CN115044712B - 一种适于ont测序平台的、用于感染样本中疱疹病毒检测的引物组及应用 - Google Patents

一种适于ont测序平台的、用于感染样本中疱疹病毒检测的引物组及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115044712B
CN115044712B CN202210818263.8A CN202210818263A CN115044712B CN 115044712 B CN115044712 B CN 115044712B CN 202210818263 A CN202210818263 A CN 202210818263A CN 115044712 B CN115044712 B CN 115044712B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
seq
herpesviruses
detection
species
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210818263.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115044712A (zh
Inventor
顾菊
李振中
周水莲
潘吾思
程彪
戴岩
李诗濛
任用
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Xiansheng Medical Examination Laboratory Co ltd
Nanjing Xiansheng Medical Laboratory Co ltd
Jiangsu Xiansheng Medical Diagnosis Co ltd
Original Assignee
Beijing Xiansheng Medical Examination Laboratory Co ltd
Nanjing Xiansheng Medical Laboratory Co ltd
Jiangsu Xiansheng Medical Diagnosis Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Xiansheng Medical Examination Laboratory Co ltd, Nanjing Xiansheng Medical Laboratory Co ltd, Jiangsu Xiansheng Medical Diagnosis Co ltd filed Critical Beijing Xiansheng Medical Examination Laboratory Co ltd
Priority to CN202210818263.8A priority Critical patent/CN115044712B/zh
Publication of CN115044712A publication Critical patent/CN115044712A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115044712B publication Critical patent/CN115044712B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请涉及生物信息学技术领域，具体提供一种适于ONT测序平台的、用于感染样本中疱疹病毒检测的靶向富集引物组及其应用。本申请根据CMV，EBV，HSV1、HSV2、VZV人源疱疹病毒的基因组序列，基于生信算法设计引物和靶向区段，本发明引物兼备种属间特异性和种属内兼容性，能快速、高效、全面的从呼吸道感染体征和症状的患者中识别并鉴别各类疱疹病毒，具有高上靶率、灵敏度和准确性。

Description

一种适于ONT测序平台的、用于感染样本中疱疹病毒检测的引 物组及应用
技术领域
本发明属于生物信息学分析技术领域，涉及用于一种检测人疱疹病毒的引物组及应用，特别是针对人疱疹病毒的扩增引物及其应用。
背景技术
疱疹病毒(herpesviruses)是在世界范围内广泛传播的一大类双链DNA病毒，包含病毒的种类众多，能够感染包括人类在内的多种哺乳动物。疱疹病毒在感染人体后能够引发多种疾病，包括口腔和生殖器疱疹、水痘、带状疱疹，严重的甚至包括多种免疫***疾病、脑炎以及癌症等。疱疹病毒在世界范围内广泛传播。
疱疹病毒有着独特的潜伏-再活化机制，它可以关闭其大部分活动状态的基因，只在特定的潜伏阶段打开特定的少数基因，并在合适的条件下恢复活性，重新进入增殖过程。这种潜伏-再活化机制使得疱疹病毒感染产生的疾病难以完全治愈，通常患者会终生携带病毒。因此，疱疹病毒感染的鉴别诊断显然具有极其重要的生物学和医学意义。
能感染的人疱疹病毒主要有8种，其中HSV1、HSV2，VZV，CMV,EBV是人群中极为普遍的疱疹病毒。HSV-1型主要引皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染。主要侵犯躯体腰以上部位,可引起口腔、唇、眼、脑及腰以上部位感染,多为隐性感染,并不表现出症状。HSV-1主要通过直接接触传播，包括接吻、接触带有HSV的病人的口腔和呼吸道分泌物。HSV-2则侵及躯体腰以下部位,主要是生殖器,它是引起性病的主要病原体之一。性生活中一定要使用安全套，避免传染给对方，而一般的接触是不是发生传染的。生殖器疱疹的病原体90％为Ⅱ型疱疹病毒，仅10％为Ⅰ型疱疹病毒。经性器官接触后，潜伏约2-20天(平均6天)，有免疫缺陷或免疫功能不全的人，如应用免疫抑制剂、肾移植、严重烧伤、重度营养不良、血液淋巴***恶性肿瘤病人等感染后症状加重，可出现疱疹性湿疹、复发性角膜溃疡，甚至全身播散性疱疹而致命。人类疱疹病毒3型 (VZV)引起两种传染病，水痘或带状疱疹。水痘是具有高度传染性的儿童常见疾病，好发于2～6岁，传染源主要是患者，患者急性期水痘内容物及呼吸道分泌物内均含有病毒。在儿童初次感染恢复后病毒潜伏在体内，而潜伏体内的病毒受到某些刺激后 (如：劳累，炎热，寒冷，X射线照射、紧张、焦虑等)复发引起带状疱疹，多见于成年人和老年人。EBV主要通过唾液传播。无症状感染多发生在幼儿，3～5岁幼儿90％以上曾感染EB病毒，90％以上的成人都有病毒抗体。EB病毒是传染性单核细胞增多症的病原体，此外EB病毒与鼻咽癌、儿童淋巴瘤的发生有密切相关性，被列为可能致癌的人类肿瘤病毒之一。CMV在人群中感染非常广泛，中国成人感染率达95％以上，通常呈隐性感染，多数感染者无临床症状，但在一定条件下侵袭多个器官和***可产生严重疾病。病毒可侵入肺、肝、肾、唾液腺、乳腺其他腺体。诱因与免疫低下(大量激素应用)、焦虑、过劳、紧张等有关。
由于感染样本中疱疹病毒种类多，并包含了非致病的病原；而且由于感染患者个体差异以及病毒的变异性，各类感染样本中普遍存在同种异株疱疹病毒，这些异株疱疹病毒在序列上也存在一定差异；再加上通常源自人的感染样本中(比如痰液、肺泡灌洗等)疱疹病毒的相对丰度都很低，实践中对于感染样本中人疱疹病毒的测序检测往往结果不准确，假阳性和假阴性问题非常严重。具体而言，假阳性问题是因为：在部分样本中疱疹病毒的丰度低，需要PCR靶向扩增，但测序建库前无法准确靶向扩增目标疱疹病毒(比如，不能有效靶向所有目标人疱疹病毒，不能有效靶同种下所有异株疱疹病毒)，并且PCR引物过多会导致反应体系压力过大，引物偏好性增加，扩增时难以全面覆盖各类型疱疹病毒，最终导致漏检而出现假阴性问题；而假阳性是因为：扩增的特异性不足，实践中很容易混入其他非目标疱疹病毒，使目标产物并没有得到预期的靶向扩增，反而扩增出非目标疱疹病毒，或其他种类病毒，在进一步物种注释时产生干扰，导致检测结果的假阳性。
感染样本中疱疹样本的复杂性决定了传统的引物设计和筛选方法很难应对感染样本中疱疹病毒测序检测问题。另外，对于本申请的ONT三代纳米孔长片段测序而言，其对于扩增片段的长度要求更为严格，这给引物设计带来了额外的难度。
有鉴于此，提出本申请。
发明内容
为解决上述技术问题，本申请基于自有引物生信设计分析流程，根据NCBI中HSV1、HSV2，VZV，CMV,EBV基因组序列，选择多基因组的保守核苷酸序列作为扩增区域，设计了三对检测疱疹病毒的PCR引物。对引物的特异性、敏感性进行试验，证实此引物能用于快速、方便、高效地检测人疱疹病毒，特异性好，灵敏度高。得到扩增产物后，结合Nanopore测序经过分析，可对人疱疹病毒进行有效准确的鉴定。
因此，本发明的第一目的是提供一种适于ONT测序平台的、用于感染样本中疱疹病毒检测的引物组合及其试剂盒；
本发明的第二目的是提供一种基于ONT测序平台的用于感染样本中疱疹病毒检测方法。
具体的，本申请的技术方案如下：
本申请首先提供一种适于ONT测序平台的、用于感染样本中疱疹病毒检测的引物组合，所述引物组合包括如下引物：
(1)EBV引物:
正向引物：CCGTGAGATGGATCAGGCTC(SEQ ID NO.1)
反向引物：CAGCAACAACCTGTGCAGAC(SEQ ID NO.2)
(2)CMV引物:
正向引物：CCTCCACCCACTACAACACAC(SEQ ID NO.3)
反向引物：GTGATGTCCCTCGCAGAACCT(SEQ ID NO.4)
(3)HSV1、HSV2、VZV引物:
正向引物：GGTTGGAATTGRTTRCGAAAGTT(SEQ ID NO.5)
反向引物：CTCCCCSCYGACATTACGTWCACG(SEQ ID NO.6)
引物中R,S,Y,W为简并碱基，遵从简并碱基密码表：R
(A/G),S(G/C),Y(C/T),W(A/T)。
进一步的，所述(3)HSV1、HSV2、VZV引物序列具体如下：
正向引物F.1
GGTTGGAATTGATTACGAAAGTT(SEQ ID NO.7)；
正向引物F.2
GGTTGGAATTGGTTACGAAAGTT(SEQ ID NO.8)；
正向引物F.3
GGTTGGAATTGATTGCGAAAGTT(SEQ ID NO.9)；
正向引物F.4
GGTTGGAATTGGTTGCGAAAGTT(SEQ ID NO.10)；
反向引物R.1
CTCCCCGCCGACATTACGTACACG(SEQ ID NO.11)；
反向引物R.2
CTCCCCCCCGACATTACGTACACG(SEQ ID NO.12)；
反向引物R.3
CTCCCCGCTGACATTACGTACACG(SEQ ID NO.13)；
反向引物R.4
CTCCCCCCTGACATTACGTACACG(SEQ ID NO.14)；
反向引物R.5
CTCCCCGCCGACATTACGTTCACG(SEQ ID NO.15)；
反向引物R.6
CTCCCCCCCGACATTACGTTCACG(SEQ ID NO.16)；
反向引物R.7
CTCCCCGCTGACATTACGTTCACG(SEQ ID NO.17)；
反向引物R.8
CTCCCCCCTGACATTACGTTCACG(SEQ ID NO.18)；
上述正向引物与反向引物可随机组合。
进一步的，所述引物能够特异性扩增人疱疹病毒基因，同时能够兼容性扩增种属内不同序列的人疱疹病毒，保证了种属特异和种内兼容性问题。
进一步的，所述引物扩增的人疱疹病毒基因组序列如下SEQ ID NO.19-23所示。
本申请还提供一种适于ONT测序平台的、且用于感染样本中疱疹病毒检测的种属间特异、种属内兼容的靶序列，所述靶序列包括SEQ ID NO.1-5所示序列任一、多个或全部。
本申请还提供一种适于ONT测序平台的、且用于感染样本中疱疹病毒检测的检测试剂盒，包含上述任一所述引物，或上述的靶序列。
本申请还提供上述任意引物组合或上述的靶序列在制备适于ONT测序平台的、且用于感染样本中疱疹病毒检测的检测试剂盒种的应用。
本申请还提供上述任意引物组合或上述的靶序列在感染样本疱疹病毒检测中的应用。
本申请还提供一种基于ONT测序平台的感染样本疱疹病毒检测方法，其特征在于，包含利用上述任一所述引物组合或上述试剂盒对感染样本DNA进行扩增的步骤。
进一步的，所述方法还包括测序和生信分析步骤。
本申请与现有技术相比所具有的积极效果在于：
(1)本申请设计的引物组合不仅具有种属间的特异性，能够避免检测的假阳性，同时具有种属内的兼容性，不仅保证了各类疱疹病毒(HSV1、HSV2，VZV，CMV,EBV) 的检出，同时保证了NT库记载的种内变异序列的疱疹病毒的检出率，在感染样本检测领域具有绝对优势。
(2)人疱疹病毒敏感性试验结果表明，本申请引物组应用于人疱疹病毒的PCR检测，与第三方qPCR验证方法相比，阳性一致率为100％(30/30)，扩增产物的上靶率在96％以上。
(3)本申请的引物基于ONT测序reads长度长的特点，引物产物长度在1300bp-1500bp左右，在选择保守核苷酸序列的前提下，同时符合引物实验设计的基本原则，结合ONT测序的特性，尽可能延伸引物产物长度，使本引物更加适用于ONT平台。
综上，本申请的引物组是适于ONT测序平台的、适于感染样本疱疹病毒检测的引物体系。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1、引物与模板结合能力评估；
图2、针对CMV的引物扩增产物的特异性评估结果图；
图3、针对VZV的引物扩增产物的特异性评估结果图；
图4、针对HSV2的引物扩增产物的特异性评估结果图；
图5、针对HSV1的引物扩增产物的特异性评估结果图；
图6、针对EBV的引物扩增产物的特异性评估结果图；
图7、本发明一个特定实施例用于引物兼容性评估结果图；
图8、本发明一个特定实施例的方法流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，并且所述实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
部分术语定义
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
本申请基于自有引物生信设计分析流程设计了如下引物组合，该引物组合解决了感染样本检测过程中的人疱疹病毒的特异性、兼容性和灵敏性问题：
(1)EBV引物:正向引物：CCGTGAGATGGATCAGGCTC；反向引物：CAGCAACAACCTGTGCAGAC；(2)CMV引物:正向引物：CCTCCACCCACTACAACACAC；反向引物：GTGATGTCCCTCGCAGAACCT；(3)HSV1、HSV2、VZV引物:正向引物：GGTTGGAATTGRTTRCGAAAGTT；反向引物：CTCCCCSCYGACATTACGTWCACG；其中引物中 R,S,Y,W为简并碱基，遵从简并碱基密码表：R(A/G),S(G/C),Y(C/T),W(A/T)。
在一些具体的实施方式中，所述(3)HSV1、HSV2、VZV引物序列具体如下：
正向引物F.1：GGTTGGAATTGATTACGAAAGTT；正向引物F.2：GGTTGGAATTGGTTACGAAAGTT；正向引物F.3：GGTTGGAATTGATTGCGAAAGTT；正向引物F.4：GGTTGGAATTGGTTGCGAAAGTT；反向引物R.1：CTCCCCGCCGACATTACGTACACG；反向引物 R.2：CTCCCCCCCGACATTACGTACACG；反向引物R.3：CTCCCCGCTGACATTACGTACACG；反向引物R.4：CTCCCCCCTGACATTACGTACACG；反向引物R.5：CTCCCCGCCGACATTACGTTCACG；
反向引物R.6：CTCCCCCCCGACATTACGTTCACG；反向引物R.7：CTCCCCGCTGACATTACGTTCACG；反向引物R.8：CTCCCCCCTGACATTACGTTCACG。在一些具体的实施方式中，上述正向引物与反向引物可随机组合。
在一些实施方式中，所述引物能够特异性扩增人疱疹病毒基因，同时能够兼容性扩增种属内不同序列的人疱疹病毒，保证了种属特异和种内兼容性问题，具有较高的上靶率。本发明所述的“上靶率”或“Ratio_ontarget”为测序得到的疱疹病毒相关序列中比对到引物靶向区域的比例。
在一些实施方式中，所述引物扩增的人疱疹病毒基因组序列如下SEQ ID NO.19-23 所示。这些靶序列是适用于本发明的ONT测序平台的、且用于感染样本中疱疹病毒检测的种属间特异、种属内兼容的靶序列。
如下为具体的实施例，其仅用于解释本发明而不做限制。
本发明过程中所涉及的生信软件和实验技术如下：
1).Oxford Nanopore技术:MinION,GridION；
2).clustalw；
3).perl；
4).rePCR。
实施例1引物序列和靶扩增区域的设计和优化
本申请用于临床感染样本疱疹病毒检测，实践中需避免检测结果的假阳性和假阴性。具体的，检测需要特异性的只针对五种疱疹类病毒，过程中不能有非特异性的检测到非目标疱疹类病毒和其他类别的病毒，否则将导致结果的假阳性，这就要求引物设计必须具有良好的“种属间”特异性；而考虑到病毒种内或属内的序列变异问题，实践中感染样本中的个体差异，特定种属的疱疹病毒下可能包含几十甚至上百株序列存在差异的同种疱疹病毒，如果引物设计不能兼容到变异株序列，容易导致漏检，进而得出假阴性结果。所以，对于感染样本的引物设计实践中并非容易，采用传统常规的引物设计软件或设计思路根本无法满足现实需要。
本实施例以申请人早期的关于感染样本的特异性引物设计专利(CN112634983B,病原物种特异PCR引物优化设计方法)和兼并性引物设计专利(CN111681711B,一种兼并引物的设计筛选方法)为基础进行引物综合设计：以人疱疹病毒CMV、EBV、HSV1、 HSV2、VZV基因组序列为基础，通过序列比对分析排除二级结构和非特异性序列区间，选择保守的核苷酸序列作为扩增区域，同时保证中间存在一定的可变区，进而使靶向扩增区间有物种区分度。同时考虑引物是否符合实验基本设计原则，如引物不能出现超过4个连续重复碱基，引物间不能出现超过5个碱基的连续互补，引物3‘端5nt不宜超过2或3个G+C等，设计引物。
进一步对所设计引物评估其与模板的结合能力，首先使用primer3中的calcEndStability函数计算引物F/R与目标物种target序列及其他物种的自由能ΔG值，若其他物种的ΔG值小于目标物种的ΔG值，则未通过模板结合评估，应过滤掉，引物与模板结合能力评估部分结果如见图1。
另外，考虑到测序检测前的扩增为多重扩增体系，在保证检测准确性的基础上，引物压力要尽量少，因此设计上还尽量保证引物扩增的序列兼容性问题，即通过最少的引物扩增更多的目标的疱疹病毒。
最后，鉴于本申请所采用的测序技术为ONT的纳米孔测序技术，其属于长片段扩增，对扩增引物和扩增片段有严格要求，因此本申请的引物引物对必须是能够扩增出符合ONT测序需求的长片段，本申请经过扩增效率优化最终筛选出最具长片段扩增优势的引物组合。
综上，通过设计和优化，本申请最终确立的引物扩增区域如下：
(1)针对EBV(SEQ ID NO.19):
MYRKGRRRTSGWTYRRSCTYWGGWYBRTSTMYKGACACNHAWRCAAGGMWNRYCTYCATBRTCTNNNCAYYGMTY TCYRKGNMVKCAYYYTCTTYMMKMGKTDCAMSGRKRNYRCNNYKTYGRYRWGTYMCMCTTYWGTTSYARRCAMNNNNNNNNNNGWCWKGYCVRKDSNCMYGRCCCYGGANNRCAAVMYGGMAKWMSNNNYYYSWKCYRYCTCVGTKSYNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGGARYNNNNNNNNNNNGDBATYGRYVVNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGDKRTTKGKRDAMNNBYNKYRYMNRRSDYDTCNGHTDDYNNNNRYBMWKRNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRRNHHRRDNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNYYDKRRMYRRMVYDSRMDRNNMHKDWRDKRWARCNNKWCVWHCMNNRYBYYKGTGVSNNNRCTMCWGYVBDNWVYMWTRBWVNMMNNNNARBHRDMYCHYBYHRBGNRDRDHRCHRYTYY BBRYADNRKKWMCMMBRGRNNTYTDRNNNYAYWWCYDCWNNYRRTBNNNNGSRSYNCRYVGYKVYGRNNYRANNRTSCSWDYKSHVHAVRWNRYSYKABRHVTNYBBHYAMMYRWNMACMCAMBDNNNMGSTDDNWRAWDYDYBVHCVYD GRWTTYRGYKVRBSDHCDSDVKANNGYHRKWNABYHDDHKNNNNNRDDYHYNVBRNHBSRNMDNMCNWSVBVYRBMYMRKKTWWBCVRHBBNNNNCYRDWYDDMMNRRYMHYKRSVKRWMSHYRRDKDNNNMHBSNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCRBBNTDMHNVV YVYRYWTYMYHBDYVKMVBYYHYDRSRHBKBNNNNYBYAGNNNNVVRCRDVTYNTRBYYYMTWYBMHSRDMYNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNYTRTYNNYGWYNMNNNNNNYYYKRDBASBASK DKTDYYCARDNYMYCGYBGANNNNNNNNNNKAYNNNNNNCWVNNNNNNTYYYDGYAMRNNNNNNNNNNGAGRYRGMWSRGRCTTSKWMTKCCRNGYTKKYNTCCRGGGYYGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNYSYGTMYKKRHHMRWYT TGYYTRSAAHWRAAGDGKRACWYRYYRAMRNNGYRCYMYCSKTGWAMCKHBDRAAGARRKTGMDGMCNYRGAVAKCGRKGNNGAGAYRATGRMGRYMKYCYTKBTWKWGTGTCMRKASRYSRWCCWRAGSYYRAWCSMYCYCMYRK。
(2)针对CMV(SEQ ID NO.20)
MYKVCRSSMRMNASANNNBACVYVBYCMNNRSAHWMDYRTSCSHGNNNVMCDKNNNNNNNNNNNYSTRCSASSYB VSRRNYHVCGHNNNNNRYYRYCRCGYTRSYBCRCCVAYAKYHARNTNAMBMYABSYYBKYRSCMCRWSGTYYCSRHVYVTCYYYRYANGYVYCARVADYHBRYSYCNAMNNNCRYYYRYBCHVNBCRSNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN RRAYWNCBRCRMVNNNNNKSRKRCRRRSTWSYCRWKYRYTGYGYCYWCKMCWMTGTKKTGMWRYRGRKNNNNNNNNNGRTVDHGRYDHWNDRWRVRAWANNNNRHRCWDWVYNNNNNRTTVGYRKHRGRRWNNNNSYGWGYRRYHSRGST TGTGYTKSWBYBBWKAKRWRKWGGCRRRYMTRYKMGSRAVNRNCDTARBMHKHGGMRKMRASCKMVRTBTGBVWRMDRWGHTSNNNTWHRWYRGCGYRTTTKYCMKAVRKWBGKWBWKGYKKTYGTSNRDTSCTRWGRKGTWWSRRKDRS GWRTSTYRVDVBTSTSRSKRRARYRKYGTSBTSWRSDNNNNRTYBRYRDCYRTGGYYNNCAWSNTTKTKYKKNNKGTSTBTNTNRDRKTSKGYGRRGG。
(3)针对HSV1、HSV2、VZV简并引物-HSV1(SEQ ID NO.21)
STYSVMRYYGAYNRYKAMRKTYRCGSCCYTYGAMNGMCWGYCMRGSKAASACCCCGYGRSRYKRRCKCRRSGSCR GSKSCWRRKRYVCGGCRRGNNNGTTSGAWCRSCGCCYGRSMWNNGYYRWRGCMGGVGRCRYSGCCCDSRYSCKYRHGKSKMYMGYGTCRRDGRCMKKSYKYGRYKDGCCNNYCRCCSASMYCKYCRCGWRRCNNNNNTKSRAGKKCCWBS MCWCSRCCRSGKYSCRCRYCARCKSCKYCRSSKCGYRSYYNNYRCDMSCYGCSKGACKYNTGKKSRCCAYSGTAT DYAGNNNNNNNNNGGMCYYSCRKYKSRYSRDGRTGGWCKMCRVCSGNCCSRYGGNCCSWRRGGACCRCNNYWRRYCYWCSTWYTRMMGSKTCTYVMKYKYGSMCRKGACSCRCKYGGYBGCCRMSCSRYAVGTBKMCYGCNWGRNNNNNN TGGYSCSSGBGKTCKMGGRTCSRYCCRCNGCGYYHCWSGKYBGMGRARSCSRNGKARTTTSCCRGYRNNNNNNAGYMSCTNKMCAKGCTGTKYRKGKTYYCVMMGRCGCYRMTGGCBNNNNNNRMGRYRCTGKYDWACYTKGRRYGSYGC RMCNGDMGSCGNNTGAKCGTMGKGYGYMMGSAGRYGNGRCGYGTKTCRAWRSKKCRYRGRYTVCARSNCASRYCGRYSTGSYNTGBARYCHRYGMMSYWTCGRMMCRCRYCNCRYCTSCKKRCRCMCGACGMTMANNCGSCKCCGKNCGC RSCRYYCMARGTWMRMCAGCRYCKYNNNNNNRGCMAKYRGYGYCKKSGRRAMCMYRMACADCATGKMCAGSKRCTNNNNNNYRYYGGSAAAYTMCNYSGSYTYCKCSRMCVWGRRRCSCNGYGGRBSGMYCCKMGNMCSCSSGBNCCAYNNNNNNCWYGCRGKMSANSTRNSGSKYGGCBRCCRMGYGNGTCMYGGSCRMRMKSRARAMSCKGYARWASGWGGRNYWGNNGYGGTCCYYWSGGNCCRYSKGVCSGSYGKMGWCCAYCWYSRYVARMYGSRRGGCCNNNNNNNNNCYRMAYACSRTGGYVNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNYSGCSAYGNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNVMGSGYSMGGGCSRYRYCBCCKGYYWYRRCKKMNNYCRGGCGSYGWTCSAMCNNNCYCGCMGBGYMYYWRSMSCYG SCSYYRMGYCMRYSCCRCRGGGKSTTMSCCKGRYWGKCKNTCVRRGGSCGYRAMYKTMRYRNTCRRYKSSRAS。
(4)针对HSV1、HSV2、VZV简并引物-HSV2(SEQ ID NO.22)
NSYYSVMRYYGRYNRYKRMRKTYRCGSCCYTCGASNRMNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNRTGKCGWKGKBGGYYTYKSMCRRRCCGYCSNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTWSYTSRCNNSCNNNNNNMGGGCCTCGYGG KYGSYNNNNAYSGTSTYCAGCMBYMMCWSGGCCVTBSRSNCYGMYYGRKSYRSRYRMYGCMGGGCCNNNNGSYSGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRYGSYGYYCMTSGTNCSRMRGANSCCRRKRGYYCSSCGGSSRGYRCYBGSSMAYKYKGKRYGGSKBSYCYSSRGVCSYNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCKRCRAYSWSNSYVCCKTCGMRRCSCKCCASGYMWRMSMGCAYMYKRNGCYRRHRSSGC YGSRGRVMMSCCRCMCMRMRTKSSCRRGYGCYSNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNSGGGMASYRCGYSKCCYTCKCGGYCCWSMWGYGSGYKGRCSGSYMCGWGVRYVCCS GGNNCAYSAKRMARRAGMSGTAMMRSGMGGSYNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNYGYRAMYKTMRYRNTCRRYKSSRAS。
(5)针对HSV1、HSV2、VZV简并引物-VZV(SEQ ID NO.23)
CTYCCCCCKGACATTACRTACACGTATTTTCAGTCMTCTTCRAGTGGAACCACTACCGCCCGTGGAGCGCGTCGA AACGATGTMAACTCCACGTCTAAGCCTAGCCCATCGGGGGGGTTTGAAAGACGGTTGGCGTCTATTATGGCCGCTGACACAGCCTTRCACGCAGAAGTTATATTCAACACTGGAATTTACGAAGAAACTCCAACAGATATCAAAGAATGG CCAATGTTTATAGGCAYGGAGGGCAMTTTGCCAAGGYTAAACGCTCTGGGGTCATATACCGCTCGTGTGGCCGGGGTCATTGGTGCGATGGTTTTCAGCCCAAATTCTGCGTTGTATCTAACTGAGGTGGAGGATAGCGGGATGACCGAA GCCAAGGATGGGGGACCGGGTCCATCATTTAATCGATTTTACCAGTTTGCCGGACCTCATYTAGCTGCGAATCCCCAAACAGATCGAGATGGCCACGTTCTATCCAGTMAGTCTACGGGTTCATCAAACACAGAGTTTRGCGTGGATTAT TTGGCMCTCATTTGTGGATTTGGAGCACCCCTGYTGGCGCGACTGCTTTTTTATCTAGAACGCTGTGACGCTGGT GCGTTTACAGGGGGTCACGGGGATGCGTTAAAATATGTTACGGGGACCTTTGACTCTGAAATTCCATGTAGTTTATGTGAAAARCAYACGCGGCCGGTATGCGCTCACACAACAGTACACCGACTTAGACAACGCATGCCGCGATTTGGA CAAGCCACCCGTCAACCTATTGGGGTGTTTGGAACAATGAACAGCCAATATAGCGACTGCGATCCTCTRGGAAAC TATGCTCCATATTTAATCCTTCGAAAACCCGGGGATCAAACGGAAGCAGCAAAGGCAACCATGCAGGACACTTATAGGGCTACAYTAGAACGCTTGTTTATCGATCTAGAACAAGAGCGACTACTGGATCGCGGTGCCCCMTGTTCTTCC GAGGGACTATCGTCTGTCATTGTGGATCATCCAACGTTTCGTCGCATATTAGACACACTGCGTGCGCGTATAGAACAGACAACAACACAATTTATGAAAGTGTTGGTYGAGACCCGCGATTATAAGATCCGTGAAGGATTATYCGAAGCCACCCATTCAATGGCGTTAACGTTTGATCCRTACTCAGGAGCATTTTGTCCCATTACCAATTTTTTAGTTAAACGAACACACCTAGCCGTGGTACAAGACTTAGCATTAAGCCARTGTCATTGTGTATTTTACGGACAGCAAGTTGAGGGGCGGAACTTTCGTAACCAATTCCARCC。
其中，M,K,Y,R,W,S,B,D,H,V,N为简并碱基，遵从简并碱基密码表, M(A/C),K(G/T),Y(C/T),R(A/G),W(A/T),S(G/C),B(G/T/C),D(G/A/T),H(A/G/T),V(A/G/ C),N(A/C/G/T)。
最终设计筛选的引物序列如下：
(1)针对EBV引物:
正向引物：CCGTGAGATGGATCAGGCTC(SEQ ID NO.1)；
反向引物：CAGCAACAACCTGTGCAGAC(SEQ ID NO.2)；
(2)针对CMV引物:
正向引物：CCTCCACCCACTACAACACAC(SEQ ID NO.3)；
反向引物：GTGATGTCCCTCGCAGAACCT(SEQ ID NO.4)；
(3)针对HSV1、HSV2、VZV的兼容性引物:
正向引物：GGTTGGAATTGRTTRCGAAAGTT(SEQ ID NO.5)；
反向引物：CTCCCCSCYGACATTACGTWCACG(SEQ ID NO.6)；
其中HSV1、HSV2、VZV引物中R,S,Y,W为简并碱基，遵从简并碱基密码表：R (A/G),S(G/C),Y(C/T),W(A/T)，具体序列如下：
正向引物F.1：GGTTGGAATTGATTACGAAAGTT(SEQ ID NO.7)；
正向引物F.2：GGTTGGAATTGGTTACGAAAGTT(SEQ ID NO.8)；
正向引物F.3：GGTTGGAATTGATTGCGAAAGTT(SEQ ID NO.9)；
正向引物F.4：GGTTGGAATTGGTTGCGAAAGTT(SEQ ID NO.10)；
反向引物R.1：CTCCCCGCCGACATTACGTACACG(SEQ ID NO.11)；
反向引物R.2：CTCCCCCCCGACATTACGTACACG(SEQ ID NO.12)；
反向引物R.3：CTCCCCGCTGACATTACGTACACG(SEQ ID NO.13)；
反向引物R.4：CTCCCCCCTGACATTACGTACACG(SEQ ID NO.14)；
反向引物R.5：CTCCCCGCCGACATTACGTTCACG(SEQ ID NO.15)；
反向引物R.6：CTCCCCCCCGACATTACGTTCACG(SEQ ID NO.16)；
反向引物R.7：CTCCCCGCTGACATTACGTTCACG(SEQ ID NO.17)；
反向引物R.8：CTCCCCCCTGACATTACGTTCACG(SEQ ID NO.18)。
上述正反引物可两两随机匹配使用。
实施例2疱疹病毒引物特异性评价
本专利的关注点在于，所提出的检测人疱疹病毒的引物能特异性靶向五种人疱疹病毒物种，而不能扩增其他非目标疱疹病毒或其他物种病毒的片段，从而提高疱疹病毒检测的灵敏性。具体将设计好的引物序列纳入NCBI Primer blast，数据库选择NR，应用NCBIPrimer blast验证检测疱疹病毒引物特异性。
具体结果参见图2-6(每个物种截取部分)，结果表明，本申请设计的3种引物能都只能特异性匹配到人疱疹病毒，而不会与其他非目标疱疹病毒或其他物种交叉，充分证明了本申请实施例1设计的引物存在高度特异性。
实施例3物种内兼容性扩增评估
本发明的引物，不仅能够在种水平兼容性的使用一对引物同时靶向三种疱疹病毒病毒HSV1、HSV2和VZV(本发明的第三对引物)，同时还能兼容的靶向同种疱疹病毒下的不同病毒株，具有良好的物种兼容性以及物种内兼容性，有效减少了多重扩增体系的压力，并且最大限度的确保在不同感染患者的样本中不因为病毒的变异性而导致病毒脱靶，进而影响检出，最终导致病毒检出假阴。
使用rePCR将本发明引物比对于NT库，进一步将比上的序列提取出来基于NT序列注释,即该引物靶向的菌株，本发明引物可以优势靶向到NT库中记载的该物种病毒不同株，如图7所示，柱形图纵坐标为比对上的NT库记载的病毒株数目，横纵标为对应的疱疹病毒，可以明显的看出一对引物可以兼容性的靶向该物种下几十种甚至上百种病毒毒株，并且值得注意的是，第三对引物还同时靶向了三个物种HSV1、HSV2和 VZV，柱形图下方为NT库中比对上的病毒株(随机挑选5个结果展示)。
实施例4基于临床样本的人疱疹病毒测序检测
本专利的关注点在于，所提出的检测人疱疹病毒的引物能对靶向区间进行疱疹病毒特异性扩增，从而提高疱疹病毒检测的灵敏性。本实施例基于临床阴性样本的实验结果统计引物的特异度，整体应用流程如图8所示，具体描述如下：
一、临床阳性样本分别进行人疱疹病毒的提取，样本类型为肺泡灌洗液或痰液，其中阳性样本的判定基于第三方检测方法-疱疹病毒核酸检测试剂盒的检测结果；
二、加入引物构建扩增反应体系，随后进行PCR扩增反应；
三、扩增完成后，对扩增产物进行建库，并进一步参照GridION使用说明进行Nanopore上机测序；
四、对测序序列首先进行质控，对于纳米孔长读长数据，过滤低质量和长度过短的序列，同时去除接头序列；
五、序列质控后使用blast与nt数据库进行比对，从而进行物种鉴定，同时得到序列在参考基因组上的比对位置；
六、基于上一步得到的结果统计人疱疹病毒相关的序列数(R)以及比对到靶向区域的序列数(Target-R)，进一步通过计算Target-R/R的比值得到上靶率。
样本的检出结果见表1，第三对简并引物以HSV1为例，可以看出所设计引物无论针对何种感染样本类型进行PCR扩增后，与临床分子检测试验结果相比，一致率为100％ (30/30)。可见，本发明所设计引物能够高效特异地从呼吸道感染患者中识别和鉴别疱疹病毒，假阳性为0，特异性为100％。
表1.样本的测序1h检出结果
实施例5检测灵敏度评估
本发明通过设计PCR引物扩增人疱疹病毒的保守区域，进一步对产生的PCR反应产物进行纳米孔Nanopore上机测序，通过分析序列的物种属性和比对位置，基于临床阳性样本的实验结果统计扩增产物的上靶率和引物的灵敏度。具体实施基于实施例4 的流程进行。
临床样本的疱疹病毒Reads数和上靶率统计结果见表2，第三对简并引物以HSV1为例，可以看出使用所设计引物进行PCR扩增后，在测序1h时样本均可检出疱疹病毒，阳性一致率为100％(30/30)。统计疱疹病毒相关Reads在靶向扩增区域的覆盖情况，结果显示样本上靶率在96％以上。可见，本发明所设计引物能够高效特异地从呼吸道感染患者中识别和鉴别疱疹病毒。
表2.样本的疱疹病毒测序1h检出结果
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 江苏先声医学诊断有限公司
南京先声医学检验实验室有限公司
北京先声医学检验实验室有限公司
<120> 一种适于ONT测序平台的、用于感染样本中疱疹病毒检测的引物组及应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgtgagatg gatcaggctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagcaacaac ctgtgcagac 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctccaccca ctacaacaca c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgatgtccc tcgcagaacc t 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttggaatt grttrcgaaa gtt 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctccccscyg acattacgtw cacg 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggttggaatt gattacgaaa gtt 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggttggaatt ggttacgaaa gtt 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggttggaatt gattgcgaaa gtt 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggttggaatt ggttgcgaaa gtt 23
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctccccgccg acattacgta cacg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcccccccg acattacgta cacg 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctccccgctg acattacgta cacg 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctcccccctg acattacgta cacg 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctccccgccg acattacgtt cacg 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctcccccccg acattacgtt cacg 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctccccgctg acattacgtt cacg 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctcccccctg acattacgtt cacg 24

Claims (3)

1.一种适于ONT测序平台的、用于感染样本中疱疹病毒检测的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括如下引物：
(1)EBV引物:
正向引物：CCGTGAGATGGATCAGGCTC(SEQ ID NO.1)；
反向引物：CAGCAACAACCTGTGCAGAC(SEQ ID NO.2)；
(2)CMV引物:
正向引物：CCTCCACCCACTACAACACAC(SEQ ID NO.3)；
反向引物：GTGATGTCCCTCGCAGAACCT(SEQ ID NO.4)；
(3)HSV1、HSV2、VZV引物:
正向引物：GGTTGGAATTGRTTRCGAAAGTT(SEQ ID NO.5)
反向引物：CTCCCCSCYGACATTACGTWCACG(SEQ ID NO.6)
其中引物中R,S,Y,W为简并碱基，遵从简并碱基密码表：R(A/G),S(G/C),Y(C/T),W(A/T)；
所述引物能够特异性扩增人疱疹病毒基因，同时能够兼容性扩增种属内不同序列的人疱疹病毒，保证种属特异和种内兼容。
2.一种适于ONT测序平台的、且用于感染样本中疱疹病毒检测的检测试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述引物组合。
3.权利要求1所述的引物组合在制备适于ONT测序平台的、且用于感染样本中疱疹病毒检测的检测试剂盒中的应用。
CN202210818263.8A 2022-04-22 2022-04-22 一种适于ont测序平台的、用于感染样本中疱疹病毒检测的引物组及应用 Active CN115044712B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210818263.8A CN115044712B (zh) 2022-04-22 2022-04-22 一种适于ont测序平台的、用于感染样本中疱疹病毒检测的引物组及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210818263.8A CN115044712B (zh) 2022-04-22 2022-04-22 一种适于ont测序平台的、用于感染样本中疱疹病毒检测的引物组及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115044712A CN115044712A (zh) 2022-09-13
CN115044712B true CN115044712B (zh) 2024-05-24

Family

ID=83165369

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210818263.8A Active CN115044712B (zh) 2022-04-22 2022-04-22 一种适于ont测序平台的、用于感染样本中疱疹病毒检测的引物组及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115044712B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834543A (zh) * 2017-03-01 2017-06-13 复旦大学 人疱疹病毒各亚型快速检测与定量试剂和试剂盒
CN106834542A (zh) * 2017-02-17 2017-06-13 东莞市儿童医院 一种同步扩增检测hcmv、hsv1、hsv2和b19的引物、探针、试剂盒及方法
CN108441580A (zh) * 2017-03-03 2018-08-24 绍兴迅敏康生物科技有限公司 一步法同时检测hsv-1，hsv-2，vzv疱疹病毒的试剂盒及检测方法
CN110317902A (zh) * 2019-06-20 2019-10-11 上海伯杰医疗科技有限公司 人疱疹病毒ⅰ/ⅱ/ⅲ/ⅴ型核酸分型检测试剂盒及检测方法
CN111500788A (zh) * 2020-05-29 2020-08-07 领航基因科技（杭州）有限公司 用于人类疱疹病毒感染检测的试剂盒及其检测方法
CN113637796A (zh) * 2021-07-06 2021-11-12 杭州圣庭医疗科技有限公司 一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7442505B2 (en) * 2004-12-30 2008-10-28 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions and methods for detecting human herpesviruses

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834542A (zh) * 2017-02-17 2017-06-13 东莞市儿童医院 一种同步扩增检测hcmv、hsv1、hsv2和b19的引物、探针、试剂盒及方法
CN106834543A (zh) * 2017-03-01 2017-06-13 复旦大学 人疱疹病毒各亚型快速检测与定量试剂和试剂盒
CN108441580A (zh) * 2017-03-03 2018-08-24 绍兴迅敏康生物科技有限公司 一步法同时检测hsv-1，hsv-2，vzv疱疹病毒的试剂盒及检测方法
CN110317902A (zh) * 2019-06-20 2019-10-11 上海伯杰医疗科技有限公司 人疱疹病毒ⅰ/ⅱ/ⅲ/ⅴ型核酸分型检测试剂盒及检测方法
CN111500788A (zh) * 2020-05-29 2020-08-07 领航基因科技（杭州）有限公司 用于人类疱疹病毒感染检测的试剂盒及其检测方法
CN113637796A (zh) * 2021-07-06 2021-11-12 杭州圣庭医疗科技有限公司 一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Amplification of the Six Major Human Herpesviruses from Cerebrospinal Fluid by a Single PCR;SOPHIE MINJOLLE等;JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY;第37卷(第4期);第950-953页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115044712A (zh) 2022-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106834543B (zh) 人疱疹病毒各亚型快速检测与定量试剂和试剂盒
Bal et al. Emergence of enterovirus D68 clade D1, France, August to November 2018
CN101487062B (zh) 同步检测肝炎、艾滋病毒和***核酸的试剂盒
Rotbart et al. Persistent enterovirus infection in culture-negative meningoencephalitis: demonstration by enzymatic RNA amplification
Sarcinella et al. Cytomegalovirus glycoprotein B genotype does not correlate with outcomes in liver transplant patients
JP2017184745A (ja) 分子コーミングを用いるゲノムｄｎａ及び感染性ウイルスｄｎａの検出によるウイルス感染の診断
Sauvage et al. Viral metagenomics applied to blood donors and recipients at high risk for blood-borne infections
van Velzen et al. Longitudinal study on oral shedding of herpes simplex virus 1 and varicella‐zoster virus in individuals infected with HIV
Pandey et al. Inferred father-to-son transmission of herpes simplex virus results in near-perfect preservation of viral genome identity and in vivo phenotypes
WO2018035860A1 (zh) 同时检测及定量分析四种血源性病毒的多重Taqman探针qPCR的试剂盒及方法
Perkins et al. Detection of equine herpesvirus‐1 in nasal swabs of horses by quantitative real‐time PCR
Whitney et al. Genital tract sequestration of SIV following acute infection
Mahalingam et al. Prevalence and distribution of latent simian varicella virus DNA in monkey ganglia
CN115044712B (zh) 一种适于ont测序平台的、用于感染样本中疱疹病毒检测的引物组及应用
Roizman et al. The molecular epidemiology of herpes simplex viruses
CN106498093A (zh) 一种广谱检测致癌病原微生物的方法
Triantos et al. Presence of human herpes virus‐8 in saliva and non‐lesional oral mucosa in HIV‐infected and oncologic immunocompromised patients
TWI690596B (zh) 檢測hsv1及hsv2的套組及方法
CN106868218A (zh) 用于病毒性脑炎快速诊断的多重pcr试剂盒
Criscuolo et al. Oral Human Papillomavirus: a multisite infection
Gray et al. Experimental simian varicella virus infection of St. Kitts vervet monkeys
CN113817870B (zh) 同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用
Poorghobadi et al. Discordant immune response among treatment experienced patients infected with HIV-1: Crosstalk between MiRNAs expression and CD4+ T cells count
Fischer et al. Evaluation and application of a broad-spectrum polymerase chain reaction assay for human papillomaviruses in the screening of squamous cell tumours of the head and neck
Bratt et al. Two cases of oral-to-genital HIV-1 transmission

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant