CN110982942B - 检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途 - Google Patents

检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110982942B
CN110982942B CN202010136909.5A CN202010136909A CN110982942B CN 110982942 B CN110982942 B CN 110982942B CN 202010136909 A CN202010136909 A CN 202010136909A CN 110982942 B CN110982942 B CN 110982942B
Authority
CN
China
Prior art keywords
coronavirus
seq
composition
cov
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010136909.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110982942A (zh
Inventor
戴立忠
谭德勇
邓中平
纪博知
刘佳
程星
孙青芝
颜进
毛君杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sansure Biotech Inc
Original Assignee
Sansure Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sansure Biotech Inc filed Critical Sansure Biotech Inc
Priority to CN202010136909.5A priority Critical patent/CN110982942B/zh
Publication of CN110982942A publication Critical patent/CN110982942A/zh
Priority to EP20923345.1A priority patent/EP4015654A4/en
Priority to PCT/CN2020/090054 priority patent/WO2021174674A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110982942B publication Critical patent/CN110982942B/zh
Priority to US17/891,291 priority patent/US20230193407A1/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，更具体的，涉及冠状病毒的检测领域，本发明提供了一种组合物，其能够检测新型冠状病毒2019‑nCoV、冠状病毒229E、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、冠状病毒HKU1、冠状病毒MERSr‑CoV、冠状病毒SARSr‑CoV并分型；与此同时，还提供了包含所述组合物的试剂盒，所述组合物的用途，以及用于检测冠状病毒并分型的方法。本发明的组合物结合荧光探针法和熔解曲线法，能够在一管同时检测七个冠状病毒并进行分型，其成本低，通量高，耗时少，极大的提升了检测效率，并且操作简便，单管操作避免由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。

Description

检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，更具体地，属于冠状病毒的检测领域，更具体地，本发明能够检测新型冠状病毒2019-nCoV、冠状病毒229E、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、冠状病毒HKU1、冠状病毒MERSr-CoV、冠状病毒SARSr-CoV并分型。
背景技术
冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）正冠状病毒亚科（Orthocoronavirinae），根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ和δ四个属，可以感染许多动物物种，包括人、蝙蝠、狗、猪、老鼠、鸟、牛、鲸、马、山羊、猴子等。已知感染人的冠状病毒有6种，包括α属的229E和NL63，β属的OC43和HKU1、中东呼吸综合征相关冠状病毒（MERSr-CoV）和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒（SARSr-CoV）。2019年12月以来，湖北省武汉市发生不明原因肺炎感染事件，从患者下呼吸道分离出一种属于β属的新型冠状病毒。随后，世界卫生组织将其命名为“2019新型冠状病毒（2019-nCoV）”。
新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。根据武汉病毒所石正丽研究员最新研究成果发现，2019-nCoV与其实验室之前从中华菊头蝠中分离到的一个蝙蝠冠状病毒毒株RaTG13相似度非常高，整体基因组相似度达96.2%。另外，研究显示2019-nCoV与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21）同源性也达85%以上。
在可以感染人的7种冠状病毒中，冠状病毒229E、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、冠状病毒HKU1为常见的呼吸道感染病毒，感染人后病症较轻，一般不会引起重症，但如果是新型冠状病毒2019-nCoV、冠状病毒MERSr-CoV、冠状病毒SARSr-CoV感染，则患者感染症状就非常严重，且极易产生重症。如果能够在一次测试中就对各种冠状病毒进行明确的分型，将会极大方便后续的诊疗措施，做到精准治疗和防控，尤其针对传染性和危害性大的新型冠状病毒2019-nCoV、冠状病毒MERSr-CoV、冠状病毒SARSr-CoV，可以做到及时控制传染源，阻断病毒大流行和大爆发。
因此，本领域需求同时并快速鉴定多个冠状病毒并分型的相关产品。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种能够检测冠状病毒并分型的组合物，所述组合物包括：
第一组：
如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针；
如SEQ ID NO:4所示的冠状病毒NL63上游引物、如SEQ ID NO:5所示的冠状病毒NL63下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的冠状病毒NL63探针；
如SEQ ID NO:7所示的冠状病毒HKU1上游引物、如SEQ ID NO:8所示的冠状病毒HKU1下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的冠状病毒HKU1探针；
第二组：
如SEQ ID NO:10所示的冠状病毒229E上游引物和如SEQ ID NO:11所示的冠状病毒229E下游引物；
如SEQ ID NO:12所示的冠状病毒OC43上游引物和如SEQ ID NO:13所示的冠状病毒OC43下游引物；
如SEQ ID NO:14所示的冠状病毒MERSr-CoV上游引物和如SEQ ID NO:15所示的冠状病毒MERSr-CoV下游引物；
如SEQ ID NO:16所示的冠状病毒SARSr-CoV上游引物和如SEQ ID NO:17所示的冠状病毒SARSr-CoV下游引物；
其中，第一组内的荧光基团彼此互不相同，并且第二组内的荧光基团彼此互不相同。
所述冠状病毒包括：新型冠状病毒2019-nCoV、冠状病毒229E、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、冠状病毒HKU1、冠状病毒MERSr-CoV、冠状病毒SARSr-CoV。
使用本发明的组合物，结合荧光探针法和熔解曲线法，能够使用一个管在一次试验中同时检测七个冠状病毒并进行分型，其成本低，通量高，耗时少。使得单次试验一管能给出8个靶点的信息，极大的提升了检测效率，并且操作简便，结果读取过程通过扩增曲线和CT值即可以判定。检测全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。
在本发明中，荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO: 6所示的冠状病毒NL63探针的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO:9所示的冠状病毒HKU1探针的荧光报告基团为ROX。
在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO:10所示的冠状病毒229E上游引物的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:12所示的冠状病毒OC43上游引物的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO:14所示的冠状病毒MERSr-CoV上游引物的荧光报告基团为ROX；如SEQ ID NO:16所示的冠状病毒SARSr-CoV的荧光报告基团为CY5。
在一个实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
进一步地，所述组合物还包括：如SEQ ID NO:18所示的内标上游引物、如SEQ IDNO:19所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:20所示的内标探针。
在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO:20所示的内标探针的荧光报告基团为CY5。
进一步地，所述组合物中引物的用量为50~150nM；所述组合物中探针的用量为25~75nM。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测冠状病毒并分型的试剂盒中的用途。
所述冠状病毒包括：新型冠状病毒2019-nCoV，冠状病毒229E、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、冠状病毒HKU1、冠状病毒MERSr-CoV、冠状病毒SARSr-CoV。
第三方面，本发明提供了一种检测冠状病毒并分型的试剂盒，所述试剂盒包括上述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、逆转录酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述组合物中引物的用量为50~150nM；所述组合物中探针的用量为25~75nM；所述dNTP的用量为0.2~0.3mM。
进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/μL~15U/μL，例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶（MMLV）；所述DNA聚合酶的浓度为5U/μL~15U/μL，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，所述试剂盒除上述的本发明的组合物之外，还进一步包括以下组份和用量：
组份 每一个反应中的体积/浓度
Mg<sup>2+</sup> 4mM
dNTPs（100mM） 0.25mM
MMLV（10U/µl） 10U
Taq酶（5U/µl） 5U
SEQ ID NO:1-16 100nM
SEQ ID NO:17-20 50nM
PCR缓冲液（1.5x） 补至50 µl
第四方面，提供了一种用于检测冠状病毒并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1）释放待测样本的核酸；
2）使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；
3）获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃，时间25~35分钟，1次循环；预变性，温度为94℃，时间2~10分钟，1次循环；变性，温度为94℃，时间为10~20秒，退火，温度为60℃，时间为20~40秒，45~50次循环；熔解曲线分析，温度为50℃~95℃，每上升0.5℃采集一次荧光，1次循环。
在本发明的变型中，可选地，新型冠状病毒2019-nCoV上游引物可以如SEQ ID NO:24所示，新型冠状病毒2019-nCoV下游引物可以如SEQ ID NO:25所示，新型冠状病毒2019-nCoV探针可以如SEQ ID NO:26所示；冠状病毒NL63上游引物可以如SEQ ID NO:30所示，冠状病毒NL63下游引物可以如SEQ ID NO:31所示，冠状病毒NL63探针可以如SEQ ID NO:32所示；冠状病毒HKU1上游引物可以如SEQ ID NO:36所示，冠状病毒HKU1下游引物可以如SEQID NO:37所示，冠状病毒HKU1探针可以如SEQ ID NO:38所示；冠状病毒229E上游引物可以如SEQ ID NO:39所示，冠状病毒229E下游引物可以如SEQ ID NO:40所示；冠状病毒OC43上游引物可以如SEQ ID NO:45所示，冠状病毒OC43下游引物可以如SEQ ID NO:46所示；冠状病毒MERSr-CoV上游引物可以如SEQ ID NO:49所示，冠状病毒MERSr-CoV下游引物可以如SEQ ID NO:50所示；和/或冠状病毒SARSr-CoV上游引物可以如SEQ ID NO:51所示，SARSr-CoV下游引物可以如SEQ ID NO:52所示。
附图说明
图1：A为本发明表1组合物检测冠状病毒2019-nCoV的扩增曲线图；B为本发明的表2组合物检测冠状病毒2019-nCoV的扩增曲线图；C为本发明的表3组合物检测冠状病毒2019-nCoV的扩增曲线图；
图2：A为本发明表1组合物检测冠状病毒NL63的扩增曲线图；B为本发明的表2组合物检测冠状病毒NL63的扩增曲线图；C为本发明的表3组合物检测冠状病毒NL63的扩增曲线图；
图3：A为本发明表1组合物检测冠状病毒HKU1的扩增曲线图；B为本发明的表2组合物检测冠状病毒HKU1的扩增曲线图；C为本发明的表3组合物检测冠状病毒HKU1的扩增曲线图；
图4：A为表1组合物检测冠状病毒229E的熔解曲线图；B为本发明的表2组合物检测冠状病毒229E的熔解曲线图；C为本发明的表3组合物检测冠状病毒229E的熔解曲线图；
图5：A为本发明表1组合物检测冠状病毒OC43的熔解曲线图；B为本发明的表2组合物检测冠状病毒OC43的熔解曲线图；C为本发明的表3组合物检测冠状病毒OC43的熔解曲线图；
图6：A为本发明表1组合物检测冠状病毒MERSr-CoV的熔解曲线图；B为本发明的表2组合物检测冠状病毒MERSr-CoV的熔解曲线图；C为本发明的表3组合物检测冠状病毒MERSr-CoV的熔解曲线图；
图7：A为本发明表1组合物检测冠状病毒SARSr-CoV的熔解曲线图；B为本发明的表2组合物检测冠状病毒SARSr-CoV的熔解曲线图；C为本发明的表3组合物检测冠状病毒SARSr-CoV的熔解曲线图；
图8：A为本发明表1组合物检测内标的扩增曲线图；B为本发明的表2组合物检测内标的扩增曲线图；C为本发明的表3组合物检测内标的扩增曲线图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下表1~3所示：
Figure 661352DEST_PATH_IMAGE001
Figure 742441DEST_PATH_IMAGE002
Figure 827071DEST_PATH_IMAGE003
Figure 261595DEST_PATH_IMAGE004
Figure 239915DEST_PATH_IMAGE005
Figure 101692DEST_PATH_IMAGE006
其中，新型冠状病毒2019-nCoV探针的荧光报告基团为FAM；冠状病毒NL63探针的荧光报告基团为HEX；冠状病毒HKU1探针的荧光报告基团为ROX，探针的3’末端还具有BHQ1或BHQ2猝灭基团。
冠状病毒229E上游引物的荧光报告基团为FAM；冠状病毒OC43上游引物的荧光报告基团为HEX；冠状病毒MERSr-CoV上游引物的荧光报告基团为ROX；冠状病毒SARSr-CoV的荧光报告基团为CY5。
实施例2、检测冠状病毒并分型的方法
本发明检测样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液。磁珠法提取病毒核酸，在样本处理室进行如下操作：
2.1 取适量1.5 mL灭菌离心管，分别标记阴性对照、阳性对照及待测样本，每管加入300μL RNA提取溶液1；
2.2 每管加入200μL待测样本或阴性对照、阳性对照；盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；
2.3 每管加入100μL RNA提取溶液2-mix（充分混匀后吸取），震荡混匀10秒钟后，室温静置10分钟；
2.4 瞬时离心后将离心管置于分离器上，3分钟后缓慢将溶液吸出（注意不要碰到吸附于管壁的棕色物）；
2.5 每管加入600μL RNA提取溶液3和200μL RNA提取溶液4，震荡混匀5秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；
2.6 约3分钟后，上清液分为两层，将吸头***离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1分钟后将管底残余液体完全吸出丢弃；
2.7 每管加入50μL PCR-mix，用吸头吸取PCR-mix洗脱吸附于离心管壁的棕色残留物，反复几次尽量将其完全洗脱，然后将洗脱后的全部棕色混合液转移至0.2mL PCR反应管中，盖上管盖，转移到扩增检测区。
实时荧光PCR反应体系按照如下进行配置：
Figure 408040DEST_PATH_IMAGE007
PCR扩增程序如下进行设置：
Figure 505309DEST_PATH_IMAGE008
结果分析：
1）目的检测信号为FAM、HEX（或VIC）、ROX及CY5，内参检测信号为CY5；
2）Baseline（基线）的设置：Baseline一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点（Start）避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点（End）比最早出现指数扩增的样本Ct减少1-2个循环。Threshold（阈值）的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；
3）先分析内标在CY5通道是否检测扩增曲线，且Ct≤39，若有，表示本次检测有效，继续进行后续分析:
A）若FAM通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct＜39，表示新型冠状病毒2019-nCoV检测结果为阳性；若FAM通道检测到Tm（69.5±1.0℃）特征峰，表示冠状病毒229E检测结果为阳性；
B）若HEX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct＜40，表示冠状病毒NL63检测结果为阳性；若HEX通道检测到Tm（67.0±1.0℃）特征峰，表示冠状病毒OC43为阳性；
C）若ROX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct＜40，表示冠状病毒HKU1检测结果为阳性；若ROX通道检测到Tm（70.5±1.0℃）特征峰，表示冠状病毒MERSr-CoV检测结果为阳性；
D）若CY5通道检测到Tm（68.0±1.0℃）特征峰，表示冠状病毒SARSr-CoV检测结果为阳性；
4）若内标在CY5通道没有检测到Ct或Ct＞39，表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新准备实验。
实施例3、本发明组合物测试阳性对照的检测结果
使用本发明表1~表3的组合物，按照实施例2所述的方法，对各个靶标阳性质粒进行检测，以模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测，结果如图1~8所示。从图中可以看出：
冠状病毒2019-nCoV用表1中的组合物检测时，Ct值在25左右；用表2中的组合物检测时，Ct值在28左右；用表3中的组合物检测时，Ct值在32左右，A、B和C的扩增曲线均较为挺拔。
冠状病毒NL63用表1中的组合物检测时，Ct值在30左右；用表2中的组合物检测时，Ct值在29左右，但B的曲线不如A挺拔；用表3中的组合物检测时，Ct值在34左右，基本上没有扩增曲线。
冠状病毒HKU1用表1中的组合物检测时，Ct值在25左右；用表2中的组合物检测时，Ct值在30左右；用表3中的组合物检测时，Ct值在34左右，A、B的扩增曲线均较为挺拔，C基本上没有扩增曲线。
冠状病毒229E用表1中的组合物检测时，特征峰明显；用表2中的组合物检测时，特征峰较为明显；用表3中的组合物检测时，特征峰不明显。
冠状病毒OC43用表1中的组合物检测时，特征峰明显；用表2中的组合物检测时，特征峰较为明显；用表3中的组合物检测时，特征峰不明显。
冠状病毒MERSr-CoV用表1中的组合物检测时，特征峰明显；用表2中的组合物检测时，特征峰较为明显；用表3中的组合物检测时，特征峰不明显。
冠状病毒SARSr-CoV用表1中的组合物检测时，特征峰明显；用表2中的组合物检测时，特征峰较为明显；用表3中的组合物检测时，特征峰不明显。
内标用表1中的组合物检测时，Ct值在27左右；用表2中的组合物检测时，Ct值在30左右；用表3中的组合物检测时，Ct值在31左右，A、B的扩增曲线均较为挺拔，C的扩增曲线不挺拔。
序列表
<110> 圣湘生物科技股份有限公司
<120> 检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtagcttgt cacaccgttt 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
attagcataa gcagttgtgg cat 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atagtgaacc gccacacatg accat 25
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtcttggtaa tcgcaaacgt aat 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agaatcagaa cgagtgcgag ac 22
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctctctgttg ttgagtttga ggatcgct 28
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttgttagtag tttagttttg gctcg 25
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgccacacat aactatttca ctc 23
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
attctatcgc cttgcgaatg aatgt 25
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aatttgctga gcttgtgcc 19
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
taactcctca agaaacttac ccaa 24
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aatctactgg gtcgctagca a 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tagtcggaat agcctcatcg c 21
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caaaagaaga atcaacagac caaat 25
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tcattggacc aggctgaaca c 21
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
catgcttagg ataatggcct ctct 24
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
acctgtagaa acggtgtgac aagtt 25
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tccatctcac tgcaatgttt tga 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tggaaaaact gcaacaacat cat 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
agcaacttct tcaagggccc ggc 23
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gccccaaggt ttacccaat 19
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aggtcttcct tgccatgttg 20
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
actgcgtctt ggttcaccgc tctca 25
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ggccgcaaat tgcacaat 18
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gtgtgacttc catgccaatg c 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cccccagcgc ttcagcgttc tt 22
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ctagcagtcg ttcttcaact cgt 23
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gccaaagtaa cagcagcaac 20
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cgtagcactt caagacaaca gtctcgcact 30
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ttgagtttga ggatcgctct 20
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gactgttgtc ttgaagtgct acg 23
<210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
actcatctcg tgctagcagt cgttcttcaa ct 32
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tgcccacgaa ggtatcttct g 21
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ggatcccttg ccgaaac 17
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tcaccaagct gacacttcta ttccctccg 29
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
cccaacccaa attcactgtg t 21
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ggtaatccca gagaaccagg 20
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
actcaaccac aaggaaaccc tatcccacat 30
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
caacaacatc ctcttcttaa ccctagt 27
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ttcatcacgc actggttcaa c 21
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gtcacccaag ttgcattttt attatc 26
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
cccagacgac accttcaac 19
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ctggtacaga cacaacagac gtt 23
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
accatcgtgg cagcagtt 18
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gcgatgaggc tattccgact ag 22
<210> 46
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
accttcctga gccttcaata tagtaacc 28
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
caactggctc ccaggtggt 19
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
tccttaacag cccggaatgg 20
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
ggcactgagg acccacgtt 19
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
aattgcgaca tacccataaa agc 23
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
tggcctctct tgttcttgct 20
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ctgatgatgt tccacctggt t 21
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
aatgtgacag agccatgcct 20
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
catagcactt gctgtaactt gtcac 25
<210> 55
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
gccaagtgtg agggctg 17
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
ggctgatgaa ctataaaagg gaag 24
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
aatgccccag tctctgtcag cactcc 26
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
ctcggatcca tctcactgc 19
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
ttggaaaaac tgcaacaaca tcat 24
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
caacttcttc aagggcccgg ct 22

Claims (10)

1.一种能够检测冠状病毒并分型的组合物，所述组合物包括：
用于荧光探针法的第一组：
如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针；
如SEQ ID NO:4所示的冠状病毒NL63上游引物、如SEQ ID NO:5所示的冠状病毒NL63下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的冠状病毒NL63探针；和
如SEQ ID NO:7所示的冠状病毒HKU1上游引物、如SEQ ID NO:8所示的冠状病毒HKU1下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的冠状病毒HKU1探针；以及
用于熔解曲线法的第二组：
如SEQ ID NO:10所示的冠状病毒229E上游引物和如SEQ ID NO:11所示的冠状病毒229E下游引物；
如SEQ ID NO:12所示的冠状病毒OC43上游引物和如SEQ ID NO:13所示的冠状病毒OC43下游引物；
如SEQ ID NO:14所示的冠状病毒MERSr-CoV上游引物和如SEQ ID NO:15所示的冠状病毒MERSr-CoV下游引物；和
如SEQ ID NO:16所示的冠状病毒SARSr-CoV上游引物和如SEQ ID NO:17所示的冠状病毒SARSr-CoV下游引物；
其中，第一组内的荧光报告基团彼此互不相同，并且第二组内的荧光报告基团彼此互不相同。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括如SEQ ID NO:18所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:19所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:20所示的内标探针。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，SEQ ID NO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO: 6所示的冠状病毒NL63探针的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO:9所示的冠状病毒HKU1探针的荧光报告基团为ROX。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，如SEQ ID NO:10所示的冠状病毒229E上游引物的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:12所示的冠状病毒OC43上游引物的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO:14所示的冠状病毒MERSr-CoV上游引物的荧光报告基团为ROX；如SEQ IDNO:16所示的冠状病毒SARSr-CoV的荧光报告基团为CY5。
5.权利要求1~4中任一项所述的组合物在制备检测冠状病毒并分型的试剂盒中的用途。
6.一种用于检测冠状病毒并分型的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1~4中任一项所述的组合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、逆转录酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述组合物中引物的用量为50~150nM；所述组合物中探针的用量为25~75nM。
9.一种用于非诊断目的的检测冠状病毒并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1）释放待测样本的核酸；
2）使用如权利要求1~4中任一项所述的组合物对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；
3）获得并分析结果。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃，时间25~35分钟，1次循环；预变性，温度为94℃，时间2~10分钟，1次循环；变性，温度为94℃，时间为10~20秒，退火，温度为60℃，时间为20~40秒，45~50次循环；熔解曲线分析，温度为50℃~95℃，每上升0.5℃采集一次荧光，1次循环。
CN202010136909.5A 2020-03-02 2020-03-02 检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途 Active CN110982942B (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010136909.5A CN110982942B (zh) 2020-03-02 2020-03-02 检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途
EP20923345.1A EP4015654A4 (en) 2020-03-02 2020-05-13 COMPOSITION, KIT AND METHOD FOR CORONAVIRUS DETECTION AND TYPING
PCT/CN2020/090054 WO2021174674A1 (zh) 2020-03-02 2020-05-13 检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒及方法
US17/891,291 US20230193407A1 (en) 2020-03-02 2022-08-19 Composition, kit, and method for detecting and typing coronaviruses

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010136909.5A CN110982942B (zh) 2020-03-02 2020-03-02 检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110982942A CN110982942A (zh) 2020-04-10
CN110982942B true CN110982942B (zh) 2020-05-22

Family

ID=70081341

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010136909.5A Active CN110982942B (zh) 2020-03-02 2020-03-02 检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230193407A1 (zh)
EP (1) EP4015654A4 (zh)
CN (1) CN110982942B (zh)
WO (1) WO2021174674A1 (zh)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110982942B (zh) * 2020-03-02 2020-05-22 圣湘生物科技股份有限公司 检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN111394520B (zh) * 2020-04-20 2020-11-17 上海国际旅行卫生保健中心(上海海关口岸门诊部) 一种基于rt-lamp技术检测新冠病毒用引物组及检测试剂盒
CN111321253A (zh) * 2020-04-26 2020-06-23 圣湘生物科技股份有限公司 检测呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法
CN111549177A (zh) * 2020-04-27 2020-08-18 广州再生医学与健康广东省实验室 用于检测SARS-CoV-2的gRNA及试剂盒
CN112111597B (zh) * 2020-04-28 2023-07-21 安徽同科生物科技有限公司 一种免核酸提取快速检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光PCR试剂盒
CN111304372B (zh) * 2020-04-29 2020-08-14 圣湘生物科技股份有限公司 检测2019新型冠状病毒突变的组合物、用途及试剂盒
CN111471800B (zh) * 2020-05-26 2021-01-08 ***(北京)国际旅行卫生保健中心 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物
CN111394522B (zh) * 2020-06-03 2020-08-28 圣湘生物科技股份有限公司 检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN111518960A (zh) * 2020-06-16 2020-08-11 河北省儿童医院 一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法
CN111808989A (zh) * 2020-06-18 2020-10-23 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种冠状病毒/流感病毒/鼻病毒核酸联合检测试剂盒及使用方法
CN111893215A (zh) * 2020-07-15 2020-11-06 四川大学华西医院 一种检测冠状病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用
CN112111603A (zh) * 2020-08-27 2020-12-22 圣湘生物科技股份有限公司 检测呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法
CN112553380A (zh) * 2020-12-31 2021-03-26 哈尔滨星云医学检验所有限公司 一种利用多重pcr技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其应用
CN113322348A (zh) * 2021-03-27 2021-08-31 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及使用方法
CN113755644B (zh) * 2021-09-24 2024-05-03 中国科学院武汉病毒研究所 一种检测新型冠状病毒Alpha和Delta突变体试剂盒及应用
CN115044704B (zh) * 2021-11-22 2023-06-16 江汉大学 一种人冠状病毒HCoV-229E的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用
CN113981152B (zh) * 2021-12-28 2022-03-25 深圳联合医学科技有限公司 检测SARS-CoV-2变异株的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN115725801B (zh) * 2022-12-02 2023-06-13 广州呼吸健康研究院 一种用于检测新冠病毒变异株的引物对、探针及试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103205509A (zh) * 2013-04-23 2013-07-17 中国检验检疫科学研究院 基于新型悬浮芯片技术的13种呼吸道病毒高通量非诊断性检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110144422B (zh) * 2019-06-17 2023-08-11 中华人民共和国无锡海关 同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒
CN110157839B (zh) * 2019-06-17 2023-06-20 中华人民共和国无锡海关 一种同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒
CN110468234A (zh) * 2019-08-09 2019-11-19 厦门安普利生物工程有限公司 用于19种人呼吸道病毒检测的多重荧光定量pcr试剂盒
CN110982942B (zh) * 2020-03-02 2020-05-22 圣湘生物科技股份有限公司 检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103205509A (zh) * 2013-04-23 2013-07-17 中国检验检疫科学研究院 基于新型悬浮芯片技术的13种呼吸道病毒高通量非诊断性检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR;Victor M Corman等;《Euro Surveill.》;20200123;第25卷(第3期);2000045 *
Molecular Diagnosis of a Novel Coronavirus (2019-nCoV) Causing an Outbreak of Pneumonia.;Daniel K.W. Chu等;《Clinical Chemistry》;20200131;第66卷(第4期);第549-555页 *
Recent advances and perspectives of nucleic acid detection for coronavirus;Minzhe Shen等;《Journal of Pharmaceutical Analysis》;20200301;第1-5页 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4015654A4 (en) 2022-12-07
EP4015654A1 (en) 2022-06-22
WO2021174674A1 (zh) 2021-09-10
CN110982942A (zh) 2020-04-10
US20230193407A1 (en) 2023-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110982942B (zh) 检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN111074011B (zh) 检测引起呼吸道感染的病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN112646934B (zh) 一种鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重荧光定量pcr检测引物及试剂盒
CN110592290A (zh) 一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒及检测方法
CN113881812B (zh) 检测SARS-CoV-2突变株的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN111455107A (zh) 用于检测猫呼吸道病原体的引物组、产品、方法及应用
CN110699489B (zh) 非洲猪瘟病毒cd2v基因的实时荧光pcr检测引物探针组、试剂盒及方法
CN113897460B (zh) 一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的核酸组合物、试剂盒及方法
CN111321253A (zh) 检测呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法
CN112011650B (zh) 中华蜜蜂囊状幼虫病毒rt-rpa检测引物和探针及试剂盒
CN111808997A (zh) 检测10种呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法
CN108504774B (zh) 一种检测鼻病毒分型和肠道病毒的方法
CN111518877B (zh) 用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量pcr检测试剂盒
CN113564280A (zh) 一种用于检测禽腺病毒i群12个血清型的raa引物及其检测方法
CN116445659A (zh) 用于检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的试剂盒及应用
CN113186312B (zh) 一种区分布鲁氏菌a19疫苗株与野毒株的分子标记
CN112501358B (zh) 一种用于检测9种儿童消化道病原体的引物探针组合及试剂盒
CN112522430A (zh) 一种同步检测29种儿童消化道感染相关病原体的引物探针组合物及试剂盒
CN110607398B (zh) 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒
CN115612753A (zh) 一种阿留申、肠炎、犬瘟热病检测的方法
CN114959081A (zh) 一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用
CN110157836B (zh) 一种检测ibrv和bvdv的引物、探针及方法
CN112111603A (zh) 检测呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法
CN116042918B (zh) 五种病毒联检组合物、试剂盒、方法及其用途
CN113981145B (zh) 一种i群禽腺病毒a、b、c、d和e种的检测方法及检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant