CN115651846A - 一种木霉菌剂、生物有机肥及其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物及农业废弃物再利用技术领域，涉及一种木霉菌剂、生物有机肥及其制备方法及应用。以薄荷加工废弃物作为原料，采用哈茨木霉ZL‑811进行液态发酵，发酵后的发酵液与培养基载体混合，即得。本发明能够进行木霉高密度发酵，获得包含大量厚垣孢子的发酵物，制备木霉菌剂，随后加入腐熟有机肥，生产多功能的木霉生物有机肥料。不仅实现了薄荷加工废弃物的资源化利用，而且生产获得的木霉菌剂及多功能生物有机肥料可用于田间施用。

Description

一种木霉菌剂、生物有机肥及其制备方法及应用

技术领域

本发明属于微生物及农业废弃物再利用技术领域，涉及一种木霉菌剂、生物有机肥及其制备方法及应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

薄荷主要用于薄荷油的提取和薄荷脑的合成，目前对于提取后所剩余的薄荷药渣(即薄荷加工废弃物)的处理多以填埋或者焚烧等传统方式进行，不仅占用了大量的土地资源和资金，还排放出大量对人体健康和环境具有危害性的气体。

木霉(Trichoderma spp.)是农业生产中重要的生防菌株和植物促生菌株，它们生长迅速，对营养物质要求低，适应力强，能够很好地促进宿主植物生长和抗病性。同时，木霉还能活化土壤中的难溶的磷、钾及微量元素等，补充植物生活环境中的营养，并能通过根际定殖和产生激素促进植物生长。因此，木霉菌适用于微生物肥料的开发利用。

生物有机肥是以工农业废弃物为原料，不仅实现了工农业废弃物的资源化利用，还可以有效解决环境污染问题，是对人、畜、环境安全无毒的环保型肥料。但目前国内已公布的用于生物有机肥生产的木霉菌株种类有限，限制了生物有机肥产业的发展。基于木霉菌开发的孢子粉、发酵液等多种制剂，广泛应用于农业生产中。目前已经有许多商品化的木霉菌制剂，其中以分生孢子制剂为主。但是分生孢子制剂存在生产工艺通用性差、产品货架期短、抗土壤抑菌作用弱等不足。厚垣孢子制剂在这些方面明显好于分生孢子制剂。然而诱导木霉菌厚垣孢子大量产生比较困难，因而目前采用商品化的木霉菌制剂将薄荷加工废弃物生产微生物肥料存在一定的困难。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种木霉菌剂、生物有机肥及其制备方法及应用，本发明的哈茨木霉能够进行木霉高密度发酵，获得包含大量厚垣孢子的发酵物，制备木霉菌剂，随后加入腐熟有机肥，生产多功能的木霉生物有机肥料。不仅为薄荷加工废弃物的资源化利用提供了解决方案，而且生产获得的木霉菌剂及多功能生物有机肥料可用于田间施用，起到防治植物病虫害、促进农作物生长和改良盐碱土壤的作用，在绿色农业和生态修复方面具有良好的开发应用前景。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，一种木霉菌剂的制备方法，以薄荷加工废弃物作为原料，采用哈茨木霉ZL-811进行液态发酵，发酵后的发酵液与培养基载体混合，即得。

另一方面，一种木霉菌剂，由上述木霉菌剂的制备方法获得。

第三方面，一种生物有机肥的制备方法，以薄荷加工废弃物作为原料，采用哈茨木霉ZL-811进行固态发酵获得固体发酵物，将固体发酵物与有机肥混合，即得。

第四方面，一种生物有机肥，由上述生物有机肥的制备方法获得。

第五方面，一种上述木霉菌剂和/或生物有机肥在促进植物生长、防治植物病虫害和/或改良盐碱土壤中的应用。

研究表明：本发明提供的木霉菌剂和/或生物有机肥不仅能够有效促进小麦和黄瓜等植物的生长，而能能够显著降低土传线虫的发病率，减轻病害，还能够有效改良土壤盐渍化程度，提高土壤有机质含量，增加土壤中的微生物群落数量和多样性，增加细菌和真菌的总量。

本发明的有益效果为：

通过本发明方法发酵生产得到的哈茨木霉菌剂和生物有机肥，可产生大量的厚垣孢子，生产过程环保无污染，木霉菌剂中孢子数大于2×(10⁶-10⁸)CFU·g^-1，木霉生物有机肥中木霉孢子数大于10⁵cfu/g。它们对小麦、黄瓜等作物的促生效果好，对土传病害也有良好的田间防治效果，而且可有效改良土壤盐渍化程度。本发明技术方案为薄荷加工废弃物的资源化利用提供了一条新途径，有效解决了薄荷加工废弃物难以资源化利用的问题，通过向液体发酵液的菌剂制备和固体发酵物的生物有机肥添加，生产的木霉菌剂和木霉生物有机肥可用于田间施用，起到防治植物病虫害、促进农作物生长和改良盐碱土壤的作用，在绿色农业和生态修复方面具有良好的开发应用前景。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中薄荷加工废弃物及其粉碎过筛后的形态学观察图，A为薄荷加工废弃物，B为80～120目粉碎薄荷渣，C为200目粉碎薄荷渣；

图2为本发明实施例中哈茨木霉ZL-811固态发酵产厚垣孢子的流程(A)及显微观察图(B)；

图3为本发明实施例中哈茨木霉ZL-811液态发酵产厚垣孢子的流程(A)及显微观察图(B)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

鉴于目前商品化的木霉菌制剂将薄荷加工废弃物生产微生物肥料存在一定的困难，本发明提出了一种哈茨木霉、木霉菌剂、生物有机肥及其制备方法及应用。

本发明所述的哈茨木霉ZL-811为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ZL-811，保藏时间为2021年9月18日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.23238，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ZL-811的全基因组序列已提交NCBI DDBJ/ENA/GenBank(Accession No.JAJOLQ00000000(version JAJOLQ01000000)；BioProject:PRJNA785358；BioSample:SAMN23554013)。

本发明的一种典型实施方式，提供了一种木霉菌剂的制备方法，以薄荷加工废弃物作为原料，采用哈茨木霉ZL-811进行液态发酵，发酵后的发酵液与培养基载体混合，即得。

本发明所述的薄荷加工废弃物为经蒸馏法提取精油后薄荷废渣。薄荷废渣优选为留兰香薄荷废渣和/或椒样薄荷废渣。将薄荷废渣整理后，立刻进行高温干燥，粉碎机破碎后，过筛待用。

该实施方式的一些实施例中，以保存的哈茨木霉ZL-811为菌种，PDA平板培养，收集分生孢子作为种子液，以种子液进行液态发酵。较为具体地，接种哈茨木霉ZL-811于PDA平板，培养后产生新鲜分生孢子，用生理盐水洗涤菌丝表面，经玻璃绒纸过滤，去除菌丝体得到孢子悬液，作为种子液。更为具体地，培养温度为25～30℃，培养时间为5～15天。采用的生理盐水中，氯化钠的质量分数为0.89～0.91％，吐温(Tween)的质量分数为0.048～0.052％。

该实施方式的一些实施例中，进行液态发酵的薄荷加工废弃物颗粒为200目以上。

该实施方式的一些实施例中，液态发酵中，向基础培养基中添加质量分数为2～5％薄荷加工废弃物。基础培养基为MM培养基。

该实施方式的一些实施例中，液态发酵中，发酵温度25～30℃，溶氧为38～42L/h，发酵时间为10～15天。得到含有大量厚垣孢子的液体发酵液，所得厚垣孢子含量达到1.5×10⁹cfu/mL以上。

该实施方式的一些实施例中，培养基载体的成分为硅藻土、草炭和麸皮。

本发明的另一种实施方式，提供了一种木霉菌剂，由上述木霉菌剂的制备方法获得。

本发明的第三种实施方式，提供了一种生物有机肥的制备方法，以薄荷加工废弃物作为原料，采用哈茨木霉ZL-811进行固态发酵获得固体发酵物，将固体发酵物与有机肥混合，即得。

本发明所述的薄荷加工废弃物为经蒸馏法提取精油后薄荷废渣。薄荷废渣优选为留兰香薄荷废渣和/或椒样薄荷废渣。将薄荷废渣整理后，立刻进行高温干燥，粉碎机破碎后，过筛待用。

该实施方式的一些实施例中，以保存的哈茨木霉ZL-811为菌种，PDA平板培养，收集分生孢子作为种子液，以种子液进行液态发酵。较为具体地，接种哈茨木霉ZL-811于PDA平板，培养后产生新鲜分生孢子，用生理盐水洗涤菌丝表面，经玻璃绒纸过滤，去除菌丝体得到孢子悬液，作为种子液。更为具体地，培养温度为25～30℃，培养时间为5～15天。采用的生理盐水中，氯化钠的质量分数为0.89～0.91％，吐温(Tween)的质量分数为0.048～0.052％。

该实施方式的一些实施例中，进行固态发酵的薄荷加工废弃物颗粒为80～120目。

该实施方式的一些实施例中，固态发酵中，培养基的制备过程为：将薄荷加工废弃物与麸皮进行混合，加入氨基酸溶液，灭菌后即得。薄荷加工废弃物与麸皮的质量比为2.5～3.5:1。灭菌温度为120～125℃，灭菌时间为20～30min。

该实施方式的一些实施例中，固态发酵中，发酵温度为25～30℃，发酵时间为15～20天。该条件下，能够得到含有大量厚垣孢子的固体发酵物，所得孢子含量达到2.5×10⁹cfu/g以上。

该实施方式的一些实施例中，有机肥与固体发酵物的添加质量比为2～8％：1。

本发明的第四种实施方式，提供了一种生物有机肥，由上述生物有机肥的制备方法获得。

本发明的第五种实施方式，提供了一种上述木霉菌剂和/或生物有机肥在促进植物生长、防治植物病虫害和/或改良盐碱土壤中的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

实施例1利用薄荷加工废弃物的木霉菌株ZL-811固态发酵

(1)无菌种子液的制备

接种哈茨木霉ZL-811于PDA平板，28℃培养10天后，产生大量新鲜分生孢子；用10mL生理盐水(0.9％NaCl，0.05％Tween)洗涤菌丝表面，经玻璃绒纸过滤，去除菌丝体得到孢子悬液；用30％的甘油悬浮，充分混匀，分装到1.5mL离心管中，标记好名称和时间，-80℃冻存；取一管孢子液进行活菌计数，确定孢子液的浓度。

(2)薄荷加工废弃物的处理

在山东商河留兰香产业园中，收集经蒸馏法提取精油后的留兰香薄荷和椒样薄荷的薄荷废渣。将薄荷废渣分散整理后，立刻进行65℃高温干燥，粉碎机破碎后，过不同目数的筛子收集。其中，80目-120目的破碎废渣用于固态发酵，而200目以上的破碎废渣用于液态发酵(图1)。

(3)木霉菌株ZL-811的固态发酵

取80目-120目的薄荷废渣，与麸皮按质量比3:1混合后加入干净的平口培养瓶，每瓶加入20mL氨基酸溶液(0.1％体积比)，121℃灭菌25min；将2mL哈茨木霉种子液加入到灭菌的培养基中，摇晃均匀；28℃发酵培养15-20天，得到含有大量厚垣孢子的固体发酵物(图2)，所得孢子含量达到2.5×10⁹cfu/g以上。

实施例2利用薄荷加工废弃物的木霉菌株ZL-811液态发酵

无菌种子液的制备和薄荷加工废弃物的处理按照实施例1中所述。

以MM培养基(15g/L KH₂PO₄,5g/L (NH₄)₂SO₄,0.6g/L MgSO₄,0.6g/L CaCl₂,0.005g/L FeSO₄·7H₂O,0.0016g/L MnSO₄·H₂O,0.0014g/L ZnSO₄·7H₂O,0.0037g/LCoCl₂·6H₂O,20g/L葡萄糖，自然pH值)为基础培养基，添加质量分数为3％的200目以上的薄荷废渣；接种10mL哈茨木霉种子液到5L发酵罐中，发酵温度28℃、溶氧40L/h、发酵罐搅拌100rpm，培养10-15天，得到含有大量厚垣孢子的液体发酵液(图3)，所得厚垣孢子含量达到1.5×10⁹cfu/mL以上。

实施例3利用木霉菌株ZL-811固态发酵物制备木霉生物有机肥

取实施例1中含有厚垣孢子的木霉固体发酵物，按5％(干重比)的比例加入有机肥中,混合均匀后，40-50℃暖风干燥至含水率在15-20％左右。其中厚垣孢子含量为10⁵cfu/g以上。供试全元有机肥由金星(日照)农业科技有限公司提供，含水量≤30％，有机质≥45％、全氮4％、全磷(P₂O₅)4％、全钾(K₂O)2％、硫酸锌(ZnSO₄)0.05％、游离氨基酸(AminoAcid)1％。

木霉生物有机肥中有效活性孢子的检测：取1g肥料，取含9mL去离子水的长试管，制备孢子悬液，分别设置7个稀释浓度(10^-1-10^-7)，然后各取100μL加入到平板培养皿中，向加入菌液的平板中倒入含Triton X-100的PDA培养基，充分摇匀。待冷却凝固后，培养皿倒置放入培养箱中，28℃培养3天后进行菌落计数，完成活菌计数。

结果显示：制备的哈茨木霉ZL-811菌剂含有活性厚垣孢子孢子含量为1.9×10⁵cfu/g以上。在常温存放6个月和12个月后，活性厚垣孢子含量为1.6×10⁵cfu/g和1.2×10⁵cfu/g，保持了较高的厚垣孢子活力(表1)。

表1 ZL-811菌剂和生物有机肥不同保存期的孢子活力

实施例4利用木霉菌株ZL-811液态发酵液制备木霉菌剂

菌剂载体的制备：分别称量硅藻土3000g、草炭1500g和麸皮750g，气流粉碎并过300目筛，收集得培养基载体。

木霉菌剂的制备：取取实施例2中哈茨木霉ZL-811液体发酵液(含厚垣孢子10⁹cfu/mL)，与200g菌剂载体搅拌混匀并置于35℃下保温烘干，随后粉碎过200目筛，收集得哈茨木霉ZL-811菌剂。

取1g哈茨木霉ZL-811菌剂，取含9mL去离子水的长试管，制备孢子悬液，分别设置7个稀释浓度(10^-1-10^-7)，然后各取100μL加入到平板培养皿中，向加入菌液的平板中倒入含Triton X-100的PDA培养基，充分摇匀。待冷却凝固后，培养皿倒置放入培养箱中，28℃培养3天后进行菌落计数，完成活菌计数。

结果显示：制备的哈茨木霉ZL-811菌剂含有活性厚垣孢子孢子含量为1.1×10⁸cfu/g。在常温存放6个月和12个月后，活性厚垣孢子含量为0.9×10⁸cfu/g和0.7×10⁸cfu/g，保持了较高的厚垣孢子活力(表1)。

实施例5木霉菌株ZL-811菌剂和生物有机肥的植物促生效果

供试材料：木霉菌株ZL-811菌剂，木霉菌株ZL-811生物有机肥，小麦(济麦22)和黄瓜(津研四号)。

在实验室进行了盆栽试验。试验采取随机区组设计，设3个处理。处理组1：不施木霉生物有机肥直接播种；处理组2：将本发明实施例3制备的木霉菌株ZL-811生物有机肥按10％的比例与土壤充分混匀作为栽培用土，直接播种；处理组3：将本发明实施例4制备的木霉菌株ZL-811菌剂按1％的用量进行拌种处理。

以上处理分别种植在直径20cm、高45cm的花盆中，按每盆分别播种10粒种子，设6次重复，以不加木霉制剂为对照，一周后统计发芽率；每盆定苗3株，7天后分别测定株高、鲜重等指标。

表2 ZL-811菌剂和生物有机肥对小麦幼苗生长的影响

表3 ZL-811菌剂和生物有机肥对黄瓜幼苗生长的影响

从以上结果(表2和表3)可以看出，施用本发明方法制备的木霉菌株ZL-811菌剂和生物有机肥对小麦和黄瓜的生长都具有显著的促进作用。

实施例6木霉菌株ZL-811菌剂和生物有机肥对番茄根结线虫的防治效果

设置3个处理组。处理组1：不施木霉菌剂和生物有机肥；处理组2：施加本发明实施例3制备的木霉菌株ZL-811生物有机肥；处理组3：施加本发明实施例4制备的木霉菌株ZL-811菌剂。

番茄种子在28℃催芽，待露白后播种50株至长59cm、宽24cm的育苗盘中，用地膜覆盖，出苗后去掉地膜。移栽2周后，移入含有不同处理组的育苗盘中，同时在各处理的根上接种500条跟结线虫J2，每个处理3次重复，每个重复10株。40d后观察病情，统计番茄根系上的根结数量，并计算根结减退率。根结减退率＝(对照根结数-处理根结数)/对照根结数×100％。

表4 ZL-811菌剂和生物有机肥对根结线虫的防治效果

从以上结果(表4)可以看出，施用本发明方法制备的木霉菌株ZL-811菌剂和生物有机肥对番茄根结线虫具有显著的抑制作用。

实施例7木霉菌株ZL-811菌剂的盐碱土壤改良效果

盐碱土壤采集于黄河三角洲盐碱土壤。实验前先测定盐碱土壤性状指标。取土壤样品10kg，按1％的施加量将本发明实施例4制备得到的木霉ZL-811菌剂加入盐碱土壤中，混合均匀。处理20d后，取土壤样品再次测定土壤性状指标。

表5 哈茨木霉ZL-811菌剂对盐碱土壤的改良效果

结果显示：哈茨木霉ZL-811菌剂处理20d后，盐碱土壤的含盐量显著下降，而土壤有机质、紧实度、水稳性团聚体、含水量以及菌落数量等显著上升(表5)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种木霉菌剂的制备方法，其特征是，以薄荷加工废弃物作为原料，采用哈茨木霉ZL-811进行液态发酵，发酵后的发酵液与培养基载体混合，即得。

2.如权利要求1所述的木霉菌剂的制备方法，其特征是，以保存的哈茨木霉ZL-811为菌种，PDA平板培养，收集分生孢子作为种子液，以种子液进行液态发酵。

3.如权利要求1所述的木霉菌剂的制备方法，其特征是，液态发酵中，向基础培养基中添加质量分数为2～5％薄荷加工废弃物。

4.一种木霉菌剂，其特征是，由权利要求1～3任一所述的木霉菌剂的制备方法获得。

5.一种生物有机肥的制备方法，其特征是，以薄荷加工废弃物作为原料，采用哈茨木霉ZL-811进行固态发酵获得固体发酵物，将固体发酵物与有机肥混合，即得。

6.如权利要求5所述的生物有机肥的制备方法，其特征是，以保存的哈茨木霉ZL-811为菌种，PDA平板培养，收集分生孢子作为种子液，以种子液进行液态发酵；优选地，接种哈茨木霉ZL-811于PDA平板，培养后产生新鲜分生孢子，用生理盐水洗涤菌丝表面，经玻璃绒纸过滤，去除菌丝体得到孢子悬液，作为种子液。

7.如权利要求5所述的生物有机肥的制备方法，其特征是，固态发酵中，培养基的制备过程为：将薄荷加工废弃物与麸皮进行混合，加入氨基酸溶液，灭菌后即得。

8.如权利要求5所述的生物有机肥的制备方法，其特征是，有机肥与固体发酵物的添加质量比为2～8％：1。

9.一种生物有机肥，由权利要求5～8任一所述的生物有机肥的制备方法获得。

10.一种权利要求4所述的木霉菌剂和/或权利要求9所述的生物有机肥在促进植物生长、防治植物病虫害和/或改良盐碱土壤中的应用。

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