CN114933974A - 一种拟康氏木霉c5-9及其在拮抗灰葡萄孢菌中的应用 - Google Patents

一种拟康氏木霉c5-9及其在拮抗灰葡萄孢菌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)C5‑9，保藏编号为CGMCCNo.40015，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2021年12月22日。所述的拟康氏木霉C5‑9对灰葡萄孢菌有直接的拮抗作用，所述的拟康氏木霉C5‑9可应用于防治由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起的灰霉病病害。

Description

一种拟康氏木霉C5-9及其在拮抗灰葡萄孢菌中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种拟康氏木霉C5-9及其在拮抗灰葡萄孢菌中的应用。
背景技术
由灰葡萄孢菌引起的灰霉病是世界范围内危害最为严重的真菌性病害，能够侵染包括番茄、黄瓜、草莓等蔬菜水果在内的200多种植物。灰葡萄孢菌为死体营养型病原真菌，可以产生多种植物毒素和细胞壁水解酶来杀死植物寄主细胞。由于灰葡萄孢菌具有多种侵染模式且菌核在植物残体上长期存活并产生抗药性，导致世界范围内灰霉病难于防治。据统计，每年世界上用于防治灰霉病的费用超过十亿元，即使如此，该病仍给农业带来了数十亿的经济损失。而在防治植物病害的众多技术中，生物防治是一种可持续发展的逐渐代替化学防治的良好措施。
木霉菌对灰霉病菌有不同程度的拮抗作用，木霉的生物防治机制分为直接生防机制和间接生防机制，前者主要指木霉与灰霉病菌直接作用过程中所涉及的重寄生、抗生和营养竞争，后者是木霉通过诱导植物产生***抗性来防治灰霉。因此筛选有开发利用价值的木霉菌，对于工农业生产具有重要的理论和实际意义。木霉制剂的应用范围较为广阔，但是目前的木霉制剂还存在一定的自身缺陷。木霉的最适生长温度均在25-35℃之间，低温下生长和产孢受抑，这些菌株的筛选均在常温条件进行。而灰霉病害为一种中低温病害，20-23℃为最适温度，在更低温条件下就已经生长。木霉生长适温与灰霉病的生长适温存在差异，造成冬季低温、雾霾条件下发生的灰霉病的防治效果较差，限制了木霉制剂生防效果的进一步提高及应用领域的进一步拓宽。目前国内外对低温地区的木霉菌研究少之又少。因此，开发低温的木霉制剂是解决目前木霉制剂发展瓶颈的关键，尤其我国北方季节变化明显，气温偏低，使用一般木霉菌对抗灰霉病效果甚微。因此，寻找一种在低温条件下能快速增殖并且具有很强的对抗灰霉病菌能力的木霉，对高效防治灰霉病具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种拟康氏木霉C5-9。
本发明的另一个目的是提供所述拟康氏木霉C5-9在拮抗灰葡萄孢菌中的应用。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
一种拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)C5-9，保藏编号为CGMCCNo.40015。
本发明的另一方面，还包括所述的拟康氏木霉C5-9拮抗灰葡萄孢菌中的应用。
本发明的另一方面，还包括所述的拟康氏木霉C5-9在防治由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起的灰霉病病害方面的应用。
本发明的另一方面，还包括所述的拟康氏木霉C5-9的发酵产物。
在上述技术方案中，所述发酵产物通过以下方法制备：接种拟康氏木霉C5-9孢子于PDB液体培养基中使其终浓度为1*104-1*106cfu/mL，16℃震荡培养72-96h后离心收集发酵液。
在上述技术方案中，将所述发酵液使用真空冷冻干燥机制备成干粉，冻干温度为-40℃到-55℃，冻干时间36h-42h。将干粉加水溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，得到无菌发酵产物。
本发明的另一方面，还包括所述的发酵产物在拮抗灰葡萄孢菌中的应用。
本发明的另一方面，还包括所述的发酵产物在防治由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)侵染引起的灰霉病病害方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明提供的拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)C5-9在16℃低温环境下可快速繁殖，PDA培养基对峙培养对灰葡萄孢菌的抑制率为59.7％，说明拟康氏木霉C5-9对灰葡萄孢菌有直接的拮抗作用。
2.本发明还提供了拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)C5-9在PDB发酵培养基中获得的发酵产物。96小时发酵获得的发酵产物对灰葡萄孢菌的抑制率为64％，说明拟康氏木霉C5-9在该发酵培养基中发酵产生了高效的拮抗灰葡萄孢菌的抗生物质。
附图说明
图1是菌株C5-9基于ITS序列同源性构建的***发育树
图2是实施例1中实施例组1和对照组1的平板对峙实验结果。实施例组1中上方放置菌块为拟康氏木霉C5-9，下方放置菌块为灰葡萄孢菌，对照组1中下方放置菌块为灰葡萄孢菌。图2中，A、C和B、D分别显示平板正反面。箭头所示为两组中测量的灰葡萄孢菌生长直径。
图3是实施例2中实施例组2和对照组2的灰葡萄孢菌丝生长。由图3可见拟康氏木霉C5-9发酵产物抑制了灰葡萄孢菌丝生长。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例所涉及的培养基及供试灰葡萄孢菌株：
PDA培养基(1L)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g以及水1000mL，自然pH值，115℃灭菌20min后待用。
PDB液体培养基(1L)：马铃薯200g、葡萄糖20g以及水1000mL，自然pH值，115℃灭菌20min后待用。
所用灰葡萄孢菌为已公布基因组数据菌株，编号为Botrytis cinerea,B05.10。
实施例1
拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)C5-9的筛选方法，包括以下步骤：
从河北承德兴隆县半壁山南山坡采集表层土壤样品，采用稀释涂平板的方法，利用PDA培养基进行菌株分离。称取10g土壤样品溶解于90mL无菌水中，在振荡器上180r/min充分振荡30min，静置10min，用无菌水逐级梯度稀释至10-2-10-4，分别吸取100μL稀释梯度为10-3和10-4的稀释液均匀涂布到PDA培养基上，于16℃恒温培养箱中培养，筛选具有较好低温适应性的木霉菌株。结果共分离得到不同菌落形态的木霉菌株64株，将这些菌株进行多次划线纯化获得纯培养菌株后于4℃保存。
上述获得的菌种中，C5-9是一株分类命名为拟康氏木霉(Trichodermakoningiopsis)的菌株，已于2021年12月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，菌种保藏号为CGMCC No.40015，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
将上述木霉C5-9进行分子生物学鉴定。提取该菌株基因组DNA，利用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS6(5’-GAAGGTGAAGTCGTAACAAGG-3’)扩增其ITS区(内转录间隔区)，将扩增片段进行Sanger测序。测序结果如下：
AGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAGAAATAACGTCCGCGAGGGGACTACAGAAAGAGTTTGGTTGGTCCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTATGGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACG。
将获得的C5-9菌株ITS序列与NCBI数据库公布的木霉模式菌株ITS序列进行比对，利用MEGA软件构建***发育树，结果如图1所示，C5-9与拟康氏木霉亲缘关系最近，聚集于同一个分支，确定本研究所筛选出的C5-9菌株为拟康氏木霉(Trichodermakoningiopsis)。
实施例2
采用平板对峙培养法检测实施例1获得的拟康氏木霉对灰葡萄孢菌的拮抗能力。
实施例组1：在直径90mm的PDA培养基上相距两端各1cm的地方分别接入灰葡萄孢菌和实施例1获得的拟康氏木霉C5-9，使拟康氏木霉形成直径为0.5cm的木霉菌块，使灰葡萄孢菌形成直径为0.5cm的灰霉菌块，木霉菌块和灰霉菌块沿PDA培养基的径向排列；
对照组1：在直径90mm的PDA培养基上距离边缘1cm的地方接入灰葡萄孢菌，使灰葡萄孢菌形成直径为0.5cm的灰霉菌块。上述实施例组1和对照组1各做3个平行实验。将实施例组1和对照组1于16℃培养14d观察拟康氏木霉C5-9对灰葡萄孢菌的生长抑制情况，并测定灰葡萄孢菌落直径(R)，计算抑制率。结果如图2所示，在没有拟康氏木霉C5-9的情况下，对照组1中灰葡萄孢菌16℃培养14d时已经覆盖整个平板。而实施例组1中灰葡萄孢菌的生长明显受到拟康氏木霉C5-9的抑制，图1中A显示拟康氏木霉C5-9完全覆盖了灰葡萄孢菌落。
测量图1中灰葡萄孢菌落直径，3个实施例组1所获得灰葡萄孢菌落直径的平均值和3个对照组1所获得灰葡萄孢菌落直径(R)的平均值如表1所示。实施例组1中的灰葡萄孢菌落直径(3.06±0.03cm)显著短于与对照组1中的灰葡萄孢菌落直径(7.60±0.04cm)。
表1
组别 灰葡萄孢菌落直径R(单位：cm) 抑制率
实施例组1 3.06±0.03* 59.7％
对照组1 7.60±0.04 -
*表示经Student’s t-test分析，实施例组灰葡萄孢菌斑直径与对照组相比差异显著，P<0.05.
抑制率(％)＝(R1-R2)/R1×100％，R1为对照组1所获得的灰葡萄孢菌落直径；R2为实施例组1所获得的灰葡萄孢菌落直径。
即本发明保藏编号为CGMCC No.40015的低温型拟康氏木霉(Trichodermakoningiopsis)对灰葡萄孢菌的抑制率为59.7％，可能通过重寄生、抗生和营养竞争等直接作用机制拮抗灰葡萄孢菌。
实施例3
接种拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)C5-9孢子于100mL PDB液体培养基中使其终浓度为1*106cfu/mL，16℃震荡培养96h后离心收集发酵液。将发酵液在-40℃到-55℃冷冻36h-42h获得1.5g干粉，加水溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，制备成0.3g/mL的无菌发酵产物。
配制含终浓度7.5mg/mL无菌发酵产物的PDA培养基平板(实施例组2)，未加发酵产物的PDA培养基平板作为对照(对照组2)。接种5μL浓度为1*106cfu/mL的灰葡萄孢菌孢子于实施例组2和对照组2的中心位置，16℃培养2d，3d和4d后分别测量灰葡萄孢菌斑的直径(R')。结果如图3所示，16℃培养2d，3d和4d后，与对照组2相比，实施例组2中的灰葡萄孢菌斑的生长明显受到了抑制。
述实施例组2和对照组2各做3个平行实验，测量并求取灰葡萄孢菌斑直径(R')的平均值，计算抑制率，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003638520380000051
*表示经Student’s t-test分析，实施例组2灰葡萄孢菌斑的直径与对照组2相比差异显著，P<0.05.
抑制率(％)＝(R1'-R2')/R1'×100％，R1'为对照组2所获得的灰葡萄孢菌斑的直径；R2'为实施例组2所获得的灰葡萄孢菌斑的直径。
实施例组2的灰葡萄孢菌斑的直径与对照组2相比存在显著差异，拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)C5-9在PDB培养基中发酵96h后产生的发酵产物对灰葡萄孢菌的抑制率在2d，3d和4d时分别为64.3％，54.6％和51.7％，说明保藏编号为CGMCCNo.40015拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)能够产生拮抗灰葡萄孢菌的抗生物质。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华北理工大学
<120> 一种拟康氏木霉C5-9及其在拮抗灰葡萄孢菌中的应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 399
<212> DNA
<213> Trichoderma koningiopsis
<400> 1
aggggttcga gggttgaaat gacgctcgga caggcatgcc cgccagaata ctggcgggcg 60
caatgtgcgt tcaaagattc gatgattcac tgaattctgc aattcacatt acttatcgca 120
tttcgctgcg ttcttcatcg atgccagaac caagagatcc gttgttgaaa gttttgattc 180
attttgaatt tttgctcaga gctgtaagaa ataacgtccg cgaggggact acagaaagag 240
tttggttggt ccctccggcg ggcgcctggt tccggggctg cgacgcaccc ggggcgtgac 300
cccgccgagg caacagtttg gtatggttca cattgggttt gggagttgta aactcggtaa 360
tgatccctcc gctggttcac caacggagac cttgttacg 399

Claims (8)

1.一种拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)C5-9，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.40015。
2.如权利要求1所述的拟康氏木霉C5-9拮抗灰葡萄孢菌中的应用。
3.如权利要求1所述的拟康氏木霉C5-9在防治由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起的灰霉病病害方面的应用。
4.如权利要求1所述拟康氏木霉C5-9的发酵产物。
5.如权利要求4所述的发酵产物，其特征在于，通过以下方法制备：接种拟康氏木霉C5-9孢子于PDB液体培养基中使其终浓度为1*104-1*106cfu/mL，16℃震荡培养72-96h后离心收集发酵液。
6.如权利要求5所述的发酵产物，其特征在于，将所述发酵液使用真空冷冻干燥机制备成干粉，冻干温度为-40℃到-55℃，冻干时间36h-42h。将干粉加水溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，得到无菌发酵产物。
7.如权利要求4-6中任一项所述的发酵产物在拮抗灰葡萄孢菌中的应用。
8.如权利要求4-6中任一项所述的发酵产物在防治由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起的灰霉病病害方面的应用。
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