CN111492052A - 细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

作为使神经嵴细胞增殖而不降低分化能力的技术，本申请提供了神经嵴细胞的制造方法，其包括(1)获得神经嵴细胞的工序，和(2)在包含GSK3β抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中悬浮培养神经嵴细胞的工序，该培养基包含显示与超过1μM、低于5μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂。

Description

细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及神经嵴细胞的制造方法及增殖方法，培养基，冷冻保存物，以及自神经嵴细胞制造各种细胞的方法。详言之，本发明涉及神经嵴细胞的制造方法及增殖方法以及在所述方法中使用的培养基，包含神经嵴细胞的冷冻保存物，以及可自神经嵴细胞分化诱导得到的各种细胞的制造方法。
发明背景
神经嵴细胞(Neural Crest Cell:NCC)，是指在发育早期自神经板形成神经管时，在神经外胚层和表皮外胚层之间发生的细胞，其具有分化为神经细胞、胶质细胞、间充质基质细胞、骨细胞、软骨细胞、角膜细胞及色素细胞等多种细胞的多能性(multipotency)以及自我增殖能力。这样的多能性(multipotency)及自我增殖能力显示出神经嵴细胞作为再生医疗中的细胞药物的有用性，对高效地维持或增殖神经嵴细胞的技术存在需求。
非专利文献1中，记载了自人诱导性多能性细胞(iPSC)诱导神经嵴细胞，进一步自神经嵴细胞诱导间充质基质细胞等。非专利文献1中，神经嵴细胞的维持培养使用添加TGFβ抑制剂、表皮生长因子(EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，也称为“FGF2”)的培养基，采用粘附培养来进行。
另外，非专利文献2中，记载了由鸡胚神经管诱导神经嵴细胞，且进一步自神经嵴细胞诱导胶质细胞等。在非专利文献2中，神经嵴细胞的维持培养使用添加鸡胚提取物、***(IGF)、bFGF及视黄酸(RA)的培养基，通过悬浮培养来进行。
非专利文献3中，记载了自人胚胎干细胞(ESC)或人iPSC诱导神经嵴细胞，进一步自神经嵴细胞诱导平滑肌细胞等。非专利文献3中，神经嵴细胞的维持培养使用添加GSK3β抑制剂及TGFβ抑制剂的培养基，通过粘附培养来进行。
进一步地，非专利文献4中，记载了自人iPSC诱导神经嵴细胞，并通过使用添加GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、EGF及bFGF的培养基通过粘附培养或悬浮培养而维持。非专利文献4报道了通过粘附培养进行维持培养时，培养细胞团中的神经嵴细胞的数及比例，其在bFGF的浓度为0pg/ml-10ng/ml的范围中浓度依赖性地减少(参照图5A～C)。另外，通过悬浮培养进行维持培养时，使用1μM的CHIR99021作为GSK3β抑制剂培养7天，确认Sox10阳性细胞的存在，但不清楚该细胞是否具有多能性(multipotency)。
需要注意，非专利文献1～4中的任一篇都没有记载通过使用添加超过1μM的浓度的CHIR99021和bFGF的培养基而悬浮培养神经嵴细胞并由此使其维持并增殖。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1Fukuta M等人，＂Derivation of mesenchymal stromal cells frompluripotent stem cells through a neural crest lineage using small moleculecompounds with defined media.＂，PLoS One，2014，9(12):e112291.
非专利文献2Kerosuo L等人，＂Crestospheres:Long-Term Maintenance ofMultipotent，Premigratory Neural Crest Stem Cells.＂，Stem Cell Reports，2015，5(4):499-507.
非专利文献3Menendez L等人，＂Wnt signaling and a Smad pathway blockadedirect the differentiation of human pluripotent stem cells to multipotentneural crest cells.＂，Proc.Natl.Acad.Sci.，2011，108(48):19240-5.
非专利文献4Horikiri T等人，＂SOX10-Nano-Lantern Reporter Human iPS Cells；AVersatile Tool for Neural Crest Research.＂，PLoS One，2017，12(1):e0170342.
发明概述
发明要解决的技术问题
神经嵴细胞本来具备分化为神经细胞、胶质细胞、间充质基质细胞、骨细胞、软骨细胞、角膜细胞及色素细胞等多种细胞的多能性(multipotency)，但已知在培养下，多能性(multipotency)会逐渐降低，
可分化的细胞种类减少。
本发明的主要目的在于提供用于长期培养维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞并使之增殖的技术。
用于解决技术问题的手段
为解决上述技术问题，本发明提供以下的[1]～[21b]。
[1]、神经嵴细胞的制造方法，其包括以下的工序：
(1)获得神经嵴细胞的工序，
(2)在包含GSK3β抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中悬浮培养神经嵴细胞的工序，该工序中的所述培养基包含显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂。
[1a]、根据[1]的制造方法，其中所述GSK3β抑制剂的浓度是显示与超过1μM、低于5μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度。
[1b]、根据[1]的制造方法，其中所述效果基于GSK3β抑制剂的GSK3β抑制活性来评价，GSK3β抑制剂的GSK3β抑制活性按照以下的流程确定：
(i)对于在GSK3β的控制下报道基因表达被抑制的细胞，在GSK3β抑制剂存在及不存在下进行培养的流程，
(ii)测定在GSK3β抑制剂存在及不存在下报道基因的表达量的流程，及，
(iii)基于在GSK3β抑制剂存在下报道基因的表达量相对于在GSK3β抑制剂不存在下报道基因的表达量的增加量，确定GSK3β抑制剂的GSK3β抑制活性的流程。
[2]、根据[1]的制造方法，其中所述培养基进一步包含TGFβ抑制剂。
[3]、根据[1]的制造方法，其中所述培养基为CDM培养基。
[4]、根据[1]的制造方法，其中所述培养基进一步包含表皮生长因子(EGF)。
[5]、根据[1]的制造方法，其中所述GSK3β抑制剂为选自以下的至少一者：CHIR99021，CP21R7，CHIR98014，LY2090314，肯帕罗酮(Kenpaullone)，AR-AO144-18，TDZD-8，SB216763，BIO，TWS-119及SB415286。
[6]、根据项5的制造方法，其中所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。[6a]、根据项6的制造方法，其中CHIR99021的浓度为超过1μM、低于5μM。
[6b]、根据项6a的制造方法，其中CHIR99021的浓度为2μM以上、4.5μM以下。
[6c]、根据项5的制造方法，其中所述GSK3β抑制剂为CP21R7。
[6d]、根据项6c的制造方法，其中CP21R7的浓度为0.5μM以上、1μM以下。
[7]、根据项2的制造方法，其中所述TGFβ抑制剂为选自以下的至少一者：SB431542，A83-01，LDN193189，Wnt3a/BIO，BMP4，GW788388，SM16，IN-1130，GW6604及SB505124。
[7a]、根据[1]-[7]的任一项的制造方法，其中所述bFGF的浓度为20-40ng/ml。
[8]、根据[1]的任一项的制造方法，其中所述工序(2)中，神经嵴细胞在接种后每5-8天传代。
[9]、根据[1]的任一项的制造方法，其中所述工序(1)为诱导从干细胞分化为神经嵴细胞的工序。
[10]、神经嵴细胞的增殖方法，其包含以下工序：
(I)在包含GSK3β抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中悬浮培养神经嵴细胞的工序，所述培养基包含显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂。
[10a]、根据[10]的增殖方法，其中所述GSK3β抑制剂的浓度是显示与超过1μM、低于5μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度。
[10b]、根据[10]的增殖方法，其中所述培养基进一步包含TGFβ抑制剂。
[10c]、根据[10]的增殖方法，其中所述培养基为CDM培养基。
[10d]、根据[10]的增殖方法，其中所述培养基进一步包含表皮生长因子(EGF)。
[10e]、根据[10]的增殖方法，其中所述GSK3β抑制剂为选自以下的至少一者：CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、肯帕罗酮、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及SB415286。
[10f]、根据[10e]的增殖方法，其中所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。
[10g]、根据[10f]的制造方法，其中CHIR99021的浓度为超过1μM、低于5μM。
[10h]、根据[10g]的制造方法，其中CHIR99021的浓度为2μM以上、4.5μM以下。
[10i]、根据[10e]的制造方法，其中所述GSK3β抑制剂为CP21R7。
[10j]、根据[10i]的制造方法，其中CP21R7的浓度为0.5μM以上、1μM以下。
[10k]、根据[10b]的增殖方法，其中所述TGFβ抑制剂为选自以下的至少一者：SB431542，A83-01，LDN193189，Wnt3a/BIO，BMP4，GW788388，SM16，IN-1130，GW6604及SB505124。
[10l]、[10]的增殖方法，其中所述工序(I)中，神经嵴细胞在接种后每5-8天传代。
[11]、一种培养基，其为包含GSK3β抑制剂、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及神经嵴细胞的培养基，其中包含显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂。
[11a]、根据[11]的培养基，其中所述GSK3β抑制剂的浓度是显示与超过1μM、低于5μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度。
[12]、根据[11]的培养基，其中进一步包含TGFβ抑制剂。
[13]、根据[11]的培养基，其中所述培养基为CDM培养基。
[14]、根据[11]的培养基，其中进一步包含表皮生长因子(EGF)。
[15]、根据[11]的培养基，其中所述GSK3β抑制剂为选自以下的至少一者：CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、肯帕罗酮、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及SB415286。
[16]、根据[15]的培养基，其中所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。
[16a]、根据[16]的培养基，其中CHIR99021的浓度为超过1μM、低于5μM。
[16b]、根据[16a]的培养基，其中CHIR99021的浓度为2μM以上、4.5μM以下。
[16c]、根据[15]的培养基，其中所述GSK3β抑制剂为CP21R7。
[16d]、根据[16c]的制造方法，其中CP21R7的浓度为0.5μM以上、1μM以下。
[17]、根据[12]的培养基，其中所述TGFβ抑制剂为选自以下的至少一者：SB431542，A83-01，LDN193189，Wnt3a/BIO，BMP4，GW788388，SM16，IN-1130，GW6604及SB505124。
[18]、一种冷冻保存物，其包含通过根据项1的制造方法获得的神经嵴细胞。
[18a]、根据[18]的冷冻保存物，其通过以下工序获得：
将通过根据[1]的工序获得的神经嵴细胞分离的工序，及将所分离的神经嵴细胞悬浮于细胞保存液中并冷冻的工序。
[19]、神经细胞、胶质细胞、间充质基质细胞、骨细胞、软骨细胞、角膜细胞或色素细胞的制造方法，其包括以下的工序：
(i)在包含GSK3β抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中悬浮培养神经嵴细胞的工序，该工序中的所述培养基包含显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂，及，
(ii)将通过工序(i)可获得的神经嵴细胞分化为选自以下的至少一种细胞的工序：神经细胞、胶质细胞、间充质基质细胞、骨细胞、软骨细胞、角膜细胞及色素细胞。
[19a]、根据[19]的制造方法，其中所述GSK3β抑制剂的浓度是显示与超过1μM、低于5μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度。
[19b]、根据[19]的制造方法，其中所述培养基进一步包含TGFβ抑制剂。
[19c]、根据[19]的制造方法，其中所述培养基为CDM培养基。
[19d]、根据[19]的制造方法，其中所述培养基进一步包含表皮生长因子(EGF)。
[19e]、根据[19]的制造方法，其中所述GSK3β抑制剂为选自以下的至少一者：CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、肯帕罗酮、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及SB415286。
[19f]、根据[19e]的制造方法，其中所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。
[19g]、根据[19f]的培养基，其中CHIR99021的浓度为超过1μM、低于5μM。
[19h]、根据[19g]的培养基，其中CHIR99021的浓度为2μM以上、4.5μM以下。
[19i]、根据[19e]的培养基，其中所述GSK3β抑制剂为CP21R7。
[19j]、根据[19i]的制造方法，其中CP21R7的浓度为0.5μM以上、1μM以下。
[19k]、根据[19b]的制造方法，其中所述TGFβ抑制剂为选自以下的至少一者：SB431542，A83-01，LDN193189，Wnt3a/BIO，BMP4，GW788388，SM16，IN-1130，GW6604及SB505124。
[19l]、[19]的制造方法，其中所述工序(i)中，神经嵴细胞在接种后每5-8天传代。
[20]、长期培养具有多能性的神经嵴细胞的方法，其包括以下工序：(1)获得神经嵴细胞的工序，
(2)在包含GSK3β抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子的培养基中悬浮培养神经嵴细胞的工序，该工序中的所述培养基包含显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂。
[20a]、根据[20]的培养方法，其中所述GSK3β抑制剂的浓度是显示与超过1μM、低于5μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度。
[20b]、根据[20]的培养方法，其中所述培养基进一步包含TGFβ抑制剂。
[20c]、根据[20]的增殖方法，其中所述培养基为CDM培养基。
[20d]、根据[20]的增殖方法，其中所述培养基进一步包含表皮生长因子(EGF)。
[20e]、根据[20]的增殖方法，其中所述GSK3β抑制剂为选自以下的至少一者：CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、肯帕罗酮、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及SB415286。
[20f]、根据[20e]的增殖方法，其中所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。
[20g]、根据[20f]的制造方法，其中CHIR99021的浓度为超过1μM、低于5μM。
[20h]、根据[20g]的制造方法，其中CHIR99021的浓度为2μM以上、4.5μM以下。
[20i]、根据[20e]的制造方法，其中所述GSK3β抑制剂为CP21R7。
[20j]、根据[20i]的制造方法，其中CP21R7的浓度为0.5μM以上、1
μM以下。
[20k]、根据[20b]的增殖方法，其中所述TGFβ抑制剂为选自以下的至少一者：SB431542，A83-01，LDN193189，Wnt3a/BIO，BMP4，GW788388，SM16，IN-1130，GW6604及SB505124。
[20l]、根据[20]的增殖方法，其中所述工序(I)中，神经嵴细胞在接种后每5-8天传代。
[21]、一种培养基用于长期培养具有多能性的神经嵴细胞的用途，
所述培养基包含碱性成纤维细胞生长因子、以及显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂。
[21a]、碱性成纤维细胞生长因子与显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂在神经嵴细胞的培养中的用途。
[21b]、碱性成纤维细胞生长因子与显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂用于制造神经嵴细胞培养基的用途。
本说明书中，“多能性(pluripotency)”是指可分化为具备各种不同形态或功能的组织、细胞，且可分化为任何***的3胚层细胞的能力。
“多能性(pluripotency)”无法分化为胚盘，因此不具有形成个体的能力，就这一点而言，“多能性”与可分化为包括胚盘在内的生物体的任何组织的“全能性(totipotency)”有所区别。
“多能性(multipotency)”是指可分化为多个限定数量的***的细胞的能力。例如间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞是多能性(multipotent)的，但不是多能性(pluripotent)的。神经嵴细胞具有分化为神经细胞、胶质细胞、间充质基质细胞、骨细胞、软骨细胞、角膜细胞及色素细胞等细胞的多能性(multipotency)。
本说明书中，“培养”是指将细胞维持于体外环境中并使其增殖(生长)和/或分化。“培养”是指在组织外或体外(例如细胞培养皿或烧瓶中)维持细胞，使其增殖(生长)和/或分化。
“粘附培养”是指在使细胞附着于容器的状态下，例如在适当的培养基的存在下使细胞附着于灭菌塑料(或经涂布的塑料)的细胞培养皿或***状态下进行培养。
另外，“悬浮培养”是指细胞在不使细胞附着于容器的状态下在适当的培养基中、在由单一细胞或2种以上的细胞构成的细胞团(cellsphere)而分散的状态下培养。
“扩大培养”是指以使所需的细胞增殖为目的进行的培养。
“GSK3β抑制剂”是指具有抑制GSK3β(糖原合成酶3β)的活性的物质。GSK3(糖原合成酶3)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的一种，其与糖原的产生、细胞凋亡、干细胞的维持等多种信号通路相关。GSK3中存在α和β两种同种型。本发明中的所用的“GSK3β抑制剂”，只要具有GSK3β抑制活性则无特别限定，也可为同时具有GSK3β抑制活性和GSK3α抑制活性的物质。
“TGFβ抑制剂”是指对于TGFβ(转化生长因子β)具有抑制活性的物质。TGFβ是与2种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶型受体结合的细胞因子，通过以Smad(R-Smad)的活化为主的信号传导来控制细胞增殖、细胞分化、细胞死亡等。作为具有TGFβ抑制活性的物质，可例举抑制TGFβ与其受体结合的物质，或抑制TGFβ结合至受体后的下游信号的物质。作为该下游信号，可例举TGFβII型受体所致TGFβI型受体的磷酸化、磷酸化TGFβI型受体所致的Smad磷酸化等。本发明中所用的“TGFβ抑制剂”只要具有TGFβ抑制活性则不作特别限定。
本说明书中，“标记”是指“标记蛋白”或“标记基因”，是在特定的细胞型中细胞表面、细胞质内及/或核内等特异性表达的蛋白或其基因。标记可为阳性选择标记或阴性选择标记。优选地，标记为细胞表面标记、特别是细胞表面阳性选择标记时，可实施活细胞的浓缩、分离及/或检测。
标记蛋白的检测可利用对该标记蛋白具有特异性的抗体进行免疫学分析来实施，所述免疫学分析例如为ELISA、免疫染色、流式细胞分析等。对于标记蛋白具有特异性的抗体的实例包括与标记蛋白中的特定氨基酸序列或标记蛋白所结合的特定糖链等结合的抗体。另外，对于表达于细胞内、且不出现在细胞表面的标记蛋白(例如转录因子或其亚单位等)而言，可使该标记蛋白与报道蛋白一起表达，并通过检测该报道蛋白来检测作为对象的标记蛋白(例如非专利文献4)。该方法在无法认定适当的细胞表面标记时可优选使用。标记基因的检测可利用该领域公知的核酸扩增方法及/或核酸检测方法来实施，所述方法例如为RT-PCR、微阵列、生物芯片及RNAseq等。
本说明书中，“表达(expression)”是指由细胞内的启动子所驱动的特定的核苷酸序列的转录及/或翻译。
本说明书中，“包含/含有(comprise(s)或comprising)”是指包含该语句之后的要素、但不限于此。因此，虽然其意味着包含其语句之后的要素，但不意味着排除其它的任意要素。
本说明书中，“约”或“大约”表示相对于基准值分别加或减30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％乃至1％的值。优选地，“约”或“大约”的用语表示相对于基准值分别加或减15％、10％、5％、或1％的范围。
发明的效果
通过本发明，提供用于长期培养维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞并使其增殖的技术。
附图说明
【图1】为显示神经嵴细胞的扩大培养开始后的总细胞数的变化的图(实施例1)。纵轴表示总细胞数，“1.E+”表示10的乘方。例如“1.E+04”表示10000个。横轴为培养天数。
【图2】为显示神经嵴细胞的扩大培养开始后的SOX10表达阳性细胞率的变化的图(实施例1)。纵轴表示SOX10表达阳性细胞率(％)，横轴表示培养天数。
【图3】为显示以bFGF及EGF的浓度为20ng/ml(A)或40ng/ml(B)、CHIR99021的浓度为1、2、3或5μM(分别表示1×，2×，3×，5×)进行神经嵴细胞的扩大培养时测得总细胞数的变化结果的图(实施例2)。纵轴表示总细胞数，“1.E+”表示10的乘方。例如“1.E+04”表示10000个。横轴表示培养天数。
【图4】为显示以bFGF及EGF的浓度为40ng/ml、CHIR99021的浓度为3、3.5、4、4.5或5μM进行神经嵴细胞的扩大培养时测得总细胞数的变化结果的图(实施例2)。纵轴表示总细胞数，“1.E+”表示10的乘方。
【图5】为显示以bFGF及EGF的浓度为20ng/ml(A)或40ng/ml(B)、CHIR99021的浓度为1、2、3或5μM(分别表示1×，2×，3×，5×)进行神经嵴细胞的扩大培养时测得SOX10表达阳性细胞率的变化结果的图(实施例2)。纵轴表示SOX10表达阳性细胞率(％)，横轴表示培养天数。
【图6】为显示bFGF及EGF的浓度为40ng/ml、CHIR99021的浓度为3、3.5、4、4.5或5μM时进行神经嵴细胞的扩大培养时测得SOX10表达阳性细胞率的变化结果的图(实施例2)。纵轴表示SOX10表达阳性细胞率(％)，横轴表示培养天数。
【图7】为显示作为GSK3β抑制剂使用CP21R7进行神经嵴细胞的扩大培养开始后的SOX10表达阳性细胞率的变化的图(实施例3)。纵轴表示SOX10表达阳性细胞率(％)，横轴表示培养天数。
【图8】为显示以bFGF的浓度为10、12.5、15.0、17.5ng/ml进行神经嵴细胞的扩大培养时测得总细胞数的变化结果的图(实施例8)。纵轴表示总细胞数，“1.E+”表示10的乘方。
【图9】为显示以bFGF的浓度为10、12.5、15.0、17.5ng/ml进行神经嵴细胞的扩大培养时测得SOX10表达阳性细胞率的变化结果的图(实施例8)。纵轴表示SOX10表达阳性细胞率(％)，横轴表示培养天数。
具体实施方式
以下对于适于实施本发明的方式进行说明。需要说明，以下说明的实施方式，仅为显示本发明的代表性实施方式的例子，本发明的范围并不因此被狭窄解释。
[神经嵴细胞的制造方法及增殖方法]
本发明所涉及的神经嵴细胞的制造方法包括以下的工序。特别是，其中工序(2)为本发明所涉及的神经嵴细胞的增殖方法。
(1)获得神经嵴细胞的工序，
(2)在包含GSK3β抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中悬浮培养神经嵴细胞的工序，该工序中的所述培养基包含显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂。
[获得神经嵴细胞的工序(1)]
获得神经嵴细胞的工序(1)，是获得供应工序(2)的神经嵴细胞的工序。工序(1)中的获得神经嵴细胞的方法无特别限定，可例举诱导从干细胞分化为神经嵴细胞的方法、购入市售的神经嵴细胞的方法、及采集天然存在的神经嵴细胞的方法等。
本发明的一个实施方式中，为了获得供应工序(2)的神经嵴细胞，可诱导从干细胞分化为神经嵴细胞。
本发明中可使用的“干细胞(stem cell)”的实例包括例如多能性干细胞(pluripotent stem cell)。本发明中可使用的“多能性干细胞(pluripotent stem cell)”是指具有能够分化为生物体的具有各种不同形态或功能的组织或细胞、且具有分化为3胚层(内胚层，中胚层，外胚层)的任何***的细胞的能力干细胞。对其没有特别限定，但可例举胚胎干细胞(ESC)、源自核移植得到的克隆胚的胚胎干细胞、***干细胞、胚胎生殖细胞、人工多能性干细胞(本说明书中有时称为“iPSC”)等。另外，本发明中可使用的“多能性干细胞(multipotent stem cell)”是指具有可分化为多个限定数量的***的细胞的能力的干细胞。本发明中可使用的“多能性干细胞(multipotent stem cell)”的实例包括例如牙髓干细胞、源自口腔粘膜的干细胞、毛囊干细胞、培养源自成纤维细胞、骨髄干细胞的体干细胞等。优选的多能性干细胞(pluripotent stem cell)为ESC及iPSC。
“ESC”若为小鼠ESC，则可利用InGenious Targeting Laboratory公司、理研(理化学研究所)等建立的各种小鼠ESC株；若为人ESC，则可利用威斯康星大学、NIH、理研、京都大学、国立成育医疗研究中心及Cellartis公司等建立的各种人ESC株。例如人ESC株的实例包括ESI Bio社分开出售的CHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等，WiCellResearch分开出售的H1株、H9株等，理研分开出售的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。
“人工多能性干细胞”是指向哺乳动物体细胞或未分化干细胞导入特定的因子(核初始化因子)并进行再编程而获得的细胞。目前有各种各样的“人工多能性干细胞”，除了山中(Yamanaka)等人通过向小鼠成纤维细胞中导入Oct3/4·Sox2·Klf4·c-Myc这四种因子而建立的iPSC(Takahashi K，Yamanaka S.，Cell，(2006)126:663-676)之外，还可使用以下细胞：将同样的四种因子导入人成纤维细胞而建立的人细胞来源的iPSC(Takahashi K，Yamanaka S.，et al.Cell，(2007)131:861-872.)；将上述四种因子导入后，以Nanog的表达作为指标来筛选而建立的Nanog-iPSC(Okita，K.，Ichisaka，T.，and Yamanaka，S.(2007).Nature 448，313-317.)；以不含c-Myc的方法制备的iPSC(Nakagawa M，Yamanaka S.，etal.Nature Biotechnology，(2008)26，101-106)；以无病毒法导入六种因子而建立的iPSC(Okita K et al.Nat.Methods 2011May；8(5):409-12，Okita K et al.Stem Cells.31(3):458-66.)等。另外，还可使用以下细胞：由Thomson等制备的将OCT3/4·SOX2·NANOG·LIN28的四种因子导入而建立的人工多能性干细胞(Yu J.，Thomson JA等人，Science(2007)318:1917-1920.)；由Daley等制备的人工多能性干细胞(Park IH，Daley GQ等人，Nature(2007)451:141-146)；由樱田等制备的人工多能性干细胞(日本特开2008-307007号)等。
此外，也可使用已公开的所有论文或专利中公开的任一种本领域公知的人工多能性干细胞，这样的论文例如有Shi Y.，Ding S.，et al.，Cell Stem Cell，(2008)Vol3，Issue 5,568-574；Kim JB.，Scholer HR.，et al.，Nature，(2008)454，646-650；Huangfu D.，Melton，DA.，et al.，Nature Biotechnology，(2008)26，No 7，795-797；这里的专利例如有日本特开2008-307007号，日本特开2008-283972号，US2008-2336610，US2009-047263，WO2007-069666，WO2008-118220，WO2008-124133，WO2008-151058，WO2009-006930，WO2009-006997，WO2009-007852。
可利用的人工多能性干细胞株的实例包括由NIH、理研、京都大学等建立的各种iPSC株。例如，人iPSC株可例举：理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株等；京都大学的253G1株、253G4株、1201C1株、1205D1株、1210B2株、1383D2株、1383D6株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A3株、FfI-01s04株等；优选1231A3株。
自干细胞诱导分化为神经嵴细胞可根据由文献公知(例如非专利文献1)的方法来进行。例如在使用人iPSC的情况下，在将iPSC接种于培养皿等并粘附培养后，用含有TGFβ抑制剂及GSK3β抑制剂的培养基进行粘附培养，由此可使其分化为神经嵴细胞。
此时，所使用的培养基没有特别限定，但例如TeSR1培养基及化学限定培养基(CDM)是适用的。除此之外，也可使用BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、GlasgowMEM培养基、改良的MEM(IMEM)培养基、改良的MDM(IMDM)培养基、Medium 199培养基、EagleMEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基(高糖、低糖)、DMEM/F12培养基、Ham培养基、RPMI 1640培养基、Fischer氏培养基，及其混合培养基等。
对于CDM培养基没有特别限定，但例如可使用由Iscove氏改良Dulbecco氏培养基(GE Healthcare公司制)调配的培养基。作为更具体的实例，可使用如非专利文献1中记载的CDM培养基。CDM培养基中可包含脱铁运铁蛋白、硫代甘油、牛血清白蛋白(BSA)，胰岛素及/或抗生素。
对于在添加TGFβ抑制剂及GSK3β抑制剂之前的培养期间而言，只要是能够得到目标细胞数的期间即可，没有特别限定，但例如为2～6天。
TGFβ抑制剂的实例包括SB431542(4-(5-苯并[1,3]二噁基-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑基-2-基)-苯甲酰胺，4-[4-(1,3-苯并二噁基-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑基-2-基]-苯甲酰胺，4-[4-(3,4-二甲基二氧基苯基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑基-2-基]-苯甲酰胺)，A83-01(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1-苯基硫代氨基甲酰基-4-喹啉-4-基吡唑基)，LDN193189(4-[6-[4-(1-哌嗪基)苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]-喹啉)，Wnt3a/BIO(Wnt家族成员3A/(2'Z,3'E)-6-溴靛红-3'-肟)，BMP4(骨形态发生蛋白4)，GW788388(4-[4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑基-4-基]-吡啶-2-基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺)，SM16(4-[4-(1,3-苯并二噁-5-基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑基-2-基]-双环[2.2.2]辛烷-1-甲酰胺)，IN-1130(3-[[5-(6-甲基-2-吡啶基)-4-(6-喹噁啉基)-1H-咪唑基-2-基]甲基]-苯甲酰胺)，GW6604(2-苯基-4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]吡啶)及SB505124(2-(5-苯并[1,3]二噁基-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑基-4-基)-6-甲基吡啶)等。可组合使用其中的2种以上。
对于该工序中的TGFβ抑制剂的添加浓度而言，其可根据所添加的TGFβ抑制剂的种类而适当调整，但例如为1～40μM、优选为5～20μM。
在使用SB431542(4-[4-(1,3-苯并二噁-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑基-2-基]-苯甲酰胺)的情况下，添加浓度可特别为10μM。
GSK3β抑制剂的实例包括CHIR98014(2-[[2-[(5-硝基-6-氨基吡啶-2-基)氨基]乙基]氨基]-4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑基-1-基)嘧啶)，CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑基-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]烟腈)，CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚基-3-基)-吡咯基-2,5-二酮)，LY2090314(3-[9-氟-1,2,3,4-四氢-2-(1-哌啶基羰基)吡咯并[3,2,1-jk][1,4]苯二氮卓-7-基]-4-咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基-1h-吡咯-2,5-二酮)，TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮)，SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚基-3-基)-1H-吡咯基-2,5-二酮)，TWS-119(3-[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧基]苯基)，肯帕罗酮(Kenpaullone)，1-氮杂肯帕罗酮(Azakenpaullone)，SB415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯基-2,5-二酮)及AR-AO144-18(1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲)，CT99021，CT20026，BIO((2'Z,3'E)-6-溴靛红-3'-肟)，BIO-丙酮肟，吡啶并咔唑-环戊二烯钌复合物，OTDZT，α-4-二溴苯乙酮，锂等。可组合使用其中的2种以上。
GSK3β抑制剂不限于此，也可使用针对GSK3β的mRNA的反义寡核苷酸或siRNA、结合GSK3β的抗体、显性负GSK3β变异体等作为GSK3β抑制剂，上述物质可通过商业手段获得，或可根据公知的方法合成。
该工序中的GSK3β抑制剂的添加浓度可根据所添加的GSK3β抑制剂的种类适当调整，但例如为0.01～20μM、优选为0.1～10μM。
在使用CHIR99021的情况下，添加浓度没有特别限定，但可例如为0.1～1μM、优选为0.5～1μM、特别是1μM。
对于添加TGFβ抑制剂及GSK3β抑制剂后的培养期间而言，只要能够获得目标细胞数则没有特别限定，但例如为6～14天，8～12天，9～11天或者10天。
粘附培养中使用培养皿、培养瓶、微培养板、OptiCell(产品名)(Nunc公司)等的细胞培养片等培养容器。培养容器优选经表面处理以提高与细胞的粘附性(亲水性)，或包被有胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、纤维结合蛋白、基质胶(Matrigel，例如BD基质胶(日本Becton Dickinson公司))，玻璃粘连蛋白等细胞粘附用基质。
需要说明，“基质胶”是由富含细胞外基质蛋白的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤提取的可溶性基底膜制备物，涂布有基质胶的培养容器可市售获得。基质胶的主成分为：层粘连蛋白、胶原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白多糖，及内功素/巢蛋白1、2。基质胶中除了上述的主成分以外，还含有TGFβ、上皮细胞生长因子、***、成纤维细胞生长因子、组织纤溶酶原活化因子3、4、及EHS肿瘤中自然产生的其它的生长因子。
培养温度没有特别限定，但可在30～40℃(例如37℃)进行培养。
另外，培养容器中的二氧化碳浓度例如为5％左右。
在本发明的一个实施方式中，为了获得供应工序(2)的神经嵴细胞，也可购入市售的神经嵴细胞。市售的神经嵴细胞的实例包括例如人毛囊外毛根鞘细胞(Cosmo Bio公司制)，O9-1小鼠颅侧神经嵴细胞系(Merck Millipore公司制)等。
本发明的一个实施方式中，为了获得供应工序(2)的神经嵴细胞，可采集天然存在的神经嵴细胞。已报道神经嵴细胞存在于哺乳类的生物体中，存在于受精后30天前后的人胚的神经管、胎生第9天前后的小鼠胚神经管、以及人、猪及啮齿类的成年生物体皮肤等(Betters et al.，Developmental biology，2010，344(2):578-592，Jiang et al.，Development，2000，127(8):1607-1616，Dupin et al.，Developmental biology，2012，366(1):83-95，Nagoshi et al.，Cell Stem Cell 2，April2008，392-403)。可利用公知的方法(例如Motohashi et al.，Biology open，2016，5:311-322，Pfaltzgraffet al.，Journalof Visualized Experiments，2012，64:4134)采集这样的神经嵴细胞并供应工序(2)。
[神经嵴细胞的扩大培养工序(2)]
神经嵴细胞的扩大培养工序(2)，是在包含GSK3β抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中悬浮培养神经嵴细胞的工序。
此时，对于所用的培养基没有特别限定，例如，CDM培养基是适用的。除此之外，还可使用TeSR1培养基、BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、改良的MEM(IMEM)培养基、改良的MDM(IMDM)培养基、Medium 199培养基、EagleMEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基(高糖、低糖)、DMEM/F12培养基、Ham培养基、RPMI 1640培养基、Fischer氏培养基，及其混合培养基等。
可使用如上文所述的GSK3β抑制剂，没有特殊限定。
优选的GSK3β抑制剂为选自以下的至少一者：CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、肯帕罗酮、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及SB415286。特别优选的GSK3β抑制剂是CHIR99021或CP21R7。
该工序中的GSK3β抑制剂的添加浓度是显示与超过1μM的浓度(或者超过1μM且低于5μM的浓度)的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度。也可使用CHIR99021本身作为GSK3β抑制剂。如后文所述，在使用CHIR99021本身作为GSK3β抑制剂的情况下，适当的添加浓度是超过1μM的浓度，优选为2μM以上且低于5μM，更优选为超过2μM、4.5μM以下，特别是优选为3μM以上、4.5μM以下。因此，在该工序中使用CHIR99021以外的GSK3β抑制剂时，其添加浓度为显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度，优选为显示与2μM以上、低于5μM的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度，更优选为显示与超过2μM、4.5μM以下的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度，特别是优选为显示与3μM以上、4.5μM以下的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度。
通过在该浓度的GSK3β抑制剂和bFGF的存在下悬浮培养神经嵴细胞，可在持续超过9周(63天)的长期的培养期间内培养并增殖维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞。
本发明的一个实施方式中，对于“维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞”而言，其具有分化为神经细胞、胶质细胞及间充质基质细胞的分化能力，或者除此之外还具有分化为骨细胞、软骨细胞、角膜细胞及色素细胞的分化能力。
“维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞”可通过多种方法评价。对所述方法没有特别限定，例如有将作为评价对象的神经嵴细胞分别分化诱导为神经细胞、胶质细胞及间充质基质细胞等的方法。若作为评价对象的神经嵴细胞能够实际分化为神经细胞、胶质细胞及间充质基质细胞等，则可判断作为评价对象的神经嵴细胞为“维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞”。其它方法例如测定标记蛋白、基因的表达的方法。作为评价对象的神经嵴细胞中，若作为转录因子的SOX10被表达，则可判断作为评价对象的神经嵴细胞是“维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞”。SOX10的检测可利用对该标记蛋白具有特异性的抗体进行免疫学分析，例如ELISA、免疫染色、流式细胞分析等。对于标记基因的检测，可利用本领域公知的核酸扩增方法及/或核酸检测方法，例如RT-PCR、微阵列、生物芯片等。另外，若为在作为NCC的标记基因的SOX10基因的下游***编码报道蛋白(例如Nano-Lantern(Saito K等人，＂Luminescent proteins for high-speed single-cell andwhole-body imaging.＂Nat.Commun.，2012；3:1262.))的碱基序列、且在SOX10的启动子的控制下表达SOX10和报道蛋白的融合蛋白的细胞，则可使用检测该报道蛋白(例如测定荧光强度)的方法。
对于GSK3β抑制剂，“与超过1μM的浓度”(或者与超过1μM、低于5μM的浓度)的CHIR99021所显示的效果同等的效果”可基于GSK3β抑制活性来进行评价。GSK3β抑制剂的GSK3β抑制活性可通过本身公知的方法测定，例如可通过Patsch et al.，Nature cellbiology，2015，17(8):994-1003，Uno et al.，Brain Res.，2009，1296:148-163中记载的方法测定。更具体地，GSK3β抑制活性可以以Wnt/β-链蛋白通路中的GSK3β的基因表达调节功能(特别是β-链蛋白的磷酸化功能)作为指标进行测定。更具体为：(i)在GSK3β抑制剂存在及不存在的条件下培养由于GSK3β的控制而抑制了报道基因表达的细胞，(ii)在GSK3β抑制剂存在及不存在的条件下测定报道基因的表达量，及(iii)基于与不存在GSK3β抑制剂的情况下的报道基因的表达量相比在GSK3β抑制剂的存在下的报道基因的表达量的增加量，确定GSK3β抑制剂的GSK3β抑制活性(参照实施例9)。
在该测定结果中，当GSK3β抑制剂显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的GSK3β抑制活性(抑制％)同等的抑制活性时，则判断该GSK3β抑制剂显示“与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果”(与CHIR99021所显示的效果同等的GSK3β抑制活性)。在此，“同等”的值(抑制％)是指相对于基准值而言分别显示加/减30％，25％，20％，15％，10％，8％，6％，5％，4％，3％，2％或1％的值，优选为加/减分别15％，10％，5％，或1％的范围。
对于GSK3β抑制剂显示“与超过1μM的浓度”(或者超过1μM、低于5μM的浓度)的CHIR99021所显示的效果同等的效果”，也可以基于在与本说明书实施例的方法相同的方法培养神经嵴细胞时，“维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞”的可能培养期间来适当地进行评价。如果在用含GSK3β抑制剂的培养基培养神经嵴细胞进行培养时，在“维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞”的数量相比于培养开始时持续增加的条件下培养的期间，能够与用含有超过1μM的浓度的CHIR99021培养基培养神经嵴细胞的情况下的相应期间同等，则判断该GSK3β抑制剂显示“与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果”(与CHIR99021所显示的效果同等的神经嵴细胞增殖活性)。在此，“同等”的值(期间)是指相对于基准值而言分别显示加/减30％，25％，20％，15％，10％，8％，6％，5％，4％，3％，2％或1％的值，优选为分别加/减15％，10％，5％，或1％的范围。
使用CHIR99021本身作为GSK3β抑制剂时，添加浓度设定为超过1μM的浓度，优选为2μM以上、低于5μM，更优选为超过2μM、4.5μM以下，特别是优选为3μM以上、4.5μM以下。已了解到为了在维持长期期间分化能力的情况下同时达到使神经嵴细胞增殖的效果，CHIR99021在2μM以上、低于5μM时使该效果提高，特别是在3μM以上、4.5μM以下时使该效果达到最高。具体地，在CHIR99021浓度为3-4.5μM时，可经112天(16周)培养维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞并使其增殖。另外，在CHIR99021浓度为2μM时，也可经9周(63天)以上维持多能性。另一方面，在1μM或者5μM下，分别培养3周(21天)、6周(42天)时可见维持多能性的细胞数减少。
另外，在使用CP21R7作为GSK3β抑制剂的情况下，添加浓度设定为超过0.1μM的浓度，优选为0.5μM以上，更优选为1μM以上。就CP21R7而言，已知在0.5μM以上、1μM以下时，在维持长时间分化能力的同时使神经嵴细胞增殖的效果较高。具体地，在CP21R7浓度为0.5-1μM时，可培养并增殖维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞达84天(12周)以上。与之相比，在0.1μM下，培养3周(21天)内可见维持多能性的细胞数减少。
bFGF的添加浓度没有特别限定，但例如为10～200ng/ml，优选为20～40ng/ml。
除了GSK3β抑制剂及bFGF以外，还可向培养基中添加TGFβ抑制剂及/或表皮生长因子(EGF)。TGFβ抑制剂可使用上述抑制剂，无特别限定。
优选的TGFβ抑制剂为为选自以下的至少一者：SB431542，A83-01，LDN193189，Wnt3A/BIO，BMP4，GW788388，SM16，IN-1130，GW6604及SB505124。特别优选的TGFβ抑制剂为SB431542。
另外，TGFβ抑制剂的添加浓度根据所添加的TGF3β抑制剂的种类进行适当调整，例如为1～50μM、优选为5～20μM。
在使用SB431542时的添加浓度没有特别限定，例如为1～40μM、优选为5～20μM、特别是10μM。
EGF的添加浓度没有特别限定，例如为5～100ng/ml、优选为20～40ng/ml。
在悬浮培养中，在将通过工序(1)获得的神经嵴细胞从培养容器解离后，将其分散于培养基中，通过搅拌或振荡将培养基成分及培养基内氧浓度均一化，同时形成细胞凝集块。适当的搅拌速度可根据细胞密度及培养容器的大小来适当设定，但过度的搅拌或振荡会对细胞造成物理压力，抑制细胞凝集块的形成。因此，将搅拌或振荡速度控制为既使培养基成分及培养基内氧浓度均一化，又不抑制细胞凝集块的形成的速度。也可在不搅拌或振荡的情况下通过静置来进行悬浮培养。
培养温度没有特别限定，可在30～40℃(例如37℃)进行培养。另外，培养容器中的二氧化碳浓度例如为5％左右。
关于该工序中的培养时间，只要是可获得目标细胞数的时间即可。该工序中，长时间培养并增殖维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞是可能的。维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞占培养细胞团的比例至少维持在20％以上，30％以上，40％以上，优选为50％以上，60％以上，70％以上，更优选为80％以上，90％以上，95％以上。
其间，适当地进行细胞传代。传代在例如接种后每5-8天进行。传代的间隔时间足以使细胞凝集块扩大，且优选短于认为会导致细胞凝集块变得过大、造成氧和养分难以到达细胞凝集块内部细胞的时间。
通过本工序，可培养并增殖维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞的时间没有特别限定，但例如可为7天，14天，21天，28天，35天，42天，49天，56天，63天，70天，77天，84天，91天，98天，105天，或112天以上，优选为35天以上，更优选为42天以上，进一步优选为63天以上，特别优选为84天以上，最优选为112天以上。
[培养基]
本发明还提供用于上述的神经嵴细胞的制造方法及增殖方法中的包含神经嵴细胞的培养基。培养基的优选的组成如前文所述。
[细胞保存物]
另外，本发明还提供包含通过上述的神经嵴细胞的制造方法及增殖方法获得的神经嵴细胞的冷冻保存物。所述神经嵴细胞为SOX10表达阳性，且NCC的细胞表面抗原标记p75表达阳性。
冷冻保存物可通过以下步骤制造：将通过神经嵴细胞的制造方法及增殖方法获得的神经嵴细胞从培养基分离，在冷冻保存液中悬浮并冷冻。可通过细胞滤器(cellstrainer)或离心分离来从培养基分离神经嵴细胞。分离后的细胞可视需要洗净。冷冻保存物除了神经嵴细胞以外还可包含其它细胞团，但优选包含纯的神经嵴细胞。神经嵴细胞的纯化可通过例如以上述标记的表达为指标进行细胞分选以与其它细胞团分离而进行。细胞保存液使用现有的用于细胞冷冻保存的试剂即可。例如市售的Cryostem Freezing Medium及CELLBANKER(注册商标)等。
冷冻保存物可利用作为用于自神经嵴细胞分化诱导而得到神经细胞、胶质细胞、间充质基质细胞、骨细胞、软骨细胞、角膜细胞及色素细胞的起始材料。另外，冷冻保存物可用于制造以神经嵴细胞为构成要素的组织模型。
[自神经嵴细胞制造各种细胞的方法]
本发明所涉及的神经细胞、胶质细胞、间充质基质细胞、骨细胞、软骨细胞、角膜细胞或色素细胞的制造方法包括下述工序。其中，工序(i)与本发明所涉及的神经嵴细胞的制造方法的工序(2)或者本发明所涉及的神经嵴细胞的增殖方法是相同的。
(i)在包含GSK3β抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中悬浮培养神经嵴细胞的工序，该工序中的所述培养基包含显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂，及，
(ii)将通过工序(i)获得的神经嵴细胞分化为选自以下的至少一种细胞的工序：神经细胞、胶质细胞、间充质基质细胞、骨细胞、软骨细胞、角膜细胞及色素细胞。
[诱导为各种细胞的工序]
依据本发明所涉及的神经嵴细胞的制造方法及增殖方法，可得到维持分化为神经细胞、胶质细胞及间充质基质细胞的多能性(multipotency)，或者除此之外还维持分化为骨细胞、软骨细胞、角膜细胞及色素细胞的多能性(multipotency)的神经嵴细胞。
从神经嵴细胞向神经细胞、胶质细胞、间充质基质细胞、骨细胞、软骨细胞、角膜细胞及色素细胞的各种细胞的分化诱导可根据文献公知(例如非专利文献1～4)的方法进行。
具体地，向神经细胞的分化诱导可通过非专利文献1或非专利文献4所述的方法进行。
例如，将神经嵴细胞接种于涂布有纤连蛋白的培养板，更换为添加有N-2补充剂(17502-048，Gibco)、BDNF(028-16451，和光纯药)、GDNF(074-06264，和光纯药)、NT-3(141-06643，和光纯药)、NGF(141-07601，和光纯药)的DMEM/F12，在37℃、5％CO2下培养14天。
或者，将神经嵴细胞接种于培养板，以含有10μM SB431542及1μM CHIR99021的CDM培养基培养1天后，更换为添加有B-27补充剂(17504-044，Gibco)、N-2补充剂、L-谷氨酰胺(073-05391，和光纯药)、青霉素/链霉素(15140-122，Gibco)、BDNF、GDNF、NT-3、NGF的Neurobasal培养基(21103-049，Gibco公司)，在37℃、5％CO2下培养35天。
培养后，用4％多聚甲醛将细胞固定，通过免疫染色法来确认向表达TUBB3蛋白的神经细胞的分化出现。
向胶质细胞的分化诱导，可通过与非专利文献1或非专利文献4所述的方法的向神经细胞的分化诱导同样的方法进行。分化诱导期间结束后，确认由于GFAP蛋白的表达而使出现向胶质细胞的分化。
向间充质基质细胞的分化诱导可基于非专利文献1所述的方法进行。
具体地，例如，将神经嵴细胞以6.5×104个/cm2的密度接种于培养皿中，以含有10μMSB431542及1μM CHIR99021的CDM培养基培养1天。1天后，将培养基交换为含10％胎牛血清(FBS，Nichirei)的αMEM(Nacalai Tesque)。约4天后可见细胞的形态变化。细胞的传代通过以0.25％胰蛋白酶-EDTA(GIBCO)将细胞解离、以1.0×104个/cm2的密度接种而进行。分化诱导开始14天后，对人间充质基质细胞的表面抗原标记CD73、CD44、CD45及CD105的表达进行FACS分析，确认分化为间充质基质细胞。
向骨细胞的分化诱导可基于非专利文献1所述的方法进行。具体地，例如将2.5×105个上述的间充质基质细胞接种于经纤连蛋白涂布的培养板，用含10％FBS、0.1μM***、50μg/ml抗坏血酸及10mMβ-磷酸甘油的αMEM培养2周。培养基仅在最初的1周内每2天交换一次。通过茜素红染色来检测钙化结节，确认分化为骨细胞。
向软骨细胞的分化诱导，可基于非专利文献1所述的方法进行。具体地，例如以1.5×105个/5μl的浓度将上述的间充质基质细胞悬浮于含有1％(v/v)ITS+预混物(BD)、0.17mM AA2P，0.35mM脯氨酸(Sigma)、0.1mM***(Sigma)、0.15％(v/v)葡萄糖(Sigma)、1mM丙酮酸钠(Invitrogen)、2mM GlutaMax、0.05mM MTG、40ng/ml PDGF-BB及1％(v/v)FBS(Nichirei)的DMEM:F12(Invitrogen)中。在经纤连蛋白涂布的培养板中点上细胞悬浮液5μl，培养1小时。1小时后添加1ml的上述的分化诱导培养基。在分化诱导开始后第3～5天添加10ng/ml的TGFβ3(R&D)，第10天添加50ng/ml的BMP4。培养16天在，经阿尔辛蓝(alcian blue)染色确认出现向软骨细胞的分化。
向角膜细胞的分化诱导可基于非专利文献1所述的方法进行。具体地，例如，将神经嵴细胞接种于经纤连蛋白涂布的培养板，用含有10μM SB431542及1μM CHIR99021的CDM培养基培养1天。1天后将培养基更换为通过将角膜内皮细胞以CDM培养基培养所制成的条件化培养基。培养基每2天更换一次，在分化诱导开始后第12天通过免疫染色法确认角膜细胞的标记分子ZO-1的表达，通过qPCR确认COL4A1及COL8A1的表达。
向色素细胞的分化诱导可基于非专利文献1所述的方法进行。具体地，例如将神经嵴细胞接种于经纤连蛋白涂布的培养板，用含有10μM SB及1μM CHIR的CDM培养基培养1天。1天后将培养基更换为含1μM CHIR，25ng/ml BMP4及100nM内皮素-3(American Peptide公司)的CDM培养基。培养基每2天更换一次。在第7天通过MITF及c-KIT基因的表达确认分化为色素细胞。
所得的神经细胞、胶质细胞、间充质基质细胞、骨细胞、软骨细胞、角膜细胞及色素细胞可分别用作再生医疗用的细胞制剂。
神经嵴细胞是具有向神经细胞、胶质细胞、间充质基质细胞、骨细胞、软骨细胞、角膜细胞及色素细胞等多种的细胞分化的多能性(multipotency)及自我增殖能力的细胞。基于在神经嵴细胞中观察到这样的能力，可望将神经嵴细胞应用于再生医疗用的细胞药物等。若可高效地使维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞得到维持或者增殖，则其大量制造将成为可能。进一步地，若能配制维持多能性(multipotency)的神经嵴细胞的保存物，则能够用作细胞药物的原料。例如，在细胞药物的制造中，人们正在探讨通过使用位于自干细胞分化为目标细胞(例如神经细胞)的中间点的细胞(例如神经嵴细胞)作为起始原料来实现简化制造方法、缩短制造时间、降低制造成本等目的，可认为本发明有可能提供对这些目的有用的技术。此外，不仅是细胞药品的制造，在利用各种细胞进行筛选***的构建中同样也可考虑这种做法。
实施例
[实施例1：神经嵴细胞的扩大培养]
[自iPSC向NCC的分化诱导]
根据非专利文献1记载的方法，使人iPSC分化为神经嵴细胞(Neural Crest Cell:NCC)。对于iPSC使用如非专利文献4所记载的SOX10-Nano-Lantern Reporter Human iPSC(201B7株)。该细胞株在NCC的标记基因——SOX10基因的下游***有编码荧光蛋白Nano-Lantern(Saito K等人，＂Luminescent proteins for high-speed single-cell andwhole-body imaging.＂Nat.Commun.，2012；3:1262.)的碱基序列，在SOX10的启动子的控制下表达SOX10与Nano-Lantern的融合蛋白。
将iPSC接种于涂布基质胶的培养皿，以TeSR1培养基粘附培养4天后，用含有10μMSB431542(TGFβ抑制剂)及1μM CHIR99021(GSK3β抑制剂)的CDM培养基粘附培养10天，使其分化为NCC。
[NCC的扩大培养]
将NCC自培养皿解离，用含有10μM SB431542、3μM CHIR99021、40ng/ml bFGF及40ng/mlEGF的CDM培养基悬浮培养。每隔7天进行细胞的传代。
扩大培养开始后的总细胞数的变化示于图1，SOX10表达阳性细胞率的变化示于图2。为测定SOX10表达阳性细胞率，使用StemPro Accutase细胞解离试剂(Invitrogen)将细胞凝集块解离，配制单细胞溶液。将悬浮于添加有1μg/m的PI(碘化丙啶，Wako)的FACS缓冲液(2％BSA HBSS)中的单细胞溶液通过具有35μm尼龙网孔的滤管(BD Falcon)过滤后，用流式细胞仪(FACS Aria，BD Biosciences)进行分析，测定活细胞(PI阴性细胞)中的GFP阳性细胞的比例。在整个期间内总细胞数增加，在培养第121天也确认SOX10表达阳性细胞率高。SOX10表达是具有多分化能力的NCC的标记。该结果表明，NCC在长期的培养期间内，在维持分化能力的同时发生了增殖。
[实施例2：培养基添加物的浓度探讨]
探讨NCC的扩大培养中GSK3β抑制剂、bFGF及EGF的浓度对于NCC的自我增殖能力及分化能力所产生的影响。以下未特别提到的条件表明进行与实施例1相同的扩大培养。
图3显示将bFGF及EGF的浓度设为20ng/ml(A)或40ng/ml(B)，将CHIR99021的浓度设为1、2、3、5μM时的总细胞数的变化。CHIR99021浓度为1μM或2μM时经1周的细胞增殖比例为8-30倍(另参照下文的实施例8)。另外，图4显示将bFGF及EGF的浓度设为40ng/ml，将CHIR99021的浓度设为3、3.5、4、4.5、5μM时的总细胞数的变化。bFGF、EGF及CHIR99021的浓度对总细胞数的变化未产生影响。
图5显示将bFGF及EGF的浓度设为20ng/ml(A)或40ng/ml(B)，将CHIR99021的浓度设为1、2、3、5μM时的SOX10表达阳性细胞率的变化。另外，图6显示将bFGF及EGF的浓度设为40ng/ml，将CHIR99021的浓度设为3、3.5、4、4.5、5μM时的SOX10表达阳性细胞率的变化。当CHIR99021的浓度为3-4.5μM时，即使在长期的培养中(在培养第121天)也确认有90％以上的SOX10表达阳性细胞率。当CHIR99021的浓度为2μM时，也在比较长的培养期间中(在培养第63天)确认有约55％以上的SOX10表达阳性细胞率。另一方面，当CHIR99021的浓度为5μM时，至培养第42天也维持了约55％以上的SOX10表达阳性细胞率，但在培养第63天时SOX10表达阳性细胞率降至约5％以下。当CHIR99021的浓度为1μM时，在短期培养中(在培养第21天)，观察到SOX10表达阳性细胞率的下降，在培养第63天时SOX10表达阳性细胞率为约25％以下。需要说明，bFGF及EGF1的浓度对SOX10表达阳性细胞率的变化未产生影响。
[实施例3：GSK3β抑制剂的探讨]
除了将NCC的扩大培养中所用的GSK3β抑制剂由CHIR99021变更为CP21R7以外，以与实施例1相同的方式进行NCC的扩大培养。CP21R7的浓度为0.1、0.5或1μM。
SOX10表达阳性细胞率的变化如图7所示。CP21R7的浓度为0.5或1μM时，在培养第84天也确认SOX10表达阳性细胞率高。另一方面，CP21R7浓度为0.1μM时，在短的培养期间(培养第21天)中，SOX10表达阳性细胞率即开始下降。
[实施例4：神经嵴细胞向神经细胞的分化诱导]
确认实施例1所扩大培养的NCC向神经细胞分化的能力。
基于非专利文献4所述的方法进行向神经细胞的分化诱导。
将经30天扩大维持培养的5×105个NCC接种于培养板，用含10μM SB431542及1μMCHIR99021的CDM培养基培养1天。1天后交换为添加有B-27补充培养基(17504-044，Gibco)、N-2补充培养基(17502-048，Gibco)、L-谷氨酰胺(073-05391，和光纯药)、青霉素/链霉素(15140-122，Gibco)、BDNF(028-16451，和光纯药)、GDNF(074-06264，和光纯药)、NT-3(141-06643，和光纯药)、NGF(141-07601，和光纯药)的Neurobasal培养基(21103-049，Gibco公司)，在37℃、5％CO2下培养35天。上述培养期间中每3～4天进行培养基交换。
添加4％多聚甲醛(和光纯药)，在4℃孵育1小时，进行细胞的固定。使其依次与作为一抗的抗TUBB3抗体(845502，Bioregend公司)及抗GFAP抗体(ab7260，abcam公司)反应、进一步与作为二抗的与一抗的免疫动物相应的Alexa488标记的二抗(Invitrogen公司)及Alexa568标记的二抗反应后，通过荧光显微镜观察。
确认自经30天维持培养的NCC分化而出现表达TUBB蛋白的神经细胞、及表达GFAP蛋白的胶质细胞。
进一步地，使用经84天扩大维持培养的NCC同样地确认向神经细胞分化能力。其结果是确认了向神经细胞(外周蛋白阳性细胞)及胶质细胞(GFAP阳性细胞)的分化。
[实施例5：神经嵴细胞向色素细胞的分化诱导]
确认了经实施例1扩大培养的NCC向神经细胞分化的能力。
基于非专利文献1所述的方法进行向黑色素细胞的分化诱导。
将经84天扩大维持培养的NCC接种于经纤连蛋白涂布的6孔培养板，用含10μMSB431542及1μM CHIR99021的CDM培养基培养1天。1天后更换为添加有BMP4及内皮素-3(和光纯药)的CDM培养基，37℃、5％CO2下培养7天。上述培养期间中每2天更换培养基。
添加4％多聚甲醛，在4℃孵育1小时，进行细胞的固定。依次使其与作为一抗的抗MITF抗体(Sigma公司)，进一步与作为二抗的与一抗的免疫动物相应的Alexa568标识二抗(Invitrogen公司)反应后，通过荧光显微镜观察。确认了从经84天维持培养的NCC分化出现了表达MITF蛋白的黑色素细胞。
[实施例6：神经嵴细胞向间充质基质细胞的分化诱导]
确认了经实施例1扩大培养的NCC向间充质基质细胞分化的能力。
基于非专利文献1所述的方法，进行向间充质基质细胞的分化诱导。
将经84天扩大维持培养的NCC接种于经纤连蛋白涂布的直径6cm的细胞培养用培养皿，用含有10μM SB431542及1μM CHIR99021的CDM培养基培养1天。1天后，将培养基更换为CTSStemPro MSC SFM(Gibco，A1033201)。通过以StemPro Accutase细胞解离试剂(Invitrogen公司)解离细胞后，以1.0-2.0×106个/盘(10cm盘的情况下)的密度进行接种来进行细胞传代。
对于向间充质基质细胞的分化诱导开始14天后的NCC而言，使用人间充质基质细胞的表面抗原标记的抗体即CD73抗体(BD)、CD44抗体(BD)、CD45抗体(BD)及CD105抗体(eBioscience)进行免疫染色后，进行FACS分析。确认了自经84天维持培养的NCC分化出现了表达CD44、CD73及CD0105蛋白、且不表达CD45蛋白的间充质基质细胞。
[实施例7：神经嵴细胞向骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞的分化诱导]
确认了经实施例1扩大培养的NCC向骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞分化的能力。
基于非专利文献1所述的方法，进行向骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞的分化诱导。
以实施例6记载的方法使经84天扩大维持培养的NCC分化为间充质基质细胞。将间充质基质细胞以4.0×104个/孔接种于经纤连蛋白涂布的12孔培养板，用含10％FBS、0.1μM***、50μg/ml抗坏血酸及10mMβ-磷酸甘油的αMEM培养4周，诱导分化为骨细胞。培养基每2-3天更换一次。通过茜素红染色检测钙化结节，确认向骨细胞的分化。
如下进行向软骨细胞的分化诱导。首先，将由经84天扩大维持培养的NCC所分化诱导的间充质基质细胞以1.5×105个/5μl的浓度悬浮于含1％(v/v)ITS+预混物(BD)、0.17mMAA2P，0.35mM脯氨酸(Sigma)、0.1mM***(Sigma)、0.15％(v/v)葡萄糖(Sigma)、1mM丙酮酸钠(Invitrogen)、2mM GlutaMax、0.05mM MTG、40ng/mlPDGF-BB及1％(v/v)FBS(Nichirei)的DMEM:F12(Invitrogen)中，以5μl/孔将细胞悬浮液点在经纤连蛋白涂布的12孔培养板上，培养1小时。1小时后以1ml/孔添加进一步含有10ng/ml的TGFβ3(R&D)及100ng/ml的BMP7(和光纯药)的培养基。经10天的培养，通过阿尔辛蓝染色确认了出现向软骨细胞的分化。
如下进行向脂肪细胞的分化诱导。将由经84天扩大维持培养的NCC所分化诱导的间充质基质细胞以4.0×104个/孔接种于经纤连蛋白涂布的24孔培养板，以hMSC(人间充质干细胞)生脂分化培养基BulletKit(Lonza Japan)所附属的培养基进行4周的培养。培养基每2-3天更换一次。通过油红(oil red)O染色检测染色后细胞内的油滴，确认分化为脂肪细胞。
如下进行骨细胞的茜素红S染色。首先添加100％乙醇，在室温孵育10分钟，进行细胞固定。使其与茜素红染色溶液(MERCK MILLIPORE公司)反应，用水洗净并干燥后，用显微镜观察。
软骨细胞的阿尔辛蓝染色通过如下进行：通过添加4％多聚甲醛(和光纯药)并在室温孵育30分钟来固定细胞，使所固定的细胞与1％阿尔辛蓝染色液(MUTO PURE CHEMICALSCO.)反应后，用水洗净并使其干燥。
脂肪细胞的油红O染色通过以下进行：用10％***在室温固定细胞1小时，用异丙醇以0.5％稀释油红O溶液、再以3:2与水混合得到染色液，使细胞与所述染色液在室温反应1小时，用水洗净。油滴的观察利用显微镜进行。
[实施例8：培养基添加物的浓度探讨2]
探讨NCC的扩大培养中的bFGF的浓度对于NCC的自我增殖能力及分化能力产生的影响。对于以下未特定提及的条件，表明以与实施例1相同的方式进行扩大培养。
图8显示CHIR99021的浓度为1.5μM，bFGF的浓度为10、12.5、15.0、17.5ng/ml时的总细胞数的变化，图9显示SOX10表达阳性细胞率的变化。bFGF浓度对于SOX10表达阳性率没有影响。
上述的bFGF浓度范围中，总细胞数的变化行为大概相同，细胞增殖比例在1周6-13倍的范围。由于实施例2中1周的细胞增殖比例(CHIR99021浓度为1μM或2μM，bFGF浓度为20ng/ml或40ng/ml)在更高的范围，为8-30倍(参照图3)，提示bFGF对于NCC的自我增殖能力有促进作用，其适当的浓度范围为20-40ng/ml。
[实施例9：GSK3β抑制活性的测定]
确立用于评价GSK3β抑制剂的GSK3β抑制活性的实验***。
在Wnt/β-链蛋白通路中，GSK3β在Wnt配体不存在下发挥对β-链蛋白的磷酸化的功能。磷酸化的β-链蛋白被泛素化而在蛋白酶体内分解，因此Wnt-β-链蛋白通路下游的基因表达受到抑制。该通路中，当GSK3β被抑制时，β-链蛋白不会被分解而向核内移动，与T细胞因子(TCF)/淋巴样增强因子(LEF)等其它转录因子共同诱导Wnt-β-链蛋白通路下游的基因表达。CellSensor LEF/TCF-blaHCT-116细胞系(Thermo Fisher，K1676)组入有稳定表达的LEF/TCF，且组入有在LEF/TCF的控制下表达的报道基因(β-内酰胺酶报道基因)。该细胞系中的报道基因在Wnt-配体不存在下的表达是GSK3β的功能(β-链蛋白的磷酸化功能)受抑制的指标。使用该细胞系进行分析以测定GSK3β抑制剂的GSK3β抑制活性。
该分析根据Invitrogen公司的操作方案(基于CellSensor(注册商标)LEF/TCF-bla HCT 116细胞的分析操作方案)进行。
具体地，将LEF/TCF-bla HCT-116细胞悬浮于分析培养基(OPTI-MEM、0.5％透析的FBS、0.1mM NEAA、1mM丙酮酸钠、100U/mL/100μg/mL青霉素/链霉素)中(312,500个细胞/mL)。将细胞悬浮液接种于分析培养板的各孔中(10,000个细胞/孔)，培养16-24小时。
向孔中添加GSK3β抑制剂(在此使用CHIR99021，浓度为0.316、1.00、3.16、10.0、31.6、100、316、1000、3160、10000nM)，培养5小时。
将β-内酰胺酶的底物溶液(LiveBLAzer-FRET B/G(CCF4-AM)底物混合物)添加于各孔中(8μL/孔)，孵育2小时。用荧光培养板读数器测定荧光值。对于每个浓度条件进行2个孔的测定。
结果示于表1。1μM的CHIR99021所显示的GSK3β抑制活性以荧光值计为113.5(2个孔的平均值)。
对于CHIR99021以外的GSK3β抑制剂，也可通过本实验***在各浓度条件中下测定荧光值，按照固定的方法制作标准曲线，由此确定显示与1μM的CHIR99021所显示的GSK3β抑制活性(以荧光值计为113.5)同等的GSK3β抑制活性的浓度。
【表1】
Figure BDA0002515200170000321

Claims (21)

1.神经嵴细胞的制造方法，其包括以下的工序：
(1)获得神经嵴细胞的工序，
(2)在包含GSK3β抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子的培养基中悬浮培养神经嵴细胞的工序，所述培养基包含显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中所述培养基进一步包含TGFβ抑制剂。
3.根据权利要求1所述的制造方法，其中所述培养基为CDM培养基。
4.根据权利要求1所述的制造方法，其中所述培养基进一步包含表皮生长因子。
5.根据权利要求1所述的制造方法，其中所述GSK3β抑制剂为选自以下的至少一者：CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、肯帕罗酮、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及SB415286。
6.根据权利要求5所述的制造方法，其中所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。
7.根据权利要求2所述的制造方法，其中所述TGFβ抑制剂为选自以下的至少一者：SB431542，A83-01，LDN193189，Wnt3a/BIO，BMP4，GW788388，SM16，IN-1130，GW6604及SB505124。
8.根据权利要求1所述的制造方法，其中所述工序(2)中，神经嵴细胞在接种后每5-8天传代。
9.根据权利要求1所述的制造方法，其中所述工序(1)是诱导从干细胞分化为神经嵴细胞的工序。
10.神经嵴细胞的增殖方法，其包括以下的工序：
(I)在包含GSK3β抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子的培养基中悬浮培养神经嵴细胞的工序，所述培养基包含显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂。
11.一种培养基，其包含GSK3β抑制剂、碱性成纤维细胞生长因子及神经嵴细胞，其中包含显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂。
12.根据权利要求11所述的培养基，其进一步包含TGFβ抑制剂。
13.根据权利要求11所述的培养基，其中所述培养基为CDM培养基。
14.根据权利要求11所述的培养基，其进一步包含表皮生长因子。
15.根据权利要求11所述的培养基，其中所述GSK3β抑制剂为选自以下的至少一者：CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、肯帕罗酮、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及SB415286。
16.根据权利要求15所述的培养基，其中所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。
17.根据权利要求12所述的培养基，其中所述TGFβ抑制剂为选自以下的至少一者：SB431542，A83-01，LDN193189，Wnt3a/BIO，BMP4，GW788388，SM16，IN-1130，GW6604及SB505124。
18.一种冷冻保存物，其包含通过根据权利要求1的制造方法获得的神经嵴细胞。
19.神经细胞、胶质细胞、间充质基质细胞、骨细胞、软骨细胞、角膜细胞或色素细胞的制造方法，其包括以下的工序：
(i)在包含GSK3β抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子的培养基中悬浮培养神经嵴细胞的工序，所述培养基包含显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂，及，
(ii)使通过工序(i)获得的神经嵴细胞分化为选自以下至少一种细胞的工序：神经细胞、胶质细胞、间充质基质细胞、骨细胞、软骨细胞、角膜细胞及色素细胞。
20.长期培养具有多能性的神经嵴细胞的方法，其包含以下工序：
(1)获得神经嵴细胞的工序，
(2)在包含GSK3β抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子的培养基中悬浮培养神经嵴细胞的工序，所述培养基包含显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂。
21.培养基用于长期培养具有多能性的神经嵴细胞的用途，所述培养基包含碱性成纤维细胞生长因子和显示与超过1μM的浓度的CHIR99021所显示的效果同等的效果的浓度的GSK3β抑制剂。
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