由试剂盒提供的计算机软件或计算机服务器产生，用户通过所述计算机服务器上传至计算机服务器产生报告的网站。
在一些实施方式中，所述报告可包括预后，例如，预期的总生存期，对治疗的预期反应，预期的无疾病生存期，预期的无进展生存期，或预期的无复发生存期。所述报告可包括对病症的诊断。所述报告可包括对治疗形式的推荐，例如，使用特定药物进行治疗或停止治疗。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括本文提供的反应混合物。在一些实施方式中，试剂盒还包括用于扩增特定的物种特异性基因的未被充分代表的引物组，其中，用于扩增目标序列的至少一个末端的引物包括热启动引物和任选地非热启动的引物。
在一些实施方式中，试剂盒包括与目标多核苷酸的第一序列互补的未被充分代表的引物，所述目标多核苷酸包括：(a)位于与存在于第一序列中的目标基因座对应的位置的第一核苷残基；(b)连接至引物并且就在对应于目标基因座的位置的5’附近的荧光团；以及(c)连接至第一引物并且就在对应于目标基因座的位置的3’附近的淬灭剂。
在一些实施方式中，试剂盒包含选择性扩增样品中的核酸的试剂。所述试剂盒包括(a)第一和/或第二未被充分代表的引物，每个引物均具有3’端和5’端，其中，每个引物与待扩增的核酸的一部分互补或与其补体互补，并且，其中，至少一个未被充分代表的引物包括(i)位于对应于存在于第一序列内的基因座的位置的第一未被充分代表的引物；(ii)连接至引物以及对应于目标基因座的位置的5’的荧光团；和(iii)连接至第一引物以及对应于目标基因座的位置的3’的淬灭剂；(b)用于扩增核酸的说明手册。所述试剂盒可任选地包括DNA聚合酶。
在进一步的实施方式中，所述试剂盒包括用于选择性扩增核酸的试剂。所述试剂盒包括(i)具有3’端和5’端的寡核苷酸探针，其包括RNaseH可裂解结构域，(ii)荧光团和淬灭剂，其中，可裂解的结构域位于荧光团和淬灭剂之间，并且，其中，所述探针与待被扩增的目标核酸的一部分互补或与其补体互补。
本文公开的引物或探针中的任一种可并入试剂盒中。在一些应用中，所述试剂盒包括至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,或90个引物对或探针。这样的试剂盒优选地包括至少一个引物对，并优选地包括至少5个、20个或20个引物对。试剂盒中的引物对优选地能够在相同的多路反应中使用，这意味着它们具有相容的熔融温度和相同的未被充分代表的核苷酸类型。
a.应用和方法
本文公开的内容提供可用于检测、诊断、预后、监测或预测药物对不同疾病、感染类型和相关研究应用的反应的组合物、方法和试剂盒。
b.癌症
癌症是一种遗传畸变疾病。在个性化肿瘤药物来临之际，癌症的临床管理已向肿瘤基因分型发展。本文公开的内容提供用于检测、诊断、预后、监测或预测癌症患者体内的药物反应的方法。
简言之，代表性的方法以从患有或怀疑患有癌症的患者获取生物样本开始。接着，从所述生物样本中提取并分离目标核酸。随后，将分离的核酸进行扩增，从而将PCR扩增子制备成目标DNA。PCR扩增子被纯化并随后稀释分配在dPCR反应混合物中。在dPCR反应结束之后，读取并分析数据以识别一个或多个遗传畸变的状态或绝对量，例如，特定等位基因的突变状态，SNP的存在，缺乏杂合性，拷贝数改变的量化，基因表达水平的量化，核酸甲基化状态或基因重排的检测。通常，基因畸变影响致癌基因，肿瘤抑制基因，DNA扩增，DNA复制，DNA重组或其他已知的与癌症的发作、进展或药物反应相关的基因(例如，BRCA1基因,p53基因,APC基因,Her2/Neu扩增,Bcr/AB1,K-ras基因,和人***瘤病毒类型16和18或其他癌症的驱动或信使突变)，这在Vogelstein,et al.,Science.2013March 29；339(6127)中进行了描述。在一些应用中，本发明的方法可还包括使用是否存在与特定癌症相关的临床症状。
在一些实施方式中，检测特定等位基因中的突变，拷贝数目改变的增加，基因表达水平的提高，过度甲基化状态或检测基因重排或者它们的组合诊断癌症的存在或癌症的阶段。在一些实施方式中，检测特定等位基因中缺乏某种突变，拷贝数目改变的减少，基因表达水平的降低，过度甲基化状态或检测没有基因重排或者它们的组合诊断癌症的存在或癌症的阶段。
在一些实施方式中，特定等位基因中的一种或多种突变，拷贝数目改变的增加，基因表达水平的提高，过度甲基化状态或检测基因重排或者它们的组合诊断不存在癌症。在一些实施方式中，检测特定等位基因中缺乏某种突变，拷贝数目改变的减少，基因表达水平的降低，过度甲基化状态或检测没有基因重排或者它们的组合诊断不存在癌症。
在一些实施方式中，检测特定等位基因中的某种突变，拷贝数目改变的增加，基因表达水平的提高，过度甲基化状态或检测基因重排或者它们的组合预测良好的结果。在一些实施方式中，检测特定等位基因中缺乏某种突变，拷贝数目改变的减少，基因表达水平的降低，过度甲基化状态或检测没有基因重排或者它们的组合预测良好的结果。
在一些实施方式中，检测特定等位基因中的某种突变，拷贝数目改变的增加，基因表达水平的提高，过度甲基化状态或检测基因重排或者它们的组合预测不良结果。在一些实施方式中，检测特定等位基因中缺乏某种突变，拷贝数目改变的减少，基因表达水平的降低，过度甲基化状态或检测没有基因重排或者它们的组合预测不良结果。
可用于本发明的方法的癌症的类型包括但不限于：急性骨髓性白血病，膀胱癌(包括上尿路肿瘤和***尿路上皮癌)，骨癌(包括软骨肉瘤，尤文氏肉瘤和骨肉瘤)，乳腺癌(包括非侵入性的，侵入性的，叶状肿瘤，帕哲德氏病(Paget's disease)和怀孕期间的乳腺癌)，中枢神经***癌症，成人低级别浸润性幕上星形细胞瘤/少突神经胶质瘤，成人颅内室管膜瘤，间变性星形细胞瘤/间变性少突神经细胞瘤/多形性胶质母细胞瘤，有限(1-3)转移性病变，多发性(>3)转移性病变，癌性细胞淋巴瘤脑膜炎，非免疫抑制的原发CNS淋巴瘤和转移性脊椎肿瘤，***，慢性骨髓性白血病(CML)，结肠癌，直肠癌，***癌，食管癌，胃癌，头颈癌(包括筛窦肿瘤，上颌窦肿瘤，唾液腺肿瘤，唇癌，口腔癌，口咽癌，下咽癌，隐匿性原发性，声门型喉癌，声门上喉癌，鼻咽癌和晚期头颈癌)，肝胆癌(包括肝细胞瘤，胆囊癌，肝内胆管细胞癌和肝外胆管细胞癌)，霍奇金氏病/淋巴瘤，肾癌，黑色素瘤，多发性骨髓瘤，全身性轻链淀粉样病变，华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macro globulinemia)，骨髓增生异常综合症，神经内分泌肿瘤(包括：1型多发性内分泌肿瘤，2型多发性内分泌肿瘤，类癌瘤，胰岛细胞瘤，嗜铬细胞瘤，分化不良/小细胞/非典型肺类癌)；非霍奇金氏病(包括：慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)，成淋巴细胞淋巴瘤，AIDS-相关B细胞淋巴瘤，外周T细胞淋巴瘤和蕈样真菌病/Sezary综合症)；非黑色素瘤皮肤癌(包括基底细胞皮肤癌和鳞状细胞皮肤癌，隆突性皮肤纤维肉瘤，Merkel细胞癌)；非小细胞肺癌(NSCLC)(包括胸腺恶性肿瘤)；潜伏的原发性恶性肿瘤，卵巢癌(包括上皮细胞卵巢癌，交界性上皮细胞卵巢癌(低恶性)和罕见的卵巢组织学)；胰腺腺癌，***癌，小细胞肺癌和肺神经内分泌肿瘤，软组织肉瘤(包括软组织末端肉瘤，腹膜后肉瘤，腹膜内肉瘤和硬纤维瘤)；睾丸癌，胸腺恶性肿瘤(包括甲状腺癌，结节评估，***状癌，滤泡性癌，Hiirthle细胞肿瘤，髓样癌和未分化癌)，子宫肿瘤(包括子宫内膜癌和子宫肉瘤)。
c.自体免疫疾病
自体免疫疾病是看起来在遗传易感的个体体内发展的常见病症。全基因组分析已发现了超过300个自体免疫疾病易感性基因座。参见，Gutierrez-Arcelus et al.NatureReviews Genetics 17,160–174,Feb(2016)。而且，全基因组微卫星筛选和大尺寸单核苷酸多态性(SNP)相关研究已识别出了染色体基因座，该染色体基因座与特定自体免疫疾病相关联，所述特定自体免疫疾病包括***性红斑狼疮，类风湿性关节炎，幼年型关节炎，多发性硬化，和糖尿病。参见，Gutierrez-Roelens et al.,Curr Mol Med.2008 Sep；8(6):551-61。
本文公开的内容的额外的应用提供通过测定生物样本是否具有已知的与患上自体免疫疾病风险相关的300个易感性基因座或染色体基因座中的一个或多个来检测、诊断、预后或检测自体免疫疾病的方法。
简言之，代表性的方法以从患有或怀疑患有癌症的患者中获取生物样本。接着，从所述生物样本中提取和分离目标核酸。随后将分离的核酸进行扩增，从而将PCR扩增子制备成目标DNA。PCR扩增子被纯化并随后稀释分配至dPCR反应混合物。在dPRC反应结束之后，读取并分析反应数据以识别是否存在本文提供的一种或多种易感性基因座。所使用的分析方法取决于检测哪个基因座。本发明的方法还可包括评价是否存在于特定自体免疫疾病相关的临床症状。
在一些实施方式中，确定生物样本相对于野生型具有一个或多个易感性基因座或染色体基因座(例如，基因座特性组，例如，微卫星，SNP)表明患上自体免疫疾病的风险提高。在一些实施方式中，确定生物样本相对于野生型不包含一个或多个易感性基因座或染色体基因座表明患上自体免疫疾病的风险提高。
在一些实施方式中，确定生物样本相对于野生型具有一个或多个易感性基因座或染色体基因座(例如，基因座特性组，例如，微卫星，SNP)表明患上自体免疫疾病的风险降低。在一些实施方式中，确定生物样本相对于野生型不包含一个或多个易感性基因座或染色体基因座表明患上自体免疫疾病的风险降低。
在一些实施方式中，确定生物样本相对于野生型具有一个或多个易感性基因座或染色体基因座预测良好的结果。在一些实施方式中，确定生物样本相对于野生型不包含一个或多个易感性基因座或染色体基因座预测良好的结果。
在一些实施方式中，确定生物样本相对于野生型具有一个或多个易感性基因座或染色体基因座预测不良结果。在一些实施方式中，确定生物样本相对于野生型不包含一个或多个易感性基因座或染色体基因座预测不良结果。
而且，本文公开的方法可还包括美国专利US5641864和US6617171中描述的检测自体免疫疾病的其他方式。
d.神经学疾病
许多神经学疾病是由基因中的单个突变或影响大脑、脊髓、外周神经或肌肉的染色体突变而引起的。这些突变类型中的许多类型导致儿童神经学疾病。而且，其他神经学疾病是由若干遗传和环境因素引起的复杂疾病。
本文中我们提供用于检测、诊断、预后或监测由染色体畸变和单个基因删除而引起的神经学疾病。简言之，代表性的方法以从患有或怀疑患有癌症的患者获取生物样本开始。接着，从所述生物样本中提取并分离目标核酸。随后，将分离的核酸进行扩增，从而将PCR扩增子制备成目标DNA。PCR扩增子被纯化并随后稀释分配至与dPCR反应混合物接触。在dPCR反应结束之后，读取数据并对阳性反应进行计数以确定是否存在包含与疾病相关的染色体畸变的目标DNA，该目标DNA的突变状态或绝对定量。本发明的方法可还包括使用是否存在于神经学疾病相关的临床症状。
在本文提供的方法中使用的由染色体畸变引起的神经学疾病的实例包括但不限于：13三体性，18三体性和21三体性，由检测马赛克额外标志物异染色体12p(iso12p)确定的马赛克综合症(Pallister-Killian)；通过定量缺失的区域中的拷贝数的改变确定的染色体22q11微缺失综合症，通过定量测量染色体22q11的DFNB1基因座中的删除而确定的常染色体隐性非综合征性听力损失。
在本文提供的方法中使用的由单个基因缺失或点突变引起的神经学疾病的实例包括但不限于：可由检测单个基因缺失(SMN1(生存的运动神经元1))而确定的SMA失调；由检测基因(HBA1/HBA2(α-球蛋白))的缺失而确定的东亚型α(0)-地中海贫血疾病；通过测定GCM2(神经胶质细胞漏掉同源物2；GCM2(T370M)和GCM2(R367Tfs*))的突变状态而确定的甲状旁腺功能减退型疾病；由测定MAP3K3(有丝***活化的蛋白激酶3；MAP3K3(I441M))的突变状态而确定的疣状静脉畸形疾病；由测定PIK3CA(磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸酯3-激酶的α催化亚单元；PIK3CA(C420R),PIK3CA(E542K),PIK3CA(E545K),PIK3CA(H1047R)和PIK3CA(H1047L))的突变状态确定的***畸形和静脉畸形骨肥大综合症(Klippel-Trenaunaysyndrome)；由测定SMN1(SMN1(Y272C))和SMA的突变状态而确定的Trenaunay综合症；McCune-Albright综合症和GNAS(G蛋白的刺激性α-亚单元，Gs-α，GNAS(R201C))。在许多情况下，疾病相关的基因内突变最先使用第二代测序被识别。
可用于本文公开的内容中的神经学疾病的实例包括但不限于：艾迪(Adie)综合症，肾上腺脑白质营养不良，胼胝体发育不全，认知不能，艾卡尔迪综合征(Aicardisyndrome)，Aicardi-Goutieres综合症疾病，AIDS-神经学并发症，静坐不能，酒精相关疾病，亚历山大症(Alexander disease)，异手综合征(Alien hand syndrome(异己手，anarchic hand))，对侧感觉(allochiria)，阿尔珀斯病(Alpers'disease)，高山症，交替性偏瘫(alternating hemiplegia)，阿尔兹海默氏病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症，无脑畸形，动脉瘤，安哥曼综合征(Angelman syndrome)，血管瘤病(angiomatosis)，anoxia，抗磷脂综合症，失语症，失用症，蛛网膜囊肿，蛛网膜炎，下疝畸形，亚斯伯格综合症(Aspergersyndrome)，动脉畸形，共济失调，共济失调和小脑或脊髓小脑退化，ataxiatelangiectasia，心房纤颤，中风，注意力缺乏多动障碍，听觉处理障碍，自闭症，自主神经紊乱，背痛，巴氏综合症(Barth syndrome)，Batten disease，先天性肌强直(becker'smyotonia)，***(Behcet's disease)，贝尔氏麻痹症(bell's palsy)，良性特发性眼睑痉挛，良性局灶性肌萎缩，良性颅内压增高，伯-罗二氏综合症(Bernhardt-Rothsyndrome)，双侧额叶多小脑回畸形(bilateral frontoparietal polymicrogyria)，宾斯旺格病(Binswanger's disease)，眼睑痉挛，Bloch-Sulzberger综合症，产伤致臂丛神经损伤(brachial plexus birth injuries)，臂丛神经损伤，Bradbury-Eggleston综合症，脑肿瘤或脊髓肿瘤，脑脓肿，脑动脉瘤，脑损伤，脑损伤，脑肿瘤，脊髓半切综合症(Brown-Sequard syndrome)，bulbospinal muscular atrophy，CADASIL(伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传脑动脉瘤，cerebral autosomal dominant arteriopathysubcortical infarcts and leukoencephalopathy)，卡纳万病(Canavan disease)，腕管综合征，灼痛，cavernomas，海绵状血管瘤，海绵状血管畸形，中央颈脊髓综合症，中央脊髓综合症，中枢性疼痛综合症，脑桥中央髓鞘溶解症，centronuclear myopathy，小头畸形，神经酰胺酶缺乏症，小脑变性，小脑发育不全，脑动脉瘤，脑动脉硬化，脑萎缩，脑型脚气病(cerebral beriberi)，脑海绵血管畸形，脑性巨人症，脑缺氧，脑性瘫痪，脑血管炎(cerebral vasculitis)，脑-眼-面-骨骼综合征(COFS)，颈椎管狭窄症，腓骨肌萎缩症，chiari畸形，胆固醇酯贮积病，舞蹈症，舞蹈性棘红细胞增多症(choreoacanthocytosis)，慢性疲劳综合征，慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)，慢性直立不耐症(chronic orthostatic intolerance)，慢性疼痛，II型Cockayne综合征，科-勒二氏综合征(Coffm-Lowry syndrome)，colpocephaly，昏迷(coma)，复杂性区域疼痛综合征，压迫性神经病，脑震荡，先天性双侧面瘫，先天性肌无力，先天性肌病，先天性海绵状血管畸形，皮层基底节变性，颅动脉炎，颅缝早闭症，cree encephalitis，克雅氏病，累积性创伤疾病，库欣综合征，巨细胞包涵体病(CIBD)，巨细胞病毒感染，舞眼舞足综合征(斜视眼阵挛肌阵挛综合征)，丹迪-沃克综合症(DWS)，道森病(Dawson disease)，减压病，De morsier综合征，dejerine-klumpke麻痹(dejerine-klumpke palsy)，dejerine-Sottas病，睡眠期延迟综合症，痴呆，多发梗塞性痴呆(dementia-multi-infarct)，语义性痴呆，皮质下痴呆，路易体痴呆，齿状核小脑共济失调，齿状核红核萎缩(dentatorubral atrophy)，抑郁症，皮肌炎，发育性运动障碍(developmental dyspraxia)，德维克氏综合征，糖尿病，糖尿病性神经病，弥漫性硬化，Dravet综合征，家族性自主神经异常(dysautonomia)，计算障碍，书写障碍，阅读障碍，吞咽困难，运动障碍，肌阵挛性小脑协调障碍，进行性小脑协调障碍(dyssynergiacerebellaris progressiva)，肌张力障碍，肌张力障碍，早期婴儿癫痫(Early infantileepileptic)，空蝶鞍综合征，脑炎，昏睡性脑炎，脑膨出，脑病，脑病(家族性婴儿)，脑三叉神经血管瘤病(encephalotrigeminal angiomatosis)，遗尿症，癫痫，癫痫性偏瘫(epileptichemiplegia)，厄尔布氏麻痹，erb-duchenne和dejerine-klumpke麻痹，红斑性肌痛，原发性震颤，脑桥外髓鞘溶解症，Fabry病，Fahr综合征，昏厥，家族性自主神经异常，家族性血管瘤，家族性特发性基底神经节钙化，家族性周期性瘫痪，家族性痉挛性麻痹，法伯病，高热性惊厥，纤维肌发育不良，纤维肌痛，费雪综合症，松软婴儿综合征，足下垂，福维尔氏综合症，Friedreich共济失调，额颞痴呆，高雪氏症，广泛性神经节苷脂沉积病(generalizedgangliosidoses)，格斯特曼综合征，Gerstmann-Straussler-Scheinker综合征，巨轴索神经病，巨细胞动脉炎，巨细胞包涵体病，球形细胞样脑白质病，舌咽神经痛，糖原贮积病，灰质异位症，Guillain-Barre综合征，Hallervorden-Spatz病，头部损伤(head injury)，头痛，连续性偏头痛，偏侧面肌痉挛，交叉性偏瘫，遗传性神经病，遗传性痉挛性截瘫，多神经炎型遗传性共济失调，带状疱疹，耳带状疱疹，平山综合征，Holmes-Adie综合征，前脑无裂畸形，HTLV-1相关性脊髓病，HIV感染，休斯综合症，亨廷顿氏病，水脑畸形，脑积水，正常压力性脑积水，脊髓积水，皮质醇增多症，睡眠过度，高血压，张力亢进，张力减退，低氧症，免疫介导的脑脊髓炎，包涵体肌炎，色素失禁症，婴儿张力减退，婴儿神经轴索营养不良，婴儿植烷酸贮积病，婴儿雷夫叙姆病(Infantile refsum disease)，婴儿痉挛，炎症性肌病，炎症性肌病，露脑畸形，肠道脂肪营养不良，颅内囊肿，颅内高压，艾萨克综合征，乔伯特综合征，Karak综合征，卡恩斯-赛尔综合征，肯尼迪病，金斯伯恩综合征，克莱恩-莱文综合征(Kleine-Levin syndrome)，克利佩尔-费尔综合征(Klippel feil syndrome)，克利佩尔-特脑纳综合征(Klippel-Trenaunay syndrome，KTS)，克鲁尔-布西综合征(Kluver-Bucysyndrome)，科萨柯夫遗忘综合征(Korsakoff s amnesic syndrome)，克拉伯病(Krabbedisease)，库格尔贝格-韦兰德病(Kugelberg-Welander disease)，苦鲁病(kuru)，拉福拉病，兰伯特-伊顿肌无力综合征(lambert-eaton myasthenic syndrome)，兰达-克莱夫综合症(Landau-Kleffner syndrome)，股外侧皮神经卡压(lateral femoral cutaneous nerveentrapment)，延髓背外侧(wallenberg)综合征，学习障碍，雷氏病(Leigh's disease)，伦诺克斯-加斯托二氏综合征(Lennox-Gastaut syndrome)，莱施-尼汉综合征(Lesch-Nyhansyndrome)，脑白质营养不良，莱文-克里奇利综合征(Levine-Critchley syndrome)，路易体痴呆，脂质贮积病，类脂蛋白沉积症，无脑回畸形，闭锁综合症(Locked-In syndrome)，卢·格里格氏病(Lou Gehrig's)，腰椎间盘疾病，腰椎管狭窄，狼疮-神经***后遗症，莱姆病-神经后遗症(lyme disease-neurological sequelae)，马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease，脊髓小脑性共济失调3型)，巨脑(macrencephaly)，视物显大症，巨脑症，梅-罗二氏综合征(Melkersson-Rosenthal syndrome)，梅尼埃病，脑膜炎，脑膜炎和脑炎，门克斯病(Menkes disease)，感觉异常性股痛，异染性脑白质营养不良，代谢紊乱(metabolic disorders)，头小畸形，视物显小症，偏头痛，米勒-费舍尔综合征(Millerfisher syndrome)，小中风(短暂性脑缺血发作)，恐音症，线粒体肌病，默比厄斯氏综合征(Mobius syndrome)，莫比斯综合征(Moebius syndrome)，单体肌萎缩，情绪病，运动神经元病，运动技能障碍，烟雾病(Moyamoya disease)，粘脂贮积病(mucolipidoses)，粘多糖贮积病(mucopolysaccharidoses)，多发梗塞性痴呆(multi-infarct dementia)，多灶性运动神经病变，多发性硬化，多***萎缩症，多***性萎缩伴直立性低血压，肌营养不良，肌痛性脑脊髓炎，先天性肌无力，重症肌无力，脱髓鞘弥漫性硬化(myelinoclastic diffusesclerosis)，婴儿肌阵挛性脑病，肌阵挛，肌病，先天性肌病，甲状腺毒性肌病，肌强直，先天性肌强直，肌管性肌病，发作性嗜睡病，神经棘红细胞增多症，神经退行伴脑铁沉积，神经纤维瘤病，神经阻滞剂恶性综合征，AIDS神经并发症，莱姆病神经并发症(neurologicalcomplications of lyme disease)，巨细胞病毒感染的神经学后果(neurologicalconsequences of cytomegalovirus infection)，AIDS的神经临床表现，庞贝氏病的神经临床表现，狼疮的神经后遗症，视神经脊髓炎，神经性肌强直，神经元蜡样脂褐质贮积症，神经元迁移障碍，遗传性神经病，神经结节病，神经梅毒，神经毒性，神经毒性侮辱(neurotoxic insult)，海绵状痣(nevus cavernosus)，尼曼-皮克病(Niemann-pickdisease)，非24小时睡眠-觉醒综合征，非语言学习障碍，正常压力脑积水，奥沙利文-麦克劳德综合征(O'Sullivan-McLeod syndrome)，枕神经痛，隐匿性脊柱闭合不全序列，大田原综合征(Ohtahara syndrome)，橄榄体脑桥小脑萎缩，斜视眼阵挛肌阵挛，斜视眼阵挛肌阵挛综合征，视神经炎，直立性低血压，过度使用综合征，慢性疼痛，palinopsia，恐慌症，泛酸激酶相关的神经变性，先天性副肌强直，副肿瘤疾病，感觉异常，帕金森病，阵发性发作，阵发性舞蹈手足徐动症，阵发性偏头痛，帕罗综合征(Parry-Romberg syndrome)，佩-梅氏病(Pelizaeus-Merzbacher disease)，Pena shokeir II综合征，外周神经囊肿，周期性麻痹，周围神经病变，脑室周围白质软化，持续性植物状态，广泛性发育障碍，光喷嚏反射，植烷酸贮积病，皮克氏病(Pick's disease)，pinched nerve，梨状肌综合征，垂体瘤，PMG，脊髓灰质炎，多小脑回，多发性肌炎，庞贝氏病，脑穿通，脊髓灰质炎后综合征，带状疱疹后神经痛(PHN)，感染后脑脊髓炎，***性低血压，姿势性直立性心动过速综合征，***性心动过速综合征，Prader-Willi综合征，原发性牙本质萎缩，原发性侧索硬化，原发性进行性失语症，朊病毒病，进行性面偏侧萎缩，进行性运动性共济失调，进行性多灶性白质脑病，进行性硬化性脊髓灰质炎，进行性核上性麻痹，脸盲症，Pseudo-Torch syndrome，假弓形虫病综合征(Pseudotoxoplasmosis syndrome)，假性瘤脑，狂犬病，I型拉姆齐亨特综合征(Ramsayhunt syndrome type I)，II型拉姆齐亨特综合征(Ramsay hunt syndrome type II)，III型拉姆齐亨特综合征(Ramsay hunt syndrome type III)，拉斯穆森氏脑炎(Rasmussen'sencephalitis)，反射性神经血管营养不良，反射***感神经营养不良综合征，雷夫叙姆病(Refsum disease)，婴儿雷夫叙姆病(Refsum disease-infantile)，重复性运动障碍，重复性应力损伤，多动腿综合征，逆转录病毒相关性脊髓病，雷特氏综合征(Rett syndrome)，瑞氏综合征(Reye's syndrome)，风湿性脑炎，节律性运动障碍，赖利-戴综合征(Riley-Daysyndrome)，Romberg综合征，骶骨神经根囊肿，圣维特舞蹈(saint vitus dance)，唾液腺疾病，桑德霍夫病(Sandhoff disease)，谢耳德氏病(Schilder's disease)，脑裂畸形，精神***症，Seitelberger病，癫痫发作，语义性痴呆，感觉统合功能障碍，视-光发育不良，婴儿期严重肌阵挛性癫痫(SMEI)，摇晃婴儿综合征(Shaken baby syndrome)，带状疱疹，夏伊-德雷格综合征(Shy-Drager syndrome)，干燥综合征(Sjogren's syndrome)，睡眠呼吸暂停，昏睡病，snatiation，索托氏综合症(Sotos syndrome)，痉挛状态，脊柱裂，脊髓梗死，脊髓损伤，脊髓肿瘤，脊髓性肌萎缩，脊髓小脑性共济失调，脊髓小脑萎缩，脊髓小脑变性，斯蒂尔-理查森-奥尔谢夫斯基综合征(Steele-Richardson-Olszewski syndrome)，僵硬人综合征(Stiff-Person syndrome)，纹状体黑质变性(striatonigral degeneration)，中风，斯特奇-韦伯综合症(Sturge-Weber syndrome)，亚急性硬化性全脑炎，皮质下动脉硬化性脑病，SUNCT头痛，浅表铁质沉着症，吞咽障碍，西登哈姆舞蹈病(Sydenham's chorea)，晕厥，联觉(synesthesia)，梅毒性脊髓硬化，脊髓空洞积水症，脊髓空洞症，***性红斑狼疮，脊髓痨，迟发性运动障碍，迟发性肌张力障碍，塔洛夫囊肿(tarlov cyst)，跗管综合征(Tarsal tunnel syndrome)，泰伊-萨克斯二氏病(Tay-Sachs disease)，颞动脉炎，破伤风，脊髓栓系综合征，汤姆森氏病(Thomsen disease)，汤姆森氏肌强直(thomsen'smyotonia)，胸廓出口综合征，甲状腺毒性肌病，三叉神经痛(tic douloureux)，托德氏麻痹(todd's paralysis)，杜尔雷斯综合征(Tourette syndrome)，中毒性脑病，短暂性脑缺血发作，传染性海绵状脑病，横贯性脊髓炎，创伤性脑损伤，震颤，三叉神经痛(trigeminalneuralgia)，热带痉挛性下肢瘫痪，Troyer综合征，嗜眠病(trypanosomiasis)，结节性硬化，ubisiosis，***，血管性***肿瘤，中枢神经***和***神经***的血管炎综合征，viliuisk脑脊髓炎(VE)，冯·埃科诺莫病(Von economo's disease)，希佩尔-林道综合征(Von Hippel-Lindau disease，VHL)，冯·雷克林豪森氏病(Von recklinghausen'sdisease)，瓦伦伯格氏综合征(Wallenberg's syndrome)，韦德尼希-霍夫曼病(Werdnig-Hoffman disease)，韦尼克-科尔萨科夫综合征(Wernicke-Korsakoff syndrome)，韦斯特综合征(West syndrome)，Whiplash，惠普耳氏病(Whipple's disease)，威廉姆斯综合征(Williams syndrome)，威尔逊氏病(Wilson's disease)，沃尔曼氏病(Wolman'sdisease)，X-连锁脊髓延髓肌萎缩症，或泽尔韦格氏综合征(Zellweger syndrome)。此外，上述方法可以进一步包括如美国专利申请US20120207726和US2011018390中所描述的用于评价神经***病症的其他方法。
e.感染性疾病
本发明的其他应用提供用于检测由细菌、病毒、寄生虫和真菌感染原引起的感染性疾病的方法。
在一些应用中，本文公开的方法可用于监测细胞的病毒感染。病毒基因组可快速进化并且通常彼此之间具有几个核苷酸或片段的差异，而剩余的基因组仍然没有发生改变。因此，引物或探针可制成识别保守区域并识别菌株独特的特定可变核苷酸。参见，例如，美国专利申请US20160259881，其描述了用于检测病毒和病毒重组的dPCR。用于本文公开的内容的病毒的实例可包括但不限于：人免疫缺陷病毒(HIV)或***瘤病毒(HPV)，流感菌株(例如，H1N1,H5N1,H3N2,H7N9,或H1N2)，或者它们的重组。
在一些应用中，本发明的方法可用于检测或监测与生物恐怖袭击或细菌战袭击有关的病毒或微生物感染。在一些应用中，本发明的方法用于监测群体或患者中的流行病或瘟疫。在一些应用中，本发明的方法可用于检测并诊断由感染原引起的耐药性。可用于本文公开的内容的耐药性感染原的非限定性实例是：耐万古霉素粪肠球菌，耐甲氧西林金黄色葡萄糖球菌，耐青霉素肺炎链球菌，多耐药性结核杆菌和耐AZT人免疫缺陷病毒。
本文公开的其他应用提供检测或定量生物样本中病原体的抗生素耐受菌株的方法。在一种实施方式中，本发明的方法可包括如下步骤：(a)在来自测试样品的核酸上进行实时PCR，其中，PCR反应混合物是本文描述的反应混合物，(b)确定由检测病原体特异性序列的探针产生的信号的Ct值以及赋予抗生素耐受性的多核苷酸序列(其在本文中称为“抗生素耐受性基因”)的Ct值，无论所述病原体特异性序列是基因还是基因间区域(本文称为“病原体特异性基因”)；以及(c)比较病原体特异性基因的Ct值和抗生素耐受性基因的Ct值。在另一实施方式中，本发明的方法可还包括如下步骤：(d)扩增“架桥区域”(使含有抗生素耐受性基因的元件的通常***点(***点)与目标病原体的基因组中的已知位置连接)，和(e)确定所述架桥区域的Ct值。
本文中的其他应用提供用于检测、诊断、预后或监测食品工业或饲料工业中的微生物感染或污染的方法。例如，本文公开的内容可用于识别和表征生产用有机体，例如，用于生产啤酒、葡萄酒、奶酪、酸奶、面包等等的酵母。在一些应用中，本文公开的内容可用于产品的质量控制和鉴定以及对污染物的处理(例如，畜牧业处理、巴氏处理和肉类处理)。在一些应用中，本文公开的内容可用于表征用于繁殖目的的植物、鳞茎和种子，识别植物特异性病原体的存在以及在兽医感染和动物繁殖项目中进行检测和识别。
本文公开的其他应用提供用于检测或监测环境污染物的方法。在本文公开的内容中使用的环境监测方法的实例包括但不限于：检测、识别和监测自然和工业生态环境中的病原微生物和土著微生物以及市政污水纯化***和水储库中的微***或经历了生物修复的污染区域中的微***。本文的方法还可检测包含可代谢生物异源物质的基因的质粒，监测种群动态研究中的特定目标微生物，或检测、识别、或监测环境和工业植物中的基因修饰的微生物。
本文公开的其他应用提供用于法医学或流行病学研究的方法。在本文公开的内容中使用的法医学方法的实例可包括但不限于：军事人员和犯罪调查的分类身份鉴定，生父测试和家族关系分析，HLA相容性分型，短串联重复序列(STR)以及筛选污染的血液、***或移植器官。在一些应用中，本文公开的内容提供考古学研究的方法和应用。
本文公开的其他应用提供用于检测或定量拷贝数改变的方法。在本文公开的内容中使用的与拷贝数改变有关的疾病的实例可包括但不限于：13三体型，21三体型，18三体型，Diverge/腭心面综合征(22qI I.2缺失)，Prader-Willi综合症(15ql l-ql3缺失)，威廉姆斯-伯伦综合症(Williams-Beuren syndrome，7ql 1.23缺失)，Miller-Dieker综合症(MDLS，17pl3.3微缺失)，史密斯-马吉利综合症(Smith-Magenis syndrome，SMS)(17pl l.2微缺失),1型神经纤维瘤(NF1)(17ql l.2微缺失),Phelan-McErmid综合症(22ql3缺失),Rett综合症(染色体Xq28上的MECp2中的功能缺失突变),Merzbacher疾病(PLP1的CNV),脊髓性肌萎缩(SMA)(染色体5ql3上端粒SMNI的纯合消失),Potocki-Lupski综合症(PTLS,染色体17p.l 1.2的复制)。PMP22基因的其他拷贝可与IA型Charcot-Marie-Tooth神经病变(CMTI A)以及具有压迫***可能的遗传神经病变(HNPP)相关。本文所述的检测CNV的方法可用于诊断本文所述的CNV疾病，其通过引用并入本文。可用于本文公开的内容的其他疾病在Lupski J.(2007)Nature Genetics 39:S43-S47中描述。
本文公开的其他应用提供用于检测或定量母代样品(例如，母代血液样品，绒毛膜绒毛取样或羊水)中的胎儿非整倍性的方法。用于本发明的胎儿非整倍性的实例可包括但不限于：13三体型，18三体型，21三体型(唐氏综合征)，克氏(Klinefelter)综合症(XXY)，一个或多个染色体的单体性(X染色体单体性，Turner综合症)，X三体型，一个或多个染色体的三体型，一个或多个染色体的四体性或五染色体性(例如，XXXX,XXYY,XXXY,XYYY,XXXXX,XXXXY,XXXYY,XYYYY和XXYYY)，三倍体性(每个染色体三个，例如，人体内的69个染色体)，四倍体性(每个染色体四个，例如，人体内的92个染色体)，以及多倍体性。在一些应用中，非整倍性可以是分段的非整倍性。用于本文公开的内容的分段的非整倍性的实例可包括但不限于：Ip36复制，dup(17)(pl 1.2pl 1.2)综合症，唐氏综合征，佩梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease)，dup(22)(ql 1.2ql 1.2)综合症以及猫眼综合症。
本文公开的内容的其他应用提供用于检测或定量由性别染色体或常染色体的一个或多个缺失而引起的异常胎儿基因分型的方法。用于本文公开的内容中的由一个或多个缺失引起的异常胎儿基因分型的实例可包括但不限于：猫叫综合症(Cri-du-chatsyndrome)，Wolf-Hirschhorn，威廉姆斯-伯伦综合症(Williams-Beuren syndrome)，Charcot-Marie-Tooth疾病，具有压迫***可能的遗传神经病变，史密斯-马吉利综合症(Smith-Magenis syndrome)，神经纤维瘤，Alagille综合症，腭心面综合征(Velocardiofacial syndrome)，Digeorge综合症，类固醇硫酸酯酶缺乏症，卡尔曼综合症(Kallmann syndrome)，具有线性皮肤缺陷的Microphthalmia，肾上腺发育不良(Adrenalhypoplasia)，甘油激酶缺乏症，佩梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease)，Y染色体上的睾丸决定因子，无***症(Azospermia，因子a)，无***症(因子b)，无***症(因子c)，或Ip36缺乏。在一些情况下，染色体数量的减少产生XO综合症。在另一应用中，上述方法可还包括美国专利US8293470中所描述的用于检测胎儿非整倍性的其他方法。
本文公开的内容的其他应用提供用于检测或定量基因组拷贝数的改变的方法。用于本文公开的内容中的过量的基因组DNA拷贝数的改变的实例可包括但不限于：Li-Fraumeni癌症易感癌症症状(predisposition syndrome)(Shlien et al.(2008)PNAS105:11264-9)，与畸形综合症相关的CNV，包括CHARGE(缺损，心脏异常，鼻后孔闭锁，阻滞，生殖器和耳部异常)，Peters-Plus，Pitt-Hopkins或血小板减少-桡骨缺失综合征(参见，例如，Ropers HH(2007)Am J of Hum Genetics 81:199-207)。拷贝数的改变和癌症之间的关系在例如Shlien A.and Malkin D.(2009)Genome Med.1(6):62中描述。拷贝数的改变还与例如自闭症，精神***症和先天学习障碍相关联。
参见，例如，Sebat J.,et al.(2007)Science 316:445-9；Pinto J.et al.(2010)Nature 466:368-72；Cook E.H.和Scherer S.W.(2008)Nature 455:919-923。拷贝数的改变可与癌症患者对某些治疗的耐受性有关。例如，胸苷酸合成酶的扩增可导致转移性结肠直肠癌患者对5-氟尿嘌呤治疗的耐受性。参见，See Wang et al.(2002)PNAS USA vol.99,pp.16156-61。确定CNV的方法在例如PCT申请公开WO2012/109500中描述。
本文公开的内容的其他应用提供用于检测或定量RNA的基因表达水平(例如，信使RNA水平)的方法。在一些应用中，所述方法用于检测或定量相对于野生型或标准而言较低的RNA表达水平。在一些应用中，所述方法用于检测或定量相对于野生型或标准而言较高的RNA表达水平。
本文公开的内容的其他应用提供用于检测和进行各种不同的基因分析的方法。用于本文公开的内容的基因分析的实例可包括但不限于：如果序列是突变状态或野生型状态，那么序列具有一个或多个突变(例如，新生突变(de novo mutation)，无义突变，错义突变，沉默突变，移码突变，***，取代，点突变，单核苷酸多态性(SNP)，单核苷酸变体，新生单核苷酸变体，删除，重排，扩增，染色体易位，中间缺失，染色体倒置，杂合性缺失，功能缺失，功能获得，显性失活(dominant negative)，或致死)。在一些应用中，本文公开的内容可用于检测与癌症的发作和进展相关的特定点突变。在另一应用中，上述方法可还包括分析核酸的其他方法，例如，用于检测突变、基因表达或拷贝数改变的其他方法，其在美国专利申请US20120252015,US2012021549,US20120214163,US20120225428,US20120245235,US20120252753,US20100196898,US20120270739,US20110171646,和美国专利US 8304194中描述。
本文公开的内容的其他应用提供检测或定量涉及母体和胎儿基因序列之间的定量差异的胎儿基因异常的方法。用于本文公开的内容的母体及其胎儿之间的基因异常的差异的实例可包括但不限于：母体和胎儿DNA之间的杂合性和纯合性，以及非整倍性。例如，缺失染色体X拷贝(单倍体性X)导致Turner综合症，而染色体21的额外的拷贝导致唐氏综合征。诸如Edward综合症和Patau综合症之类的其他疾病分别由染色体18和染色体13的额外的拷贝引起。
本文公开的内容的其他应用提供用于检测或定量各种不同的染色体非整倍性的方法。用于本文公开的内容的染色体非整倍性的实例可包括但不限于：易位，***，扩增，添加，颠换，倒置，非整倍性，多倍体性，单倍体性，三倍体性，21三体型，13三体型，14三体型，15三体型，16三体型，18三体型，22三体型，三倍体性，四倍体性，性别染色体异常(包括但不限于：XO,XXY,XYY,和XXX)。在目标序列可存在于母体DNA(杂合体)中的一个拷贝中但在胎儿(纯合体)体内引起疾病的疾病的实例包括但不限于：镰状红细胞贫血症(sickle cellanemia)，囊性纤维化，血友病和Tay Sachs疾病。因此，使用本文所述的方法，本领域技术人员可将具有一个突变的基因组与具有两个突变的基因组区分开。
本文公开的内容的其他应用提供用于检测或定量遗传性基因疾病的方法。基因疾病可在产前筛选或在产后筛选。用于本文公开的内容的可检测的基因疾病的实例可包括但不限于：21羟化酶缺乏症，囊性纤维化，脆性X染色体综合症(Fragile X Syndrome)，Turner综合症，杜与氏肌肉营养不良综合征(Duchenne Muscular Dystrophy)，唐氏综合征或其他三体型，心脏疾病，单基因疾病，HLA分型，苯丙酮尿症，镰状红细胞贫血症(sickle cellanemia)，Tay-Sachs疾病，地中海贫血(thalassemia)，克氏综合症(KlinefelterSyndrome)，亨廷顿疾病(Huntington Disease)，自体免疫疾病，脂沉积症，肥胖疾病，血友病，遗传性代谢缺陷(inborn errors of metabolism)，和糖尿病。使用的其他基因突变在下列数据库中描述：GDB人类基因组数据库，RTI国际组织赞助的人类基因组注释官方全球数据库(The Official World-Wide Database for the Annotation of the HumanGenome Hosted by RTI International，美国北加州)。
本文公开的内容的其他应用提供用于检测或定量镰状红细胞贫血症的方法。镰状红细胞贫血症是常染色体隐性疾病。美国黑人中有9％是杂合性的，而0.2％的是纯合性隐性的。隐性等位基因导致血红蛋白的β链中单个氨基酸取代。
本文公开的内容的其他应用提供用于检测或定量Tay-Sachs疾病的方法。Tay-Sachs疾病是一种导致神经***退化的常染色体隐性疾病。症状在出生后显现。该等位基因的纯合性隐性儿童很少存活超过五岁。患者缺乏产生分解GM2神经节苷脂脂质的N-乙酰基-己糖氨酶的能力。
本文公开的内容的其他应用提供用于检测或定量苯丙酮尿症(PKU)的方法。PKU是一种隐性遗传的疾病，该病的患者缺乏合成将氨基酸苯基丙氨酸转化为酪氨酸的酶的能力。该等位基因的纯合性隐性个体在其尿液和血液中累积苯基丙氨酸和异常的分解产物。
本文公开的内容的其他应用提供用于检测或定量血友病的方法。血友病是一组血液无法正常凝结成块的疾病。血液中的因子被包括在血凝块中。缺乏正常因子VIII的血友病患者具有血友病A和缺乏因子IX的具有血友病B的那些患者。这些基因负载在X染色体上，因此，引物和探针可用于本发明的方法中以检测胎儿是否遗传了母体的缺乏的X染色体或父亲的正常等位基因。
本文公开的内容的其他应用提供用于检测和定量由核酸上的差异性甲基化区域(DMR)引起的基因异常的方法。术语“差异性甲基化区域”或“DRM”是指染色体DNA中胎儿DNA和母体DNA之间的被差异性地进行甲基化的区域。本发明提供基于cffDNA的检测的一种新的无创产前检测(NIPT)方法。在一些应用中，所选择的用于分析的DMR是胎儿DNA中过度甲基化并且在母体中去甲基化的那些差异性甲基化区域。也就是说，这些所选择的DMR表现出相对于在母体DNA中在胎儿DNA中具有更大程度的(即，更多)甲基化。在其他应用中，DMR是在胎儿DNA中去甲基化的且在母体血液中过度甲基化的那些区域。在一些应用中，染色体13，染色体18，染色体21，染色体X和染色体Y中的每一个的DMR的较大区域(大约2000)可使用本文提供的方法进行分析。在一些应用中，本文公开的内容可用于检测或定量染色体21上的多个DMR，用于诊断21三体型。
染色体21上的多个DMR包括两个或多个，三个或多个，四个或多个，五个或多个，六个或多个，七个或多个，八个或多个，九个或多个，十个或多个，十一个或多个，或十二个区域。在各种不同的其他实施方式中，多个DMR位于选自染色体13，染色体18，染色体X和染色体Y的染色体上，从而能够诊断这些染色体中的任一个的非整倍性。
试剂用于相对于非甲基化的DNA进行差异性修饰甲基化的DNA。例如，采用亚硫酸氢盐处理DNA将胞嘧啶转化为尿嘧啶，但是留下5-甲基胞嘧啶残基未受影响，并且产生具有A,T,G和U的新序列，其是具有有限核苷酸组成的引物的完美模板。在特定实施方式中，DMR中的至少一个位于RASSF1A和/或TBX3基因中，或选自RASSF1A,TBX3,HLCS,ZFY,CDC42EP1,MGC15523,SOX14,GSTP1,DAPS,ESR1,ARC,HSD1784,H1C1,和SPN的基因中。
一方面，本发明提供使用母体血液样本的NIPT方法。去甲基化的DNA通过化学方法发生改变或进行酶消化，留下未受影响的过度甲基化的DNA。目标靶点的多个DMR的水平由具有有限核苷酸组成的引物来确定。术语“多个DMR的水平”是指DMR的量、普遍性或拷贝数。在具有胎儿非整倍性的胎儿中，相对于正常胎儿，由于非整倍性而产生大量DMR。胎儿非整倍性通过比较目标靶点的多个DMR的水平和相同样品的参比靶点或正常母体参比样品的参比靶点来诊断。
本文公开的内容的其他应用提供用于确定生物样品中的等位基因一致性的方法，用于诊断药物代谢(例如，药代动力学或药效学)，药物安全性，毒性或副作用。在一些应用中，本文公开的内容可用于确定来自患者的种系DNA(例如，SNP)的生物样本的遗传药理学。在一些应用中，本文公开的内容可用于确定来自患者的体DNA(例如，肿瘤DNA)的生物样本的遗传药理学。在一些应用中，本文公开的内容可应用于治疗疾病方面在治疗性介入的过程中所需的突变，所述疾病的治疗可决定给定治疗的过程和疗效。测量药物治疗的疗效的一些非限定性实例是检测或定量：白血病患者或样品中的最小残留病(MRD)，种系SNP，或体突变。用于本文公开的内容的药物遗传基因及其变体的实例可在各种不同的数据库中找到，例如，“Pharmacogenomics Knowledge Base”，并且定期在期刊Pharmacogenetics andGenomics中公开。
本文公开的内容的其他应用提供用于进行确定作为疾病风险或遗传药理学基础的基因变异的关联研究的方法。进行基因关联研究测试以找到疾病和基因组区域(例如，基因座，单体型，使用统计学方法(例如，数量性状基因座(QTL)))之间的关系。在受到疾病影响的种群中的较高的基因变异频率通常被解释为与疾病风险提高相关。用于本文公开的内容的用于进行关联性研究的基因变异的实例可包括但不限于：SNP，微卫星标志物，***，删除，可被数量串联重复序列(VNTR)以及拷贝数改变(CNV)。
在一些应用中，进行病例对照关联性研究。在一些研究中，进行基于家族的关联性研究或QTL。
本文公开的内容的其他应用提供用于进行NGS的测序文库准备，单细胞扩增和RNA-seq检测的方法。
本文公开的其他方法是细胞中非整倍性存在的联合诊断。最常见的染色体非整倍性是唐氏综合征(21三体)，Edwards综合症(18三体)和Patau综合症(13三体)。估计691个新生儿中有一个出现T21，3762个新生儿中有一个出现T18，7906个新生儿中有一个T13。在没有达到条件的胎儿中出现更高的比例。
诸如羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛取样之类的有创产前诊断检测是目前染色体非整倍性的金标准，但是这与0.2％至0.5％的胎儿丢失风险相关联。诸如对由母体血液的无细胞DNA(cfDNA)产生的文库进行的大规模平行测序(MPS)或第二代测序(NGS)之类的无创产前检测(NIPT)已表现出是一种可靠的染色体非整倍性检测方法。然而，NGS分析需要在集中实验室中进行，并且目前的NGS工作流程非常费时并且费用较高。因此，目前NGS NIPT分析方法并不适用于大量患者样品或者并不适用于尚无法访问集中实验室的全球区域。
本发明提供用于T21，T18和T13的染色体非整倍性以及其他非整倍性的基于数字扩增的NIPT。测试使用来自母体血液的cfDNA并且同时定量染色体21，染色体18和染色体13中的任一种或优选地全部染色体21，染色体18和染色体13。数字扩增可在支持96孔板的任何常规PCR仪器上进行并且末端读取在ddPCR读取器上进行。母体血液在怀孕过程中采集。从母体血液，优选地从母体血浆中纯化cfDNA。通过ddPCR测试样品以识别带有可接受的置信度(例如，至少95％置信度)的真实的阴性结果和阳性结果。无法根据带有可接受的置信度的真实的阴性结果或阳性结果进行分类的样品(换言之，无结果的样品)随后进行测序，优选地通过第二代技术进行测序。
本文公开的内容还提供通过含有胎儿材料的母体样品用于胎儿生理物理评分测定和胎儿性别测定的方法。胎儿特异性靶点的实例包括用于男性胎儿的Y染色体和胎儿和母体DNA之间的差异性甲基化的区域(DMR)。Y染色体的存在说明男性胎儿。胎儿生理物理评分(FF)可通过如下方程式进行计算：FF＝(NY/NYC)/(NY/NYC+NM/NMC)*2*100％，其中，NY是通过数字扩增确定的Y特异性靶点的拷贝数，NYC是存在于1-基因组等同材料中的Y特异性靶点的拷贝数，NM是总的母体特异性靶点的拷贝数，NMC是1基因组等同材料中存在的母体特异性靶点的拷贝数。胎儿生理物理评分可通过另一方程式计算：FF＝(NDMT/NDMC-NDMMT/NDMC)/(NDMUT/NDMC)，其中，NDMT是通过数字扩增确定的甲基化特异性处理之后的DMR的拷贝数，NDMC是1基因组等同材料中的DMR的拷贝数，NDMMT是在甲基化特异性处理之后不含胎儿材料的母体对照样本中的DMR的拷贝数，NDMUT是未进行甲基化特异性处理的DMR的拷贝数。甲基化特异性处理的实例包括但不限于：甲基化敏感性限制酶消化，和亚硫酸氢盐处理。
本文公开的内容还提供用于测量母体血液中从可能污染cfDNA的细胞中释放的DNA水平的方法。采集、存储、运输和处理母体血液，随后从血浆中提取cfDNA。血液的保存和防止血细胞发生溶解在该过程中至关重要，以确保cfDNA的品质。将血液DNA释放进入血浆中改变了所提取的cfDNA的尺寸分布并且降低了胎儿生理物理评分，这使得下游应用更加复杂。靶定的扩增子的尺寸与cfDNA的尺寸分布匹配并且靶定的基因组区域的尺寸超过了cfDNA的尺寸的90％，95％，99％。通过dPCR同时定量多个靶点并且调节多个靶点的丰度使得每个靶点的阳性液滴在二维图谱上形成不同的簇并且易于与多个靶点阳性液滴区分开。随后理论上计算多个靶点阳性液滴的数量，从与所观察到的多个靶点阳性液滴进行比较。多个靶点阳性液滴的额外数量说明在cfDNA提取物中存在血细胞DNA并且额外数量的百分比通过XCMT/CGE*100％计算，其中，XCMT是多个靶点区域的拷贝数并且CGE是样品中基因组等同材料的拷贝数。
本文公开的内容进一步提供了用于降低dPCR分区的碎片尺寸的方法。基因组DNA的纯化过程基于方法和操作产生不同尺寸的碎片化的DNA。大碎片由于其结构而更加难以发生变性并且具有更强的杂交。在dPCR形式中，精确定量依赖于在泊松分布之后将目标靶点成功地分配至单个腔室中。因此，如果在相同DNA片段上存在有两个或多个靶点或者相同靶点的两个或多个拷贝并且其被分配至1个腔室中，那么，多靶点检测或多拷贝基因检测可产生错误定量。理想的DNA碎片尺寸小于500bp,400bp,300bp,200bp,170bp,150bp,或100bp。DNA碎片化的实例包括：物理碎片化方法，例如，声波处理，声波剪切，流体动力学剪切和电磁力剪切等；酶碎片化方法，例如，单个或多个限制性核酸内切酶消化，片段化酶处理，DNaseI处理，和转座酶处理，等等。在一些实施方式中，DNA碎片化在dPCR组装之前进行。在一些实施方式中，DNA碎片化和dPCR组装被组合在一起。
本文公开的内容还提供在相同荧光通道中检测多个靶点并且在1-D振幅，2-D振幅或3-D振幅上通过不同信号强度或信号强度的不同组合分辨多个靶点时在dPCR中进行靶点拷贝数计算的方法。分析方法被设计为在每个荧光通道中检测两个或多个靶点。在给定的通道中，靶点1(T1)与较高的振幅相关并且另一靶点(T2)与较低的振幅相关。当两种类型的靶点被分配在同一分区中时，该分区的振幅与较高的振幅相同。假设总分区数为T，具有较高的振幅的分区数为H，具有较低的振幅的分区数为L，T1的拷贝数为(ln(T)-ln(T-H))*(RV/PV)，T2的拷贝数为(ln(T)-ln(T-H-L))*(RV/PV))-(ln(T)-ln(T-H))*(RV/PV)，其中，RV是总反应体积，PV是分区体积。相同的原理应用于其他荧光通道中的反应和带有超过两种类型的靶点的反应。
为了实施本文公开的内容提供的方法的各种不同的应用，各种不同的传统技术可联合使用以使得本发明的方法适于特定的应用。这些传统技术可在标准实验室手册(例如，Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV),Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cells:A Laboratory Manual,PCR Primer:A Laboratory Manual,and Molecular Cloning:A Laboratory Manual(all from Cold Spring HarborLaboratory Press)；Stryer,L.(1995)Biochemistry(4th Ed.)Freeman,New York；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”1984,IRL Press,London,Nelsonand Cox(2000),Lehninger,(2004)Principles of Biochemistry 4th Ed.,W.H.FreemanPub.,New York,N.Y.and Berg et al.(2006)Biochemistry,6th Ed.,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.)中找到，上述参考文献的全部内容通过引用并入本文，用于所有目的。
实施例
实施例1：未被充分代表的引物降低dPCR中的背景信号
本实验的进行是为了确定带有未被充分代表的核苷酸类型的引物(例如，三种核苷酸类型的引物)相对于包含四种核苷酸的传统引物是否可降低dPCR反应中的背景信号。带有未被充分代表的核苷酸的引物有时被称为未被充分代表的引物。
在本实验中，在模板上进行液滴数字PCR反应(ddPCR)(n＝4)和没有模板进行反应(n＝2)之后，将从包含未被充分代表的引物的dPCR反应中产生的荧光信号与包含一对四核苷酸引物的PCR反应进行比较。
简言之，20μL ddPCR反应包含大肠杆菌基因组DNA模板的1000个拷贝，10μL QX200
Figure BDA0002437945330000641
Digital PCR Supermix(2X)，以及800nM的每种引物。使三种核苷酸类型的引物和传统引物靶定大肠杆菌中的相同基因组区域。传统的四种核苷酸引物包含两个鸟嘌呤并且三种核苷酸类型的引物由ATC核苷酸构成。最后，阴性对照不包含DNA模板，仍然使用上述相同的20μL ddPCR反应混合物。
接着，使用商售的液滴生成器(Bio-Rad Laboratories,Inc.)产生油包水液滴。PCR反应的循环如下：95℃持续5分钟，随后进行如下40个循环：95℃持续15秒，60℃持续30秒，4℃持续5分钟，并在95℃下加热5分钟。使用QX200液滴读取器和QuantaSoftTM软件(均来自于Bio-Rad Laboratories,Inc.)测量和分析荧光信号。
结果如图7A和图7B所示。含有三种核苷酸类型的引物反应(A)和四种核苷酸引物反应(B)的液滴的阳性模板均产生28,000-31,000的荧光信号。三种核苷酸类型的引物反应的背景信号产生2000这样极低的背景信号，与此相比，(B)四种核苷酸引物反应的背景信号为16,000-18,000。
总之，这些结果说明三种核苷酸类型的引物相对于传统的四种核苷酸的引物大大降低了背景信号。此外，这些结果说明，三种核苷酸类型的引物降低了反应中的引物-引物相互作用。
实施例2：三体性和整倍体DNA的辨别
本实验的实施是为了确定未被充分代表的引物是否能够在dPCR平台中准确地且灵敏地多路复用。
在本实验中，5-多路复用ddPCR反应在单个反应管中使用五对引物进行，从而定量染色体(Chr)21，染色体18，染色体13，染色体X和染色体Y的拷贝数改变。
20μL ddPCR反应含有250个拷贝数的模板DNA(第一或第二DNA模板类型)，10μLQX200
Figure BDA0002437945330000651
Digital PCR Supermix(2X)，一对Chr21引物，一对Chr18引物，一对Chr13引物，一对ChrX引物和一对ChrY引物。PCR条件如下：95℃持续5分钟，随后进行如下40个循环：95℃持续15秒，60℃持续30秒，4℃持续5分钟，并在95℃下加热5分钟。
母体血液中平均11％至13.4％的无细胞DNA是胎儿来源的。第一DNA模板是由正常人类基因组DNA构成的整倍性样品。第二DNA模板是由来自唐氏综合征患者的带有10％的三体性染色体21的基因组DNA的正常人类基因组DNA构成的三体性样品，所述唐氏综合征患者通常含有额外的Chr21的全部拷贝或部分拷贝。
每种类型的DNA模板进行32次复制以达到期望数量的阳性液滴。使用QX200液滴读取器和QuantaSoftTM软件(均来自于Bio-Rad Laboratories,Inc.)测量和分析荧光信号。
结果如图8所示。图中显示了五种物种的阳性液滴，其表明所有五种染色体21，18，13，X和Y(从上至下)均被检测到并且从背景信号(黑点)中被区分出来。而且，所有五种染色体的拷贝数也进行了定量(参见下表1A)。
表1A：在5-多路复用dPCR中检测到的每个染色体的拷贝数
Figure BDA0002437945330000661
第一DNA模板是包含平衡数量的染色体的整倍性样品(显示为WT)。在该样品中，染色体21被估算为245.32个拷贝，染色体18被估算为244.11个拷贝，染色体13被估算为239.61个拷贝，染色体XY作为一个物种一同被估算为249.15个拷贝。
第二DNA模板是三倍体型样品，其包含10％额外的Chr21拷贝(显示为10％T21)。在该样品中，染色体21被估算为261.46个拷贝，染色体18被估算为249.50个拷贝，染色体13被估算为246.90个拷贝，染色体XY作为一个物种一同被估算为250.44个拷贝。并且，使用染色体XY作为参比的比例在下表中显示。
在两种DNA模板类型(WT和10％T21)的每对染色体之间进行T-测试，从而确定它们彼此是否显著不同(参见表1B)。
表1B：显示了由WT和10％T21 DNA模板的每对染色体之间的t-测试获得的p值
Figure BDA0002437945330000662
在WT DNA模板中，没有发现染色体非整倍性。在10％T21样品中，Chr21的拷贝数显著较高，而染色体18，13和XY的拷贝数彼此之间并未显著不同。
这些结果说明使用本文提供的未被充分代表的引物和方法可在五种不同的染色体的5-多路复用反应中准确地定量拷贝数改变并且获得三倍体样品和整倍性样品之间统计学上显著的区别。
实施例3：使用14-多路复用dPCR确定cffDNA中的染色体非整倍性
除了母体血液中低丰度的胎儿DNA之外，胎儿DNA也被碎片化而进入血流。因此，在无创产前检测(NIPT)应用中，需要更多的扩增子/目标染色体以检测到足够的阳性液滴。
本实验的实施是为了确定在单个反应管中使用未被充分代表的引物的14-多路复用dPCR是否可以准确地定量和检测非常少量的三体型DNA模板。
20μL ddPCR反应包含500个拷贝的模板DNA(其包括第一，第二或第三DNA样品)，10μL QX200
Figure BDA0002437945330000671
Digital PCR Supermix(2X)，Chr21引物和Chr18引物。因为采用更多的扩增子/目标染色体设计的dPCR分析需要较少量的cffDNA输入，因此选择七种不同的扩增子用于染色体21(Chr18)和七种不同的扩增子用于染色体18(Chr18)。PCR条件为95℃持续5分钟，随后进行如下40个循环：95℃持续15秒，60℃持续30秒，4℃持续5分钟，并且在95℃加热5分钟。使用QX200液滴读取器和QuantaSoftTM软件(均来自于Bio-RadLaboratories,Inc.)测量和分析荧光信号。
对每种类型的基因组DNA进行八次复制以实现期望数量的阳性液滴。第一DNA样品由正常人类基因组DNA构成，第二DNA样品由带有10％三体型21的正常人类基因组DNA(来自唐氏综合征患者的基因组DNA)构成，并且第三DNA样品由带有10％三体型18(来自Edward综合症患者的基因组DNA)的正常人类基因组DNA构成。
图9显示了在每种DNA样品类型中检测到的阳性液滴。在图9中，正常人类基因组DNA(显示为WT)，带有10％三体型21的正常人类基因组DNA(显示为10％T21)，带有10％三体型18的正常人类基因组DNA(显示为10％T18)。含有Chr21扩增子的液滴位于图中14,000-20,000处；含有Chr18扩增子的液滴位于图中7,000-12,000处。
表2A显示了每个复制中所检测到的Chr21，Chr18的拷贝数以及三个DNA样品类型中的Chr21和Chr18的比例。
Figure BDA0002437945330000681
图2B显示了三种DNA样品类型的平均拷贝数以及通过t-测试获得的p-值。
Figure BDA0002437945330000682
通过t-测试获得的p-值显示多路复用分析能够检测三体型T21和T18样品与正常整倍性样品之间的拷贝数变化的统计学上的显著差异。
这些结果显示，本文公开的内容提供的未被充分代表的引物和方法可使用14-多路复用dPCR分析以样品中低至10％的DNA浓度差异这样的检测灵敏度来检测染色体异常。此外，该实验显示出，如无创产前检测(NIPT)方法中所需要的，未被充分代表的引物可用于dPCR平台以检测或定量低丰度cffDNA中的Chr21和Chr18的三体性。
实施例4：使用15-多路复用dPCR确定cffDNA中的唐氏综合征，Edward综合症和Patau综 合症
在该实验中，使用五种不同的扩增子在单个反应管中进行15-多路复用dPCR，这五种不同的扩增子，选择其每一个带有FAM荧光标记的探针的五种不同的扩增子用于染色体21，选择其每一个被相同的FAM荧光标记的探针检测的五种不同的扩增子用于染色体18，选择其每一个被相同的HEX荧光标记的探针检测的五种不同的扩增子用于染色体13。
测试了四种类型的DNA样品：正常人类基因组DNA，带有10％三体型21基因组DNA(来自唐氏综合征患者)的正常人类基因组DNA，带有10％三体型18基因组DNA(来自Edward综合症患者)的正常人类基因组DNA，以及带有10％三体型13基因组DNA(来自Patau综合症患者)的正常人类基因组DNA。
20μL ddPCR反应包含500个拷贝的模板DNA，10μLQX200Probe Digital PCRSupermix(2X)，Chr21引物，Chr18引物，Chr13引物，探针1，探针2和探针3。PCR条件为：95℃持续5分钟，随后进行如下50个循环：95℃持续15秒，60℃持续45秒，98℃持续10分钟，并在4℃下孵育5分钟。每个DNA样品类型进行八次复制以达到期望数量的阳性液滴。使用QX200液滴读取器和QuantaSoftTM软件(均来自于Bio-Rad Laboratories,Inc.)测量和分析荧光信号。
图10显示了每种DNA样品类型的阳性扩增子液滴。含有Chr21扩增子的阳性液滴位于簇(A)，含有Chr18扩增子的液滴位于簇(B)，含有Chr13扩增子的液滴位于簇(C)。
表3A，3B和3C分别显示了Chr21，Chr13和Chr18的定量拷贝数，以及四种DNA样品类型(WT，10％T21，10％T18和10％T13)的每个复制的比例。在表3A，表3B和表3C的下部显示了通过t-测试获得的WT(正常)和T21，T18以及T13三体型样品之间的平均拷贝数和p-值。
表3A：染色体21的拷贝数的定量
Figure BDA0002437945330000701
Figure DA00024379453332956
表3B：染色体13的拷贝数的定量
Figure BDA0002437945330000702
Figure DA00024379453332995
表3C：染色体18的拷贝数的定量
Figure BDA0002437945330000711
Figure DA00024379453333023
所进行的所有t-测试具有表3A，表3B和表3C所示的显著性p-值。这些结果说明，在单个反应管中使用未被充分代表的引物的15-多路复用dPCR分析可检测少量cffDNA中Chr21，Chr13和Chr18中的染色体非整倍性。
实施例5：基于甲基化胞嘧啶的转化确定拷贝数的改变
在由大肠杆菌(ATCC 700927D-5)纯化得到的商售基因组DNA上根据生产厂商的说明使用ZYMO RESEARCH的EZ DNA MethylationTM试剂盒进行甲基化胞嘧啶的转化。在本实验中转化200ng大肠杆菌基因组DNA并随后进行纯化。接着，我们将转化的DNA以1∶100(转化的∶原始的)至100∶1(转化的∶原始的)的比例与原始DNA(模拟甲基化的DNA)混合。
在不同的混合物的每一个上进行两次ddPCR反应，一个靶向转化的DNA序列，另一个靶向原始DNA序列。20μL ddPCR反应包含500个拷贝的模板DNA，10μL QX200
Figure BDA0002437945330000721
Digital PCR Supermix(2X)以及引物混合物。PCR条件为：95℃持续5分钟，随后进行如下40个循环：95℃持续15秒，60℃持续30秒，4℃持续5分钟，90℃持续10分钟，并在4℃下孵育5分钟。每个DNA样品类型进行八次复制以达到期望数量的阳性液滴。使用QX200液滴读取器和QuantaSoftTM软件(均来自于Bio-Rad Laboratories,Inc.)测量和分析荧光信号。
本实验表明，DNA中的大多数胞嘧啶转化为尿嘧啶并且靶向转化的DNA或原始DNA的引物成功地定量了对应的靶点。
虽然为了清楚地理解本发明已经对本发明做了详细描述，但是在后附的权利要求的范围内可进行一些改变。包括登录号，网页等在内的所有公开出版物以及本申请中所引用的所有专利文献的全部内容均通过引用并入本文，用于所有目的，这与单独地引用这些公开出版物和专利文献是相同的。不同版本的序列之间有一定程度的差异，网页或其他参考文献可能在不同的时间出现，本文中是指在有效提交日的参考文献相关的版本。有效提交日是指讨论中所公开的登录号的最早优先权日。除非另有明确说明，本发明的任何要素、实施方式、步骤、特征或方面可与其他任何要素、实施方式、步骤、特征或方面联合实施。
Figure BDA0002437945330000731
Figure BDA0002437945330000741
Figure BDA0002437945330000751
序列表
<110> 阿提拉生物***股份有限公司
王友祥
杨志杰
陈欣
赵玉
王蓉
<120> 使用有限核苷酸组成的引物的数字扩增
<130> 063010-517594
<150> US 62/544,605
<151> 2017-08-11
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 58
aaccacgtcc tttcctccgt catccctaca ccaac 35
<210> 59
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 59
aaccccgtac aaaatcgcca ccaccaacct cttgcctaca cctgcattta ccccaac 57
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 60
tccacagctc ctgcttatat caaaacc 27
<210> 61
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 61
aaccccgtac aaaatcgcca ccaccaacta aaacacattc aacactgtct cccagacacc 60
caaac 65
<210> 62
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 62
ctcttcccca ccatgtgttc attcattc 28
<210> 63
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 63
aaccccgtac aaaatcgcca ccaccaactc ctctagcatt aatagttacc acacctc 57
<210> 64
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 64
tactgaccaa tccaatgtca aattcctcta ccac 34
<210> 65
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 65
aaccccgtac aaaatcgcca ccaccaacaa accccaatgc ccaaatcttg ccattttttc 60
ac 62
<210> 66
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 66
tacccttcct tccctgaaca cagtcaatca tttctc 36
<210> 67
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 67
aaccccgtac aaaatcgcca ccaccaacct ctgccctcac gacccaatca cctttcaaac 60
<210> 68
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 68
cctccaaaac tcatctggaa atttattccc ccac 34
<210> 69
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM
<400> 69
aggagttcct atccggcctt ccatatcacc cctcactcct 40
<210> 70
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM
<400> 70
aggagtacca ctcttcctca gaagatatcc ttccactcct 40
<210> 71
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> HEX
<400> 71
aggagtaacc ccgtacaaaa tcgccaccac caacactcct 40
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<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
ctccataccc actatcaatc atatcaccat cctcggattg gtattggagg ttattaataa 60
tggtgga 67
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
tccaccatta ttaataacct ccaataccaa tcc 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
ctccataccc actatcaatc atatcaccat cctc 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
tccaccatta ttaataacct ccaataccaa tccgaggatg gtgatatgat tgatagtggg 60
tatggag 67
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
tccaccatta ttaataacct ccaataccaa tcc 33
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<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
ctccataccc agtatcaatg atatcagcat cctcggattg gtattgcagg ttattaataa 60
tcgtgga 67
<210> 78
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 78
tccacgatta ttaataacct gcaataccaa tccgaggatg ctgatatcat tgatactggg 60
tatggag 67
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 79
ctccataccc actatcaatc atatcaccat cctc 34
<210> 80
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 80
ctccataccc actatcaatc atatcaccat cctc 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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tccacgatta ttaataacct gcaataccaa tccgaggatg ctgatatcat tgatactggg 60
tatggag 67
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
<400> 82
ctccataccc agtatcaatg atatcagcat cctcggattg gtattgcagg ttattaataa 60
tcgtgga 67
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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tccaccatta ttaataacct ccaataccaa tcc 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 84
tccaccatta ttaataacct ccaataccaa tcc 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 85
ctccataccc agtatcaatg atatcagcat cctcggattg gtattgcagg ttattaataa 60
tcgtgga 67
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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tccacgatta ttaataacct gcaataccaa tccgaggatg ctgatatcat tgatactggg 60
tatggag 67
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 87
ctccataccc actatcaatc atatcaccat cctc 34

Claims (50)

1.一种在样品中的目标核酸上进行数字扩增的方法，所述方法包括：
将包含目标核酸的样品进行等分；
在各个等份中进行扩增反应，其中，如果所述目标核酸存在于所述等份中的话，那么所述目标核酸的扩增片段通过扩展所述目标核酸上的一对正向和反向引物而形成；其中，所述引物在四种标准核苷酸类型中的一种或多种中未被充分代表，所述引物中的未被充分代表的核苷酸类型相同；
以及，如果每个等份中存在扩增的片段的话，检测扩增的片段。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述目标核酸的拷贝数由包含或缺乏扩增的片段的等份数来确定，优选地根据泊松分布确定。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述样品包括多个目标核酸，所述扩增采用与各个靶点对应的多个正向和反向引物对来进行，所述多个正向和反向引物对中的每一个在相同的标准核苷酸类型中未被充分代表，任选地，其中，所述多个正向和反向引物对为至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个或至少10个。
4.如权利要求3所述的方法，其中，引物对中的每一个在同一个且只有一个标准核苷酸类型中未被充分代表。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述目标核酸来自不同的染色体或相同的染色体。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述目标核酸是DNA，RNA，cDNA，无细胞DNA，无细胞胎儿DNA或循环肿瘤DNA。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述样品是组织或体液。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，各个等份中的扩增反应是聚合酶链反应。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，各个等份中的扩增反应是等温扩增反应。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，各个等份中的扩增反应是等温反应和聚合酶链反应的组合。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在将包含目标核酸的样品分配至各个等份之前或之后，对目标核酸进行预扩增。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在将包含目标核酸的样品分配至各个等份之前或之后，采用化学试剂、蛋白质或酶处理所述目标核酸。
13.如权利要求12所述的方法，其中，采用亚硫酸氢盐处理所述目标核酸以确定所述目标核酸的甲基化状态。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述检测表明预先界定的基因异常是否存在于所述目标核酸中。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述预先界定的基因异常是染色体非整倍性，单核苷酸多态性(SNP)，***或删除。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述染色体非整倍性是21三体型，18三体型，13三体型，三倍体X或单体型X。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述染色体非整倍性基于两个染色体上目标核酸的拷贝数的比例来确定，两个染色体中的一个具有非整倍性但另一个没有。
18.如权利要求16所述的方法，其在包括来自染色体21的目标核酸，来自染色体18的目标核酸和来自染色体13的目标核酸在内的多个目标核酸上进行，其中，所述检测表明目标核酸中的一个包括非整倍性。
19.如权利要求16至18中任一项所述的方法，其在来自种群的样品上进行，其中，所述方法识别包含染色体非整倍性的样品，缺乏非整倍性的染色体和无结果的样品，并且所述方法还包括对来自无结果的样品的DNA进行测序以确定待通过数字扩增分析确定结果的样品是否具有染色体非整倍性。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述测试是通过第二代测序技术进行。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述样品是无细胞核酸样品。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述无细胞核酸样品来自孕妇并且所述目标核酸是胎儿核酸。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述胎儿核酸是Y染色体的片段或Y染色体编码的片段。
24.如权利要求22所述的方法，其中，所述胎儿核酸相对于对应的母体核酸是差异性甲基化的。
25.如权利要求21所述的方法，其采用多种目标核酸进行，所述多种目标核酸包括胎儿目标核酸和对应的母体目标核酸。
26.如权利要求21所述的方法，其采用多种目标核酸进行，所述多种目标核酸包括由溶解的血细胞释放的基因组靶点和无细胞目标核酸。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述目标核酸包括单核苷酸多态性(SNP)位点，***位点或删除位点。
28.如权利要求27所述的方法，其中，数字PCR是液滴数字PCR(ddPCR)。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，扩增的片段通过***染料来检测。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述DNA***染料是
Figure FDA0002437945320000041
31.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中，所述扩增的片段采用荧光团标记的寡核苷酸探针来检测。
32.如权利要求31所述的方法，其中，所述荧光团标记的寡核苷酸探针是TaqmanTM探针，分子信标探针或阴阳探针。
33.如权利要求32所述的方法，其中，所述荧光团是FAM或HEX。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在单个液滴反应中检测多个目标核酸。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述多个目标核酸基于扩增子信号强度检测。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述多个目标核酸的扩增子信号强度由于扩增子的尺寸和/或引物浓度的不同是可区分的。
37.如权利要求34所述的方法，其中，所述多个目标核酸使用DNA***染料和荧光团标记的寡核苷酸探针检测。
38.如权利要求3所述的方法，其中，两个目标核酸是相同的相邻核酸的成分。
39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述正向引物和/或反向引物在其5’端连接至在核苷酸中未被充分代表的人工序列。
40.如权利要求3所述的方法，其中，所述多个目标核酸采用在连接至引物对的核苷酸中未被充分代表的相同或不同的人工序列扩增。
41.如权利要求1所述的方法，其中，扩增的片段通过熔融曲线分析检测。
42.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在进行数字扩增之前对目标核酸进行碎片化。
43.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述正向和反向引物在四种标准核苷酸类型的唯一一个中未被充分代表。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述正向和反向引物包含未被充分代表的标准核苷酸类型中的不超过两种核苷酸。
45.如权利要求43所述的方法，其中，所述正向和反向引物的引物结合位点通过搜索所述正向和反向引物中未被充分代表的标准核苷酸类型的补体中未被充分代表的引物结合位点的目标核酸来识别。
46.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，扩增的片段在通过扩增正向和/或反向引物形成的扩增产物中占主导地位。
47.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述引物具有一个且仅一个未被充分代表的标准核苷酸类型并且未被充分代表的标准核苷酸类型的补体存在于引物中的至少一个的3’末端位置。
48.如权利要求47所述的方法，其中，未被充分代表的标准核苷酸类型的补体存在于引物的每一个的3’末端位置。
49.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述引物具有一个且仅一个未被充分代表的标准核苷酸类型，并且未被充分代表的核苷酸类型存在于引物中的一个的5’末端位置。
50.如权利要求49所述的方法，其中，未被充分代表的核苷酸类型存在于所有引物的5’末端位置。
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