CN113373267B - 检测血源性感染性病毒的多重荧光定量rt-pcr试剂盒 - Google Patents
检测血源性感染性病毒的多重荧光定量rt-pcr试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供检测血源性感染性病毒的多重荧光定量RT‑PCR试剂盒，包含定量RT‑PCR反应液、酶Mix液、引物探针Mix液、标准品(巨细胞病毒、Epstein‑Barr病毒、单纯疱疹病毒及RNase P标准品)、阳性和阴性对照品。引物探针包含四组引物和相应的不同荧光标记的探针。本发明根据巨细胞病毒、Epstein‑Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P的高度保守的蛋白分别设计高特异性的引物探针，通过一个PCR反应从血清样本中同时检测出是否有这些病毒的存在。本发明简便快捷、节约成本、重复性好，可有效、快速筛查血源性感染性病毒。可应用于血源性感染性病毒的快速筛查及血源性感染性病毒流行病学的研究。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及检测血源性感染性病毒的多重荧光定量RT-PCR试剂盒，是一种一步法多重实时荧光定量RT-PCR在同一个反应管内检测血清标本中巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)的核酸检测方法，可应用于血源性感染性病毒的快速筛查及血源性感染性病毒流行病学的研究。
背景技术
过去的几十年中，人们越来越意识到感染性病原对血液安全的严重威胁，经输血传播的血源性感染性病原成为影响临床安全用血的主要关注点，而经输血传播的血源性感染性病原主要经由携带病原的献血者捐献的血液传播，因此血源性感染性病原的筛查策略是确保临床安全用血的重要措施。美国血库协会(AABB)指南显示：经输血传播的感染性病原有70余种，其中病毒(50多种)和细菌(10种)就有60多种；常见的病原包括乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV-1/2)、人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV-1/2)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类疱疹病毒8型(HHV-8)、登革病毒(DENV-1/2/3/4)、戊型肝炎病毒(HEV)、禽流感H7N9病毒、埃博拉病毒(EBOV)、***(TP)和疟疾等。我国实施的血液制品病原筛查包括：TP、HIV-1/2、HBV和HCV四种病原。四种病原的筛查虽然能有效地保障我国及全球多数国家和地区的临床用血安全，但随着新(突)发病原和未检测到的病原的流行趋势明显增加，同时国际合作与交流日益频繁，近年来输入性血源性感染性病原不断发生，这增加了病原的传播风险，严重威胁临床安全用血，为更好地保障临床安全用血，建立符合新时代发展要求的筛查项目已迫在眉睫。
当前，我国对血液制品的病原筛查主要是对TP、HIV-1/2、HBV和HCV四种病原采取ELISA和单重或三重的病原核酸检测。核酸检测技术直接，检测微量的感染性病原特异性和灵敏度高，但由于昂贵的检测费用及操作时间长等因素严重影响该技术的广泛应用。而实时荧光定量PCR技术以其全封闭检测、单管扩增实时定量、简便快捷、节约成本、重复性好等优势，并具有高特异性与敏感性，较于普通PCR检测更加优化，可作为一种血源性感染性病原筛查的快速、有效的检测手段。
发明内容
本发明的目的是提供检测血源性感染性病毒的多重荧光定量RT-PCR试剂盒，是一种用于血源性感染病毒(巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒)检测的一步法多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本试剂盒包含定量RT-PCR反应液、酶Mix液、引物探针Mix液、标准品(巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P)、阳性对照品(巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P)、阴性对照品。盒体设有容器孔，分别放置定量RT-PCR反应液管、酶Mix液管、引物探针Mix液管、标准品管(巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P)、阳性对照品管(巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P)、阴性对照品管。
其中定量RT-PCR反应液管包含有PCR反应缓冲液管(含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等)、酶Mix液管(含耐热TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶等)、引物探针Mix液管包含四组引物和相应的四种不同荧光标记的探针，引物探针Mix液管为棕色管。阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，阳性对照为巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P的阳性质粒样品。
多重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下：上游引物CMV-F:5’-CTGGGCATAAGCCATAATCTCATC-3’
下游引物CMV-R:5’-CAGCCTTCCCTAAGACCACC-3’
特异性探针CMV-P:5’-FAM-TGCCGCCATGGCCTGACTGCAGCCA-BHQ1-3’
上游引物EBV-F:5’-CCAAGAAGGTGGCCCAGAT-3’
下游引物EBV-R:5-TCCAGTGCTTGGGCCTTC-3’
特异性探针EBV-P:5’-VIC-TGAGCCTGACGTGCCCCCGGGAGCG-BHQ1-3’
上游引物HSV-F:5’-AGAGGGACATCCAGGACTTTG-3’
下游引物HSV-R：5’-CTTGTAATACACCGTCAGGTGG-3’
特异性探针HSV-P:5’-CY5-ACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGC-BHQ3-3’
上游引物RNase P-F:5’-GATTTGGACCTGCGAGCG-3’
下游引物RNase P-R：5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’
特异性探针RNase P-P:5’-ROX-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3’。
其中巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒及RNase P的特异性探针分别采用FAM、VIC、CY5和ROX四种不同荧光进行标记。
上述标准品包括巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒及RNaseP标准品，其保守区基因序列如下：
巨细胞病毒标准品序列为：
AATCTTAAAGATTTTCTGGGCATAAGACATAATCTCATCAGGAGAGCACTGAGGCAAGTTCTGCAATGCCGCCATGGCCTGACTGCAGCCATTGGTGGTCTTAGGGAAGGCTGAGTTCTTGGTAAAGA。
Epstein-Barr病毒标准品序列为：
TTATTTTGAATACCACCAAGAAGGTGGCCCAGATGGTGAGCCTGACGTGCCCCCGGGAGCGATAGAGCAGGGCCCCGCAGATGACCCAGGAGAAGGCCCAAGCACTGGACCCCGGGGTCAGGGT。
单纯疱疹病毒标准品序列为：
GCATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCAGGACTTTGTCCTCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGTACACCAACAAGCGCCTGGCCCACCTGACGGTGTATTACAAGCTCATGGCCCGCCGC。
RNase P标准品序列为：
ATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAG。
本发明提供的试剂盒需保存于-20℃，并减少反复冻融次数；对引物与探针Mix液进行避光保存。
本发明的另一个目的是提供所述多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒在巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒的核酸检测以及样本采集状态和核酸提取情况的判定中应用。
本发明试剂盒的使用方法：在每次荧光定量检测中均应设有阳性对照和阴性对照。标准品用Invitrogen公司的TE Buffer(货号：AM9849)稀释为1×102-1×107copies/ml。
样本核酸的提取：取200ul血清样本进行提取。核酸提取采用Geneaid公司的ViralNucleic Acid extraction Kit II，按照试剂盒内说明书进行提取操作,取10ul终产物样品核酸作为后续模板。
核酸的检测：取10ul已抽提的待测样品核酸作为模板。反应总体积为50μl，其中荧光定量PCR Mix 25μl，Taq酶Mix 2μl，引物探针Mix(20μmol/L，包含四组引物与荧光探针)共12μl，模板10μl，剩余加水补足至终体积50μl。在ABI QuantStudio5荧光定量PCR仪上检测，反应程序为：反转录42℃,5min；95℃10s热启动，然后95℃5s，55℃40s，在55℃进行多重荧光检测，共进行40个循环。
实验结果判断：①样本采集合格RNase P、巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒检测的各自CT值对应相应的荧光标记的探针，样本采集合格及核酸提取成功，则RNaseP均为阳性；其余检测样本CT值为0、40或undetermined时，报告为阴性。②检测样本巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒的CT值≤35时，报告为阳性③检测样本CT值≥35且<40的样本，建议复检，复检结果CT值＜38者，依据②的判断标准报告为相应病毒阳性。根据所获得的标准曲线，计算待测标本巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒的病毒拷贝数(copies/ml)。
本研究针对巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒设计引物探针；同时以核酶RNase P作为内参。采用单管一步法多重实时荧光定量RT-PCR，能够单管同时检测出巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒，不仅显著降低检测成本，更能获取丰富的检测信息，内参的引入可判断样本核酸质量，协助检测结果的判断。另外，多重实时荧光定量RT-PCR同样具有极高的特异性和灵敏度。
本发明的有益之处在于采用高特异性高灵敏度的一步法实时荧光定量RT-PCR技术，设计巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒高度特异的引物和荧光标记探针，引入保守的内参基因RNase P，开发一种用于巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒检测及样本采集和核酸提取情况的判定的多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该发明是通过一个PCR反应，可以从血清样本中同时检测出是否有巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒的存在，较于单重荧光定量PCR方法更简便快捷、节约成本、重复性好。对待检病毒进行全封闭检测、单管扩增实时定量，根据病毒感染的拷贝数，可有效、快速地筛查血源性感染性病毒。这一技术可应用于血源性感染性病毒的快速筛查及血源性感染性病毒流行病学的研究。
附图说明
图1为本试剂盒结构示意图，其中1为荧光定量PCR Mix管，2为Taq酶Mix管，3为引物探针Mix管，4为阴性对照管，5为标准品管(5-1巨细胞病毒、5-2Epstein-Barr病毒、5-3单纯疱疹病毒、5-4RNase P，共4管)，6为阳性对照管(6-1巨细胞病毒、6-2Epstein-Barr病毒、6-3单纯疱疹病毒、6-4RNase P，共4管)。
图2为本试剂盒用于检测巨细胞病毒阳性患者血清标本的实例。
图3为本试剂盒用于检测Epstein-Barr病毒阳性患者血清标本的实例。
图4为本试剂盒用于检测单纯疱疹病毒阳性患者血清标本的实例。
图5为本试剂盒检测巨细胞病毒的灵敏度，从左到右(1-7)依次为108、107、106、105、104、103、102copies/ml。
图6为本试剂盒巨细胞病毒标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图，其中Lane Marker为DL2000 Marker，Lane 1为阴性对照，Lane 2-8分别为102、103、104、105、106、107、108实时荧光定量RT-PCR产物。
图7为本试剂盒巨细胞病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
图8为本试剂盒检测Epstein-Barr病毒的灵敏度，从左到右(1-7)依次为108、107、106、105、104、103、102copies/ml。
图9为本试剂盒Epstein-Barr病毒标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图，其中Lane Marker为DL2000 Marker，Lane 1为阴性对照，Lane 2-8分别为102、103、104、105、106、107、108实时荧光定量RT-PCR产物。
图10为本试剂盒Epstein-Barr病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
图11为本试剂盒检测单纯疱疹病毒的灵敏度，从左到右(1-7)依次为108、107、106、105、104、103、102copies/ml。
图12为本试剂盒单纯疱疹病毒标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图，其中Lane Marker为DL2000 Marker，Lane 1为阴性对照，Lane 2-8分别为102、103、104、105、106、107、108实时荧光定量RT-PCR产物。
图13为本试剂盒单纯疱疹病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
图14为本试剂盒检测RNase P的灵敏度，从左到右(1-7)依次为108、107、106、105、104、103、102copies/ml。
图15为本试剂盒RNase P标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图，其中Lane M为DL2000 Marker，Lane 1为阴性对照，Lane 2-8分别为102、103、104、105、106、107、108实时荧光定量RT-PCR产物。
图16为本试剂盒RNase P标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
图17巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒阳性样本混合检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，以下实施例仅限于说明本发明而不限制本发明的范围。
实施例1
一种检测血源性感染性病毒的多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，本试剂盒包含定量RT-PCR反应液、酶Mix液、引物探针Mix液、标准品(巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P)、阳性对照品(巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNaseP)、阴性对照品。盒体设有容器孔，分别放置定量RT-PCR反应液管、酶Mix液管、引物探针Mix液管、标准品管(巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P)、阳性对照品管(巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P)、阴性对照品管。
参见图1，本试剂盒包装内设有容器孔，用于放置对应试剂盒组分：定量RT-PCR反应液管(标号1)、酶混合液管(标号2)、引物探针混合液管(标号3)、阴性对照品管(标号4)、标准品管(标号5)(包括5-1巨细胞病毒、5-2Epstein-Barr病毒、5-3单纯疱疹病毒、5-4RNase P标准品，共4管)、阳性对照品管(标号6)(包括6-1巨细胞病毒、6-2Epstein-Barr病毒、6-3单纯疱疹病毒、6-4RNase P阳性对照品，共4管)。试剂盒包含：定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品(巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNaseP)、阳性对照品(巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P)、阴性对照品。
实施例2
1材料与方法
1.1血清标本与病毒核酸：
巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒的临床样本来源于浙江大学医学院附属第一医院及浙江省内其他几家医院巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒核酸阳性患者血清标本。
另外，其他疱疹病毒如VZV、HHV-6、HHV-7、HHV-8阳性标本由传染病诊治国家重点实验室提供。
1.2引物与探针
从NCBI基因库下载了巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒涵盖国内外的多条基因序列。利用DNAman软件对其进行了同源性比较，确定以上病毒基因组的保守区。使用Primer Express 3.0软件在其保守区设计高度特异性的引物与Taqman探针，引物和探针序列均通过Blast验证，具有较好特异性。
引物和探针序列如下：
上游引物CMV-F:5’-CTGGGCATAAGCCATAATCTCATC-3’
下游引物CMV-R:5’-CAGCCTTCCCTAAGACCACC-3’
特异性探针CMV-P:5’-FAM-TGCCGCCATGGCCTGACTGCAGCCA-BHQ1-3’
上游引物EBV-F:5’-CCAAGAAGGTGGCCCAGAT-3’
下游引物EBV-R:5-TCCAGTGCTTGGGCCTTC-3’
特异性探针EBV-P:5’-VIC-TGAGCCTGACGTGCCCCCGGGAGCG-BHQ1-3’
上游引物HSV-F:5’-AGAGGGACATCCAGGACTTTG-3’
下游引物HSV-R：5’-CTTGTAATACACCGTCAGGTGG-3’
特异性探针HSV-P:5’-CY5-ACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGC-BHQ3-3’
上游引物RNase P-F:5’-GATTTGGACCTGCGAGCG-3’
下游引物RNase P-R：5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’
特异性探针RNase P-P:5’-ROX-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3’。
其中，RNase P的探针引物引自J.Clin.Microbiol.2005,43(4):1851。以上引物和探针委托生工生物工程(上海)有限公司合成。
1.3病毒核酸的提取与标准品定量标准：
样本核酸的提取：吸取200ul血清标本于EP管中，进行核酸提取。核酸提取采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acid extraction KitII，按照试剂盒说明书进行提取,取10ul已抽提的待测样品核酸作为模板。
合成各基因标准品片段，将其连接到质粒载体pMDTM19-T Simple Vector(TaKaRa公司)上。转化后培养。鉴定后提取质粒DNA，利用NanoDrop ND-2000Spectrophotometer测定质粒DNA浓度，确定DNA的拷贝数，作为标准品定量母液。根据实验需要，将标准品定量母液稀释至所需最高浓度，并做十倍稀释至最低浓度，-20℃保存备用。
1.4多重实时荧光定量RT-PCR反应体系和条件的优化：
核酸的检测：取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。反应总体积为50μl，其中定量RT-PCR反应液25μl，酶混合液2μl，引物探针混合液(20μmol/L，包含四组特异性引物和相应的四种荧光探针)共12μl，模板10μl，加水补足至50μl。在ABI QuantStudio5荧光定量PCR仪(或者其他四色荧光及以上的PCR仪)上进行检测，反应参数为：反转录42℃,5min；95℃10s热启动，然后95℃5s，55℃40s，在55℃进行多重荧光检测，共进行40个循环。
结果判断：选择荧光检测通道FAM、VIC、CY5、ROX，荧光基线选取3-15个循环的荧光信号的平均值，阈值设定以阈值线刚好超过阴性对照品的最高点。①样本采集合格RNaseP、巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒检测的各自CT值对应相应的荧光标记的探针。样本采集合格、核酸提取成功，则RNase P检测为阳性；当检测样本CT值为40、0和无数值时，报告为阴性。②当检测样本的巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒的CT值≤35时，报告为阳性。③当检测样本CT值≥35且小于40的样本，建议复检，复检结果CT值＜38者，依据②的判断标准报告为相应病毒阳性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，采用矩阵法筛选引物和探针的最合适浓度，引物浓度从1～20μM，探针浓度从1～20μM，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值(ΔRn)选择最合适引物和探针浓度。
1.5多重实时荧光定量RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验
选择巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒阳性标本(均来自巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒已验证为核酸阳性的血清)和其他疱疹病毒如VZV、HHV-6、HHV-7、HHV-8阳性标本，用多重实时荧光定量RT-PCR方法验证方法的特异性；对已标定拷贝数(copies/ml)的巨细胞病毒合成片段(107copies/ml)、Epstein-Barr病毒合成片段(107copies/ml)、单纯疱疹病毒合成片段(107copies/ml)和RNase P合成片段(107copies/ml)分别稀释后，平行实验进行荧光定量PCR反应，验证方法的灵敏度。此外，对每一个指定浓度的阳性标准品作3次重复检测，对实验所得的Ct值计算其标准差与变异系数，验证方法的重复性。
2结果
2.1多重实时荧光定量RT-PCR反应体系及条件
核酸的检测：取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。反应总体积为50μl，其中定量RT-PCR反应液25μl，酶混合液2μl，引物探针混合液(20μmol/L，包含四组特异性引物和相应的四种荧光探针)共12μl，模板10μl，加水补足至50μl。在ABI QuantStudio5荧光定量PCR仪(或者其他四色荧光及以上的PCR仪)上进行检测，反应参数为：反转录42℃,5min；95℃10s热启动，然后95℃5s，55℃40s，在55℃进行多重荧光定量PCR检测，共进行40个循环。
2.2特异性试验
本发明建立的一步法多重荧光定量RT-PCR方法对巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒具有良好的特异性，能完全检出近期采集的临床阳性标本。本发明中的多重引物探针与其他和其他疱疹病毒如VZV、HHV-6、HHV-7、HHV-8阳性标本等均无交叉反应。该方法检出血清标本的巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒阳性结果参见图2、图3、图4，其中巨细胞病毒的Ct值为25.45、Epstein-Barr病毒的Ct值为24.23、单纯疱疹病毒的Ct值为26.37。
2.3敏感性试验
对巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P敏感性进行检测，将已标定拷贝数(copies/ml)的巨细胞病毒(107copies/ml)、Epstein-Barr病毒合成片段(107copies/ml)、单纯疱疹病毒的合成片段(107copies/ml)和RNase P合成片段(107copies/ml)分别作十倍梯度稀释后，用本试剂盒进行检测，检测结果显示该方法检测敏感性分别达到102、102、102和102copies/ml。结果参见图5、图8、图11、图14。另外，取实时荧光定量RT-PCR产物5μl，进行凝胶电泳(120V 20min)，结束后用凝胶成像***检测电泳结果。结果参见图6、图9、图12、图15。其中Lane M为DL2000 Marker，Lane 1-6分别为片段(108copies/ml)十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照。对巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒阳性样本混合检测，病原与内参检测结果显示可以实现单管同时检测并区分上述病原体(参见图17)。
2.4重复性试验
分别取巨细胞病毒合成片段(终浓度为106copies/ml)、Epstein-Barr病毒合成片段(106copies/ml)单纯疱疹病毒合成片段(106copies/ml)和RNase P合成片段(106copies/ml)，按10倍梯度稀释为105与104，对106、105、104样本分别作3次重复检测，计算其变异系数与标准差。结果显示，不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.03～0.31之间，变异系数均低于1.19％，具有较好的重复性(结果见表1)。
表1多重实时荧光定量RT-PCR检测合成核酸的重复性试验
实施例3
采用本试剂盒对临床样本的检测主要采集的临床样本主要来源于2021年5月至2021年7月间术前四项检测标本共200份。采用本方法中的多重实时荧光定量RT-PCR对采集的标本进行检测，结果如下：术前四项检测标本共200份，筛查出巨细胞病毒阳性标本2份，EB病毒阳性标本2份，单纯疱疹病毒阳性标本0份，所有内参RNase P基因的检测结果均为阳性。本试剂盒检测阳性结果与商用试剂盒(之江生物)检测阳性结果符合度达100％。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 检测血源性感染性病毒的多重荧光定量RT-PCR试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 1
ctgggcataa gccataatct catc 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 2
cagccttccc taagaccacc 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 3
tgccgccatg gcctgactgc agcca 25
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 4
ccaagaaggt ggcccagat 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 5
tccagtgctt gggccttc 18
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 6
tgagcctgac gtgcccccgg gagcg 25
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 7
gatttggacc tgcgagcg 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 8
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 9
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 10
agagggacat ccaggacttt g 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 11
cttgtaatac accgtcaggt gg 22
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 12
accgccgaac tgagcagaca cccgc 25
Claims (5)
1.检测血源性感染性病毒的多重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含定量RT-PCR反应液、酶Mix液、引物探针Mix液、标准品、阳性对照品、阴性对照品；其中定量RT-PCR反应液包含有PCR反应缓冲液、酶Mix液，引物探针Mix液包含四组引物和相应的四种不同荧光标记的探针；荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下：
上游引物CMV-F:5’-CTGGGCATAAGCCATAATCTCATC-3’
下游引物CMV-R:5’-CAGCCTTCCCTAAGACCACC-3’
特异性探针CMV-P:5’-FAM-TGCCGCCATGGCCTGACTGCAGCCA-BHQ1-3’
上游引物EBV-F:5’-CCAAGAAGGTGGCCCAGAT-3’
下游引物EBV-R:5-TCCAGTGCTTGGGCCTTC-3’
特异性探针EBV-P:5’-VIC-TGAGCCTGACGTGCCCCCGGGAGCG-BHQ1-3’
上游引物HSV-F:5’-AGAGGGACATCCAGGACTTTG-3’
下游引物HSV-R：5’-CTTGTAATACACCGTCAGGTGG-3’
特异性探针HSV-P:5’-CY5-ACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGC-BHQ3-3’
上游引物RNase P-F:5’-GATTTGGACCTGCGAGCG-3’
下游引物RNase P-R：5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’
特异性探针RNase P-P:5’-ROX-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3’
所述标准品包括巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒及RNase P标准品，其保守区基因序列如下：
巨细胞病毒标准品序列为：
AATCTTAAAGATTTTCTGGGCATAAGACATAATCTCATCAGGAGAGCACTGAGGCAAGTTCTGCAATGCCGCCATGGCCTGACTGCAGCCATTGGTGGTCTTAGGGAAGGCTGAGTTCTTGGTAAAGA
Epstein-Barr病毒标准品序列为：
TTATTTTGAATACCACCAAGAAGGTGGCCCAGATGGTGAGCCTGACGTGCCCCCGGGAGCGATAGAGCAGGGCCCCGCAGATGACCCAGGAGAAGGCCCAAGCACTGGACCCCGGGGTCAGGGT
单纯疱疹病毒标准品序列为：
GCATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCAGGACTTTGTCCTCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGTACACCAACAAGCGCCTGGCCCACCTGACGGTGTATTACAAGCTCATGGCCCGCCGC
RNase P标准品序列为：
ATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAG。
2.根据权利要求1所述的多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、RNase P的阳性质粒样品。
3.根据权利要求1所述的多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，PCR反应缓冲液管含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶Mix液含耐热TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶。
4.根据权利要求1所述的多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，引物探针混合液管为棕色管。
5.根据权利要求1所述的多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒保存于-20℃。
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