CN114958660A - 一种多粘类芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种多粘类芽孢杆菌菌株及其应用，多粘类芽孢杆菌菌株P21于2021年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册，保藏编号为：CGMCCNo.24044；多粘类芽孢杆菌菌株P21能够应用于制备防治十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病用水剂中；多粘类芽孢杆菌菌株P21水剂的制备方法包括：菌种培养，包括试管种培养和菌种摇床扩大培养；发酵，包括种子悬浮液的制备、接种以及液体发酵。本发明的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)P21综合性状良好，可用于防治十字花科蔬菜(如大白菜和娃娃菜等)根肿病和三七根腐病，使用安全无残留。

Description

一种多粘类芽孢杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种多粘类芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术

目前，根肿病是世界农业生产中影响较大的一类土传病害，主要危害十字花科蔬菜和油菜，造成地下根部肿瘤，地上部萎焉，最后植株死亡。是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染引起的一种世界性病害。通常苗期受害，严重时幼苗枯死，产量严重下降，甚至绝收；田间一旦受到根肿病菌的侵染，土壤会长期带菌，严重危胁着十字花科作物的可持续生产。近年来根肿菌 (P.brassicae)在世界范围内发病日趋严重，尤其是在亚洲、北欧、澳大利亚、北美等地区，根肿病己成为一种十字花科作物的主要病害，随着机械化程度的不断提高、大棚温室育苗和漂浮育苗的推广，进一步加快了根肿病病害流行速度和危害范围，特别是云南、四川等地发生最为严重，油菜主产区面临的根肿病威胁更大，有些国家土地感染根肿病的面积接近100％，造成的经济损失甚至达到60％以上。

根肿菌是一种专性寄生菌，病菌以休眠孢子在土壤或根肿组织中越冬存活。根肿病侵染循环划分为休眠孢子土壤中存活、根毛侵染和皮层侵染三个阶段。生产上主要是通过杀死休眠孢子或者抑制休眠孢子萌发，例如向土壤中施入杀菌剂或生防菌剂，达到降低根毛侵染或皮层侵染，减轻根肿病发生。根肿病传播主要通过土壤、农机具、灌溉水、雨水和粪肥携带休眠孢子传播。由于根肿菌属于专性寄生菌，使得根肿病的防治极其困难，传统的防治理念是在土壤中施加生石灰或石灰氮(氰氨化钙)，提高土壤的pH值，降低根肿病发生。然而，长期施用或过量施用生石灰，除对土壤结构造成破坏外，许多情况下并不能取得良好的控病效果。生物农药具有多种优势，其来源广泛、不易产生耐药性、对人畜安全且具有良好的环境兼容性、开发利用途径多、种类繁多、研发的选择余地大等特点，为农业可持续发展提供了非常重要的研究方向并已成为全球农业生产发展的新趋势。

应用化学药剂防治作物土传病害在农业生产中发挥着重要作用，然而化学药剂的大量使用引起的药物残留、环境污染和抗药性积累等问题已经不符合农业健康可持续发展的要求，生物防治因其低成本、环境友好和无药物残留等特点已成为当前国内外防治植物土传病害的研究热点，将逐步取代传统的化学防治手段，具有较为广阔的应用前景。生物防治是指利用一种或多种微生物来抑制病原菌生命活力和繁殖能力的方法。生物防治植物病害的常见机制有：改善土壤理化性质及营养状况促进植物生长，提高植物健康水平，增强寄主植物的抗病能力；利用生防细菌、链霉菌及放线菌等拮抗微生物的寄生、拮抗作用，及其与病原菌的营养物质、生态位的竞争效应抑制和消灭病原菌；诱导寄主植物产生对病原菌的***抗性。

通过代谢组学、培养组学的前期研究基础发现，多粘类芽孢杆菌菌株P21 菌株与其它菌株(抗生素溶杆菌、绿针假单胞菌等)都有良好的兼容性，温室和田间试验证实多粘类芽孢杆菌和抗生素溶杆菌菌群组合与单一的生防菌相比，相对防效显著提高；通过KEGG途径富集分析表明，差异代谢物主要参与氨基酸代谢，胆汁酸生物合成，ABC转运蛋白，代谢物的种类及含量在白菜根肿病的生物防治中起着重要的作用。并且多粘类芽孢杆菌菌株P21能够在白菜根组织中有良好的定殖特性，对生态环境拥有着很强的适应性，更有利于蔬菜根肿病的防治。因此多粘类芽孢杆菌菌株P21有着很好的挖掘潜力和开发前景。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)现有的根肿菌防治方法中，长期施用或过量施用生石灰，除对土壤结构造成破坏外，许多情况下并不能取得良好的控病效果。

(2)现有应用化学药剂防治作物土传病害的方法中，化学药剂大量使用引起的药物残留、环境污染和抗药性积累等问题不符合农业健康可持续发展要求。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种多粘类芽孢杆菌菌株P21及其应用。

本发明是这样实现的，一种多粘类芽孢杆菌菌株P21，所述多粘类芽孢杆菌菌株P21于2021年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册，保藏编号为：CGMCCNo.24044。

本发明的另一目的在于提供一种所述的多粘类芽孢杆菌菌株P21在制备防治十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病用水剂中的应用。

进一步，所述多粘类芽孢杆菌菌株P21水剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一，菌种培养，包括试管种培养和菌种摇床扩大培养；

步骤二，发酵，包括种子悬浮液的制备、接种以及液体发酵。

进一步，所述步骤一中的试管种培养包括：

将NA培养基121℃灭菌30min后倒入9cm平板中制成NA培养基底板，接种多粘类芽孢杆菌P21，28℃培养36h。

进一步，所述NA培养基的配方为：葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，牛肉浸膏 3.0g，酵母浸膏1.0g，琼脂粉17.0～20.0g，蒸馏水1000mL。

进一步，所述步骤一中的菌种摇床扩大培养包括：

将平板种子接种茄瓶斜面NA培养基上，28℃下培养36h，获得茄瓶种子。

进一步，所述步骤二中的种子悬浮液的制备包括：

用灭菌水洗下茄瓶斜面上的菌落，得到种子悬浮液。

进一步，所述步骤二中的接种包括：

将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐培养基。

其中，所述发酵罐培养基的配方及处理方法为：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.7％，酵母膏0.1％，硫酸镁0.15％，磷酸氢二钾0.15％，甘油10％，蒸馏水1000mL，灭菌前pH 7.5。

进一步，所述步骤二中的液体发酵包括：

发酵罐培养基在接种后，培养36～48h；其中，所述发酵罐罐温为26～32℃，罐压为0.5kg/cm²，罐内搅拌速度为180rpm；在接种升压过程中，罐压不超过 1.5kg/cm²。

进一步，所述多粘类芽孢杆菌菌株P21水剂的使用方法为灌根。

结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：

本发明提供的多粘类芽孢杆菌菌株P21从云南省玉溪市通海县健康白菜根组织中分离得到，该多粘类芽孢杆菌菌株P21可制成水剂，可作用于蔬菜(白菜、娃娃菜等)和三七经济作物上，用于防治蔬菜根肿病和三七根腐病。

本发明提供的多粘类芽孢杆菌菌株P21，可制成水剂，作用于娃娃菜、白菜、三七等农作物上，通过产生次生代谢产物：丰源素、伊枯草菌素等抗菌相关物质来降解病原菌的细胞壁，对病原菌的孢子萌发和芽管伸长都有一定的抑制作用，用于防治十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病。并且本发明的水剂使用安全无残留，有助于减少化学药剂在农产品中的使用量和残留量，降低生产成本，实用性强，适用于工业化生产。

第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：

本发明提供的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)P21综合性状良好，可用于防治十字花科蔬菜(如大白菜和娃娃菜等)根肿病和三七根腐病。

第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

本发明技术方案的多粘类芽孢杆菌菌株P21从云南省玉溪市通海县健康白菜根组织中分离得到，且多粘类芽孢杆菌菌株P21已于2021年12月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册，保藏编号为 CGMCCNo.24044。多粘类芽孢杆菌菌株P21能够应用于制备防治十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病用水剂中；多粘类芽孢杆菌菌株P21水剂的制备方法包括：菌种培养，包括试管种培养和菌种摇床扩大培养；发酵，包括种子悬浮液的制备、接种以及液体发酵。本发明的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)P21 综合性状良好，可用于防治十字花科蔬菜(如大白菜和娃娃菜等)根肿病和三七根腐病，使用安全无残留。

通过代谢组学、培养组学的前期研究基础发现，多粘类芽孢杆菌菌株P21 菌株能够与其它菌株(抗生素溶杆菌、绿针假单胞菌等)都有良好的兼容性，温室和田间试验证实多粘类芽孢杆菌和抗生素溶杆菌菌群组合与单一的生防菌相比，相对防效显著提高；通过KEGG途径富集分析表明，差异代谢物主要参与氨基酸代谢，胆汁酸生物合成，ABC转运蛋白，代谢物的种类及含量在白菜根肿病的生物防治中起着重要的作用。

本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为多粘类芽孢杆菌菌株P21易培养、易分离，能够在白菜根组织中有良好的定殖特性，对生态环境拥有着很强的适应性，更有利于蔬菜根肿病的防治。因此多粘类芽孢杆菌菌株P21有着很好的挖掘潜力和开发前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的多粘类芽孢杆菌菌株P21水剂制备方法流程图；

图2是本发明实施例提供的多粘类芽孢杆菌菌株(Paenibacilluspolymyxa) P21菌落形态图；图中：A为P21纯培养后划线图；B为涂板计数下的单菌落图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种多粘类芽孢杆菌菌株及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。

本发明实施例提供的多粘类芽孢杆菌菌株P21，其分类命名为多粘类芽孢杆菌，所述多粘类芽孢杆菌菌株P21于2021年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册，保藏编号为：CGMCCNo.24044。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101，电话:010-64807355，传真: 010-64807288，电子邮件:[email protected] htp:///wcgmcc net；参据的生物材料 (株):P21；中建议的分类命名:多粘类芽孢杆菌Paenibailluspolymyxa；该生物材料(株)已于2021年12月06日由本保藏中心收到，并登记入册。根据请求，由该日起保存三十年，在期满前收到提供生物材料样品的请求后再延续保存五年。该生物材料(株)的存活性经本保藏中心于2021年12月06日检测，结果是:存活。

本发明实施例提供的多粘类芽孢杆菌菌株P21的应用为：将所述多粘芽孢杆菌菌株P21制备为水剂，用于防治十字花科蔬菜(如娃娃菜、大白菜)根肿病和三七根腐病。

如图1所示，本发明实施例提供的多粘类芽孢杆菌菌株P21水剂制备方法包括以下步骤：

S101，菌种培养，包括试管种培养和菌种摇床扩大培养；

S102，发酵，包括种子悬浮液的制备、接种以及液体发酵。

本发明实施例提供的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)P21制备为水剂，其制备方法包括如下步骤：

(1)菌种培养

a.试管种培养：将NA培养基121℃灭菌30min后倒入9cm平板中制成NA 培养基底板，接种多粘类芽孢杆菌P21，28℃培养36h；

所述NA培养基的配方为：葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，牛肉浸膏3.0g，酵母浸膏1.0g，琼脂粉17.0～20.0g，蒸馏水1000mL；

b.菌种摇床扩大培养：将平板种子接种茄瓶斜面NA培养基上，28℃下培养 24～48h，获得茄瓶种子；

(2)发酵

a.种子悬浮液的制备：用灭菌水洗下茄瓶斜面上的菌落，得到种子悬浮液；

b.接种：将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐培养基；

所述发酵罐培养基的配方及处理方法为：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.7％，酵母膏0.1％，硫酸镁0.15％，磷酸氢二钾0.15％，甘油10％，蒸馏水1000mL，灭菌前pH 7.5；

c.液体发酵：发酵罐培养基在接种后，培养36～48h。发酵罐罐温为26～32℃，罐压为0.5kg/cm²，罐内搅拌速度为180rpm。在接种升压过程中，罐压不超过 1.5kg/cm²。

本发明实施例提供的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)P21水剂的使用方法为灌根。

本发明所述的一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)P21菌株，具有以下形态特征：

多粘类芽孢杆菌菌株(Paenibacilluspolymyxa)P21菌落如图2所示，呈白色圆形，较小，表面光滑、湿润、黏稠。革兰氏染色为阳性，菌体杆状，有芽孢，最适生长温度为28℃。

实施例1：多粘类芽孢杆菌菌株P21水剂的制备。

(1)菌种培养

a.试管种培养(以下均为重量百分比)

将NA培养基(蛋白胨5.0g，蔗糖10.0g，酵母粉1.0g，牛肉浸膏3.0g，琼脂17.0～20.0g)放入试管中，蒸馏水1000mL，灭菌，做成平板，接种多粘类芽孢杆菌菌株(Paenibacilluspolymyxa)P21，28℃培养36h。

b.菌种摇床扩大培养

将平板种子接种茄瓶斜面NA培养基(培养基配方与上述步骤a相同)上， 26℃下培养48h，获得茄瓶种子。

(2)发酵

具体发酵生产过程如下：

a.种子悬浮液的制备：用灭菌水洗下茄瓶斜面上的菌落，得到种子悬浮液；

b.接种：将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐(发酵罐的培养基配方为：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.7％，酵母膏0.1％，硫酸镁0.15％，磷酸氢二钾 0.15％，甘油10％，灭菌前pH 8.0；发酵罐罐温为26～32℃，罐压为0.5kg/cm²，罐内搅拌速度为180rpm)，注意避免污染；升压时罐压不能超过1.5kg/cm²；

c.液体发酵：

发酵罐在接种后，培养36h，至菌数不再增加，立即放罐，经平板计数测定含菌量，含菌量达15亿CFU/mL；

本制剂可通过灌根方式施用于作物生长前期和发病阶段根部作为病害防控和增产措施，方法如下：作物生长前期或在病害始发期，采用生物制剂灌根于作物根部以防病控病作用。对农作物发生严重地区可在作物生长过程中追施3 次。

实施例2：多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)P21和抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)13-6的共培养兼容性试验。

所用培养基如下：

KB培养基、R₂A培养基。

试验方法：

选择两株生防菌株，一株为抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)13-6(已公开在申请号为ZL200910094763.6专利说明书中)，一株为多粘类芽孢杆菌P21，分别进行单培养及共培养：(1)P21；(2)13-6；(3)13-6+P21。每株细菌在KB 培养基上培养48h，从每个纯培养基上挑取单菌落，转入50mL KB液体培养基中，28℃，150r/min培养24h，得到种子液。按1％的比例接种13-6种子液于500mL KB液体培养基中，28℃，150r/min培养48h后，再按1％的比例接种P21种子液，28℃，150r/min共培养12h。稀释单培养及共培养的细菌培养液(10^-7)，从每个稀释液中吸取0.1mL，涂布于R₂A培养基，根据不同的菌落形态进行计数。

两株生防菌的共培养在相同浓度涂板分离中，每个生防菌的菌落数量都明显增多，说明多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)P21和抗生素溶杆菌 (Lysobacterantibioticus)13-6有着良好的兼容性，两株生防菌都能促进其他菌株的生长。

实施例3：多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)P21对不同病原菌的离体抑菌试验。

所用培养基如下：

YEM培养基、NA培养基、PDA培养基。

多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)P21的菌剂对胡萝卜软腐果胶杆菌及其它病原菌的离体抑菌试验。

供试病原菌：

包括胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、腐皮镰刀菌 (Fusariumsolani)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、蓝莓根癌病菌 (Agrobacteriumtumefactions)等，以上病原菌均由云南农业大学细菌研究室提供。

试验方法：

病原真菌的活化：将保存的病原菌菌株移至PDA培养基中，置26℃恒温条件下扩大培养，待菌丝长满培养皿时，供抑菌实验备用。

细菌的活化：将胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、蓝莓根癌病菌(Agrobacterium tumefactions) 从-80℃保存的细菌冻存管中吸取80μL菌液于NA培养基中。所有供试病原细菌都于28℃倒置培养48h，待细菌活化后挑取单菌落进行划线扩大培养，28℃倒置培养48h，供抑菌实验备用。

测定方法：

病原真菌抑菌率的测量：采用平板对峙培养法检测各个菌株对病原菌生长的抑制能力，在超净工作台内，使用打孔器将PDA上长好的病原菌制成直径为 5mm菌饼，然后将菌饼转接至PDA培养基平板中央，再用移液枪枪头将分离纯化的生防菌P21接至距病原菌2.5cm处，每皿接种一株供试细菌，共设3个重复，同时以只放病原菌菌饼的平板为对照，26℃真菌恒温培养箱培养，待培养至CK长满培养基时，测量抑菌带宽度。

病原细菌抑菌率的测量：挑取活化+病原细菌的单菌落接种于100mLNA液体培养基中，28℃160rpm振荡培养36h制备成菌悬液，将菌悬液与45℃的NA 固体培养基混匀制成带菌底板，在超净工作台将生防菌P21点接于带菌底板中央，28℃倒置培养48h，测量抑菌带宽度。

试验结果与分析：

试验结果见表1。

表1多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)P21对不同病原菌生长抑制效果测定

由表1可知，多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)P21对所供试的8 种病原细菌、真菌均有较强的拮抗作用，其中多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)P21对辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)的抑制作用最强，多粘类芽孢杆菌P21对胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)的抑制作用较强，但对烟草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)的抑制作用弱。且发现多粘类芽孢杆菌P21对病原真菌的抑制效果要优于对病原细菌的抑制效果。

实施例4：多粘类芽孢杆菌菌株P21对娃娃菜根肿病的田间防控试验。

供试作物：娃娃菜品种(金丝白)，对根肿病为感病。

供试培养基：KB液体培养基

实验地点：云南省玉溪市通海县贾梨园蔬菜试验田

生防菌剂的制备：

将多粘类芽孢杆菌菌株P21接种于装有500mL KB液体培养基三角瓶中，在摇床中(28℃，160rpm)振荡培养3d，紫外分光光度计调节菌悬液OD_600nm＝0.5，菌悬液浓度相当于1×10⁸CFU/mL以备用。

实验方法：

试验设生防菌剂处理、清水对照、农药对照3个处理，施药的方法都采用灌根法，每棵白菜根部浇灌生防菌液300mL，发病初期施第一次生防菌剂，7d 后再追施3次生防菌液，50d后进行病情调查，记录娃娃菜根肿病的发病率和病情指数，计算防效并分析结果。每个处理随机选取30棵娃娃菜进行调查，3次重复，依据根肿病发病情况进行分级(见表2)，各处理的发病率、病情指数、防病效果参照如下计算方式进行。

表2根肿病分级标准

发病率＝发病株数/总株数×100％

病情指数＝Σ(各级病株数ⅹ相对级数值)×100/(调查总株数×9)

防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％

表3生防菌剂P21对白菜根肿病的田间防效测定

由表3可知，在田间施用生防菌剂多粘类芽孢杆菌菌株(Paenibacilluspolymyxa)P21对娃娃菜根肿病的防治作用明显，防治效果72.65％。与对照及农药氰霜唑相比，施用生防菌剂多粘类芽孢杆菌菌株(Paenibacilluspolymyxa) P21的发病率和病情指数都有显著降低，防效效果表现最显著。说明生防菌剂多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)P21对娃娃菜根肿病有着很好的防治效果，并且该防效试验具有可重复性，说明该生防菌剂多粘类芽孢杆菌 (Paenibacilluspolymyxa)P21对娃娃菜根肿病具有稳定、较好的防治效果，也具备了生产上大量推广的基本条件。

实施例5：多粘类芽孢杆菌菌株P21对大棚二年生三七根腐病的防病试验。

供试作物：二年生三七

供试培养基：KB液体培养基

实验地点：文山州砚山县平远街三七农户种植大棚

生防菌剂的制备：

将多粘类芽孢杆菌菌株P21接种于装有500mL KB液体培养基三角瓶中，在摇床中(28℃，160rpm)振荡培养3d，紫外分光光度计调节菌悬液OD₆₀₀＝0.5，菌悬液浓度相当于1×10⁸CFU/mL以备用。

试验方法：

试验设生防菌剂处理、清水对照，都采用灌根法，每棵二年三七根部浇灌生防菌液500mL，7d后再追施3次生防菌液，90d后进行病情调查，记录三七根腐病的发病率和病情指数，计算防效并分析结果。每个处理的三次重复小区都随机选取10棵二年生三七进行调查，依据根腐病发病情况进行分级(见表2)，各处理的发病率、病情指数、防病效果参照如下计算方式进行。

三七根腐病的田间分级标准：0级，健康，无症状；1级,腐烂仅发生在块根表面、且0<腐烂面积占比≤10％，或腐烂已扩展至内部且5％<腐烂面积占比≤10％； 2级，腐烂已扩展至内部、且10％<腐烂面积占比≤40％，支须根无腐烂；3级，腐烂已扩展至内部、且40％<腐烂面积占比≤50％，支须根腐烂；4级，腐烂已扩展至内部、且50％<腐烂面积占比≤70％，支须根腐烂脱落；5级，腐烂已扩展至内部、且腐烂面积占比>70％直至整个块根完全腐烂，支须根腐烂。

发病率＝发病株数/总株数×100％

病情指数＝[Σ(各级病株数×各级代表值)/调查总株数/最高一级代表值] ×100

防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％

试验结果与分析

试验结果见表4。

表4多粘类芽孢杆菌菌株P21对三七根腐病的防病作用

由表4可知，施用多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)P21对二年生三七根腐病有一定的防效，显著减轻了二年生三七根腐病的发病率和病情指数。

实施例6：多粘类芽孢杆菌菌株(Paenibacilluspolymyxa)P21对大白菜根肿病的田间控病试验。

试验所用供试作物和培养基如下：

KB培养基和NA培养基

供试作物：大白菜(鲁春白1号83-1)，对十字花科蔬菜根肿病表现为感病；

防治对象：大白菜根肿病

实验地点：云南省昆明市盘龙区上大摆村大白菜根肿病试验田

生防菌剂的制备：如实施例3所述制备生防菌剂

接种方法：

试验设生防菌剂处理、清水对照、农药氰霜唑200倍液对照3个处理，施药的方法都采用灌根法，每棵白菜根部浇灌生防菌液300mL，发病初期施第一次生防菌剂，7d后再追施3次生防菌液，50d后进行病情调查，记录大白菜根肿病的发病率和病情指数，计算防效并分析结果。

根据根肿病病情分级标准：0级：无病害症状；1级：仅须根上有肿瘤；3 级：侧根上有肿瘤；5级：侧根肿瘤大且主根末梢有小的肿瘤；7级：主根全部肿大，但植株生长正常；9级：根上肿大部分开始龟裂腐烂、植株萎焉或已死亡。

病情指数＝Σ(各级病株数×相对级数值)×100/(调查总株数×最高级数值)

相对防效＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

试验结果与分析

结果见表5。

表5生防菌剂P21对大白菜根肿病的田间防效测定

由表5可知，在田间施用生防菌剂多粘类芽孢杆菌菌株(Paenibacilluspolymyxa)P21对大白菜根肿病的防治作用明显，防治效果64.19％。与对照及农药氰霜唑相比，施用生防菌剂多粘类芽孢杆菌菌株(Paenibacilluspolymyxa) P21的发病率和病情指数有显著降低。说明生防菌剂多粘类芽孢杆菌 (Paenibacilluspolymyxa)P21对白菜根肿病也有很好的防治效果，并且该防效试验具有可重复性，说明该生防菌剂多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) P21对白菜根肿病具有稳定、较好的防治效果，也具备了生产上大量推广的基本条件。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多粘类芽孢杆菌菌株P21，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌菌株P21于2021年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册，保藏编号为：CGMCCNo.24044。

2.一种如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌菌株P21在制备防治十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病用水剂中的应用。

3.如权利要求2所述的多粘类芽孢杆菌菌株P21在制备防治十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病用水剂中的应用，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌菌株P21水剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一，菌种培养，包括试管种培养和菌种摇床扩大培养；

步骤二，发酵，包括种子悬浮液的制备、接种以及液体发酵。

4.如权利要求3所述的多粘类芽孢杆菌菌株P21在制备防治十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病用水剂中的应用，其特征在于，所述步骤一中的试管种培养包括：

将NA培养基121℃灭菌30min后倒入9cm平板中制成NA培养基底板，接种多粘类芽孢杆菌P21，28℃培养36h。

5.如权利要求4所述的多粘类芽孢杆菌菌株P21在制备防治十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病用水剂中的应用，其特征在于，所述NA培养基的配方为：葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，牛肉浸膏3.0g，酵母浸膏1.0g，琼脂粉17.0～20.0g，蒸馏水1000mL。

6.如权利要求3所述的多粘类芽孢杆菌菌株P21在制备防治十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病用水剂中的应用，其特征在于，所述步骤一中的菌种摇床扩大培养包括：

将平板种子接种茄瓶斜面NA培养基上，28℃下培养36h，获得茄瓶种子。

7.如权利要求3所述的多粘类芽孢杆菌菌株P21在制备防治十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病用水剂中的应用，其特征在于，所述步骤二中的种子悬浮液的制备包括：

用灭菌水洗下茄瓶斜面上的菌落，得到种子悬浮液。

8.如权利要求3所述的多粘类芽孢杆菌菌株P21在制备防治十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病用水剂中的应用，其特征在于，所述步骤二中的接种包括：

将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐培养基；

其中，所述发酵罐培养基的配方及处理方法为：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.7％，酵母膏0.1％，硫酸镁0.15％，磷酸氢二钾0.15％，甘油10％，蒸馏水1000mL，灭菌前pH 7.5。

9.如权利要求3所述的多粘类芽孢杆菌菌株P21在制备防治十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病用水剂中的应用，其特征在于，所述步骤二中的液体发酵包括：

发酵罐培养基在接种后，培养36～48h；其中，所述发酵罐罐温为26～32℃，罐压为0.5kg/cm²，罐内搅拌速度为180rpm；在接种升压过程中，罐压不超过1.5kg/cm²。

10.如权利要求2所述的多粘类芽孢杆菌菌株P21在制备防治十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病用水剂中的应用，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌菌株P21水剂的使用方法为灌根。

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