JP2003135100A - ヒトヘルペスウイルス6型(hhv−6)dnaの検出及びサブタイプ識別方法 - Google Patents
ヒトヘルペスウイルス6型(hhv−6)dnaの検出及びサブタイプ識別方法Info
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Abstract
V−6)タイプBのDNA上に存在する新規の108 b
p 及び228 bp ヌクレオチド配列に関する。本発明は
また、これらヌクレオチド配列近傍のHHV−6タイプ
A及びタイプBDNAの共通配列をプライマーとして用
いるPCR及び増幅産物のサイズ分析によるHHV−6
サブタイプ識別方法に関する。 【効果】 HHV−6サブタイプの識別を簡便且つ迅速
に行うことができる。
Description
ルス6型(HHV−6)DNAの検出、並びにHHV−
6のサブタイプの識別を行う方法に関する。 【0002】 【従来の技術】ヒトヘルペスウイルス6型(以下、HH
V−6と称する)は、1986年にSaluhuddin等によっ
て後天性免疫不全症候群(AIDS)患者、及びリンパ
球系疾患患者のリンパ球より第6番目のヘルペスウイル
スとして分離され(1986, Science, 234, 596-601 )、
1988年、山西等によって突発性発疹の原因ウイルス
であることが明らかにされた(1988, Lancet, 1065-106
7 )。 【0003】HHV−6は当初ヒト免疫不全ウイルス
(HIV)陽性リンパ腫及びリンパ腺炎、又HIV陰性
のリンパ腫より分離されており、又Bリンパ腫にHHV
−6DNAが見いだされるなど、何らかの血液系疾患に
関与している可能性が示唆されている。又、腎移植後、
HHV−6抗体価が著名に上昇し、拒絶反応の起こった
患者リンパ球よりHHV−6が分離される等、臓器移植
後の拒絶反応との関係も示唆されている(1990, Transp
lantation, 49, 519〜522 )。 【0004】大多数の人においては、HHV−6の感染
は、生後1年以内に成立することが抗体保有率に関する
調査より明らかとなっているが(1989 J. Clin. Microb
iol.27, 651-653 )、ウイルスの感染経路はいまだ明ら
かではない。唾液からHHV−6が分離された、という
報告も見受けられる。 【0005】最近、HHV−6はDNAの多型性から2
つのサブタイプに分けられており(1991 J. Clin. Micr
obiol 29, 367-372 )、タイプ間での病原性の違い、細
胞親和性の違い、及び増殖性の違いといった生物学的性
状にどの様な差異があるか注目されている。これまで
に、AIDS患者や、リンパ球系疾患患者からはタイプ
AのHHV−6が主に分離されているが、Pruksannonda
等はHHV−6の初感染によって発熱したと思われる患
児から分離されたHHV−6は全てタイプBであったと
報告している(1992, The New England Journal of Med
icine, 326, 1445-1550 )。 【0006】このように、HHV−6のタイピング、即
ち型の決定は種々の疾患との関連で興味深いものと考え
られる。ところが、従来HHV−6のタイピングに利用
されていた方法は、分離したウイルスからDNAを抽出
精製し、制限酵素によってウイルスDNAを消化後、電
気泳動にかけ、その電気泳動パターンによって多型性を
調べるか、タイプA及びタイプBそれぞれに特異的なモ
ノクローナル抗体を利用してウイルス感染細胞を蛍光抗
体法で染色することによって同定されてきた。しかしこ
れらの方法は、何れもウイルスの分離、培養等の操作を
伴うものであり、非常に時間と労力を必要とするばかり
か、ウイルスの分離ができなければ同定することは不可
能であった。 【0007】 【発明が解決しようとする課題】上述した様に、HHV
−6のタイピングは、種々の疾患との関連で興味深いも
のと考えられるが、従来の技術は何れも細胞培養による
ウイルス分離を伴うものであり、非常に煩雑であった。 【0008】本発明は、上記問題を解決する為のHHV
−6タイプ特異的DNAを提供すること、及びHHV−
6タイピングの簡便な方法を提供することを目的とする
ものである。 【0009】 【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
解決するために、HHV−6タイプBに属するHST株
(K. Takahashiら、 J. Virol., 3161〜3163, 1989)の
前初期遺伝子の一つについてその塩基配列を決定し、既
報のHHV−6タイプAに属するU1102株の同領域
の塩基配列(1991, J. Virol 65, 5381-5390)と比較し
た。その結果、HST株とU1102株の塩基配列の間
に特徴的な差異を見いだし、本発明を完成するに至っ
た。即ち、本発明者等がその塩基配列解析を行ったHS
T株と、既報のU1102株の前初期遺伝子内におい
て、HST株にはU1102株には見られない新規の2
ヵ所のポリヌクレオチドの挿入が認められた(図1参
照)。1ヵ所は108 bp であり、もう1カ所は228
bp であった。それぞれの塩基配列を配列番号1及び2
としてそれぞれ後記配列表中に示した。 【0010】新規の108 bp 及び228 bp ポリヌク
レオチド配列は、図2に示すHHV−6のタイピングの
結果からも明らかなように、タイプBに属するHHV−
6株に特徴的な配列であると考えられる。 【0011】従って、本発明は、配列番号1に示される
ヒトヘルペスウイルス6型由来のヌクレオチド配列若し
くは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
又はその部分配列を提供する。本発明はまた、配列番号
2に示されるヒトヘルペスウイルス6型由来のヌクレオ
チド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレ
オチド配列、又はその部分配列を提供する。 【0012】本明細書中、「HHV−6(サブ)タイプ
B」なる用語は、配列番号1及び2にそれぞれ示される
ポリヌクレオチド配列をウイルスDNA中に含むタイプ
のHHV−6に言及して使用する。また、「HHV−6
(サブ)タイプA」なる用語は、そのようなポリヌクレ
オチド配列を共に含まないタイプのHHV−6に言及し
て使用する。 【0013】それ故、HHV−6のタイプAとタイプB
の上記差異を利用することによって、例えば、タイプB
に特徴的なDNA配列をプローブとして用いるDNAハ
イブリダイゼーションによって、HHV−6のサブタイ
プ(A及びB)を識別することができる。 【0014】このように、本発明は、配列番号1に示さ
れるHHV−6由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌク
レオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分
配列をプローブとして使用するDNAハイブリダイゼー
ションによってヒトヘルペスウイルス6型のサブタイプ
A及びBを識別する方法を提供する。 【0015】本発明はまた、配列番号2に示されるHH
V−6由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド
配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列をプ
ローブとして使用するDNAハイブリダイゼーションに
よってヒトヘルペスウイルス6型のサブタイプA及びB
を識別する方法を提供する。 【0016】本発明はさらに、配列番号1及び2に示さ
れるHHV−6由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌク
レオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分
配列の両方をプローブとして使用するDNAハイブリダ
イゼーションによってヒトヘルペスウイルス6型のサブ
タイプA及びBを識別する方法を提供する。 【0017】DNAハイブリダイゼーションについて
は、Molecular Cloning, 1989 等に記載の技術が適用さ
れる。このとき、標識DNAの標識物質としては、酵素
(例えばアルカリホスファターゼ)、ラジオアイソトー
プ(例えば32P)等が使用される。 【0018】血液等のヒト検体中のHHV−6含有量が
少ない場合、例えば感染初期の場合には、前記108 b
p 及び228 bp 挿入領域をはさみ、タイプA及びBに
共通な配列を持つプライマーセットを用いてポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR)を行ってDNA増幅するならば、
PCR産物の長さの違いから両タイプを識別することが
可能となる。 【0019】上記目的で使用し得るプライマーセットの
好適例を下記に列挙する。これらのプライマーセット
は、HHV−6タイプBのDNA上に存在する新規の1
08bp及び228bpヌクレオチド配列近傍のHHV−6
タイプA及びタイプB DNAの共通配列の中から特定
的に選択したものである。実際にプライマーとして利用
される配列はプライマーセットの配列に示されたヌクレ
オチド配列の部分配列又は全配列である。また、下記に
列挙するヌクレオチド配列以外にも、決定された配列に
基づいて種々の可能な配列を選択し本発明の識別方法に
適用することも可能であろう。 【0020】プライマーセット−1プライマーI:5’
−TGATGGCACACAACAAAGAGATGT
CCAATCCTGACATCTCCA−3’5’−A
AGCAGATGAATCAAATCTT−3’5’−
ATGTGAATTGTAAAAATTTAATTAC
TGCCGCCAAAAAT−3’5’−TGAATT
TTCATGGCAA−3’5’−TTATGATGA
TACTGGTTT−3’5’−ATTAAACCTT
TAACT−3’5’−AGTCTTCCATCTGT
GAT−3’5’−ATATTCAGAGGAATCT
TCTATCGAATCTATCCATGAAGATG
ATGAC−3’プライマーII:5’−GGATTTC
CCTGGCACATCTGGAGAA−3’5’−T
GGATACATTTT−3’5’−TCTGGAGA
AGGAGT−3’5’−TTTGGATTTCCCT
GGCAC−3’5’−CTGTCTGCT−3’5’
−TACACAGTTAGGG−3’5’−AGGGC
CGCCCAGATCTGTCACTGAGGCTGT
AC−3’5’−TTCCCTGGCACATCTGG
AGAAGGAG−3’プライマーセット−2プライマ
ーI:5’−TTCTCCAGATGTGCCAGGG
AAATCC−3’5’−AAAATGTATCCA−
3’5’−ACTCCTTCTCCAGA−3’5’−
GTGCCAGGGAAATCCAAA−3’5’−A
GCAGACAG−3’5’−CCCTAACTGTG
TA−3’5’−GTACAGCCTCAGTGACA
GATCTGGGCGGCCCT−3’5’−CTCC
TTCTCCAGATGTGCCAGGGAA−3’プ
ライマーII:5’−ATCATTTCTGATATTA
AAG−3’5’−GAGTGATCAGTTTCAT
AACCAAA−3’5’−TTTCATCATTGT
TATCGCTTTCACTCTCATA−3’5’−
TGCAATGTAATCA−3’5’−TATTCA
TATGAATGTTATTAGTTCT−3’5’−
TTGCTAAATGGTGTATTCTCAT−3’
5’−GTGACCTCTGGTGGTGAA−3’プ
ライマーセット−3プライマーI:5’−TGATGG
CACACAACAAAGAGATGTCCAATCC
TGACATCTCCA−3’5’−AAGCAGAT
GAATCAAATCTT−3’5’−ATGTGAA
TTGTAAAAATTTAATTACTGCCGCC
AAAAAT−3’5’−TGAATTTTCATGG
CAA−3’5’−TTATGATGATACTGGT
TT−3’5’−ATTAAACCTTTAACT−
3’5’−AGTCTTCCATCTGTGAT−3’
5’−ATATTCAGAGGAATCTTCTATC
GAATCTATCCATGAAGATGATGAC−
3’プライマーII:5’−ATCATTTCTGATA
TTAAAG−3’5’−GAGTGATCAGTTT
CATAACCAAA−3’5’−TTTCATCAT
TGTTATCGCTTTCACTCTCATA−3’
5’−TGCAATGTAATCA−3’5’−TAT
TCATATGAATGTTATTAGTTCT−3’
5’−TTGCTAAATGGTGTATTCTCAT
−3’5’−GTGACCTCTGGTGGTGAA−
3’。 【0021】たとえば、上記プライマーセット−1を用
いた場合、そのPCR増幅産物の長さは、HHV−6タ
イプB株ではタイプA株より108 bp 長くなる。ま
た、プライマーセット−2を用いた場合、タイプB株で
はタイプA株より228 bp 長くなる。またプライマー
セット−3を用いた場合、タイプB株ではタイプA株よ
り336 bp 長くなる。何れのプライマーセットを用い
た場合でもHHV−6タイプB株とタイプA株でのPC
R産物の長さには大きな違いが生じるため、通常のアガ
ロースゲル電気泳動等のサイズ分析によって容易に両株
を識別することが可能である。 【0022】従って、本発明は、上記プライマーセット
−1の中から各々一種ずつ選択されたプライマーI及び
IIの組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス
6型(HHV−6)DNAのポリメラーゼ連鎖反応を行
って該HHV−6DNAを増幅した後、その増幅産物を
サイズ分析に掛けて、配列番号1に示されるHHV−6
由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に
相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有する
HHV−6DNAと該配列を含有しないHHV−6DN
Aとに分離して、HHV−6のサブタイプA及びBを識
別する方法を提供する。 【0023】本発明はまた、上記プライマーセット−2
の中から各々一種ずつ選択されたプライマーI及びIIの
組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス6型
(HHV−6)DNAのポリメラーゼ連鎖反応を行って
該HHV−6DNAを増幅した後、その増幅産物をサイ
ズ分析に掛けて、配列番号2に示されるHHV−6由来
のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補
的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有するHH
V−6DNAと該配列を含有しないHHV−6DNAと
に分離して、HHV−6のサブタイプA及びBを識別す
る方法を提供する。 【0024】本発明はさらに、上記プライマーセット−
3の中から各々一種ずつ選択されたプライマーI及びII
の組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス6
型(HHV−6)DNAのポリメラーゼ連鎖反応を行っ
て該HHV−6DNAを増幅した後、その増幅産物をサ
イズ分析に掛けて、配列番号1及び2に示されるHHV
−6由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配
列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有
するHHV−6DNAと該配列を含有しないHHV−6
DNAとに分離して、HHV−6のサブタイプA及びB
を識別する方法を提供する。 【0025】ここで、ポリメラーゼ連鎖反応について
は、公知の技術が適用され、また、サイズ分析において
は、アガロースゲル電気泳動等の技術が使用され、これ
らの方法は特定のものに限定されない。 【0026】既にHHV−6のタイプが明らかにされて
いる13株を用いて、上記プライマーセット−2を用い
てPCRを行ったところ、各タイプに特徴的な長さのバ
ンドがそれぞれ確認され、本発明によってHHV−6の
タイピングが可能であることが明らかとなった(図2参
照)。 【0027】PCRによって増幅されたDNA量が十分
な場合、アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマ
イドで染色し、DNAを確認できるが、臨床検体等でH
HV−6 DNA量が少ない検体においては、PCR後
でもエチジウムブロマイド染色では特異的なバンドを確
認できない場合がある。その様な場合、サザンブロッテ
ィングの後、上記プライマーセット中のポリヌクレオチ
ドをプローブとして、ハイブリダイゼーション法によっ
てHHV−6 DNAの存在を同定することができる。
これらプライマーセット中のポリヌクレオチド配列は、
タイプA及びBの双方に共通な配列であるため、どちら
のタイプのHHV−6 DNAでも検出することができ
る。一方、配列番号1に示されるポリヌクレオチド配列
若しくはその相補的配列の一部又は全部をプローブとし
て用いた場合、このポリヌクレオチド配列はタイプAの
HHV−6 DNAには存在しない配列であるため、タ
イプBのHHV−6 DNAとのみハイブリダイズす
る。ここで、プライマーセット−1または−3を用いて
PCRを行った場合、タイプB特異的なプローブは配列
番号1に示されるポリヌクレオチド配列若しくはその相
補的配列の一部又は全部が利用される。又、プライマー
セット−2又は−3を用いた場合、タイプB特異的なプ
ローブは配列番号2に示されるポリヌクレオチド配列若
しくはその相補的配列の一部又は全部が利用される。 【0028】従って、プライマーセット−1,−2又は
−3を用いてPCRを行った後、これらプライマーセッ
ト中のポリヌクレオチド配列の何れか一種の一部又は全
部をプローブとしてHHV−6 DNAの存在を確認し
た後、配列番号1又は2に示したポリヌクレオチド配列
若しくはその相補的配列の何れか一種の一部又は全部を
プローブとしてHHV−6タイプBを同定することによ
り、HHV−6のタイピングを行うことができる。もち
ろん、多量のHHV−6 DNAが利用できる場合に
は、PCRの過程を省略して直接上記ポリヌクレオチド
配列をプローブとして組み合わせることにより、HHV
−6のタイピングが可能である。 【0029】あるいは、HHV−6タイプAとBのDN
A塩基配列の違いを利用して、タイプA特異的プローブ
及びタイプB特異的プローブを設定し、これらのプロー
ブの認識部位を含むHHV−6DNAのPCR産物に対
してハイブリダイゼーションを行えば、タイプの判別が
可能である。このための有効なプローブの例として、次
のものが挙げられる。タイプA特異的プローブ:(1)
5’−GAACTCCATCAGCGGCCTCCAG
−3’、タイプB特異的プローブ:(2) 5’−TAA
ATCCATTACTGGCCTTGAA−3’。 【0030】従って、本発明は、上記ヌクレオチド配列
(1) 及び(2) 若しくはこれらの配列に相補的なヌクレオ
チド配列、又はその部分配列からなる、それぞれタイプ
A及びタイプBに特異的な各ヌクレオチド配列を独立に
少なくとも1つずつプローブとして用いて、検体中のヒ
トヘルペスウイルス6型DNAとハイブリダイゼーショ
ンすることによって、ヒトヘルペスウイルス6型のサブ
タイプA及びBを識別する方法をも提供する。 【0031】本発明によれば、下記のヌクレオチド配
列:(1) 5’−TGATGGCACACAACAAA
GAGATGTCCAATCCTGACATCTCCA
−3’(2) 5’−AAGCAGATGAATCAAA
TCTT−3’(3) 5’−ATGTGAATTGTA
AAAATTTAATTACTGCCGCCAAAAA
T−3’(4) 5’−TGAATTTTCATGGCA
A−3’(5) 5’−TTATGATGATACTGG
TTT−3’(6) 5’−ATTAAACCTTTAA
CT−3’(7) 5’−AGTCTTCCATCTGT
GAT−3’(8) 5’−ATATTCAGAGGAA
TCTTCTATCGAATCTATCCATGAAG
ATGATGAC−3’(9) 5’−TTCTCCAG
ATGTGCCAGGGAAATCC−3’(10) 5’
−AAAATGTATCCA−3’(11) 5’−ACT
CCTTCTCCAGA−3’(12) 5’−GTGCC
AGGGAAATCCAAA−3’(13) 5’−AGC
AGACAG−3’(14) 5’−CCCTAACTGT
GTA−3’(15) 5’−GTACAGCCTCAGT
GACAGATCTGGGCGGCCCT−3’(16)
5’−CTCCTTCTCCAGATGTGCCAGG
GAA−3’(17) 5’−ATCATTTCTGATA
TTAAAG−3’(18) 5’−GAGTGATCAG
TTTCATAACCAAA−3’(19) 5’−TTT
CATCATTGTTATCGCTTTCACTCTC
ATA−3’(20) 5’−TGCAATGTAATCA
−3’(21) 5’−TATTCATATGAATGTT
ATTAGTTCT−3’(22) 5’−TTGCTAA
ATGGTGTATTCTCAT−3’(23) 5’−G
TGACCTCTGGTGGTGAA−3’若しくは該
ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、並びに
配列番号1及び2に示されるヌクレオチド配列若しくは
その相補的配列又はその部分配列からなる群から選択さ
れる少なくとも1つのヌクレオチド配列をプローブとし
て用いるDNAハイブリダイゼーションによって、HH
V−6 DNAを検出することも可能であり、従って、
本発明はHHV−6 DNAの検出方法も提供する。 【0032】 【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこ
れらの実施例に限定されない。 【0033】実施例1a)DNAの抽出ヒト末梢血単核
球培養細胞にHHV−6を感染させ、培養後、感染細胞
を遠心により収集する。感染細胞沈渣に細胞溶解用緩衝
液(10mM Tris-HCl (pH8.0), 150mM NaCl, 0.4% SDS, 1
0mM EDTA, 1mg/ml Proteinase K )を0.4ml加え、6
5℃で一夜(又は56℃で3時間)インキュベートす
る。インキュベーション後、フェノール/クロロホルム
(1:1)混合液を200μl加え、激しく振盪し、遠
心処理によって液を2層に分離し、上部の水層を回収す
る。同操作を更に2回繰り返し行った後、300μlの
クロロホルムを加え激しく振盪し、更に遠心処理を行っ
た後上部の水層を回収する。同操作を更にもう一度繰り
返す。最終的に回収した水層に10μgの酵母tRNA
と3倍量のエタノールを加え、−70℃、1時間以上静
置する。遠心処理によってDNAを沈殿させた後、沈渣
を80%エタノールで洗浄、風乾し、0.5×TE(5m
M Tris-HCl (pH8.0), 0.5mM EDTA)に溶解し、PCR用
サンプルとした。 【0034】b)PCRによるHHV−6 DNA上記
サンプルを用いてPCRを行った(PCRに関しては、
例えば、R. K. Saiki ら、Science, 230, 1350(1985)参
照)。HHV−6としてはHST株とU1102株を用
いて行った。また、プライマーとしては以下のオリゴヌ
クレオチドを使用した。 【0035】プライマーA:5’−TTCTCCAGA
TGTGCCAGGGAAATCC−3’プライマー
B:5’−GTACAGCCTCAGTGACAGAT
CTGGGC−3’プライマーC:5’−CATCAT
TGTTATCGCTTTCACTCTC−3’プライ
マーD:5’−TATTCATATGAATGTTAT
TAGTTCT−3’PCRを行うに当っては、上記プ
ライマーの組み合わせとしてAとC、AとD、BとC及
びBとDの組み合わせでそれぞれ行った。 【0036】PCRの反応条件は、サンプル1〜10μ
lを用い、終濃度が10mM Tris-HCl(pH8.3), 1.5mM MgC
l2 , 0.01%ゼラチン,dNTP 200μM,各プライマー5
0pM,Taqポリメラーゼ 2.5単位となるように各組
成を加え、最終50μlとして90℃ 1分、60℃
2分、72℃ 3分のサイクルを25サイクル繰り返し
PCRを行った(図3)。増幅産物をアガロースゲル電
気泳動に掛けてサイズにより分析した。 【0037】図3に示すように、4組のプライマー何れ
の組み合わせにおいてもU1102株のPCR産物はH
ST株のPCR産物に比較してその長さが明らかに短
く、両株を容易に判別することができた。 【0038】実施例2a)DNAの抽出HHV−6とし
てタイプAであることが知られているU1102株及び
GS株(1986, Science, 234, 596-601 )、タイプBで
あることが知られているHST株(K. Takahashiら、
J. Virol., 3161〜3163, 1989)、Z29株(1988, J.
Infect. Dis, 157, 1271-1273)及びEnders株と
タイプAに特異的なモノクローナル抗体とタイプBに特
異的なモノクローナル抗体の両方に反応することからタ
イプAとタイプBの中間型と考えられているDA株を用
いてPCRによって各タイプを識別できるかどうか検討
を行った。又その他、臨床検体として国内の突発性発疹
急性期患者の末梢血から分離されたOKC株、NKT
株、103株、101株、Inoue株及びKitah
ara株とHHV−6と一部相同性があるといわれてい
るHHV−7(1990, Proc. Natl. Acad. Sci, 87, 748
-752)についても検討した。DNAの抽出は、実施例1
に述べた方法に準拠して行った。 【0039】b)PCRによるHHV−6のタイピング
上記各HHV−6より抽出したDNAをサンプルとして
PCRを行った。PCRは実施例1で示した方法に従っ
て行い、またプライマーとしては実施例1で示したプラ
イマーのAとCの組合わせを用いて行った。結果を図2
に示した。 【0040】プライマーAとCの組み合わせでは、タイ
プBのHST株は554 bp のPCR産物を生じ、タイ
プAのU1102株では326 bp のPCR産物を生じ
る。図2から明らかなようにタイプBに属するZ29
株、及びEnders株は何れも同じタイプBのHST
株と同じ泳動位置にバンドが検出され、一方タイプAに
属するGS株は同じタイプAのU1102株と同じ泳動
位置にバンドが検出され、本発明の方法を用いることに
よってHHV−6のタイピングが可能であることが検証
された。又両タイプの中間型と考えられていたDA株で
は326 bp のバンド以外に554 bp 付近に弱いバン
ドが検出され、このことから、DA株は中間型ではなく
両タイプのウイルスが混在している可能性が考えられ
た。 【0041】また、国内の突発性発疹患者からの分離株
は全てHST株と同じタイプBであった。HHV−7は
本法では検出されなかった。 【0042】実施例3a)DNAの抽出HHV−6とし
てタイプAであることが知られているU1102株とタ
イプBであることが知られているHST株を用い、それ
ぞれ実施例1で述べた方法に準拠してDNAの抽出を行
った。 【0043】b)プローブの調製配列番号1に示される
配列を利用したプローブは、その配列内に、5’−GT
AGAATATTTAAAATACATGGAAG−
3’及び5’−GTTTGTAAGTTTTTGTCT
TGTTGGG−3’の一組のプライマーを設定し、実
施例1で示したPCR法によりDNAを増幅し、その増
幅産物をランダムプライマーDNAラベリングキット
(宝酒造)を用いて32P標識することによって調製し
た。 【0044】配列番号2に示される配列を利用したプロ
ーブは、その配列内に、5’−ACAACAAGACA
TTTTGCTTACAGCC−3’及び5’−GAT
TCACTAGACTTTCTACAGCTCC−3’
の一組のプライマーを設定し、実施例1で示したPCR
法によりDNAを増幅し、その増幅産物をランダムプラ
イマーDNAラベリングキット(宝酒造)を用いて32P
標識することによって調製した。 【0045】c)PCR及びサザンブロットハイブリダ
イゼーション上記各HHV−6より抽出したDNAをサ
ンプルとしてPCRを行った。プライマーとしては配列
番号1に示される配列を含む領域の増幅には5’−GA
GGAATCTTCTATCGAATCTATCC−
3’及び5’−TTCCCTGGCACATCTGGA
GAAGGAG−3’の組み合わせを用いた。又配列番
号2に示される配列を含む領域の増幅には、実施例1で
示したプライマーのAとCの組み合わせを用いて行っ
た。PCRは実施例1で示した方法に従って行った。 【0046】PCRによって増幅した産物は、1%アガ
ロースゲル内で電気泳動した後、DNAをナイロン膜
(Hybond N+;Amersham製)に転写し
た。転写した膜を2%SDS、3%スキムミルクを含む
6×SSPE(0.9M NaCl,6mM EDT
A,0.06Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.
4))中65℃、6時間行った後、同液中に32P標識し
たプローブを加えた液と交換し、更に65℃、16時間
ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーシ
ョン終了後、膜を2×SSPEで室温20分洗浄し、更
に2×SSPEで65℃、20分洗浄を2回、0.2×
SSPEで65℃、20分洗浄を2回行った。洗浄後の
膜をX線フィルムとコンタクトし、フィルムを感光させ
ることによってプローブのハイブリダイゼーションの有
無を確認した。 【0047】図4には、配列番号1に示される配列を含
む領域のPCR産物のアガロースゲル電気泳動後のエチ
ジウムブロマイド染色図(A)及び該配列をもとに作製
したDNAプローブとのハイブリダイゼーションの結果
(B)を示した。 【0048】図5には、配列番号2に示される配列を含
む領域のPCR産物のアガロースゲル電気泳動後のエチ
ジウムブロマイド染色図(A)及び該配列をもとに作製
したDNAプローブとのハイブリダイゼーションの結果
(B)を示した。 【0049】何れの場合においても、配列番号1及び2
に示される各配列をもとに作製したプローブは共に、タ
イプBに属するHST株のDNAとのみハイブリダイズ
し、タイプAであるU1102株のDNAとはハイブリ
ダイズしなかった。従って、これら配列番号1及び2に
示されるDNA配列をプローブとして利用することによ
り、HHV−6のタイピングが可能である。 【0050】実施例4a)DNAの抽出HHV−6とし
てタイプAであることが知られているU1102株およ
びタイプBであることが知られているHST株、またタ
イプ不明の臨床分離株1及び2の感染ヒト末梢血単核球
培養細胞よりDNAを抽出した。DNAの抽出は実施例
1に述べた方法に準拠して行った。 【0051】b)PCRによるDNAの増幅及びドット
ブロット上記各HHV−6より抽出したDNAをサンプ
ルとしてPCRを行った。PCRは実施例1で示した方
法に従って行い、またプライマーとしては実施例1で示
したプライマーのAとCの組み合わせを用いて行った。
これらのPCR産物をナイロンメンブレンフィルター
(Amersham Hybond N+)に0.5μ
lずつ載せ、0.4N NaClで20分間処理した
後、6×SSPEで中和した。 【0052】c)アルカリフォスファターゼ標識DNA
プローブの調製HHV−6タイプ特異的酵素標識プロー
ブとしては、5’−GAACTCCATCAGCGGC
CTCCAG−3’を有するオリゴヌクレオチドをタイ
プAに特異的なプローブ、5’−TAAATCCATT
ACTGGCCTTGAA−3’を有するオリゴヌクレ
オチドをタイプBに特異的なプローブとして用いるた
め、これらをApplied Biosystems社
製のDNA synthesizer(381A)を用
いて合成し、アミノリンクIIを用いてその5’末端にア
ミノ基を付加した。アミノ基を付加したDNAをEMC
S[N−(ε−Maleimidocaproylox
y)succinimide]を用いてマレイミド化
し、一方アルカリフォスファターゼは2−Iminot
hiolaneを用いてSH基を付加した。両者を混合
反応させることによりアルカリフォスファターゼ標識D
NAプローブを作製した。 【0053】d)ハイブリダイゼーションb)で作製し
たメンブレンフィルターを2×SSPE、0.1%SD
Sで室温で5分間洗浄、更に2×SSPE、0.1%S
DSを用いて40℃、5分間の洗浄を3回行った。ハイ
ブリダイゼーション溶液(5×SSPE、5×Denh
ardt’s、0.5%SDS、1%Casein)を
用いて50℃、30分間ブロッキングを行い、次にc)
で調製した酵素標識プローブ2種のうち1種を加え(ア
ルカリフォスファターゼの最終濃度0.1μg/m
l)、50℃で1時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。ハイブリダイゼーション終了後1×SSC、1%S
DSを用いて40℃で5分間の洗浄を2回、1×SS
C、1% Triton X−100を用いて40℃で
5分間の洗浄を2回、1×SSCを用いて室温で5分間
の洗浄を2回行った。アルカリフォスファターゼ基質反
応液(0.3M Tris−HCl 、0.1M NaCl、50mM MgCl2
(pH 9.8))を加え、室温で5分間インキュベートした
後、NTB溶液[70% N’N−Dimethylf
ormamideにNTB(Nitro Tetraz
olium Blue)を75mg/mlの濃度に溶解
したもの]を33μl/7.5ml、BCIP溶液[10
0 %N’N−DimethylformamideにB
CIP(5−bromo−4−chloro−3−In
dorylphosphateを50mg/mlの濃度
に溶解したもの]を25μl/7.5ml加え、37℃
で2時間反応させた。 【0054】結果を図6に示した。図6のAではタイプ
Aに特異的なプローブをBではタイプBに特異的なプロ
ーブを用いた。またPCR産物の1はU1102株、2
はHST株、3は臨床分離株1、4は臨床分離株2を示
している。図に示す通り、タイプA特異的プローブはU
1102株のPCR産物とハイブリダイズするが、HS
T株とはハイブリダイズせず、またタイプB特異的プロ
ーブはHST株とハイブリダイズするがU1102株と
はハイブリダイズしなかった。これらのプローブを用い
ることにより、PCR産物をサザンブロットすることな
く、ドットブロットを行うことによって簡便かつ迅速に
タイプを識別することが可能である。また、この方法に
より、臨床分離株1はタイプA、臨床分離株2はタイプ
Bであることが判明した。 【0055】 【発明の効果】HHV−6のタイピングは、種々の疾患
との関連で興味深いものと考えられるが、これまでその
タイピングには数週間以上の時間を必要としていた。本
発明によって臨床検体からHHV−6 DNAの存在の
有無を判定することができるばかりか、そのタイピング
を簡便且つ迅速に行うことが可能となり、臨床医学、基
礎医学等の分野で極めて有効な研究手段が提供されたも
のと考えられる。 【0056】 【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KOKUSAISIYAKU <120>DETECTION OF HUMAN HERPES VIRUS 6 TYPE (HHV-6) DNA AND DISCRIMINATI ON OF SUB-TYPE <130> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 108 <212> DNA <400> 1 aatgtagaat atttaaaata catggaagta caatctccta ctgataataa tactcccacc 60 ccatcaaaga acaatgaatc cccaacaaga caaaaactta caaacata 108 <210> 2 <211> 228 <212> DNA <400> 2 ggtctgaaca acaagacatt ttgcttacag ccccgatcaa aggtcacaga caaaagaaag 60 gattcaggaa aaaggttcta actccaagtg taccgaaacg cttccttgta tgacctttac 120 cgactcagca actcctgtca aaagtcatga tgcaattcag gatactttaa atccagaaag 180 taaaatagac aaagaattgg gagctgtaga aagtctagtg aatctatg 228
T株ゲノム上の新規108 bp及び228 bp ヌクレオ
チド配列部位を示す。 【図2】タイプA及びBのいずれかに属する13種類の
HHV−6株と2種類のHHV−7株について、各ウイ
ルスDNAのPCR増幅後、アガロースゲル電気泳動に
掛けて得られた、サイズによりサブタイプの識別が可能
であることを示す泳動写真である。 【図3】4種類のプライマーセットを用いてHST株と
U1102株のDNAの各PCRを実施した後、アガロ
ースゲル電気泳動に掛けて得られた、サイズによりサブ
タイプの識別が可能であることを示す泳動写真である。 【図4】配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含む
領域のPCR産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジ
ウムブロマイド染色図(A)、及び、該配列をもとにし
て作製したDNAプローブとのハイブリダイゼーション
の結果(B)を示す写真である。 【図5】配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含む
領域のPCR産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジ
ウムブロマイド染色図(A)、及び、該配列をもとにし
て作製したDNAプローブとのハイブリダイゼーション
の結果(B)を示す写真である。 【図6】タイプAに特異的なプローブ(A)又はタイプ
Bに特異的なプローブ(B)を用いるハイブリダイゼー
ションによってサブタイプ識別を実施した結果を示すド
ットブロット写真である。 【符号の説明】 1 U1102株、 2 HST株、 3 臨床分離株 4 臨床分離株
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項1】 下記のヌクレオチド配列:(1) 5’−
TGATGGCACACAACAAAGAGATGTC
CAATCCTGACATCTCCA−3’(2) 5’
−AAGCAGATGAATCAAATCTT−3’
(3) 5’−ATGTGAATTGTAAAAATTT
AATTACTGCCGCCAAAAAT−3’(4)
5’−TGAATTTTCATGGCAA−3’(5)
5’−TTATGATGATACTGGTTT−3’
(6) 5’−ATTAAACCTTTAACT−3’
(7) 5’−AGTCTTCCATCTGTGAT−
3’(8) 5’−ATATTCAGAGGAATCTT
CTATCGAATCTATCCATGAAGATGA
TGAC−3’(9) 5’−TTCTCCAGATGT
GCCAGGGAAATCC−3’(10) 5’−AAA
ATGTATCCA−3’(11) 5’−ACTCCTT
CTCCAGA−3’(12) 5’−GTGCCAGGG
AAATCCAAA−3’(13) 5’−AGCAGAC
AG−3’(14) 5’−CCCTAACTGTGTA−
3’(15) 5’−GTACAGCCTCAGTGACA
GATCTGGGCGGCCCT−3’(16) 5’−C
TCCTTCTCCAGATGTGCCAGGGAA−
3’(17) 5’−ATCATTTCTGATATTAA
AG−3’(18) 5’−GAGTGATCAGTTTC
ATAACCAAA−3’(19) 5’−TTTCATC
ATTGTTATCGCTTTCACTCTCATA−
3’(20) 5’−TGCAATGTAATCA−3’(2
1) 5’−TATTCATATGAATGTTATTA
GTTCT−3’(22) 5’−TTGCTAAATGG
TGTATTCTCAT−3’(23) 5’−GTGAC
CTCTGGTGGTGAA−3’若しくは該ヌクレオ
チド配列に相補的なヌクレオチド配列、並びに配列番号
1または2に示されるヌクレオチド配列若しくは該ヌク
レオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又はその部
分配列からなる群から選択される少なくとも1つのヌク
レオチド配列をプローブとして用いるDNAハイブリダ
イゼーションによって、ヒトヘルペスウイルス6型DN
Aを検出する方法。
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- 2002-07-26 JP JP2002218713A patent/JP3833152B2/ja not_active Expired - Fee Related
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JP2007064926A (ja) * | 2005-09-02 | 2007-03-15 | Nipro Corp | 試験片およびその製造方法 |
CN111500788A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-08-07 | 领航基因科技(杭州)有限公司 | 用于人类疱疹病毒感染检测的试剂盒及其检测方法 |
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