JP2003135100A - ヒトヘルペスウイルス６型（ｈｈｖ−６）ｄｎａの検出及びサブタイプ識別方法 - Google Patents
ヒトヘルペスウイルス６型（ｈｈｖ−６）ｄｎａの検出及びサブタイプ識別方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨ
Ｖ−６）タイプＢのＤＮＡ上に存在する新規の１０８ b
p 及び２２８ bp ヌクレオチド配列に関する。本発明は
また、これらヌクレオチド配列近傍のＨＨＶ−６タイプ
Ａ及びタイプＢＤＮＡの共通配列をプライマーとして用
いるＰＣＲ及び増幅産物のサイズ分析によるＨＨＶ−６
サブタイプ識別方法に関する。 【効果】 ＨＨＶ−６サブタイプの識別を簡便且つ迅速
に行うことができる。
Ｖ−６）タイプＢのＤＮＡ上に存在する新規の１０８ b
p 及び２２８ bp ヌクレオチド配列に関する。本発明は
また、これらヌクレオチド配列近傍のＨＨＶ−６タイプ
Ａ及びタイプＢＤＮＡの共通配列をプライマーとして用
いるＰＣＲ及び増幅産物のサイズ分析によるＨＨＶ−６
サブタイプ識別方法に関する。 【効果】 ＨＨＶ−６サブタイプの識別を簡便且つ迅速
に行うことができる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトヘルペスウイ
ルス６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡの検出、並びにＨＨＶ−
６のサブタイプの識別を行う方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ヒトヘルペスウイルス６型（以下、ＨＨ
Ｖ−６と称する）は、１９８６年にSaluhuddin等によっ
て後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者、及びリンパ
球系疾患患者のリンパ球より第６番目のヘルペスウイル
スとして分離され（1986, Science, 234, 596-601 ）、
１９８８年、山西等によって突発性発疹の原因ウイルス
であることが明らかにされた（1988, Lancet, 1065-106
7 ）。 【０００３】ＨＨＶ−６は当初ヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）陽性リンパ腫及びリンパ腺炎、又ＨＩＶ陰性
のリンパ腫より分離されており、又Ｂリンパ腫にＨＨＶ
−６ＤＮＡが見いだされるなど、何らかの血液系疾患に
関与している可能性が示唆されている。又、腎移植後、
ＨＨＶ−６抗体価が著名に上昇し、拒絶反応の起こった
患者リンパ球よりＨＨＶ−６が分離される等、臓器移植
後の拒絶反応との関係も示唆されている（1990, Transp
lantation, 49, 519〜522 ）。 【０００４】大多数の人においては、ＨＨＶ−６の感染
は、生後１年以内に成立することが抗体保有率に関する
調査より明らかとなっているが（1989 J. Clin. Microb
iol.27, 651-653 ）、ウイルスの感染経路はいまだ明ら
かではない。唾液からＨＨＶ−６が分離された、という
報告も見受けられる。 【０００５】最近、ＨＨＶ−６はＤＮＡの多型性から２
つのサブタイプに分けられており（1991 J. Clin. Micr
obiol 29, 367-372 ）、タイプ間での病原性の違い、細
胞親和性の違い、及び増殖性の違いといった生物学的性
状にどの様な差異があるか注目されている。これまで
に、ＡＩＤＳ患者や、リンパ球系疾患患者からはタイプ
ＡのＨＨＶ−６が主に分離されているが、Pruksannonda
等はＨＨＶ−６の初感染によって発熱したと思われる患
児から分離されたＨＨＶ−６は全てタイプＢであったと
報告している（1992, The New England Journal of Med
icine, 326, 1445-1550 ）。 【０００６】このように、ＨＨＶ−６のタイピング、即
ち型の決定は種々の疾患との関連で興味深いものと考え
られる。ところが、従来ＨＨＶ−６のタイピングに利用
されていた方法は、分離したウイルスからＤＮＡを抽出
精製し、制限酵素によってウイルスＤＮＡを消化後、電
気泳動にかけ、その電気泳動パターンによって多型性を
調べるか、タイプＡ及びタイプＢそれぞれに特異的なモ
ノクローナル抗体を利用してウイルス感染細胞を蛍光抗
体法で染色することによって同定されてきた。しかしこ
れらの方法は、何れもウイルスの分離、培養等の操作を
伴うものであり、非常に時間と労力を必要とするばかり
か、ウイルスの分離ができなければ同定することは不可
能であった。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】上述した様に、ＨＨＶ
−６のタイピングは、種々の疾患との関連で興味深いも
のと考えられるが、従来の技術は何れも細胞培養による
ウイルス分離を伴うものであり、非常に煩雑であった。 【０００８】本発明は、上記問題を解決する為のＨＨＶ
−６タイプ特異的ＤＮＡを提供すること、及びＨＨＶ−
６タイピングの簡便な方法を提供することを目的とする
ものである。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
解決するために、ＨＨＶ−６タイプＢに属するＨＳＴ株
（K. Takahashiら、 J. Virol., 3161〜3163, 1989）の
前初期遺伝子の一つについてその塩基配列を決定し、既
報のＨＨＶ−６タイプＡに属するＵ１１０２株の同領域
の塩基配列（1991, J. Virol 65, 5381-5390）と比較し
た。その結果、ＨＳＴ株とＵ１１０２株の塩基配列の間
に特徴的な差異を見いだし、本発明を完成するに至っ
た。即ち、本発明者等がその塩基配列解析を行ったＨＳ
Ｔ株と、既報のＵ１１０２株の前初期遺伝子内におい
て、ＨＳＴ株にはＵ１１０２株には見られない新規の２
ヵ所のポリヌクレオチドの挿入が認められた（図１参
照）。１ヵ所は１０８ bp であり、もう１カ所は２２８
bp であった。それぞれの塩基配列を配列番号１及び２
としてそれぞれ後記配列表中に示した。 【００１０】新規の１０８ bp 及び２２８ bp ポリヌク
レオチド配列は、図２に示すＨＨＶ−６のタイピングの
結果からも明らかなように、タイプＢに属するＨＨＶ−
６株に特徴的な配列であると考えられる。 【００１１】従って、本発明は、配列番号１に示される
ヒトヘルペスウイルス６型由来のヌクレオチド配列若し
くは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
又はその部分配列を提供する。本発明はまた、配列番号
２に示されるヒトヘルペスウイルス６型由来のヌクレオ
チド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレ
オチド配列、又はその部分配列を提供する。 【００１２】本明細書中、「ＨＨＶ−６（サブ）タイプ
Ｂ」なる用語は、配列番号１及び２にそれぞれ示される
ポリヌクレオチド配列をウイルスＤＮＡ中に含むタイプ
のＨＨＶ−６に言及して使用する。また、「ＨＨＶ−６
（サブ）タイプＡ」なる用語は、そのようなポリヌクレ
オチド配列を共に含まないタイプのＨＨＶ−６に言及し
て使用する。 【００１３】それ故、ＨＨＶ−６のタイプＡとタイプＢ
の上記差異を利用することによって、例えば、タイプＢ
に特徴的なＤＮＡ配列をプローブとして用いるＤＮＡハ
イブリダイゼーションによって、ＨＨＶ−６のサブタイ
プ（Ａ及びＢ）を識別することができる。 【００１４】このように、本発明は、配列番号１に示さ
れるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌク
レオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分
配列をプローブとして使用するＤＮＡハイブリダイゼー
ションによってヒトヘルペスウイルス６型のサブタイプ
Ａ及びＢを識別する方法を提供する。 【００１５】本発明はまた、配列番号２に示されるＨＨ
Ｖ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド
配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列をプ
ローブとして使用するＤＮＡハイブリダイゼーションに
よってヒトヘルペスウイルス６型のサブタイプＡ及びＢ
を識別する方法を提供する。 【００１６】本発明はさらに、配列番号１及び２に示さ
れるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌク
レオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分
配列の両方をプローブとして使用するＤＮＡハイブリダ
イゼーションによってヒトヘルペスウイルス６型のサブ
タイプＡ及びＢを識別する方法を提供する。 【００１７】ＤＮＡハイブリダイゼーションについて
は、Molecular Cloning, 1989 等に記載の技術が適用さ
れる。このとき、標識ＤＮＡの標識物質としては、酵素
（例えばアルカリホスファターゼ）、ラジオアイソトー
プ（例えば32Ｐ）等が使用される。 【００１８】血液等のヒト検体中のＨＨＶ−６含有量が
少ない場合、例えば感染初期の場合には、前記１０８ b
p 及び２２８ bp 挿入領域をはさみ、タイプＡ及びＢに
共通な配列を持つプライマーセットを用いてポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってＤＮＡ増幅するならば、
ＰＣＲ産物の長さの違いから両タイプを識別することが
可能となる。 【００１９】上記目的で使用し得るプライマーセットの
好適例を下記に列挙する。これらのプライマーセット
は、ＨＨＶ−６タイプＢのＤＮＡ上に存在する新規の１
０８bp及び２２８bpヌクレオチド配列近傍のＨＨＶ−６
タイプＡ及びタイプＢ ＤＮＡの共通配列の中から特定
的に選択したものである。実際にプライマーとして利用
される配列はプライマーセットの配列に示されたヌクレ
オチド配列の部分配列又は全配列である。また、下記に
列挙するヌクレオチド配列以外にも、決定された配列に
基づいて種々の可能な配列を選択し本発明の識別方法に
適用することも可能であろう。 【００２０】プライマーセット−１プライマーＩ：５’
−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴ
ＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’５’−Ａ
ＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−３’５’−
ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣ
ＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’５’−ＴＧＡＡＴＴ
ＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡ
ＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−３’５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴ
ＴＡＡＣＴ−３’５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴ
ＧＡＴ−３’５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴ
ＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧ
ＡＴＧＡＣ−３’プライマーII：５’−ＧＧＡＴＴＴＣ
ＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡ−３’５’−Ｔ
ＧＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴ−３’５’−ＴＣＴＧＧＡＧＡ
ＡＧＧＡＧＴ−３’５’−ＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴ
ＧＧＣＡＣ−３’５’−ＣＴＧＴＣＴＧＣＴ−３’５’
−ＴＡＣＡＣＡＧＴＴＡＧＧＧ−３’５’−ＡＧＧＧＣ
ＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴ
ＡＣ−３’５’−ＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧ
ＡＧＡＡＧＧＡＧ−３’プライマーセット−２プライマ
ーＩ：５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧ
ＡＡＡＴＣＣ−３’５’−ＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡ−
３’５’−ＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡ−３’５’−
ＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡ−３’５’−Ａ
ＧＣＡＧＡＣＡＧ−３’５’−ＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＧ
ＴＡ−３’５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡ
ＧＡＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴ−３’５’−ＣＴＣＣ
ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡ−３’プ
ライマーII：５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡ
ＡＡＧ−３’５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴ
ＡＡＣＣＡＡＡ−３’５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴ
ＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’５’−
ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’５’−ＴＡＴＴＣＡ
ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴＴＣＴ−３’５’−
ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ−３’
５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’プ
ライマーセット−３プライマーＩ：５’−ＴＧＡＴＧＧ
ＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＣＣ
ＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴ
ＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−３’５’−ＡＴＧＴＧＡＡ
ＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣ
ＡＡＡＡＡＴ−３’５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧ
ＣＡＡ−３’５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴ
ＴＴ−３’５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−
３’５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−３’
５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣ
ＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣ−
３’プライマーII：５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡ
ＴＴＡＡＡＧ−３’５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴ
ＣＡＴＡＡＣＣＡＡＡ−３’５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴ
ＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’
５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’５’−ＴＡＴ
ＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴＴＣＴ−３’
５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ
−３’５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−
３’。 【００２１】たとえば、上記プライマーセット−１を用
いた場合、そのＰＣＲ増幅産物の長さは、ＨＨＶ−６タ
イプＢ株ではタイプＡ株より１０８ bp 長くなる。ま
た、プライマーセット−２を用いた場合、タイプＢ株で
はタイプＡ株より２２８ bp 長くなる。またプライマー
セット−３を用いた場合、タイプＢ株ではタイプＡ株よ
り３３６ bp 長くなる。何れのプライマーセットを用い
た場合でもＨＨＶ−６タイプＢ株とタイプＡ株でのＰＣ
Ｒ産物の長さには大きな違いが生じるため、通常のアガ
ロースゲル電気泳動等のサイズ分析によって容易に両株
を識別することが可能である。 【００２２】従って、本発明は、上記プライマーセット
−１の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及び
IIの組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス
６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行
って該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物を
サイズ分析に掛けて、配列番号１に示されるＨＨＶ−６
由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に
相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有する
ＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６ＤＮ
Ａとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢを識
別する方法を提供する。 【００２３】本発明はまた、上記プライマーセット−２
の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及びIIの
組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型
（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行って
該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサイ
ズ分析に掛けて、配列番号２に示されるＨＨＶ−６由来
のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補
的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有するＨＨ
Ｖ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６ＤＮＡと
に分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢを識別す
る方法を提供する。 【００２４】本発明はさらに、上記プライマーセット−
３の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及びII
の組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６
型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行っ
て該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサ
イズ分析に掛けて、配列番号１及び２に示されるＨＨＶ
−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配
列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有
するＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６
ＤＮＡとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢ
を識別する方法を提供する。 【００２５】ここで、ポリメラーゼ連鎖反応について
は、公知の技術が適用され、また、サイズ分析において
は、アガロースゲル電気泳動等の技術が使用され、これ
らの方法は特定のものに限定されない。 【００２６】既にＨＨＶ−６のタイプが明らかにされて
いる１３株を用いて、上記プライマーセット−２を用い
てＰＣＲを行ったところ、各タイプに特徴的な長さのバ
ンドがそれぞれ確認され、本発明によってＨＨＶ−６の
タイピングが可能であることが明らかとなった（図２参
照）。 【００２７】ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ量が十分
な場合、アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマ
イドで染色し、ＤＮＡを確認できるが、臨床検体等でＨ
ＨＶ−６ ＤＮＡ量が少ない検体においては、ＰＣＲ後
でもエチジウムブロマイド染色では特異的なバンドを確
認できない場合がある。その様な場合、サザンブロッテ
ィングの後、上記プライマーセット中のポリヌクレオチ
ドをプローブとして、ハイブリダイゼーション法によっ
てＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在を同定することができる。
これらプライマーセット中のポリヌクレオチド配列は、
タイプＡ及びＢの双方に共通な配列であるため、どちら
のタイプのＨＨＶ−６ ＤＮＡでも検出することができ
る。一方、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列
若しくはその相補的配列の一部又は全部をプローブとし
て用いた場合、このポリヌクレオチド配列はタイプＡの
ＨＨＶ−６ ＤＮＡには存在しない配列であるため、タ
イプＢのＨＨＶ−６ ＤＮＡとのみハイブリダイズす
る。ここで、プライマーセット−１または−３を用いて
ＰＣＲを行った場合、タイプＢ特異的なプローブは配列
番号１に示されるポリヌクレオチド配列若しくはその相
補的配列の一部又は全部が利用される。又、プライマー
セット−２又は−３を用いた場合、タイプＢ特異的なプ
ローブは配列番号２に示されるポリヌクレオチド配列若
しくはその相補的配列の一部又は全部が利用される。 【００２８】従って、プライマーセット−１，−２又は
−３を用いてＰＣＲを行った後、これらプライマーセッ
ト中のポリヌクレオチド配列の何れか一種の一部又は全
部をプローブとしてＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在を確認し
た後、配列番号１又は２に示したポリヌクレオチド配列
若しくはその相補的配列の何れか一種の一部又は全部を
プローブとしてＨＨＶ−６タイプＢを同定することによ
り、ＨＨＶ−６のタイピングを行うことができる。もち
ろん、多量のＨＨＶ−６ ＤＮＡが利用できる場合に
は、ＰＣＲの過程を省略して直接上記ポリヌクレオチド
配列をプローブとして組み合わせることにより、ＨＨＶ
−６のタイピングが可能である。 【００２９】あるいは、ＨＨＶ−６タイプＡとＢのＤＮ
Ａ塩基配列の違いを利用して、タイプＡ特異的プローブ
及びタイプＢ特異的プローブを設定し、これらのプロー
ブの認識部位を含むＨＨＶ−６ＤＮＡのＰＣＲ産物に対
してハイブリダイゼーションを行えば、タイプの判別が
可能である。このための有効なプローブの例として、次
のものが挙げられる。タイプＡ特異的プローブ：(1)
５’−ＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧ
−３’、タイプＢ特異的プローブ：(2) ５’−ＴＡＡ
ＡＴＣＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡ−３’。 【００３０】従って、本発明は、上記ヌクレオチド配列
(1) 及び(2) 若しくはこれらの配列に相補的なヌクレオ
チド配列、又はその部分配列からなる、それぞれタイプ
Ａ及びタイプＢに特異的な各ヌクレオチド配列を独立に
少なくとも１つずつプローブとして用いて、検体中のヒ
トヘルペスウイルス６型ＤＮＡとハイブリダイゼーショ
ンすることによって、ヒトヘルペスウイルス６型のサブ
タイプＡ及びＢを識別する方法をも提供する。 【００３１】本発明によれば、下記のヌクレオチド配
列：(1) ５’−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡ
ＧＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ
−３’(2) ５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡ
ＴＣＴＴ−３’(3) ５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡ
ＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡ
Ｔ−３’(4) ５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡ
Ａ−３’(5) ５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧ
ＴＴＴ−３’(6) ５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡ
ＣＴ−３’(7) ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴ
ＧＡＴ−３’(8) ５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡ
ＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧ
ＡＴＧＡＴＧＡＣ−３’(9) ５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧ
ＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣ−３’(10) ５’
−ＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡ−３’(11) ５’−ＡＣＴ
ＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡ−３’(12) ５’−ＧＴＧＣＣ
ＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡ−３’(13) ５’−ＡＧＣ
ＡＧＡＣＡＧ−３’(14) ５’−ＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴ
ＧＴＡ−３’(15) ５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴ
ＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴ−３’(16)
５’−ＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧ
ＧＡＡ−３’(17) ５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡ
ＴＴＡＡＡＧ−３’(18) ５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧ
ＴＴＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡＡ−３’(19) ５’−ＴＴＴ
ＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣ
ＡＴＡ−３’(20) ５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ
−３’(21) ５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴ
ＡＴＴＡＧＴＴＣＴ−３’(22) ５’−ＴＴＧＣＴＡＡ
ＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ−３’(23) ５’−Ｇ
ＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’若しくは該
ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、並びに
配列番号１及び２に示されるヌクレオチド配列若しくは
その相補的配列又はその部分配列からなる群から選択さ
れる少なくとも１つのヌクレオチド配列をプローブとし
て用いるＤＮＡハイブリダイゼーションによって、ＨＨ
Ｖ−６ ＤＮＡを検出することも可能であり、従って、
本発明はＨＨＶ−６ ＤＮＡの検出方法も提供する。 【００３２】 【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこ
れらの実施例に限定されない。 【００３３】実施例１ａ）ＤＮＡの抽出ヒト末梢血単核
球培養細胞にＨＨＶ−６を感染させ、培養後、感染細胞
を遠心により収集する。感染細胞沈渣に細胞溶解用緩衝
液（10mM Tris-HCl (pH8.0), 150mM NaCl, 0.4% SDS, 1
0mM EDTA, 1mg/ml Proteinase K ）を０．４ml加え、６
５℃で一夜（又は５６℃で３時間）インキュベートす
る。インキュベーション後、フェノール／クロロホルム
（１：１）混合液を２００μｌ加え、激しく振盪し、遠
心処理によって液を２層に分離し、上部の水層を回収す
る。同操作を更に２回繰り返し行った後、３００μｌの
クロロホルムを加え激しく振盪し、更に遠心処理を行っ
た後上部の水層を回収する。同操作を更にもう一度繰り
返す。最終的に回収した水層に１０μｇの酵母ｔＲＮＡ
と３倍量のエタノールを加え、−７０℃、１時間以上静
置する。遠心処理によってＤＮＡを沈殿させた後、沈渣
を８０％エタノールで洗浄、風乾し、０．５×ＴＥ（5m
M Tris-HCl (pH8.0), 0.5mM EDTA）に溶解し、ＰＣＲ用
サンプルとした。 【００３４】ｂ）ＰＣＲによるＨＨＶ−６ ＤＮＡ上記
サンプルを用いてＰＣＲを行った（ＰＣＲに関しては、
例えば、R. K. Saiki ら、Science, 230, 1350(1985)参
照）。ＨＨＶ−６としてはＨＳＴ株とＵ１１０２株を用
いて行った。また、プライマーとしては以下のオリゴヌ
クレオチドを使用した。 【００３５】プライマーＡ：５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡ
ＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣ−３’プライマー
Ｂ：５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴ
ＣＴＧＧＧＣ−３’プライマーＣ：５’−ＣＡＴＣＡＴ
ＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣ−３’プライ
マーＤ：５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴ
ＴＡＧＴＴＣＴ−３’ＰＣＲを行うに当っては、上記プ
ライマーの組み合わせとしてＡとＣ、ＡとＤ、ＢとＣ及
びＢとＤの組み合わせでそれぞれ行った。 【００３６】ＰＣＲの反応条件は、サンプル１〜１０μ
ｌを用い、終濃度が10mM Tris-HCl(pH8.3), 1.5mM MgC
l2 , 0.01％ゼラチン，dNTP 200μＭ，各プライマー５
０ｐＭ，Ｔａｑポリメラーゼ 2.5単位となるように各組
成を加え、最終５０μｌとして９０℃ １分、６０℃
２分、７２℃ ３分のサイクルを２５サイクル繰り返し
ＰＣＲを行った（図３）。増幅産物をアガロースゲル電
気泳動に掛けてサイズにより分析した。 【００３７】図３に示すように、４組のプライマー何れ
の組み合わせにおいてもＵ１１０２株のＰＣＲ産物はＨ
ＳＴ株のＰＣＲ産物に比較してその長さが明らかに短
く、両株を容易に判別することができた。 【００３８】実施例２ａ）ＤＮＡの抽出ＨＨＶ−６とし
てタイプＡであることが知られているＵ１１０２株及び
ＧＳ株（1986, Science, 234, 596-601 ）、タイプＢで
あることが知られているＨＳＴ株（K. Takahashiら、
J. Virol., 3161〜3163, 1989）、Ｚ２９株（1988, J.
Infect. Dis, 157, 1271-1273）及びＥｎｄｅｒｓ株と
タイプＡに特異的なモノクローナル抗体とタイプＢに特
異的なモノクローナル抗体の両方に反応することからタ
イプＡとタイプＢの中間型と考えられているＤＡ株を用
いてＰＣＲによって各タイプを識別できるかどうか検討
を行った。又その他、臨床検体として国内の突発性発疹
急性期患者の末梢血から分離されたＯＫＣ株、ＮＫＴ
株、１０３株、１０１株、Ｉｎｏｕｅ株及びＫｉｔａｈ
ａｒａ株とＨＨＶ−６と一部相同性があるといわれてい
るＨＨＶ−７（1990, Proc. Natl. Acad. Sci, 87, 748
-752）についても検討した。ＤＮＡの抽出は、実施例１
に述べた方法に準拠して行った。 【００３９】ｂ）ＰＣＲによるＨＨＶ−６のタイピング
上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプルとして
ＰＣＲを行った。ＰＣＲは実施例１で示した方法に従っ
て行い、またプライマーとしては実施例１で示したプラ
イマーのＡとＣの組合わせを用いて行った。結果を図２
に示した。 【００４０】プライマーＡとＣの組み合わせでは、タイ
プＢのＨＳＴ株は５５４ bp のＰＣＲ産物を生じ、タイ
プＡのＵ１１０２株では３２６ bp のＰＣＲ産物を生じ
る。図２から明らかなようにタイプＢに属するＺ２９
株、及びＥｎｄｅｒｓ株は何れも同じタイプＢのＨＳＴ
株と同じ泳動位置にバンドが検出され、一方タイプＡに
属するＧＳ株は同じタイプＡのＵ１１０２株と同じ泳動
位置にバンドが検出され、本発明の方法を用いることに
よってＨＨＶ−６のタイピングが可能であることが検証
された。又両タイプの中間型と考えられていたＤＡ株で
は３２６ bp のバンド以外に５５４ bp 付近に弱いバン
ドが検出され、このことから、ＤＡ株は中間型ではなく
両タイプのウイルスが混在している可能性が考えられ
た。 【００４１】また、国内の突発性発疹患者からの分離株
は全てＨＳＴ株と同じタイプＢであった。ＨＨＶ−７は
本法では検出されなかった。 【００４２】実施例３ａ）ＤＮＡの抽出ＨＨＶ−６とし
てタイプＡであることが知られているＵ１１０２株とタ
イプＢであることが知られているＨＳＴ株を用い、それ
ぞれ実施例１で述べた方法に準拠してＤＮＡの抽出を行
った。 【００４３】ｂ）プローブの調製配列番号１に示される
配列を利用したプローブは、その配列内に、５’−ＧＴ
ＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡＧ−
３’及び５’−ＧＴＴＴＧＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴ
ＴＧＴＴＧＧＧ−３’の一組のプライマーを設定し、実
施例１で示したＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅し、その増
幅産物をランダムプライマーＤＮＡラベリングキット
（宝酒造）を用いて32Ｐ標識することによって調製し
た。 【００４４】配列番号２に示される配列を利用したプロ
ーブは、その配列内に、５’−ＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡ
ＴＴＴＴＧＣＴＴＡＣＡＧＣＣ−３’及び５’−ＧＡＴ
ＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣ−３’
の一組のプライマーを設定し、実施例１で示したＰＣＲ
法によりＤＮＡを増幅し、その増幅産物をランダムプラ
イマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造）を用いて32Ｐ
標識することによって調製した。 【００４５】ｃ）ＰＣＲ及びサザンブロットハイブリダ
イゼーション上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサ
ンプルとしてＰＣＲを行った。プライマーとしては配列
番号１に示される配列を含む領域の増幅には５’−ＧＡ
ＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣ−
３’及び５’−ＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡ
ＧＡＡＧＧＡＧ−３’の組み合わせを用いた。又配列番
号２に示される配列を含む領域の増幅には、実施例１で
示したプライマーのＡとＣの組み合わせを用いて行っ
た。ＰＣＲは実施例１で示した方法に従って行った。 【００４６】ＰＣＲによって増幅した産物は、１％アガ
ロースゲル内で電気泳動した後、ＤＮＡをナイロン膜
（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋；Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に転写し
た。転写した膜を２％ＳＤＳ、３％スキムミルクを含む
６×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，６ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，０．０６Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４））中６５℃、６時間行った後、同液中に32Ｐ標識し
たプローブを加えた液と交換し、更に６５℃、１６時間
ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーシ
ョン終了後、膜を２×ＳＳＰＥで室温２０分洗浄し、更
に２×ＳＳＰＥで６５℃、２０分洗浄を２回、０．２×
ＳＳＰＥで６５℃、２０分洗浄を２回行った。洗浄後の
膜をＸ線フィルムとコンタクトし、フィルムを感光させ
ることによってプローブのハイブリダイゼーションの有
無を確認した。 【００４７】図４には、配列番号１に示される配列を含
む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチ
ジウムブロマイド染色図（Ａ）及び該配列をもとに作製
したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果
（Ｂ）を示した。 【００４８】図５には、配列番号２に示される配列を含
む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチ
ジウムブロマイド染色図（Ａ）及び該配列をもとに作製
したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果
（Ｂ）を示した。 【００４９】何れの場合においても、配列番号１及び２
に示される各配列をもとに作製したプローブは共に、タ
イプＢに属するＨＳＴ株のＤＮＡとのみハイブリダイズ
し、タイプＡであるＵ１１０２株のＤＮＡとはハイブリ
ダイズしなかった。従って、これら配列番号１及び２に
示されるＤＮＡ配列をプローブとして利用することによ
り、ＨＨＶ−６のタイピングが可能である。 【００５０】実施例４ａ）ＤＮＡの抽出ＨＨＶ−６とし
てタイプＡであることが知られているＵ１１０２株およ
びタイプＢであることが知られているＨＳＴ株、またタ
イプ不明の臨床分離株１及び２の感染ヒト末梢血単核球
培養細胞よりＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出は実施例
１に述べた方法に準拠して行った。 【００５１】ｂ）ＰＣＲによるＤＮＡの増幅及びドット
ブロット上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプ
ルとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは実施例１で示した方
法に従って行い、またプライマーとしては実施例１で示
したプライマーのＡとＣの組み合わせを用いて行った。
これらのＰＣＲ産物をナイロンメンブレンフィルター
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋）に０．５μ
ｌずつ載せ、０．４Ｎ ＮａＣｌで２０分間処理した
後、６×ＳＳＰＥで中和した。 【００５２】ｃ）アルカリフォスファターゼ標識ＤＮＡ
プローブの調製ＨＨＶ−６タイプ特異的酵素標識プロー
ブとしては、５’−ＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣ
ＣＴＣＣＡＧ−３’を有するオリゴヌクレオチドをタイ
プＡに特異的なプローブ、５’−ＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴ
ＡＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡ−３’を有するオリゴヌクレ
オチドをタイプＢに特異的なプローブとして用いるた
め、これらをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製のＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（３８１Ａ）を用
いて合成し、アミノリンクIIを用いてその５’末端にア
ミノ基を付加した。アミノ基を付加したＤＮＡをＥＭＣ
Ｓ［Ｎ−（ε−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘ
ｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ］を用いてマレイミド化
し、一方アルカリフォスファターゼは２−Ｉｍｉｎｏｔ
ｈｉｏｌａｎｅを用いてＳＨ基を付加した。両者を混合
反応させることによりアルカリフォスファターゼ標識Ｄ
ＮＡプローブを作製した。 【００５３】ｄ）ハイブリダイゼーションｂ）で作製し
たメンブレンフィルターを２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤ
Ｓで室温で５分間洗浄、更に２×ＳＳＰＥ、０．１％Ｓ
ＤＳを用いて４０℃、５分間の洗浄を３回行った。ハイ
ブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ’ｓ、０．５％ＳＤＳ、１％Ｃａｓｅｉｎ）を
用いて５０℃、３０分間ブロッキングを行い、次にｃ）
で調製した酵素標識プローブ２種のうち１種を加え（ア
ルカリフォスファターゼの最終濃度０．１μｇ／ｍ
ｌ）、５０℃で１時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。ハイブリダイゼーション終了後１×ＳＳＣ、１％Ｓ
ＤＳを用いて４０℃で５分間の洗浄を２回、１×ＳＳ
Ｃ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて４０℃で
５分間の洗浄を２回、１×ＳＳＣを用いて室温で５分間
の洗浄を２回行った。アルカリフォスファターゼ基質反
応液（0.3M Tris−HCl 、0.1M NaCl、50mM MgCl2
（pH 9.8））を加え、室温で５分間インキュベートした
後、ＮＴＢ溶液［７０％ Ｎ’Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆ
ｏｒｍａｍｉｄｅにＮＴＢ（Ｎｉｔｒｏ Ｔｅｔｒａｚ
ｏｌｉｕｍ Ｂｌｕｅ）を７５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解
したもの］を３３μｌ／７．５ｍｌ、ＢＣＩＰ溶液［10
0 ％Ｎ’Ｎ−ＤｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅにＢ
ＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎ
ｄｏｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅを５０ｍｇ／ｍｌの濃度
に溶解したもの］を２５μｌ／７．５ｍｌ加え、３７℃
で２時間反応させた。 【００５４】結果を図６に示した。図６のＡではタイプ
Ａに特異的なプローブをＢではタイプＢに特異的なプロ
ーブを用いた。またＰＣＲ産物の１はＵ１１０２株、２
はＨＳＴ株、３は臨床分離株１、４は臨床分離株２を示
している。図に示す通り、タイプＡ特異的プローブはＵ
１１０２株のＰＣＲ産物とハイブリダイズするが、ＨＳ
Ｔ株とはハイブリダイズせず、またタイプＢ特異的プロ
ーブはＨＳＴ株とハイブリダイズするがＵ１１０２株と
はハイブリダイズしなかった。これらのプローブを用い
ることにより、ＰＣＲ産物をサザンブロットすることな
く、ドットブロットを行うことによって簡便かつ迅速に
タイプを識別することが可能である。また、この方法に
より、臨床分離株１はタイプＡ、臨床分離株２はタイプ
Ｂであることが判明した。 【００５５】 【発明の効果】ＨＨＶ−６のタイピングは、種々の疾患
との関連で興味深いものと考えられるが、これまでその
タイピングには数週間以上の時間を必要としていた。本
発明によって臨床検体からＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在の
有無を判定することができるばかりか、そのタイピング
を簡便且つ迅速に行うことが可能となり、臨床医学、基
礎医学等の分野で極めて有効な研究手段が提供されたも
のと考えられる。 【００５６】 【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KOKUSAISIYAKU <120>DETECTION OF HUMAN HERPES VIRUS 6 TYPE (HHV-6) DNA AND DISCRIMINATI ON OF SUB-TYPE <130> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 108 <212> DNA <400> 1 aatgtagaat atttaaaata catggaagta caatctccta ctgataataa tactcccacc 60 ccatcaaaga acaatgaatc cccaacaaga caaaaactta caaacata 108 <210> 2 <211> 228 <212> DNA <400> 2 ggtctgaaca acaagacatt ttgcttacag ccccgatcaa aggtcacaga caaaagaaag 60 gattcaggaa aaaggttcta actccaagtg taccgaaacg cttccttgta tgacctttac 120 cgactcagca actcctgtca aaagtcatga tgcaattcag gatactttaa atccagaaag 180 taaaatagac aaagaattgg gagctgtaga aagtctagtg aatctatg 228
ルス６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡの検出、並びにＨＨＶ−
６のサブタイプの識別を行う方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ヒトヘルペスウイルス６型（以下、ＨＨ
Ｖ−６と称する）は、１９８６年にSaluhuddin等によっ
て後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者、及びリンパ
球系疾患患者のリンパ球より第６番目のヘルペスウイル
スとして分離され（1986, Science, 234, 596-601 ）、
１９８８年、山西等によって突発性発疹の原因ウイルス
であることが明らかにされた（1988, Lancet, 1065-106
7 ）。 【０００３】ＨＨＶ−６は当初ヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）陽性リンパ腫及びリンパ腺炎、又ＨＩＶ陰性
のリンパ腫より分離されており、又Ｂリンパ腫にＨＨＶ
−６ＤＮＡが見いだされるなど、何らかの血液系疾患に
関与している可能性が示唆されている。又、腎移植後、
ＨＨＶ−６抗体価が著名に上昇し、拒絶反応の起こった
患者リンパ球よりＨＨＶ−６が分離される等、臓器移植
後の拒絶反応との関係も示唆されている（1990, Transp
lantation, 49, 519〜522 ）。 【０００４】大多数の人においては、ＨＨＶ−６の感染
は、生後１年以内に成立することが抗体保有率に関する
調査より明らかとなっているが（1989 J. Clin. Microb
iol.27, 651-653 ）、ウイルスの感染経路はいまだ明ら
かではない。唾液からＨＨＶ−６が分離された、という
報告も見受けられる。 【０００５】最近、ＨＨＶ−６はＤＮＡの多型性から２
つのサブタイプに分けられており（1991 J. Clin. Micr
obiol 29, 367-372 ）、タイプ間での病原性の違い、細
胞親和性の違い、及び増殖性の違いといった生物学的性
状にどの様な差異があるか注目されている。これまで
に、ＡＩＤＳ患者や、リンパ球系疾患患者からはタイプ
ＡのＨＨＶ−６が主に分離されているが、Pruksannonda
等はＨＨＶ−６の初感染によって発熱したと思われる患
児から分離されたＨＨＶ−６は全てタイプＢであったと
報告している（1992, The New England Journal of Med
icine, 326, 1445-1550 ）。 【０００６】このように、ＨＨＶ−６のタイピング、即
ち型の決定は種々の疾患との関連で興味深いものと考え
られる。ところが、従来ＨＨＶ−６のタイピングに利用
されていた方法は、分離したウイルスからＤＮＡを抽出
精製し、制限酵素によってウイルスＤＮＡを消化後、電
気泳動にかけ、その電気泳動パターンによって多型性を
調べるか、タイプＡ及びタイプＢそれぞれに特異的なモ
ノクローナル抗体を利用してウイルス感染細胞を蛍光抗
体法で染色することによって同定されてきた。しかしこ
れらの方法は、何れもウイルスの分離、培養等の操作を
伴うものであり、非常に時間と労力を必要とするばかり
か、ウイルスの分離ができなければ同定することは不可
能であった。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】上述した様に、ＨＨＶ
−６のタイピングは、種々の疾患との関連で興味深いも
のと考えられるが、従来の技術は何れも細胞培養による
ウイルス分離を伴うものであり、非常に煩雑であった。 【０００８】本発明は、上記問題を解決する為のＨＨＶ
−６タイプ特異的ＤＮＡを提供すること、及びＨＨＶ−
６タイピングの簡便な方法を提供することを目的とする
ものである。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
解決するために、ＨＨＶ−６タイプＢに属するＨＳＴ株
（K. Takahashiら、 J. Virol., 3161〜3163, 1989）の
前初期遺伝子の一つについてその塩基配列を決定し、既
報のＨＨＶ−６タイプＡに属するＵ１１０２株の同領域
の塩基配列（1991, J. Virol 65, 5381-5390）と比較し
た。その結果、ＨＳＴ株とＵ１１０２株の塩基配列の間
に特徴的な差異を見いだし、本発明を完成するに至っ
た。即ち、本発明者等がその塩基配列解析を行ったＨＳ
Ｔ株と、既報のＵ１１０２株の前初期遺伝子内におい
て、ＨＳＴ株にはＵ１１０２株には見られない新規の２
ヵ所のポリヌクレオチドの挿入が認められた（図１参
照）。１ヵ所は１０８ bp であり、もう１カ所は２２８
bp であった。それぞれの塩基配列を配列番号１及び２
としてそれぞれ後記配列表中に示した。 【００１０】新規の１０８ bp 及び２２８ bp ポリヌク
レオチド配列は、図２に示すＨＨＶ−６のタイピングの
結果からも明らかなように、タイプＢに属するＨＨＶ−
６株に特徴的な配列であると考えられる。 【００１１】従って、本発明は、配列番号１に示される
ヒトヘルペスウイルス６型由来のヌクレオチド配列若し
くは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
又はその部分配列を提供する。本発明はまた、配列番号
２に示されるヒトヘルペスウイルス６型由来のヌクレオ
チド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレ
オチド配列、又はその部分配列を提供する。 【００１２】本明細書中、「ＨＨＶ−６（サブ）タイプ
Ｂ」なる用語は、配列番号１及び２にそれぞれ示される
ポリヌクレオチド配列をウイルスＤＮＡ中に含むタイプ
のＨＨＶ−６に言及して使用する。また、「ＨＨＶ−６
（サブ）タイプＡ」なる用語は、そのようなポリヌクレ
オチド配列を共に含まないタイプのＨＨＶ−６に言及し
て使用する。 【００１３】それ故、ＨＨＶ−６のタイプＡとタイプＢ
の上記差異を利用することによって、例えば、タイプＢ
に特徴的なＤＮＡ配列をプローブとして用いるＤＮＡハ
イブリダイゼーションによって、ＨＨＶ−６のサブタイ
プ（Ａ及びＢ）を識別することができる。 【００１４】このように、本発明は、配列番号１に示さ
れるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌク
レオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分
配列をプローブとして使用するＤＮＡハイブリダイゼー
ションによってヒトヘルペスウイルス６型のサブタイプ
Ａ及びＢを識別する方法を提供する。 【００１５】本発明はまた、配列番号２に示されるＨＨ
Ｖ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド
配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列をプ
ローブとして使用するＤＮＡハイブリダイゼーションに
よってヒトヘルペスウイルス６型のサブタイプＡ及びＢ
を識別する方法を提供する。 【００１６】本発明はさらに、配列番号１及び２に示さ
れるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌク
レオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分
配列の両方をプローブとして使用するＤＮＡハイブリダ
イゼーションによってヒトヘルペスウイルス６型のサブ
タイプＡ及びＢを識別する方法を提供する。 【００１７】ＤＮＡハイブリダイゼーションについて
は、Molecular Cloning, 1989 等に記載の技術が適用さ
れる。このとき、標識ＤＮＡの標識物質としては、酵素
（例えばアルカリホスファターゼ）、ラジオアイソトー
プ（例えば32Ｐ）等が使用される。 【００１８】血液等のヒト検体中のＨＨＶ−６含有量が
少ない場合、例えば感染初期の場合には、前記１０８ b
p 及び２２８ bp 挿入領域をはさみ、タイプＡ及びＢに
共通な配列を持つプライマーセットを用いてポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってＤＮＡ増幅するならば、
ＰＣＲ産物の長さの違いから両タイプを識別することが
可能となる。 【００１９】上記目的で使用し得るプライマーセットの
好適例を下記に列挙する。これらのプライマーセット
は、ＨＨＶ−６タイプＢのＤＮＡ上に存在する新規の１
０８bp及び２２８bpヌクレオチド配列近傍のＨＨＶ−６
タイプＡ及びタイプＢ ＤＮＡの共通配列の中から特定
的に選択したものである。実際にプライマーとして利用
される配列はプライマーセットの配列に示されたヌクレ
オチド配列の部分配列又は全配列である。また、下記に
列挙するヌクレオチド配列以外にも、決定された配列に
基づいて種々の可能な配列を選択し本発明の識別方法に
適用することも可能であろう。 【００２０】プライマーセット−１プライマーＩ：５’
−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴ
ＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’５’−Ａ
ＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−３’５’−
ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣ
ＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’５’−ＴＧＡＡＴＴ
ＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡ
ＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−３’５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴ
ＴＡＡＣＴ−３’５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴ
ＧＡＴ−３’５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴ
ＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧ
ＡＴＧＡＣ−３’プライマーII：５’−ＧＧＡＴＴＴＣ
ＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡ−３’５’−Ｔ
ＧＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴ−３’５’−ＴＣＴＧＧＡＧＡ
ＡＧＧＡＧＴ−３’５’−ＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴ
ＧＧＣＡＣ−３’５’−ＣＴＧＴＣＴＧＣＴ−３’５’
−ＴＡＣＡＣＡＧＴＴＡＧＧＧ−３’５’−ＡＧＧＧＣ
ＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴ
ＡＣ−３’５’−ＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧ
ＡＧＡＡＧＧＡＧ−３’プライマーセット−２プライマ
ーＩ：５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧ
ＡＡＡＴＣＣ−３’５’−ＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡ−
３’５’−ＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡ−３’５’−
ＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡ−３’５’−Ａ
ＧＣＡＧＡＣＡＧ−３’５’−ＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＧ
ＴＡ−３’５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡ
ＧＡＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴ−３’５’−ＣＴＣＣ
ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡ−３’プ
ライマーII：５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡ
ＡＡＧ−３’５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴ
ＡＡＣＣＡＡＡ−３’５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴ
ＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’５’−
ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’５’−ＴＡＴＴＣＡ
ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴＴＣＴ−３’５’−
ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ−３’
５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’プ
ライマーセット−３プライマーＩ：５’−ＴＧＡＴＧＧ
ＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＣＣ
ＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴ
ＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−３’５’−ＡＴＧＴＧＡＡ
ＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣ
ＡＡＡＡＡＴ−３’５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧ
ＣＡＡ−３’５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴ
ＴＴ−３’５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−
３’５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−３’
５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣ
ＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣ−
３’プライマーII：５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡ
ＴＴＡＡＡＧ−３’５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴ
ＣＡＴＡＡＣＣＡＡＡ−３’５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴ
ＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’
５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’５’−ＴＡＴ
ＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴＴＣＴ−３’
５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ
−３’５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−
３’。 【００２１】たとえば、上記プライマーセット−１を用
いた場合、そのＰＣＲ増幅産物の長さは、ＨＨＶ−６タ
イプＢ株ではタイプＡ株より１０８ bp 長くなる。ま
た、プライマーセット−２を用いた場合、タイプＢ株で
はタイプＡ株より２２８ bp 長くなる。またプライマー
セット−３を用いた場合、タイプＢ株ではタイプＡ株よ
り３３６ bp 長くなる。何れのプライマーセットを用い
た場合でもＨＨＶ−６タイプＢ株とタイプＡ株でのＰＣ
Ｒ産物の長さには大きな違いが生じるため、通常のアガ
ロースゲル電気泳動等のサイズ分析によって容易に両株
を識別することが可能である。 【００２２】従って、本発明は、上記プライマーセット
−１の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及び
IIの組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス
６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行
って該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物を
サイズ分析に掛けて、配列番号１に示されるＨＨＶ−６
由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に
相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有する
ＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６ＤＮ
Ａとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢを識
別する方法を提供する。 【００２３】本発明はまた、上記プライマーセット−２
の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及びIIの
組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型
（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行って
該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサイ
ズ分析に掛けて、配列番号２に示されるＨＨＶ−６由来
のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補
的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有するＨＨ
Ｖ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６ＤＮＡと
に分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢを識別す
る方法を提供する。 【００２４】本発明はさらに、上記プライマーセット−
３の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及びII
の組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６
型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行っ
て該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサ
イズ分析に掛けて、配列番号１及び２に示されるＨＨＶ
−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配
列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有
するＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６
ＤＮＡとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢ
を識別する方法を提供する。 【００２５】ここで、ポリメラーゼ連鎖反応について
は、公知の技術が適用され、また、サイズ分析において
は、アガロースゲル電気泳動等の技術が使用され、これ
らの方法は特定のものに限定されない。 【００２６】既にＨＨＶ−６のタイプが明らかにされて
いる１３株を用いて、上記プライマーセット−２を用い
てＰＣＲを行ったところ、各タイプに特徴的な長さのバ
ンドがそれぞれ確認され、本発明によってＨＨＶ−６の
タイピングが可能であることが明らかとなった（図２参
照）。 【００２７】ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ量が十分
な場合、アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマ
イドで染色し、ＤＮＡを確認できるが、臨床検体等でＨ
ＨＶ−６ ＤＮＡ量が少ない検体においては、ＰＣＲ後
でもエチジウムブロマイド染色では特異的なバンドを確
認できない場合がある。その様な場合、サザンブロッテ
ィングの後、上記プライマーセット中のポリヌクレオチ
ドをプローブとして、ハイブリダイゼーション法によっ
てＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在を同定することができる。
これらプライマーセット中のポリヌクレオチド配列は、
タイプＡ及びＢの双方に共通な配列であるため、どちら
のタイプのＨＨＶ−６ ＤＮＡでも検出することができ
る。一方、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列
若しくはその相補的配列の一部又は全部をプローブとし
て用いた場合、このポリヌクレオチド配列はタイプＡの
ＨＨＶ−６ ＤＮＡには存在しない配列であるため、タ
イプＢのＨＨＶ−６ ＤＮＡとのみハイブリダイズす
る。ここで、プライマーセット−１または−３を用いて
ＰＣＲを行った場合、タイプＢ特異的なプローブは配列
番号１に示されるポリヌクレオチド配列若しくはその相
補的配列の一部又は全部が利用される。又、プライマー
セット−２又は−３を用いた場合、タイプＢ特異的なプ
ローブは配列番号２に示されるポリヌクレオチド配列若
しくはその相補的配列の一部又は全部が利用される。 【００２８】従って、プライマーセット−１，−２又は
−３を用いてＰＣＲを行った後、これらプライマーセッ
ト中のポリヌクレオチド配列の何れか一種の一部又は全
部をプローブとしてＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在を確認し
た後、配列番号１又は２に示したポリヌクレオチド配列
若しくはその相補的配列の何れか一種の一部又は全部を
プローブとしてＨＨＶ−６タイプＢを同定することによ
り、ＨＨＶ−６のタイピングを行うことができる。もち
ろん、多量のＨＨＶ−６ ＤＮＡが利用できる場合に
は、ＰＣＲの過程を省略して直接上記ポリヌクレオチド
配列をプローブとして組み合わせることにより、ＨＨＶ
−６のタイピングが可能である。 【００２９】あるいは、ＨＨＶ−６タイプＡとＢのＤＮ
Ａ塩基配列の違いを利用して、タイプＡ特異的プローブ
及びタイプＢ特異的プローブを設定し、これらのプロー
ブの認識部位を含むＨＨＶ−６ＤＮＡのＰＣＲ産物に対
してハイブリダイゼーションを行えば、タイプの判別が
可能である。このための有効なプローブの例として、次
のものが挙げられる。タイプＡ特異的プローブ：(1)
５’−ＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧ
−３’、タイプＢ特異的プローブ：(2) ５’−ＴＡＡ
ＡＴＣＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡ−３’。 【００３０】従って、本発明は、上記ヌクレオチド配列
(1) 及び(2) 若しくはこれらの配列に相補的なヌクレオ
チド配列、又はその部分配列からなる、それぞれタイプ
Ａ及びタイプＢに特異的な各ヌクレオチド配列を独立に
少なくとも１つずつプローブとして用いて、検体中のヒ
トヘルペスウイルス６型ＤＮＡとハイブリダイゼーショ
ンすることによって、ヒトヘルペスウイルス６型のサブ
タイプＡ及びＢを識別する方法をも提供する。 【００３１】本発明によれば、下記のヌクレオチド配
列：(1) ５’−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡ
ＧＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ
−３’(2) ５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡ
ＴＣＴＴ−３’(3) ５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡ
ＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡ
Ｔ−３’(4) ５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡ
Ａ−３’(5) ５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧ
ＴＴＴ−３’(6) ５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡ
ＣＴ−３’(7) ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴ
ＧＡＴ−３’(8) ５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡ
ＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧ
ＡＴＧＡＴＧＡＣ−３’(9) ５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧ
ＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣ−３’(10) ５’
−ＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡ−３’(11) ５’−ＡＣＴ
ＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡ−３’(12) ５’−ＧＴＧＣＣ
ＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡ−３’(13) ５’−ＡＧＣ
ＡＧＡＣＡＧ−３’(14) ５’−ＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴ
ＧＴＡ−３’(15) ５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴ
ＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴ−３’(16)
５’−ＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧ
ＧＡＡ−３’(17) ５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡ
ＴＴＡＡＡＧ−３’(18) ５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧ
ＴＴＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡＡ−３’(19) ５’−ＴＴＴ
ＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣ
ＡＴＡ−３’(20) ５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ
−３’(21) ５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴ
ＡＴＴＡＧＴＴＣＴ−３’(22) ５’−ＴＴＧＣＴＡＡ
ＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ−３’(23) ５’−Ｇ
ＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’若しくは該
ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、並びに
配列番号１及び２に示されるヌクレオチド配列若しくは
その相補的配列又はその部分配列からなる群から選択さ
れる少なくとも１つのヌクレオチド配列をプローブとし
て用いるＤＮＡハイブリダイゼーションによって、ＨＨ
Ｖ−６ ＤＮＡを検出することも可能であり、従って、
本発明はＨＨＶ−６ ＤＮＡの検出方法も提供する。 【００３２】 【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこ
れらの実施例に限定されない。 【００３３】実施例１ａ）ＤＮＡの抽出ヒト末梢血単核
球培養細胞にＨＨＶ−６を感染させ、培養後、感染細胞
を遠心により収集する。感染細胞沈渣に細胞溶解用緩衝
液（10mM Tris-HCl (pH8.0), 150mM NaCl, 0.4% SDS, 1
0mM EDTA, 1mg/ml Proteinase K ）を０．４ml加え、６
５℃で一夜（又は５６℃で３時間）インキュベートす
る。インキュベーション後、フェノール／クロロホルム
（１：１）混合液を２００μｌ加え、激しく振盪し、遠
心処理によって液を２層に分離し、上部の水層を回収す
る。同操作を更に２回繰り返し行った後、３００μｌの
クロロホルムを加え激しく振盪し、更に遠心処理を行っ
た後上部の水層を回収する。同操作を更にもう一度繰り
返す。最終的に回収した水層に１０μｇの酵母ｔＲＮＡ
と３倍量のエタノールを加え、−７０℃、１時間以上静
置する。遠心処理によってＤＮＡを沈殿させた後、沈渣
を８０％エタノールで洗浄、風乾し、０．５×ＴＥ（5m
M Tris-HCl (pH8.0), 0.5mM EDTA）に溶解し、ＰＣＲ用
サンプルとした。 【００３４】ｂ）ＰＣＲによるＨＨＶ−６ ＤＮＡ上記
サンプルを用いてＰＣＲを行った（ＰＣＲに関しては、
例えば、R. K. Saiki ら、Science, 230, 1350(1985)参
照）。ＨＨＶ−６としてはＨＳＴ株とＵ１１０２株を用
いて行った。また、プライマーとしては以下のオリゴヌ
クレオチドを使用した。 【００３５】プライマーＡ：５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡ
ＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣ−３’プライマー
Ｂ：５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴ
ＣＴＧＧＧＣ−３’プライマーＣ：５’−ＣＡＴＣＡＴ
ＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣ−３’プライ
マーＤ：５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴ
ＴＡＧＴＴＣＴ−３’ＰＣＲを行うに当っては、上記プ
ライマーの組み合わせとしてＡとＣ、ＡとＤ、ＢとＣ及
びＢとＤの組み合わせでそれぞれ行った。 【００３６】ＰＣＲの反応条件は、サンプル１〜１０μ
ｌを用い、終濃度が10mM Tris-HCl(pH8.3), 1.5mM MgC
l2 , 0.01％ゼラチン，dNTP 200μＭ，各プライマー５
０ｐＭ，Ｔａｑポリメラーゼ 2.5単位となるように各組
成を加え、最終５０μｌとして９０℃ １分、６０℃
２分、７２℃ ３分のサイクルを２５サイクル繰り返し
ＰＣＲを行った（図３）。増幅産物をアガロースゲル電
気泳動に掛けてサイズにより分析した。 【００３７】図３に示すように、４組のプライマー何れ
の組み合わせにおいてもＵ１１０２株のＰＣＲ産物はＨ
ＳＴ株のＰＣＲ産物に比較してその長さが明らかに短
く、両株を容易に判別することができた。 【００３８】実施例２ａ）ＤＮＡの抽出ＨＨＶ−６とし
てタイプＡであることが知られているＵ１１０２株及び
ＧＳ株（1986, Science, 234, 596-601 ）、タイプＢで
あることが知られているＨＳＴ株（K. Takahashiら、
J. Virol., 3161〜3163, 1989）、Ｚ２９株（1988, J.
Infect. Dis, 157, 1271-1273）及びＥｎｄｅｒｓ株と
タイプＡに特異的なモノクローナル抗体とタイプＢに特
異的なモノクローナル抗体の両方に反応することからタ
イプＡとタイプＢの中間型と考えられているＤＡ株を用
いてＰＣＲによって各タイプを識別できるかどうか検討
を行った。又その他、臨床検体として国内の突発性発疹
急性期患者の末梢血から分離されたＯＫＣ株、ＮＫＴ
株、１０３株、１０１株、Ｉｎｏｕｅ株及びＫｉｔａｈ
ａｒａ株とＨＨＶ−６と一部相同性があるといわれてい
るＨＨＶ−７（1990, Proc. Natl. Acad. Sci, 87, 748
-752）についても検討した。ＤＮＡの抽出は、実施例１
に述べた方法に準拠して行った。 【００３９】ｂ）ＰＣＲによるＨＨＶ−６のタイピング
上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプルとして
ＰＣＲを行った。ＰＣＲは実施例１で示した方法に従っ
て行い、またプライマーとしては実施例１で示したプラ
イマーのＡとＣの組合わせを用いて行った。結果を図２
に示した。 【００４０】プライマーＡとＣの組み合わせでは、タイ
プＢのＨＳＴ株は５５４ bp のＰＣＲ産物を生じ、タイ
プＡのＵ１１０２株では３２６ bp のＰＣＲ産物を生じ
る。図２から明らかなようにタイプＢに属するＺ２９
株、及びＥｎｄｅｒｓ株は何れも同じタイプＢのＨＳＴ
株と同じ泳動位置にバンドが検出され、一方タイプＡに
属するＧＳ株は同じタイプＡのＵ１１０２株と同じ泳動
位置にバンドが検出され、本発明の方法を用いることに
よってＨＨＶ−６のタイピングが可能であることが検証
された。又両タイプの中間型と考えられていたＤＡ株で
は３２６ bp のバンド以外に５５４ bp 付近に弱いバン
ドが検出され、このことから、ＤＡ株は中間型ではなく
両タイプのウイルスが混在している可能性が考えられ
た。 【００４１】また、国内の突発性発疹患者からの分離株
は全てＨＳＴ株と同じタイプＢであった。ＨＨＶ−７は
本法では検出されなかった。 【００４２】実施例３ａ）ＤＮＡの抽出ＨＨＶ−６とし
てタイプＡであることが知られているＵ１１０２株とタ
イプＢであることが知られているＨＳＴ株を用い、それ
ぞれ実施例１で述べた方法に準拠してＤＮＡの抽出を行
った。 【００４３】ｂ）プローブの調製配列番号１に示される
配列を利用したプローブは、その配列内に、５’−ＧＴ
ＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡＧ−
３’及び５’−ＧＴＴＴＧＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴ
ＴＧＴＴＧＧＧ−３’の一組のプライマーを設定し、実
施例１で示したＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅し、その増
幅産物をランダムプライマーＤＮＡラベリングキット
（宝酒造）を用いて32Ｐ標識することによって調製し
た。 【００４４】配列番号２に示される配列を利用したプロ
ーブは、その配列内に、５’−ＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡ
ＴＴＴＴＧＣＴＴＡＣＡＧＣＣ−３’及び５’−ＧＡＴ
ＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣ−３’
の一組のプライマーを設定し、実施例１で示したＰＣＲ
法によりＤＮＡを増幅し、その増幅産物をランダムプラ
イマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造）を用いて32Ｐ
標識することによって調製した。 【００４５】ｃ）ＰＣＲ及びサザンブロットハイブリダ
イゼーション上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサ
ンプルとしてＰＣＲを行った。プライマーとしては配列
番号１に示される配列を含む領域の増幅には５’−ＧＡ
ＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣ−
３’及び５’−ＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡ
ＧＡＡＧＧＡＧ−３’の組み合わせを用いた。又配列番
号２に示される配列を含む領域の増幅には、実施例１で
示したプライマーのＡとＣの組み合わせを用いて行っ
た。ＰＣＲは実施例１で示した方法に従って行った。 【００４６】ＰＣＲによって増幅した産物は、１％アガ
ロースゲル内で電気泳動した後、ＤＮＡをナイロン膜
（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋；Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に転写し
た。転写した膜を２％ＳＤＳ、３％スキムミルクを含む
６×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，６ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，０．０６Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４））中６５℃、６時間行った後、同液中に32Ｐ標識し
たプローブを加えた液と交換し、更に６５℃、１６時間
ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーシ
ョン終了後、膜を２×ＳＳＰＥで室温２０分洗浄し、更
に２×ＳＳＰＥで６５℃、２０分洗浄を２回、０．２×
ＳＳＰＥで６５℃、２０分洗浄を２回行った。洗浄後の
膜をＸ線フィルムとコンタクトし、フィルムを感光させ
ることによってプローブのハイブリダイゼーションの有
無を確認した。 【００４７】図４には、配列番号１に示される配列を含
む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチ
ジウムブロマイド染色図（Ａ）及び該配列をもとに作製
したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果
（Ｂ）を示した。 【００４８】図５には、配列番号２に示される配列を含
む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチ
ジウムブロマイド染色図（Ａ）及び該配列をもとに作製
したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果
（Ｂ）を示した。 【００４９】何れの場合においても、配列番号１及び２
に示される各配列をもとに作製したプローブは共に、タ
イプＢに属するＨＳＴ株のＤＮＡとのみハイブリダイズ
し、タイプＡであるＵ１１０２株のＤＮＡとはハイブリ
ダイズしなかった。従って、これら配列番号１及び２に
示されるＤＮＡ配列をプローブとして利用することによ
り、ＨＨＶ−６のタイピングが可能である。 【００５０】実施例４ａ）ＤＮＡの抽出ＨＨＶ−６とし
てタイプＡであることが知られているＵ１１０２株およ
びタイプＢであることが知られているＨＳＴ株、またタ
イプ不明の臨床分離株１及び２の感染ヒト末梢血単核球
培養細胞よりＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出は実施例
１に述べた方法に準拠して行った。 【００５１】ｂ）ＰＣＲによるＤＮＡの増幅及びドット
ブロット上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプ
ルとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは実施例１で示した方
法に従って行い、またプライマーとしては実施例１で示
したプライマーのＡとＣの組み合わせを用いて行った。
これらのＰＣＲ産物をナイロンメンブレンフィルター
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋）に０．５μ
ｌずつ載せ、０．４Ｎ ＮａＣｌで２０分間処理した
後、６×ＳＳＰＥで中和した。 【００５２】ｃ）アルカリフォスファターゼ標識ＤＮＡ
プローブの調製ＨＨＶ−６タイプ特異的酵素標識プロー
ブとしては、５’−ＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣ
ＣＴＣＣＡＧ−３’を有するオリゴヌクレオチドをタイ
プＡに特異的なプローブ、５’−ＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴ
ＡＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡ−３’を有するオリゴヌクレ
オチドをタイプＢに特異的なプローブとして用いるた
め、これらをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製のＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（３８１Ａ）を用
いて合成し、アミノリンクIIを用いてその５’末端にア
ミノ基を付加した。アミノ基を付加したＤＮＡをＥＭＣ
Ｓ［Ｎ−（ε−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘ
ｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ］を用いてマレイミド化
し、一方アルカリフォスファターゼは２−Ｉｍｉｎｏｔ
ｈｉｏｌａｎｅを用いてＳＨ基を付加した。両者を混合
反応させることによりアルカリフォスファターゼ標識Ｄ
ＮＡプローブを作製した。 【００５３】ｄ）ハイブリダイゼーションｂ）で作製し
たメンブレンフィルターを２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤ
Ｓで室温で５分間洗浄、更に２×ＳＳＰＥ、０．１％Ｓ
ＤＳを用いて４０℃、５分間の洗浄を３回行った。ハイ
ブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ’ｓ、０．５％ＳＤＳ、１％Ｃａｓｅｉｎ）を
用いて５０℃、３０分間ブロッキングを行い、次にｃ）
で調製した酵素標識プローブ２種のうち１種を加え（ア
ルカリフォスファターゼの最終濃度０．１μｇ／ｍ
ｌ）、５０℃で１時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。ハイブリダイゼーション終了後１×ＳＳＣ、１％Ｓ
ＤＳを用いて４０℃で５分間の洗浄を２回、１×ＳＳ
Ｃ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて４０℃で
５分間の洗浄を２回、１×ＳＳＣを用いて室温で５分間
の洗浄を２回行った。アルカリフォスファターゼ基質反
応液（0.3M Tris−HCl 、0.1M NaCl、50mM MgCl2
（pH 9.8））を加え、室温で５分間インキュベートした
後、ＮＴＢ溶液［７０％ Ｎ’Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆ
ｏｒｍａｍｉｄｅにＮＴＢ（Ｎｉｔｒｏ Ｔｅｔｒａｚ
ｏｌｉｕｍ Ｂｌｕｅ）を７５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解
したもの］を３３μｌ／７．５ｍｌ、ＢＣＩＰ溶液［10
0 ％Ｎ’Ｎ−ＤｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅにＢ
ＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎ
ｄｏｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅを５０ｍｇ／ｍｌの濃度
に溶解したもの］を２５μｌ／７．５ｍｌ加え、３７℃
で２時間反応させた。 【００５４】結果を図６に示した。図６のＡではタイプ
Ａに特異的なプローブをＢではタイプＢに特異的なプロ
ーブを用いた。またＰＣＲ産物の１はＵ１１０２株、２
はＨＳＴ株、３は臨床分離株１、４は臨床分離株２を示
している。図に示す通り、タイプＡ特異的プローブはＵ
１１０２株のＰＣＲ産物とハイブリダイズするが、ＨＳ
Ｔ株とはハイブリダイズせず、またタイプＢ特異的プロ
ーブはＨＳＴ株とハイブリダイズするがＵ１１０２株と
はハイブリダイズしなかった。これらのプローブを用い
ることにより、ＰＣＲ産物をサザンブロットすることな
く、ドットブロットを行うことによって簡便かつ迅速に
タイプを識別することが可能である。また、この方法に
より、臨床分離株１はタイプＡ、臨床分離株２はタイプ
Ｂであることが判明した。 【００５５】 【発明の効果】ＨＨＶ−６のタイピングは、種々の疾患
との関連で興味深いものと考えられるが、これまでその
タイピングには数週間以上の時間を必要としていた。本
発明によって臨床検体からＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在の
有無を判定することができるばかりか、そのタイピング
を簡便且つ迅速に行うことが可能となり、臨床医学、基
礎医学等の分野で極めて有効な研究手段が提供されたも
のと考えられる。 【００５６】 【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KOKUSAISIYAKU <120>DETECTION OF HUMAN HERPES VIRUS 6 TYPE (HHV-6) DNA AND DISCRIMINATI ON OF SUB-TYPE <130> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 108 <212> DNA <400> 1 aatgtagaat atttaaaata catggaagta caatctccta ctgataataa tactcccacc 60 ccatcaaaga acaatgaatc cccaacaaga caaaaactta caaacata 108 <210> 2 <211> 228 <212> DNA <400> 2 ggtctgaaca acaagacatt ttgcttacag ccccgatcaa aggtcacaga caaaagaaag 60 gattcaggaa aaaggttcta actccaagtg taccgaaacg cttccttgta tgacctttac 120 cgactcagca actcctgtca aaagtcatga tgcaattcag gatactttaa atccagaaag 180 taaaatagac aaagaattgg gagctgtaga aagtctagtg aatctatg 228
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＨＶ−６ Ｕ１１０２株と比較される、ＨＳ
Ｔ株ゲノム上の新規１０８ bp及び２２８ bp ヌクレオ
チド配列部位を示す。 【図２】タイプＡ及びＢのいずれかに属する１３種類の
ＨＨＶ−６株と２種類のＨＨＶ−７株について、各ウイ
ルスＤＮＡのＰＣＲ増幅後、アガロースゲル電気泳動に
掛けて得られた、サイズによりサブタイプの識別が可能
であることを示す泳動写真である。 【図３】４種類のプライマーセットを用いてＨＳＴ株と
Ｕ１１０２株のＤＮＡの各ＰＣＲを実施した後、アガロ
ースゲル電気泳動に掛けて得られた、サイズによりサブ
タイプの識別が可能であることを示す泳動写真である。 【図４】配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む
領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジ
ウムブロマイド染色図（Ａ）、及び、該配列をもとにし
て作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
の結果（Ｂ）を示す写真である。 【図５】配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む
領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジ
ウムブロマイド染色図（Ａ）、及び、該配列をもとにし
て作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
の結果（Ｂ）を示す写真である。 【図６】タイプＡに特異的なプローブ（Ａ）又はタイプ
Ｂに特異的なプローブ（Ｂ）を用いるハイブリダイゼー
ションによってサブタイプ識別を実施した結果を示すド
ットブロット写真である。 【符号の説明】 １ Ｕ１１０２株、 ２ ＨＳＴ株、 ３ 臨床分離株 ４ 臨床分離株
Ｔ株ゲノム上の新規１０８ bp及び２２８ bp ヌクレオ
チド配列部位を示す。 【図２】タイプＡ及びＢのいずれかに属する１３種類の
ＨＨＶ−６株と２種類のＨＨＶ−７株について、各ウイ
ルスＤＮＡのＰＣＲ増幅後、アガロースゲル電気泳動に
掛けて得られた、サイズによりサブタイプの識別が可能
であることを示す泳動写真である。 【図３】４種類のプライマーセットを用いてＨＳＴ株と
Ｕ１１０２株のＤＮＡの各ＰＣＲを実施した後、アガロ
ースゲル電気泳動に掛けて得られた、サイズによりサブ
タイプの識別が可能であることを示す泳動写真である。 【図４】配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む
領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジ
ウムブロマイド染色図（Ａ）、及び、該配列をもとにし
て作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
の結果（Ｂ）を示す写真である。 【図５】配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む
領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジ
ウムブロマイド染色図（Ａ）、及び、該配列をもとにし
て作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
の結果（Ｂ）を示す写真である。 【図６】タイプＡに特異的なプローブ（Ａ）又はタイプ
Ｂに特異的なプローブ（Ｂ）を用いるハイブリダイゼー
ションによってサブタイプ識別を実施した結果を示すド
ットブロット写真である。 【符号の説明】 １ Ｕ１１０２株、 ２ ＨＳＴ株、 ３ 臨床分離株 ４ 臨床分離株
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 森 浩之
兵庫県神戸市西区室谷１丁目１−２ 国際
試薬株式会社研究開発センター内
Ｆターム(参考） 2G045 BA20 BB50 DA12 DA13 DA14
FB02
4B024 AA11 CA01 HA14
4B063 QA01 QA07 QA18 QQ42 QR13
QR32 QR55 QR58 QR62 QS25
QS34 QS36 QX01 QX07
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 下記のヌクレオチド配列：(1) ５’−
ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣ
ＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’(2) ５’
−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−３’
(3) ５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴ
ＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’(4)
５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’(5)
５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−３’
(6) ５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−３’
(7) ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−
３’(8) ５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴ
ＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡ
ＴＧＡＣ−３’(9) ５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴ
ＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣ−３’(10) ５’−ＡＡＡ
ＡＴＧＴＡＴＣＣＡ−３’(11) ５’−ＡＣＴＣＣＴＴ
ＣＴＣＣＡＧＡ−３’(12) ５’−ＧＴＧＣＣＡＧＧＧ
ＡＡＡＴＣＣＡＡＡ−３’(13) ５’−ＡＧＣＡＧＡＣ
ＡＧ−３’(14) ５’−ＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡ−
３’(15) ５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡ
ＧＡＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴ−３’(16) ５’−Ｃ
ＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡ−
３’(17) ５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡＡ
ＡＧ−３’(18) ５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣ
ＡＴＡＡＣＣＡＡＡ−３’(19) ５’−ＴＴＴＣＡＴＣ
ＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−
３’(20) ５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’(2
1) ５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡ
ＧＴＴＣＴ−３’(22) ５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧ
ＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ−３’(23) ５’−ＧＴＧＡＣ
ＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’若しくは該ヌクレオ
チド配列に相補的なヌクレオチド配列、並びに配列番号
１または２に示されるヌクレオチド配列若しくは該ヌク
レオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又はその部
分配列からなる群から選択される少なくとも１つのヌク
レオチド配列をプローブとして用いるＤＮＡハイブリダ
イゼーションによって、ヒトヘルペスウイルス６型ＤＮ
Ａを検出する方法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2002218713A JP3833152B2 (ja) | 2002-07-26 | 2002-07-26 | ヒトヘルペスウイルス６型（ｈｈｖ−６）ｄｎａの検出及びサブタイプ識別方法 |
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| JP2006027134A Division JP2007061084A (ja) | 2006-02-03 | 2006-02-03 | ヒトヘルペスウイルス６型（ｈｈｖ−６）ｄｎａの検出及びサブタイプ識別方法 |
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|---|---|
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|---|---|
| JP (1) | JP3833152B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007064926A (ja) * | 2005-09-02 | 2007-03-15 | Nipro Corp | 試験片およびその製造方法 |
| CN111500788A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-08-07 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 用于人类疱疹病毒感染检测的试剂盒及其检测方法 |
| RU2805956C1 (ru) * | 2023-02-20 | 2023-10-24 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ одновременной детекции лимфотропных герпесвирусов ВГЧ6А, ВГЧ6В, ВЭБ и его основных генотипов ВЭБ-1 и ВЭБ-2 |
-
2002
- 2002-07-26 JP JP2002218713A patent/JP3833152B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007064926A (ja) * | 2005-09-02 | 2007-03-15 | Nipro Corp | 試験片およびその製造方法 |
| CN111500788A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-08-07 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 用于人类疱疹病毒感染检测的试剂盒及其检测方法 |
| CN111500788B (zh) * | 2020-05-29 | 2023-11-07 | 领航医学科技(深圳)有限公司 | 用于人类疱疹病毒感染检测的试剂盒及其检测方法 |
| RU2806428C1 (ru) * | 2022-12-28 | 2023-10-31 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления вируса герпеса человека 6А |
| RU2805956C1 (ru) * | 2023-02-20 | 2023-10-24 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ одновременной детекции лимфотропных герпесвирусов ВГЧ6А, ВГЧ6В, ВЭБ и его основных генотипов ВЭБ-1 и ВЭБ-2 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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