CN110564637B - 一种促进小麦生长的复合菌剂及应用 - Google Patents

一种促进小麦生长的复合菌剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促进小麦生长的复合菌剂及应用。所述复合菌剂是由固氮菌(Azotobacter chroococcum)N24菌液、根瘤菌(Rhizobium radiobacter)J16菌液、克雷伯氏菌(Klebsiella quasivariicola)P5菌液混合发酵后制得。本发明从小麦根际土壤中分离得到固氮菌N24、解钾菌J16、溶磷菌P5，由三种菌液混合发酵制得的复合菌剂同时具备固氮、溶磷和解钾的作用，可大幅度增加土壤中有效氮、有效磷和有效钾的含量，显著提高植物的株高、鲜重、干重、氮含量、磷含量和钾含量，促进植物生长，减少化肥的使用量，提高作物产量，在农业生产上具有重要意义。

Description

一种促进小麦生长的复合菌剂及应用
技术领域
本发明涉及植物根际促生菌技术领域，具体地，涉及一种促进小麦生长的复合菌剂及应用。
背景技术
氮、磷、钾是植物进行生长和代谢活动所必需的营养元素，对农作物高产起到了关键作用。相关文献表明，土壤中95％的磷和钙、铝、铁等离子结合形成难于溶解的化合物；而钾和钠、钙等碱金属也以铝硅酸盐形式存在，降低了钾的溶解性。因此，土壤中植物能够吸收利用的活化态磷和钾元素较少。此外，尽管每年向农田中投入大量的化肥，但植物对这些化肥的利用率只有35％左右，多余的氮肥进入地下水***，对环境造成了一定破坏。所以减少化肥使用，提高土壤中氮、磷、钾的高效利用，对作物高产和土壤生态维护等方面都具有非常重要的意义。
微生物能够在土壤营养元素转化方面发挥重要作用，例如溶磷细菌可以将不溶性的磷转化为植物可利用的形态，硅酸盐细菌则可以将钾离子从钾长石中释放出来，固氮菌能将空气中的氮气转化为铵。这些植物益生菌不仅通过活化土壤中的营养元素，增强植物对氮、磷、钾的吸收，并且部分微生物还能合成和分泌对植物生长有促进作用的物质，如吲哚-3-乙酸(IAA)、铁载体及1-氨基环丙烷-羧酸(ACC)脱氨酶等，从而促进植物的生长和发育。
如韩晓阳等(2018)从茶园采集土壤，分离得到了一株枯草芽孢杆菌，该菌株对土壤钾素的转化和释放能力较强。将分离到的该解钾菌接种到土壤后发现茶园土壤中的速效钾含量增加了约28％。通过对茶树的芽重进行测定发现，使用解钾菌后百芽重显著增加；同时，茶叶的茶多酚含量降低，而氨基酸的浓度明显提高，说明解钾菌不仅能提高茶叶产量，还能改善茶叶的品质。尽管该技术在一定程度上能够促进植物的生长，由于只添加了一种解钾菌，虽然土壤中的可利用钾含量提高了，但磷元素依然成为限制植物生长的因素，所以单一的菌株对土壤养分转化和植物生长的提升能力有限。
又如申请号为CN201610155718.7的中国专利公开了一种能促进白三叶地上组织生长的高效解磷菌及其应用，具体是采集白三叶根际土壤，利用PKO选择培养基从样本中分离纯化出一种溶磷细菌，经鉴定为阴沟肠杆菌(Enteuobactor cloacae)，该菌株在PKO培养基上能形成较大的溶磷圈。将该菌接种到白三叶上之后，宿主植物的生物量有大幅度的增加。该技术仅包含一种解磷菌，功能较为单一，只能提高土壤中磷含量。植物生长需要大量的氮、磷和钾，单一的解磷菌不能满足植物生长的需求，在推广使用中有一定的局限性。
又如Reinhold等(1993)从巴基斯坦盐碱地先锋植物禾草卡拉草(Leptochlotusca)中分离到固氮弧菌(Azoarus spp.)，证明了生长在常年不施任何氮肥的盐碱土中的卡拉草，每年的生物学产量可达到20～40t/hm2，与其中固氮弧菌的作用密切相关。在一些禾本科植物中存在着的内生固氮细菌与宿主植物在长期的共同进化过程中形成一个高效固氮体系—内生固氮体系。研究证明，内生固氮菌避免了化合态氮的抑制及土著微生物的竞争，更有利于充分发挥固氮效能，分泌固氮产物直接供给植物吸收，表现出更高的固氮效率。同时还具有分泌生长素、溶磷，增强植株抗病性、抗逆境等多方面的促进植物生长的作用。该技术由于仅包含一种固氮菌，功能较为单一，虽然能够起到固氮作用和一定的溶磷作用，但仍然不能满足植物生长需要大量氮、磷、钾的需求。
因此，筛选相关的功能微生物并研究它们对植物的促生作用，对减少钾肥使用、提高作物产量等方面具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种促进小麦生长的复合菌剂。本发明从小麦根际土壤中分离得到固氮菌N24、解钾菌J16、溶磷菌P5，三种菌对小麦的适应性较好，能在小麦根际定殖并促进小麦生长，将三种菌液混合发酵制得的混合菌液能显著提高植物生长性能。
本发明的另一目的在于提供上述复合菌剂在提高植物生长性能中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明从小麦根际土壤中分离得到一株固氮菌N24，并对其进行了形态学、生理生化特性和遗传学方面的鉴定，16S rDNA鉴定结果验证其为固氮菌(Azotobactersp.CCNWSX1904)。将该固氮菌N24于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019281。保藏地址为中国.武汉.武汉大学。通过对其固氮酶活性进行测定，结果表明该菌株的固氮酶活性较高，为152.56nmol/gh，能有效固定大气中的氮气，可大幅度的增加土壤中速效氮的含量，提高植物对氮元素的利用率，进而促进植物生长，减少化肥的使用量，提高作物产量。
本发明还从小麦根际土壤中分离得到一株解钾菌J16，并对其进行了形态学、生理生化特性和遗传学方面的鉴定，16S rDNA鉴定结果验证其为根瘤菌(Rhizobiumsp.CCNWSX1901)。将该解钾菌J16于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019279。保藏地址为中国.武汉.武汉大学。通过对钾含量进行测定，结果表明该菌株能有效溶解植物根际土壤中的难溶钾，可大幅度的增加土壤中速效钾的含量，提高植物对土壤中钾的利用率，进而促进植物生长，减少化肥的使用量，提高作物产量。
本发明还从小麦根际土壤中分离得到一株溶磷菌P5，并对其进行了形态学、生理生化特性和遗传学方面的鉴定，16S rDNA鉴定结果验证其为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.CCNWSX1902)。将该溶磷菌P5于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019280。保藏地址为中国.武汉.武汉大学。通过对磷含量进行测定，结果表明该菌株能有效溶解植物根际土壤中的难溶磷，可大幅度的增加土壤中速效磷的含量，提高植物对土壤中磷的利用率，进而促进植物生长，减少化肥的使用量，提高作物产量。
将上述三种菌的菌液按一定比例接种到LB液体培养基中，经过发酵后所得的混合菌液同时具备固氮、溶磷和解钾的作用，可大幅度增加土壤中有效氮、有效磷和有效钾的含量，显著提高植物的株高、鲜重、干重、氮含量、磷含量和钾含量，具有促进植物生长的作用。
因此，本发明请求一种促进小麦生长的复合菌剂，是由固氮菌(Azotobactersp.CCNWSX1904)N24菌液、根瘤菌(Rhizobium sp.CCNWSX1901)J16菌液、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.CCNWSX1902)P5菌液混合发酵后制得。
优选地，所述固氮菌(Azotobacter sp.CCNWSX1904)N24菌液、根瘤菌(Rhizobiumsp.CCNWSX1901)J16菌液、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.CCNWSX1902)P5菌液的体积比为(1～2)：(1～2)：(1～2)。
更优选地，所述固氮菌(Azotobacter sp.CCNWSX1904)N24菌液、根瘤菌(Rhizobium sp.CCNWSX1901)J16菌液、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.CCNWSX1902)P5菌液的体积比为2：1：1。
优选地，所述复合菌剂中三种细菌的总有效活菌数为2×108～9×108个/mL。
优选地，所述固氮菌(Azotobacter sp.CCNWSX1904)N24于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019281。
优选地，所述根瘤菌(Rhizobium sp.CCNWSX1901)J16于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019279。
优选地，所述克雷伯氏菌(Klebsiella sp.CCNWSX1902)P5于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019280。
优选地，所述发酵的培养基为LB液体培养基，由以下组分组成：终浓度为3～7g/L的酵母提取物，终浓度为8～12g/L的胰蛋白胨，终浓度为5～15g/L的NaCl，余量水。
更优选地，所述LB液体培养基由以下组分组成：终浓度为5g/L的酵母提取物，终浓度为10g/L的胰蛋白胨，终浓度为10g/L的NaCl，余量水。
优选地，所述发酵的培养条件为25～30℃、150～180rpm培养24～48h。
更优选地，所述发酵的培养条件为18℃、180rpm培养24～48h。
本发明还请求保护上述复合菌剂在提高植物生长性能中的应用。
优选地，所述提高植物生长性能包括促进植物生长，提高植物株高，提高植物干重，提高植物氮含量、钾含量、磷含量。
更优选地，所述植物为小麦。
本发明还请求保护上述复合菌剂在溶解植物根际土壤难溶钾、难溶磷中的应用。
其中，所述难溶钾为含钾硅酸盐矿物，所述难溶磷为无机磷和/或有机磷。
本发明还请求保护上述复合菌剂在提高植物根际土壤速效氮、速效钾、速效磷含量中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明从小麦根际土壤中分离得到固氮菌N24、解钾菌J16、溶磷菌P5，三种菌株对小麦的能适应性较好，能在小麦根际定殖并促进小麦生长。
(2)由三种菌液混合发酵制得的复合菌剂同时具备固氮、溶磷和解钾的作用，可大幅度增加土壤中有效氮、有效磷和有效钾的含量，显著提高植物的株高、鲜重、干重、氮含量、磷含量和钾含量，促进植物生长，减少化肥的使用量，提高作物产量，在农业生产上具有重要意义。
附图说明
图1为不同固氮菌酶活测定结果。
图2为菌株N24的***发育树。
图3为小麦接种菌株N24后株高、干重、氮含量的变化情况。
图4为菌株J16形成的解钾圈。
图5为菌株J16产IAA比色检测结果。
图6为菌株J16的***发育树。
图7为小麦接种菌株J16后株高、干重、钾含量和磷含量的变化情况。
图8为菌株P5形成的溶磷圈。
图9为菌株P5的***发育树。
图10为小麦接种菌株P5后株高、干重、氮含量和磷含量的变化情况。
图11为施加复合菌剂后小麦的生长情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
Ashby培养基：葡萄糖10g，K2HPO4 0.2g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2SO40.2g，CaCO3 5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。
解钾培养基：蔗糖5g，Na2HPO4 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeCl3 0.005g，CaCO3 0.1g，钾长石粉1g(过100目筛后无菌水浸泡3d，除去水溶性钾)，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5。
PKO无机磷培养基：葡萄糖10g，Ca3(PO4)2 5g，(NH4)SO4 0.5g，NaCl 0.2g，KCl0.2g，MgSO4·7H2O 0.3g，MnSO4 0.03g，FeSO4·7H2O 0.03g，酵母膏0.5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值6.8～7.0。
LB固体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂15g，水1000mL。
LB液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，水1000mL。
Salkowski显色液：0.5M FeCl3 1mL，H2SO4 30mL，蒸馏水50mL。
蒙金娜有机磷培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，卵磷脂0.2g，CaCO3 5g，酵母膏0.4g，琼脂15g，蒸馏水l000mL，pH值7.0～7.2。
实施例1固氮菌的筛选及鉴定
一、固氮菌的筛选
1、固氮菌初筛
2017年9月从陕西省杨凌区的农田中采集生长7个月左右的小麦植株，用力抖落小麦根部松散结合的土壤。将植株根剪下放入10mL灭菌的离心管中，注入5mL无菌水后进行超声波处理，使与植株根部紧密结合的根际土溶于水中。所采集的土样为黄壤土，样品速效磷24.03mg/kg、速效钾126.17mg/kg、碱解氮56.28mg/kg、有机质21.06g/kg、pH＝8.27。
将水溶液作一系列10倍稀释，分别取5μL稀释度为10-5、10-6和10-7的土壤悬液涂布于Ashby培养基上，于28℃培养5天。将生长出的菌株转接到LB固体培养基上保存备用。
2、固氮酶活测定
向10mL具有橡胶塞的瓶子中注入Ashby培养基并制成斜面，将上述在Ashby培养基上生长的11株菌分别接种到斜面上，于28℃下培养24h。用注射器从瓶中抽出1mL的空气，再用注射器注入1mL的C2H2，28℃下反应12h。然后从瓶子中抽出1mL的气体，利用Shimadzu GC-14C气相色谱仪测定C2H4和C2H2的峰面积，同时测定已知浓度C2H4和C2H2的峰面积并制作标准曲线，由标准曲线换算得出所生成的乙烯的量，根据公式：固氮酶活性＝C2H4摩尔数(nmol)/[菌体重量(g)*反应时间(h)]计算固氮酶活性。
试验结果表明，菌株N24(即CCNWSX1904)的固氮酶活性较高，为152.56nmol/gh(如图1所示)。
3、IAA标准曲线制作
准确称取IAA 10mg，先用少量乙醇溶解，后用去离子水定容至10mL，则得到浓度为1mg/mL的IAA标准储备液。准确吸取一定量的标准储备液至10mL容量瓶中，去离子水定容至刻度，使得到标准浓度为0、40、80、120、160、200μg/mL的IAA系列标准溶液，配置好后避光保存。取1mL各浓度标准溶液，加入等体积Salkowski比色液，避光反应30min，用紫外可见分光光度计在530nm检测吸光值，以吸光值为纵坐标，IAA浓度为横坐标，绘制标准曲线。
4、N24产IAA能力测定
将固氮菌株N24接种到装有20mL的TY液体培养基锥形瓶中，在28℃条件下，150r/min振荡培养48h。培养液于10000rpm离心10min，吸取1mL上清液，加入等体积的Salkowski显色液，室温下避光反应30min，利用紫外分光光度计测定OD530。
结果表明菌株N24能够产生IAA，其培养液中的浓度为149.23mg/L。
二、菌株N24的鉴定
1、形态特征
将N24菌株制备成菌悬液并稀释后涂布于Ashby培养基上，于28℃培养24h后观察菌落和菌体形态。
结果显示该菌革兰氏染色呈阴性，细胞卵圆状，产荚膜，不产生芽孢；在Ashby培养基上培养24h后，菌落呈圆形，边缘整齐，半透明，生长到后期菌落略显棕褐色。
2、生理生化特征
参照细菌鉴定手册对菌株N24的VP反应、碳源利用、吲哚试验等生理生化特性进行测定，其结果显示该菌株能够利用葡萄糖、枸橼酸和乳糖作为碳源生长，吲哚实验、过氧化氢酶和接触酶反应呈阳性，VP反应和甲基红实验呈阴性。
3、16S rDNA测序
采用细菌基因组提取试剂盒提取菌株N24的基因组DNA，用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(5’-TACCTTGTTACGACTT)扩增16S rDNA，经电泳检测后送公司测序，序列在NCBI数据库中进行比对。菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
菌株N24 16S rDNA序列(SEQ ID NO:1)：
GTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCCGATAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGGGCTCTTCGGACCTCACGCTATCGGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCTGTAAGCGAATACCTTGCAGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGGTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGCCTGACTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGCTCCTTGAGAGCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCGGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGTCGCGAGGCGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACC
鉴定结果：菌株N24在分类上归属于固氮菌，与Azotobacter chroococcum相似度为99.92％，菌株N24的***发育树如图2所示。
将固氮菌(Azotobacter sp.CCNWSX1904)N24于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019281。保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
三、小麦促生试验
挑选颗粒饱满的小麦种子，用70％的乙醇进行表面消毒，以无菌水冲洗至少6次，最后一次冲洗的无菌水涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，检查小麦表面消毒是否彻底。将消毒的小麦种子播种于花盆土壤中，每盆种6颗，表面覆盖约1cm土壤。试验设2个处理，处理1每个植株接1mL无菌培养基，处理2每个植株接种N24菌液(约108个/mL)1mL，每个处理3个重复。花盆放置于温室，设置培养条件为光照16h/8h、温度25℃/18℃。待小麦出苗后，每隔5天浇一次水，60天后测定植物株高、干重和氮含量。
结果如表1和图3所示，由表1可以看出，接种固氮菌的小麦的长势要明显好于未接菌对照组，接菌植物株高、干重和氮含量分别比空白对照组提高了33.7％、41.8％和57.7％。
表1小麦接种N24菌液前后植物株高、干重和氮含量的变化
株高(cm) 植物干重(g) 植物氮含量(g/kg)
对照 20.1 0.966 7.9
接菌处理 26.87 1.37 12.46
实施例2解钾菌的筛选及鉴定
一、解钾菌的筛选
1、解钾菌初筛
2017年9月从陕西省杨凌区的农田中采集生长7个月左右的小麦植株，用力抖落小麦根部松散结合的土壤。将植株根剪下放入10mL灭菌的离心管中，注入5mL无菌水后进行超声波处理，使与植株根部紧密结合的根际土溶于水中。所采集的土样为黄壤土，样品速效磷24.03mg/kg、速效钾126.17mg/kg、碱解氮56.28mg/kg、有机质21.06g/kg、pH＝8.27。
将水溶液作一系列10倍稀释，分别取5μL稀释度为10-5、10-6和10-7的土壤悬液涂布于解钾培养基上，于28℃培养5天。将能产生透明解钾圈的菌株转接到LB固体培养基上保存备用。
2、解钾能力测定
将上述有解钾圈的菌株纯化后重新接种于解钾培养基上，测定解钾圈直径D和菌落直径d。挑取D/d大于2的菌落于LB液体培养基中，于28℃下培养24h。吸取1mL上述菌悬液到50mL钾长石液体培养基中，以1mL LB培养基代替菌悬液作为对照，各处理设3个重复。在28℃、200rpm条件下培养3天后，利用火焰光度计法测定解钾细菌培养液上清中的有效钾的含量。
试验结果表明编号为J16(即CCNWSX1901)的菌株解钾圈和培养液中可溶性有效钾的含量较大，分别为3.85和224.7mg/L。菌株J16形成的解钾圈如图4所示。
3、溶解无机磷能力
将上述有解钾圈的J16菌株按1％接种于LB液体培养基中，于28℃下培养24h。吸取1mL上述菌悬液到50mL解磷液体培养基中，以1mL LB培养基代替菌悬液作为对照，各处理设3个重复。在28℃、200rpm条件下培养5天后，将5mL的培养液于10000rpm条件下离心，取1mL的上述上清液并加入5mL钼锑抗试剂，用超纯水定容到50mL后反应20min，测定OD650并计算磷含量。
试验结果表明菌株J16兼具溶磷能力，发酵液中可溶性磷的含量达到156.89mg/L。
4、J16产IAA能力测定
将具有解钾能力的J16菌株接种到装有20mL的TY液体培养基锥形瓶中，在28℃条件下，150r/min振荡培养48h。用移液器吸取50μL培养液到白色陶瓷板上，再加入50μL的Salkowski显色液，以50μL 50mg/L的IAA标准溶液作阳性对照，室温下避光反应30min后观察颜色。
结果如图5所示，表明菌株J16菌悬液与显色液反应变红，说明该菌株能产生IAA。
二、菌株J16的鉴定
1、形态特征
将J16菌株制备成菌悬液并稀释后涂布于LB固体培养基上，于28℃培养24h后观察菌落和菌体形态。
结果显示该菌革兰氏染色呈阴性，细胞呈短杆状，不产生芽孢；在LB培养基上培养24h后，菌落呈圆形，边缘整齐，菌落乳白色。
2、生理生化特征
参照细菌鉴定手册对菌株J16的VP反应、碳源利用、吲哚试验等生理生化特性进行测定，其结果显示该菌株能够以葡萄糖、枸橼酸为碳源生长，不能利用乳糖和丙二酸盐，VP反应、吲哚实验、甲基红实验和淀粉水解实验呈阴性，能产生脲酶。
3、16S rDNA测序
采用细菌基因组提取试剂盒提取菌株J16的基因组DNA，用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(5’-TACCTTGTTACGACTT)扩增16S rDNA，经电泳检测后送公司测序，序列在NCBI数据库中进行比对。菌株J16的16S rDNA序列如SEQ ID NO:2所示。
菌株J16 16S rDNA序列(SEQ ID NO:2)：
GGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCATGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGATGGCTTTTGGAGATTAGCTCGACATCGCTGTCTCGCTGCCCACTGTCACCACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCTCGGCTTATCACCGGCAGTCCCCTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTTCTGGGGCCAGCCTAACTGAAGGACATCGTCTCCAATGCCCATACCCCGAATGTCAAGAGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGTTTAATGCGTTAGCTGCGCCACCGAACAGTATACTGCCCGACGGCTAACATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTAATGGACCAGTAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGGAATTCCACTTACCTCTTCCATACTCAAGATACCCAGTATCAAAGGCAGTTCCAGAGTTGAGCTCTGGGATTTCACCCCTGACTTAAATATCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAACAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGGGCTTCTTCTCCGGATACCGTCATTATCTTCTCCGGTGAAAGAGCTTTACAACCCTAAGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTATGGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCAACGCGGGCCAATCCTTCCCCGATAAATCTTTCCCCCGTAGGGCGTATGCGGTATTAATTCCAGTTTCCCGGAGCTATTCCGCAGGAAAGGGTATGTTCCC
鉴定结果：菌株J16在分类上归属于根瘤菌，与Rhizobium radiobacter相似度为99.68％，菌株J16的***发育树如图6所示。
将根瘤菌(Rhizobium sp.CCNWSX1901)J16于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019279。保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
三、小麦促生试验
挑选颗粒饱满的小麦种子，用70％的乙醇进行表面消毒，以无菌水冲洗至少6次，最后一次冲洗的无菌水涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，检查小麦表面消毒是否彻底。将消毒的小麦种子播种于花盆土壤中，每盆种6颗，表面覆盖约1cm土壤。试验设2个处理，处理1每个植株接1mL无菌培养基，处理2每个植株接种J16菌液(约108个/mL)1mL，每个处理3个重复。花盆放置于温室，设置培养条件为光照16h/8h、温度25℃/18℃。待小麦出苗后，每隔5天浇一次水，60天后测定植物株高、鲜重、干重、氮磷钾含量。
结果如表2和图7所示，由表2可以看出，接种解钾菌的小麦对磷、钾的吸收要明显高于未接菌对照组，植物的长势更好。接菌植物株高、干重、钾含量和磷含量分别比空白对照组提高了30.2％、51.1％、24.8％和42.9％。
表2小麦接种J16菌液前后植物株高、干重、钾含量和磷含量的变化
株高(cm) 植物钾含量(g/kg) 植物干重(g) 植物磷含量(g/kg)
对照 21.03 24.82 0.95 2.42
接菌处理 27.38 30.98 1.435 3.46
实施例3溶磷菌的筛选及鉴定
一、溶磷菌的筛选
1、溶磷菌初筛
2017年9月从陕西省杨凌区的农田中采集生长7个月左右的小麦植株，用力抖落小麦根部松散结合的土壤。将植株根剪下放入10mL灭菌的离心管中，注入5mL无菌水后进行超声波处理，使与植株根部紧密结合的根际土溶于水中。所采集的土样为黄壤土，样品速效磷24.03mg/kg、速效钾126.17mg/kg、碱解氮56.28mg/kg、有机质21.06g/kg、pH＝8.27。
将水溶液作一系列10倍稀释，分别取5μL稀释度为10-5、10-6和10-7的土壤悬液涂布于PKO无机磷培养基上，于28℃培养5天。将能产生透明溶磷圈的菌株转接到LB固体培养基上保存备用。
2、溶解无机磷能力测定
将上述有溶磷圈的菌株纯化后重新接种于PKO无机磷培养基上，测定溶磷圈直径D和菌落直径d。挑取D/d大于2的菌落于LB液体培养基中，于28℃下培养24h。吸取1mL上述菌悬液到50mL解磷培养基(NBRIP培养基)中，以1mL LB培养基代替菌悬液作为对照，各处理设3个重复。在28℃、200rpm条件下培养5天后，将5mL的培养液于10000rpm条件下离心，取1mL的上述上清液并加入5mL钼锑抗试剂，用超纯水定容到50mL后反应20min，测定OD650并计算磷含量。
试验结果表明编号为P5(即CCNWSX1902)的菌株溶磷圈和发酵液中可溶性磷的含量较大，分别为2.56和231.68mg/L。菌株P5形成的溶磷圈如图8所示。
3、P5产IAA能力测定
将具有溶磷能力的P5菌株接种到装有20mL的LB液体培养基锥形瓶中，在28℃条件下，150r/min振荡培养48h。用移液器吸取50μL培养液到白色陶瓷板上，再加入50μL的Salkowski显色液，以50μL 50mg/L的IAA标准溶液作阳性对照，室温下避光反应30min后观察颜色。
结果表明菌株P5菌悬液与显色液反应变红，说明该菌株能产生IAA。
4、溶解有机磷
将P5菌株按1％接种于LB液体培养基振荡培养24h，取5μL菌悬液滴加到蒙金娜有机磷培养基上，于28℃培养5天。
结果显示在菌落周围出现了透明的溶磷圈，说明菌株P5也能溶解有机磷。
5、固氮能力检测
将菌株P5接种于LB培养基上培养24h，挑去菌落溶于无菌水制备P5菌悬液，用移液器取5μL菌悬液滴加到Ashby培养基上，于28℃培养3天。
结果表明菌株能够在Ashby无氮培养基上正常生长，表明该菌株具备一定的固氮能力。
二、菌株P5的鉴定
1、形态特征
将P5菌株制备成菌悬液并稀释后涂布于LB固体培养基上，于28℃培养24h后观察菌落和菌体形态。
结果显示该菌革兰氏染色呈阴性，细胞呈短杆状，不产生芽孢；在LB培养基上培养24h后，菌落呈圆形，边缘整齐，直径2～3mm，菌落乳白色且中心略带淡黄色。
2、生理生化特征
参照细菌鉴定手册对菌株P5的VP反应、碳源利用、吲哚试验等生理生化特性进行测定，其结果显示该菌株能以葡萄糖、枸橼酸、丙二酸盐和乳糖作为碳源生长，吲哚试验和甲基红试验呈阴性，VP反应呈阳性，能产生淀粉酶和脲酶。
3、16S rDNA测序
采用细菌基因组提取试剂盒提取菌株P5的基因组DNA，用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(5’-TACCTTGTTACGACTT)扩增16S rDNA，经电泳检测后送公司测序，序列在NCBI数据库中进行比对。菌株P5的16S rDNA序列如SEQ ID NO:3所示。
菌株P5 16S rDNA序列(SEQ ID NO:3)：
ACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTGGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTGAGGTTAATAACCTCATCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTG
鉴定结果：菌株P5在分类上归属于克雷伯氏菌，与Klebsiella quasivariicola相似度为99.85％，菌株P5的***发育树如图9所示。
将克雷伯氏菌(Klebsiella sp.CCNWSX1902)P5于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019280。保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
三、小麦促生试验
挑选颗粒饱满的小麦种子，用70％的乙醇进行表面消毒，以无菌水冲洗至少6次，最后一次冲洗的无菌水涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，检查小麦表面消毒是否彻底。将消毒的小麦种子播种于花盆土壤中，每盆种6颗，表面覆盖约1cm土壤。试验设2个处理，处理1每个植株接1mL无菌培养基，处理2每个植株接种P5菌液(约108个/mL)1mL，每个处理3个重复。花盆放置于温室，设置培养条件为光照16h/8h、温度25℃/18℃。待小麦出苗后，每隔5天浇一次水，60天后测定植物株高、鲜重、干重、氮磷钾含量。
结果如表3和图10所示，由表3可以看出，接种溶磷菌的小麦对氮磷的吸收要明显高于未接菌对照组，植物的长势更好。接菌植物株高、干重、氮含量和磷含量分别比空白对照组提高了20.2％、55.3％、31.8％和51.2％。
表3小麦接种P5菌液前后植物株高、干重、氮含量和磷含量的变化
株高(cm) 植物氮含量(g/kg) 植物干重(g) 植物磷含量(g/kg)
对照 21.12 8.57 0.94 2.44
接菌处理 25.39 11.3 1.46 3.69
实施例4复合菌剂的筛选
1、复合菌剂的制备及配比筛选
将固氮能力较强的N24、溶磷能力较强的J16和解钾能力较强的P5，三种菌株接种到LB液体培养基中，于28℃、180rpm条件下培养24～48小时。按N24：J16：P5体积比为1:1:1、2:1:1、1:2:1、1:1:2进行组合，通过溶磷、解钾和固氮能力的测定，发现N24：J16：P5＝2:1:1组合的效果最好(表4)。
表4复合菌剂不同配比对土壤氮和有效磷、钾的影响
N24：J16：P5 土壤碱解氮(mg/kg) 土壤有效钾(mg/kg) 土壤有效磷(mg/kg)
1:1:1 19.28 98.24 13.09
1:2:1 19.54 100.51 14.19
2:1:1 21.98 104.42 14.92
1:1:2 18.71 90.38 11.49
液体N24菌剂的制备：
将菌株N24按照1％的比例接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃、180rpm条件下培养36小时即为N24菌剂。
液体P5菌剂的制备：
将P5按照1％的比例接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃、180rpm条件下培养36小时即为P5菌剂。
液体J16菌剂的制备：
将J16按照1％的比例接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃、180rpm条件下培养36小时即为J16菌剂。
复合菌剂的制备：
将P5、N24和J16在牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养36小时后，按2:1:1的比例进行混合，并使混合液中三种细菌的总有效活菌数为2×108～9×108个/mL，此混合菌液即为复合菌剂。
2、小麦盆栽试验
挑选颗粒饱满的小麦种子，用70％的乙醇进行表面消毒，以无菌水冲洗至少6次，最后一次冲洗的无菌水涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，检查小麦表面消毒是否彻底。将消毒的小麦种子播种于花盆土壤中，表面覆盖约1cm土壤。试验设2个处理，处理1每盆接5mL无菌培养基，处理2每盆接种复合菌剂5mL，每个处理3个重复。花盆放置于温室，设置培养条件为光照16h/8h、温度25/18℃。待小麦出苗后，每隔5天浇一次水，60天后测定土壤有效氮、磷、钾，植物株高、鲜重、干重、氮磷钾含量。结果如表5、表6所示。
由表5可以看出，复合菌剂对于土壤中营养元素的转化效果要明显高于未接菌对照组。接种复合菌剂的土壤中全氮、碱解氮、速效磷、速效钾和有机质分别比空白对照组提高了18.4％、81.2％、99.5％、19.4％和55.7％(表5)。
表5接菌处理对土壤养分的影响
Figure GDA0002205617940000151
由表6可以看出，接种复合菌剂的小麦对氮磷钾的吸收要明显高于未接菌对照组，植物的长势更好。接种复合菌剂的植物株高、干重、氮含量、钾含量和磷含量分别比空白对照组提高了59.8％、105％、65.6％、50.3％和75.1％(表6)。
表6接菌处理对小麦生长的影响
Figure GDA0002205617940000152
Figure GDA0002205617940000161
3、利用复合微生物菌剂减少化肥使用量
向种植小麦的土壤中施加当地常规复合肥或复合菌剂，验证施加复合菌剂是否能代替复合肥，减少化肥使用量。
向土壤中施加75％复合肥作为空白对照组，施加100％复合肥作为对照组。另外向土壤中施加75％复合肥+复合菌剂作为试验组。
结果如图11所示，由图11可以看出，减少化肥的使用，小麦生长较差、叶片颜色发黄。但向减少25％化肥的土壤中加入复合微生物菌剂后，小麦的生长状况显著改善，和完全使用化肥的对照组相比，减少施肥并添加菌剂的试验组小麦长势甚至优于对照组，说明该复合微生物菌剂在不影响小麦生长的情况下能降低化肥的使用量。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种促进小麦生长的复合菌剂及应用
<140> 2019106205879
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1299
<212> DNA
<213> 固氮菌(Azotobacter chroococcum)
<400> 1
gtgagtaatg cctaggaatc tgcccgatag tgggggacaa cgtttcgaaa ggaacgctaa 60
taccgcatac gtcctacggg agaaagtggg ggctcttcgg acctcacgct atcggatgag 120
cctaggtcgg attagctagt tggtggggta aaggctcacc aaggcgacga tccgtaactg 180
gtctgagagg atgatcagtc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc 240
agcagtggga atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag 300
aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag ggctgtaagc gaataccttg 360
cagttttgac gttaccgaca gaataagcac cggctaactt cgtgccagca gccgcggtaa 420
tacgaagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggtttgg 480
taagttggat gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac tgcctgacta 540
gagtacggta gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag 600
gaacaccagt ggcgaaggcg accacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg 660
gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gactagccgt 720
tgggctcctt gagagcttag tggcgcagct aacgcattaa gtcgaccgcc tggggagtac 780
ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 840
gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta cctggccttg acatgctgag aactttccag 900
agatggattg gtgccttcgg gaactcagac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt 960
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca 1020
cctcgggtgg gcactctaag gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1080
tcaagtcatc atggccctta cggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacagag 1140
ggttgccaag tcgcgaggcg gagctaatcc cagaaaaccg atcgtagtcc ggatcgcagt 1200
ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cgaatcagaa tgtcgcggtg 1260
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacc 1299
<210> 2
<211> 1250
<212> DNA
<213> 根瘤菌(Rhizobium radiobacter)
<400> 2
ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcagcat gctgatctgc 60
gattactagc gattccaact tcatgcactc gagttgcaga gtgcaatccg aactgagatg 120
gcttttggag attagctcga catcgctgtc tcgctgccca ctgtcaccac cattgtagca 180
cgtgtgtagc ccagcccgta agggccatga ggacttgacg tcatccccac cttcctctcg 240
gcttatcacc ggcagtcccc ttagagtgcc caactaaatg ctggcaacta agggcgaggg 300
ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca 360
gcacctgttc tggggccagc ctaactgaag gacatcgtct ccaatgccca taccccgaat 420
gtcaagagct ggtaaggttc tgcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg 480
tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttt aatcttgcga ccgtactccc caggcggaat 540
gtttaatgcg ttagctgcgc caccgaacag tatactgccc gacggctaac attcatcgtt 600
tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gcacctcagc 660
gtcagtaatg gaccagtaag ccgccttcgc cactggtgtt cctccgaata tctacgaatt 720
tcacctctac actcggaatt ccacttacct cttccatact caagataccc agtatcaaag 780
gcagttccag agttgagctc tgggatttca cccctgactt aaatatccgc ctacgtgcgc 840
tttacgccca gtaattccga acaacgctag cccccttcgt attaccgcgg ctgctggcac 900
gaagttagcc ggggcttctt ctccggatac cgtcattatc ttctccggtg aaagagcttt 960
acaaccctaa ggccttcatc actcacgcgg catggctgga tcaggcttgc gcccattgtc 1020
caatattccc cactgctgcc tcccgtagga gtttgggccg tgtctcagtc ccaatgtggc 1080
tgatcatcct ctcagaccag ctatggatcg tcgccttggt aggcctttac cccaccaact 1140
agctaatcca acgcgggcca atccttcccc gataaatctt tcccccgtag ggcgtatgcg 1200
gtattaattc cagtttcccg gagctattcc gcaggaaagg gtatgttccc 1250
<210> 3
<211> 1313
<212> DNA
<213> 克雷伯氏菌(Klebsiella quasivariicola)
<400> 3
acgggtgagt aatgtctggg aaactgcctg atggaggggg ataactactg gaaacggtag 60
ctaataccgc ataacgtcgc aagaccaaag tgggggacct tcgggcctca tgccatcaga 120
tgtgcccaga tgggattagc tggtaggtgg ggtaacggct cacctaggcg acgatcccta 180
gctggtctga gaggatgacc agccacactg gaactgagac acggtccaga ctcctacggg 240
aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat gccgcgtgtg 300
tgaagaaggc cttcgggttg taaagcactt tcagcgggga ggaaggcggt gaggttaata 360
acctcatcga ttgacgttac ccgcagaaga agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc 420
ggtaatacgg agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc acgcaggcgg 480
tctgtcaagt cggatgtgaa atccccgggc tcaacctggg aactgcattc gaaactggca 540
ggctagagtc ttgtagaggg gggtagaatt ccaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc 600
tggaggaata ccggtggcga aggcggcccc ctggacaaag actgacgctc aggtgcgaaa 660
gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gctgtaaacg atgtcgattt 720
ggaggttgtg cccttgaggc gtggcttccg gagctaacgc gttaaatcga ccgcctgggg 780
agtacggccg caaggttaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 840
atgtggttta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctgg tcttgacatc cacagaactt 900
tccagagatg gattggtgcc ttcgggaact gtgagacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag 960
ctcgtgttgt gaaatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat cctttgttgc 1020
cagcggttag gccgggaact caaaggagac tgccagtgat aaactggagg aaggtgggga 1080
tgacgtcaag tcatcatggc ccttacgacc agggctacac acgtgctaca atggcatata 1140
caaagagaag cgacctcgcg agagcaagcg gacctcataa agtatgtcgt agtccggatt 1200
ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtagat cagaatgcta 1260
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtg 1313

Claims (7)

1.一种促进小麦生长的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂是由固氮菌(Azotobacter sp.)N24菌液、根瘤菌(Rhizobium sp.)J16菌液和克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)P5菌液混合发酵后制得；所述固氮菌(Azotobacter sp.)N24于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019281；所述根瘤菌(Rhizobium sp.)J16于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019279；所述克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)P5于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019280。
2.根据权利要求1所述复合菌剂，其特征在于，所述固氮菌(Azotobacter sp.)N24菌液、根瘤菌(Rhizobium sp.)J16菌液、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)P5菌液的体积比为1～2：1～2：1～2。
3.根据权利要求2所述复合菌剂，其特征在于，所述固氮菌(Azotobacter sp.)N24菌液、根瘤菌(Rhizobium sp.)J16菌液、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)P5菌液的体积比为2：1：1。
4.根据权利要求1所述复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中三种细菌的总有效活菌数为2×108～9×108个/mL。
5.根据权利要求1所述复合菌剂，其特征在于，所述发酵的培养基为LB液体培养基，由以下组分组成：终浓度为3～7g/L的酵母提取物，终浓度为8～12g/L的胰蛋白胨，终浓度为5～15g/L的NaCl，余量水。
6.根据权利要求1所述复合菌剂，其特征在于，所述发酵的培养条件为25～30℃、150～180rpm培养24～48h。
7.权利要求1至6任一项所述复合菌剂在提高植物生长性能中的应用。
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