WO2022259721A1 - 間葉系幹細胞の製造方法 - Google Patents

間葉系幹細胞の製造方法 Download PDF

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和雅 ▲高▼橋
静 馬場
敦 小西
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味の素株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing mesenchymal stem cells, and more particularly to a method for producing mesenchymal stem cells using a medium composition containing a basal medium and adrenocortical hormones.
  • Mesenchymal stem cells are a type of somatic stem cells that exist in the bone marrow of the living body, and are defined as adhesive cells that have the ability to differentiate into bone, cartilage, and adipocytes.
  • Mesenchymal stem cells are considered to have an extremely low risk of becoming cancerous, and are highly promising as cell materials for use in regenerative medicine.
  • mesenchymal stem cells accumulate at sites of tissue injury, release various humoral factors and exosomes, and have the function of regulating immune responses and anti-inflammatory effects, playing an important role in tissue repair and maintenance of homeostasis. is known to fulfill Therefore, mesenchymal stem cells themselves are also promising as cell preparations for treating immune diseases, inflammatory diseases, and the like.
  • mesenchymal stem cells have different differentiation potential and growth/functional characteristics depending on the tissue from which they are derived, there is a demand for efficient production of mesenchymal stem cells that exhibit useful properties according to the purpose. had been
  • Neural crest cells are peculiar to vertebrates. They are cells that differentiate into a wide variety of cells such as pigment cells. It was known that neural crest cells can be produced by the methods disclosed in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1, and that differentiation of mesenchymal stem cells can be induced therefrom (Non-Patent Document 2). A more efficient method of producing the was being investigated.
  • An object of the present invention is to provide a medium composition, a method for producing mesenchymal stem cells, and the like for efficiently producing mesenchymal stem cells.
  • mesenchymal stem cells can be efficiently induced from neural crest cells by using a medium composition containing adrenocortical hormones, and the medium composition We have found suitable concentrations of adrenocortical hormones in the product. Furthermore, they found that mesenchymal stem cells obtained by culturing neural crest cells in such a medium composition highly express TSG-6 and are useful as a preventive or therapeutic agent for inflammatory diseases. rice field. In addition, the secretome of mesenchymal stem cells obtained by culturing neural crest cells in such a medium composition reduces the expression of fibrosis marker genes COL1A1 and ACTA2, thus preventing fibrotic diseases. Alternatively, the present invention was completed by discovering that it is useful as a therapeutic drug.
  • a medium composition for inducing mesenchymal stem cells from neural crest cells containing a basal medium and an adrenocortical hormone, wherein the converted concentration of the adrenocortical hormone in the medium composition is 1.25 ⁇ M or more.
  • a method for producing a drug for the prevention or treatment of inflammatory diseases or fibrotic diseases comprising the step of inducing mesenchymal stem cells by culturing neural crest cells in a medium composition.
  • the prophylactic or therapeutic drug for inflammatory or fibrotic diseases contains mesenchymal stem cells characterized by high expression of TSG-6 as an active ingredient.
  • a method for producing a drug for the prevention or treatment of an inflammatory disease further comprising recovering TSG-6 protein from the induced mesenchymal stem cells and/or the culture supernatant, The method of [1], wherein the prophylactic or therapeutic agent contains TSG-6 protein as an active ingredient.
  • a method for producing a drug for the prevention or treatment of fibrotic diseases further comprising recovering a secretome from the induced mesenchymal stem cells and/or the culture supernatant, for the prevention or treatment of fibrosis The method of [1], wherein the drug contains the secretome as an active ingredient.
  • [5] The production method according to any one of [1] to [4], wherein the adrenocortical hormone is a glucocorticoid or a derivative thereof.
  • the glucocorticoid or its derivative is at least one selected from the group consisting of cortisone acetate, hydrocortisone, fludrocortisone acetate, prednisolone, triamcinolone, methylprednisolone, dexamethasone, betamethasone, and beclomethasone propionate. 5].
  • [7] The production method of [5] or [6], wherein the glucocorticoid or derivative thereof is dexamethasone.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • [16] The method of [13] to [15], wherein the cell population containing neural crest cells obtained in step A is subjected to step B without being subjected to neural crest cell sorting treatment.
  • [17] The production method according to any one of [1] to [3] and [5] to [16], wherein the inflammatory disease is liver cirrhosis.
  • [18] The production method according to any one of [2], [3] and [5] to [17], wherein the high expression of TSG-6 is high expression in response to IFN ⁇ stimulation.
  • a drug for the prevention or treatment of inflammatory diseases produced by the production method of any one of [1] to [3] and [5] to [18], or [1], [2], [4] A drug for preventing or treating a fibrotic disease, which is produced by the production method according to any one of to [18].
  • the present invention it is possible to provide a medium composition for efficiently inducing mesenchymal stem cells from neural crest cells.
  • a medium composition for efficiently inducing mesenchymal stem cells from neural crest cells there are provided an efficient method for producing mesenchymal stem cells, a preventive or therapeutic agent for inflammatory or fibrotic diseases containing the mesenchymal stem cells or the like as an active ingredient, and prevention of the disease.
  • a therapeutic method a method for producing the therapeutic drug, and the like.
  • FIG. 1 is a graph showing gene expression of TNFAIP6 (TSG-6) after stimulation with 50 ng/mL IFN ⁇ for 48 hours in various mesenchymal stem cells.
  • FIG. 2 is a graph showing cell growth curves during induction of differentiation.
  • FIG. 3 is a graph showing gene expression of TNFAIP6 (TSG-6) after stimulation with 50 ng/mL IFN ⁇ for 48 hours.
  • FIG. 4 is a graph showing that the secretome isolated from the mesenchymal stem cells of the present invention significantly reduced the expression of fibrotic marker genes COL1A1 and ACTA2 in the LX-2 cell line.
  • the present invention provides a medium composition for inducing mesenchymal stem cells from neural crest cells, containing a basal medium and an adrenocortical hormone, wherein the converted concentration of the adrenocortical hormone in the medium composition is 1.25.
  • a culture medium composition (hereinafter also referred to as the culture medium composition of the present invention) is provided that is at least ⁇ M.
  • the basal medium contained in the medium composition of the present invention can be a basal medium known per se, and is not particularly limited as long as it does not inhibit the induction of mesenchymal stem cells from neural crest cells.
  • the basal medium includes, for example, IMDM medium, Medium199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, StemPro34 (Invitrogen) , RPMI-base medium, StemFit (registered trademark), MCDB201 medium and mixed medium thereof.
  • StemFit (registered trademark) medium is preferably used in this step.
  • the medium may contain serum or may be serum-free. If necessary, the medium contains, for example, albumin, transferrin, Knockout Serum Replacement (KSR) (serum replacement for FBS during ES cell culture), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acids, insulin, collagen May contain one or more serum replacements such as precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol (2ME), thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, It may also contain one or more substances such as growth factors, small molecules, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, and the like.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • the medium contains adrenocortical hormones.
  • Adrenal cortical hormones include, for example, glucocorticoids and derivatives thereof, and the glucocorticoids and derivatives thereof include, for example, cortisone, cortisone acetate, hydrocortisone, fludrocortisone acetate, paramethasone, prednisolone, triamcinolone, methyl Prednisolone, dexamethasone, betamethasone, beclomethasone propionate. Among these, prednisolone, dexamethasone and betamethasone are preferred, and dexamethasone is especially preferred.
  • One or more adrenal corticosteroids may be added to the medium, but one is preferred.
  • Dexamethasone (CAS number: 50-02-2, CA index name: Pregna-1,4-diene-3,20-dione,9-fluoro-11,17,21-trihydroxy-16-methyl-,(11 ⁇ ,16 ⁇ ) )-) is
  • Dexamethasone It is a known synthetic adrenocortical hormone having a structure represented by Dexamethasone is commercially available and such commercial products can also be used in the present invention. Since differentiation of neural crest cells into mesenchymal stem cells is induced by using dexamethasone, mesenchymal stem cells can be produced with high efficiency by culturing neural crest cells in the medium composition of the present invention. be able to.
  • the concentration of adrenocortical hormone contained in the medium composition is not particularly limited as long as it is a concentration that can promote the differentiation of neural crest cells into mesenchymal stem cells. ⁇ 50 nM (or >50 nM), ⁇ 55 nM (or >55 nM), ⁇ 60 nM (or >60 nM), ⁇ 65 nM (or >65 nM), ⁇ 70 nM (or >70 nM), ⁇ 75 nM (or >75 nM), ⁇ 80 nM (or >80 nM), ⁇ 85 nM (or >85 nM), ⁇ 90 nM (or >90 nM), ⁇ 95 nM (or >95 nM), ⁇ 100 nM (or >100 nM), ⁇ 150 nM (or >150 nM), ⁇ 200 nM (or >200 nM), ⁇ 250 nM (or >250 nM), ⁇ 300 nM (or >300
  • an adrenocortical hormone other than dexamethasone is used, it is preferably used at a concentration that exhibits the same glucocorticoid potency as dexamethasone at the above concentration. Too low corticosteroid concentrations in the medium may not be sufficient to promote culture maintenance and mesenchymal stem cell induction, whereas too high corticosteroid concentrations inhibit cell proliferation and Mesenchymal stem cells cannot be obtained efficiently.
  • the concentration of adrenocortical hormone contained in the medium composition is, for example, 50 nM to 10 ⁇ M (or 50 nM to 10 ⁇ M, 50 nM to 10 ⁇ M, or 50 nM to 10 ⁇ M), preferably 60 nM to 5 ⁇ M (or 60 nM to 5 ⁇ M, 60 nM to 5 ⁇ M, or 60 nM 5 ⁇ M), more preferably 70 nM to 2 ⁇ M (or 70 nM to less than 2 ⁇ M, 70 nM to 2 ⁇ M, or 70 nM to less than 2 ⁇ M), even more preferably 100 nM to 1 ⁇ M (or 100 nM more than 1 ⁇ M, more than 100 nM and less than 1 ⁇ M, or more than 100 nM and less than 1 ⁇ M).
  • the potency of adrenocortical hormones as glucocorticoids is 0.8 for cortisone, 4 for prednisolone, 5 for methylprednisolone, 5 for triamcinolone, 10 for paramethasone, 25-30 for dexamethasone, and 25 for betamethasone when hydrocortisone is 1. ⁇ 30. If there is a possibility that the potency of each adrenocortical hormone as a glucocorticoid differs from the above value depending on the manufacturer or storage conditions, it should be experimentally confirmed in advance. It is desirable to use one in good condition.
  • the concentration of betamethasone contained in the medium composition is not particularly limited as long as it can promote the differentiation of neural crest cells into mesenchymal stem cells. ⁇ 50 nM (or >50 nM), ⁇ 55 nM (or >55 nM), ⁇ 60 nM (or >60 nM), ⁇ 65 nM (or >65 nM), ⁇ 70 nM (or >70 nM), ⁇ 75 nM (or >75 nM), ⁇ 80 nM (or >80 nM), ⁇ 85 nM (or >85 nM), ⁇ 90 nM (or >90 nM), ⁇ 95 nM (or >95 nM), ⁇ 100 nM (or >100 nM), ⁇ 150 nM (or >150 nM), ⁇ 200 nM (or >200 nM), ⁇ 250 nM (or >250 nM), ⁇ 300 nM (or >100 nM (or >50 nM
  • the concentration of betamethasone contained in the medium composition is, for example, 50 nM to 10 ⁇ M (or 50 nM to less than 10 ⁇ M, more than 50 nM to 10 ⁇ M , or 50 nM to less than 10 ⁇ M), preferably 60 nM to 5 ⁇ M (or 60 nM to less than 5 ⁇ M, 60 nM to 5 ⁇ M, or 60 nM to less than 5 ⁇ M), more preferably 70 nM to 2 ⁇ M (or 70 nM to less than 2 ⁇ M, 70 nM to 2 ⁇ M, or 70 nM to less than 2 ⁇ M), even more preferably 100 nM to 1 ⁇ M (or 100
  • the concentration of prednisolone contained in the medium composition is not particularly limited as long as it can promote the differentiation of neural crest cells into mesenchymal stem cells. ⁇ 300 nM (or >300 nM), ⁇ 330 nM (or >330 nM), ⁇ 360 nM (or >360 nM), ⁇ 390 nM (or >390 nM), ⁇ 420 nM (or >420 nM), ⁇ 450 nM (or >450 nM), ⁇ 480 nM (or >480 nM), ⁇ 510 nM (or >510 nM), ⁇ 540 nM (or >540 nM), ⁇ 570 nM (or >570 nM), >600 nM (or >600 nM), >900 nM (or >900 nM), >1.2 ⁇ M (or >1.2 ⁇ M), >1.5 ⁇ M (or >1.5 ⁇ M), >1.8 ⁇ M (or
  • the concentration of prednisolone contained in the medium composition is, for example, 300 nM to 70 ⁇ M (or 300 nM to less than 70 ⁇ M, more than 300 nM to 70 ⁇ M , or 300 nM to less than 70 ⁇ M), preferably 360 nM to 35 ⁇ M (or 360 nM to less than 35 ⁇ M, 360 nM to 35 ⁇ M, or 360 nM to less than 35 ⁇ M), more preferably 420 nM to 14 ⁇ M (or 420 nM to 14 ⁇ M, 420 nM to 14 ⁇ M, or 420 nM to 14 ⁇ M), even more preferably 600 nM to 7
  • the concentration of adrenocortical hormones contained in the medium composition is 50 nM or more and 10 ⁇ M or less for dexamethasone or betamethasone (or 50 nM or more and less than 10 ⁇ M, or more than 50 nM when each one is used alone).
  • paramethasone is 100 nM to 30 ⁇ M, Triamcinolone or methylprednisolone 250 nM to 60 ⁇ M (or 250 nM to ⁇ 60 ⁇ M, 250 nM to 60 ⁇ M, or 250 nM to less than 60 ⁇ M) and prednisolone 300 nM to 70 ⁇ M (or 300 nM >70 ⁇ M, >300 nM and ⁇ 70 ⁇ M, or >300 nM and ⁇ 70 ⁇ M) and cortisone >1.50 ⁇ M and ⁇ 375 ⁇ M (or >1.50 ⁇ M and ⁇ 375 ⁇ M, >1.50 ⁇ M and ⁇ 375 ⁇ M, or 1.50 ⁇ M) >375 ⁇ M) and hydrocortisone >1.250 ⁇ M and ⁇ 300 ⁇ M (or >1.250 ⁇ M and ⁇ 300 ⁇ M, >1.250 ⁇ M and ⁇
  • the concentration of adrenocortical hormones contained in the medium composition is 50 nM or more and 375 ⁇ M or less (or 50 nM or more and less than 375 ⁇ M, 50 nM or more and 375 ⁇ M or less, or more than 50 nM and less than 375 ⁇ M).
  • the concentration of the adrenocortical hormone is multiplied by the potency of the glucocorticoid, and the sum of the concentrations is added to the one or more adrenocortical hormones.
  • the converted concentration is, for example, 1.25 ⁇ M or more (or 1.25 ⁇ M or more), 1.375 ⁇ M or more (or 1.375 ⁇ M or more), 1.5 ⁇ M or more (or 1.5 ⁇ M or more), 1.625 ⁇ M or more (or 1.625 ⁇ M or more ⁇ M), ⁇ 1.75 ⁇ M (or >1.75 ⁇ M), ⁇ 1.875 ⁇ M (or >1.875 ⁇ M), ⁇ 2 ⁇ M (or >2 ⁇ M), ⁇ 2.125 ⁇ M (or >2.125 ⁇ M), ⁇ 2.25 ⁇ M (or 2.25 ⁇ M), ⁇ 2.375 ⁇ M (or >2.375 ⁇ M), ⁇ 2.5 ⁇ M (or >2.5 ⁇ M), ⁇ 3.75 ⁇ M (or >3.75 ⁇ M), ⁇ 5 ⁇ M (or >5 ⁇ M), ⁇ 6.25 ⁇ M (or 6.25 ⁇ M), ⁇ 7.5 ⁇ M (or >7.5 ⁇ M), ⁇ 8.75 ⁇ M (
  • the equivalent concentration of adrenocortical hormones is 1.25 ⁇ M to 300 ⁇ M (or 1.25 ⁇ M to less than 300 ⁇ M, 1.25 ⁇ M to 300 ⁇ M, or 1.25 ⁇ M to less than 300 ⁇ M).
  • 1.5 ⁇ M to 150 ⁇ M (or 1.5 ⁇ M to less than 150 ⁇ M, more than 1.5 ⁇ M to 150 ⁇ M, or more than 1.5 ⁇ M to less than 150 ⁇ M), more preferably 17.5 ⁇ M to 60 ⁇ M (or 17.5 ⁇ M to less than 60 ⁇ M, more than 17.5 ⁇ M 60 ⁇ M or less, or 17.5 ⁇ M or more and less than 60 ⁇ M), still more preferably 2.5 ⁇ M to 30 ⁇ M (or 2.5 ⁇ M or more and less than 30 ⁇ M, 2.5 ⁇ M or more and 30 ⁇ M or less, or 2.5 ⁇ M or more and less than 30 ⁇ M).
  • the medium composition of the present invention may contain serum.
  • Serum is not particularly limited as long as it is animal-derived serum as long as it does not inhibit the induction of mesenchymal stem cells, but mammal-derived serum (eg, fetal bovine serum, human serum, etc.) is preferred.
  • the concentration of serum may be within a concentration range known per se.
  • serum-free media should also be preferably used, as other animal-derived components may serve as a source of infection for blood-borne pathogens or as xenoantigens. obtain.
  • alternative additives for serum eg, Knockout Serum Replacement (KSR) (Invitrogen), Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco), etc.
  • mesenchymal stem cells induced and cultured by the medium composition of the present invention When mesenchymal stem cells induced and cultured by the medium composition of the present invention are used for medical purposes such as cell therapy, they may be infected with pathogens or become heterologous antigens. More preferably, the medium does not contain non-human animal-derived components.
  • Stem cells means immature cells with self-renewal and differentiation/proliferation abilities. Stem cells include subpopulations such as pluripotent stem cells, multipotent stem cells, and unipotent stem cells, depending on their differentiation potential.
  • a pluripotent stem cell means a cell that has the ability to differentiate into all tissues and cells that constitute a living body.
  • Multipotent stem cells refer to cells that have the ability to differentiate into multiple, but not all, types of tissues and cells.
  • a unipotent stem cell means a cell that has the ability to differentiate into a specific tissue or cell.
  • Mesenchymal stem cells targeted in the present invention are a type of multipotent stem cells that can differentiate into adipocytes, osteocytes, chondrocytes, muscle cells, hepatocytes, nerve cells, etc. known as cells that are less likely to form
  • the mesenchymal stem cells in the present invention are preferably positive for one or more mesenchymal stem cell markers (e.g., CD90, CD44, CD73, CD105, etc.), more preferably positive for the marker, and It may be negative for the expression of molecules that are not found to be expressed in foliar stem cells. Examples of molecules whose expression is not observed in mesenchymal stem cells include CD34, CD45, CD14, CD11b, CD79, CD19, HLA-DR and the like.
  • the medium composition of the present invention can be suitably used for inducing mesenchymal stem cells derived from any animal.
  • Mesenchymal stem cells that can be induced and cultured using the medium composition of the present invention include, for example, rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, lagomorphs such as rabbits, pigs, cattle, goats and horses. , ungulates such as sheep, felines such as dogs and cats, and mesenchymal stem cells derived from primates such as humans, monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, and chimpanzees, preferably human-derived mesenchymal stem cells.
  • stem cells preferably human-derived mesenchymal stem cells.
  • the medium composition of the present invention contains factors that induce differentiation of mesenchymal stem cells (e.g., glucocorticoids, factors called transforming growth factor- ⁇ family, e.g., bone morphogenetic proteins (preferably BMP-2 or BMP-4). ), basic fibroblast growth factor (bFGF), inhibin A or chondrogenesis stimulating active factor (CSA), collagenous extracellular matrices such as type I collagen (especially in gel form), and vitamins such as retinoic acid. A analog), preferably at a concentration that does not induce differentiation of mesenchymal stem cells (eg, differentiation into cartilage).
  • the medium may not contain factors that induce differentiation of mesenchymal stem cells other than adrenocortical hormones.
  • the medium may not contain factors other than dexamethasone that induce differentiation of mesenchymal stem cells.
  • the medium composition of the present invention may contain scaffolding components.
  • the scaffold components include laminin [including laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter, laminin 511), laminin ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter, laminin 111), etc. and laminin fragments (laminin 511E8, etc.)], entactin, fibronectin, gelatin, vitronectin, synthmax (Corning Co.), extracellular matrices such as Matrigel, etc., preferably laminin-511.
  • These scaffold components are generally 0.001 ⁇ g/ml to 1000 ⁇ g/ml, preferably 0.01 ⁇ g/ml to 100 ⁇ g/ml, more preferably 0.1 ⁇ g/ml to 10 ⁇ g/ml, more preferably 0.1 ⁇ g/ml to 100 ⁇ g/ml. Add to medium at ⁇ g/ml to 1 ⁇ g/ml, most preferably 0.2 ⁇ g/ml.
  • the medium composition of the present invention is used to induce differentiation of neural crest cells into mesenchymal stem cells.
  • Nesenchymal stem cells also called “NCC”
  • NCC neural Crest Cell
  • the term "neural crest cells” as used herein includes not only cells collected from a living body, but also neural crest cells derived from pluripotent stem cells and subcultured cells thereof.
  • the neural crest cells are not particularly limited in origin, and may be derived from any vertebrate, but neural crest cells derived from mammals are preferred. Such mammals include, but are not limited to, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, cows, horses, goats, monkeys, and humans. Humans are preferred.
  • Neural crest cells may be biologically-derived neural crest cells, for example, neural crest-derived tissues in vivo (e.g., bone marrow, dorsal root ganglion, heart, cornea, iris, dental pulp, olfactory mucosa, etc.). can be manufactured from Neural crest cells derived from pluripotent stem cells can also be preferably used.
  • a method for obtaining neural crest cells from pluripotent stem cells a method known per se can be used.
  • One example is culturing pluripotent stem cells in a culture medium containing a TGF ⁇ inhibitor and a GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • a method of inducing differentiation is exemplified.
  • Whether or not the thus obtained cell population contains neural crest cells can be determined by confirming the expression of one or more neural crest cell-specific marker genes such as TFAP2a, SOX9, SOX10, TWISTI, and PAX3 by a method known per se. good.
  • proteins present on the cell surface of neural crest cells such as CD271 protein (also referred to as “p75(NTR)”) can also be used as neural crest cell-specific markers.
  • the neural crest cells are preferably derived from pluripotent stem cells, more preferably iPS cells.
  • Pluripotent stem cells include any cells that can be induced into intermediate mesoderm cells that also have proliferative potential.
  • pluripotent stem cells include, but are not limited to, embryonic stem (ES) cells, cloned embryo-derived embryonic stem (ntES) cells obtained by nuclear transfer, spermatogonial stem cells (GS cells), and embryonic germ cells.
  • EG cells embryonic stem
  • iPS induced pluripotent stem
  • Muse cells pluripotent stem cells derived from bone marrow stem cells.
  • Preferred pluripotent stem cells are iPS cells, more preferably human iPS cells, from the viewpoint that they can be obtained without destroying embryos, ova, etc. in the manufacturing process.
  • a method for producing iPS cells is known in the art, and can be produced by introducing a reprogramming factor into any somatic cell.
  • the initialization factors are, for example, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 Genes or gene products such as -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glis1 are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination. Also good.
  • Combinations of initialization factors include WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/091659 101407 ⁇ WO2009/102983 ⁇ WO2009/114949 ⁇ WO2009/117439 ⁇ WO2009/126250 ⁇ WO2009/126251 ⁇ WO2009/126655 ⁇ WO2009/157593 ⁇ WO2010/009015 ⁇ WO2010/033906 ⁇ WO2010/033920 ⁇ WO2010/042800 ⁇ WO2010/050626 ⁇ WO2010/056831 ⁇ WO2010/068955 ⁇ WO2010/098419 ⁇ WO2010/102267 ⁇ WO2010/111409 ⁇ WO2010/111422 ⁇ WO2010/115050 ⁇ WO2010/124290 ⁇ WO2010/147395 ⁇ WO2010/147612 ⁇ Huangfu D, et al.
  • Somatic cells include, but are not limited to, fetal (pup) somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells, and primary cultured cells. , passaged cells, and cell lines are all included.
  • somatic cells include, for example, (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells, (2) tissue progenitor cells, and (3) blood cells (peripheral stem cells).
  • lymphocytes epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosa cells, enterocytes, splenocytes, pancreatic cells (pancreatic exocrine cells) etc.), differentiated cells such as brain cells, lung cells, kidney cells and adipocytes.
  • the mammal from which somatic cells are collected is not particularly limited, but is preferably human.
  • the present invention can provide mesenchymal stem cell differentiation promoting agents containing adrenocortical hormones. By culturing neural crest cells using a medium containing the differentiation-promoting agent, it is possible to increase induction efficiency into mesenchymal stem cells.
  • the differentiation-promoting agent of the present invention may consist only of adrenocortical hormones, but may also contain a physiologically acceptable carrier (e.g., physiological isotonic solution (physiological saline, the above-mentioned basal medium, glucose, etc.).
  • physiologically acceptable carrier e.g., physiological isotonic solution (physiological saline, the above-mentioned basal medium, glucose, etc.).
  • adjuvants e.g., D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • excipients e.g., D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • stabilizers e.g., human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • binders It may also be provided as a composition containing a dissolution aid, a nonionic surfactant, a buffer (e.g., phosphate buffer, sodium acetate buffer), a preservative, an antioxidant, the above-mentioned additives, etc.).
  • a buffer e.g., phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • preservative e.g., an antioxidant, the above-mentioned additives, etc.
  • the content of adrenocortical hormone contained in the differentiation-promoting agent of the present invention is such that when the differentiation-promoting agent of the present invention is added to a medium and used, the adrenocortical hormone concentration in the medium is It is preferably configured to contain a concentration sufficient to promote the induction of lineage stem cells.
  • the differentiation promoting agent of the present invention is used by being added to a medium in the form of an isotonic aqueous solution, powder, or the like.
  • the medium composition of the present invention can be produced by adding adrenocortical hormone to the basal medium, but it can also be used in the form of a kit containing the adrenocortical hormone and the basal medium. That is, the adrenocortical hormone and the basal medium are separately combined and supplied in the form of a kit, and the user adds the adrenocortical hormone to the basal medium at the time of use to prepare and use the medium composition of the present invention. can do.
  • the components that make up the basal medium and other components may be provided separately. Both components may be the same or different and may be liquid or powder, and each component may be provided separately, or several components may be provided in a mixed state. Moreover, the kit may not necessarily contain all the components of the medium composition of the present invention, and may omit extremely easily available components such as water. When the component is in the form of powder, it can be used by dissolving in a buffer or the like at the time of use, if desired.
  • the present invention provides a method for producing mesenchymal stem cells (hereinafter referred to as a method for producing mesenchymal stem cells), which comprises a step (step 1) of inducing mesenchymal stem cells by culturing neural crest cells in the medium composition of the present invention. , also referred to as the manufacturing method of the present invention).
  • a step (step 1) of inducing mesenchymal stem cells by culturing neural crest cells in the medium composition of the present invention. also referred to as the manufacturing method of the present invention.
  • differentiation into mesenchymal stem cells is induced by culturing neural crest cells in a medium composition containing a basal medium and adrenocortical hormones.
  • By culturing neural crest cells in a medium containing adrenocortical hormones it becomes possible to efficiently differentiate neural crest cells into cells that retain their ability as mesenchymal stem cells.
  • the culture in step 1 can be suspension culture, adherent culture, or a combination thereof.
  • “Suspension culture” in the present invention refers to culturing cells (or aggregates of cells) while maintaining a state in which they are suspended in a culture solution.
  • “Adhesive culture” refers to culture performed under conditions that allow cells (or aggregates of cells) to adhere to culture equipment and the like. In this case, the adhesion of cells means that a strong cell-substratum junction is formed between the cells or cell aggregates and the cultureware.
  • suspension culture refers to culture under conditions that do not form strong cell-substrate bonds between cells or cell aggregates and cultureware, etc.
  • adherent culture refers to cells or cells This refers to culturing under conditions that form a strong cell-substrate bond between the aggregates and the cultureware.
  • the incubator used for floating culture is not particularly limited as long as it is capable of floating culture, and can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • Such incubators include, for example, flasks, tissue culture flasks, culture dishes (dishes), petri dishes, tissue culture dishes, multidishes, microplates, microwell plates, micropores, multiplates, and multiwell plates.
  • chamber slides Petri dishes, tubes, trays, culture bags, Erlenmeyer flasks, spinner flasks or roller bottles.
  • These incubators are preferably cell non-adhesive in order to enable suspension culture.
  • the surface of the incubator has been artificially treated (for example, superhydrophilic treatment such as MPC polymer, low protein adsorption treatment, etc.) for the purpose of reducing adhesion to cells. You can use things, etc.
  • Rotation culture may be performed using a spinner flask, roller bottle, or the like.
  • the culture surface of the incubator may be flat-bottomed or uneven.
  • the incubator used for adherent culture is not particularly limited as long as it allows adherent culture, and a person skilled in the art can appropriately select an incubator according to the culture scale, culture conditions, and culture period. It is possible to Such incubators include, for example, flasks, tissue culture flasks, culture dishes (dish), tissue culture dishes, multidishes, microplates, microwell plates, multiplates, multiwell plates, chamber slides, Petri dishes, Tubes, trays, culture bags, microcarriers, beads, stack plates, spinner flasks or roller bottles. These incubators are preferably cell-adhesive in order to allow adherent culture.
  • Examples of cell-adhesive incubators include incubators whose surface has been artificially treated for the purpose of improving adhesion to cells, specifically surface-treated incubators, or An incubator whose inside is coated with a coating agent is included.
  • Surface-treated culture vessels include culture vessels that have been surface-treated, such as by positive charge treatment.
  • Coating agents include, for example, laminin [including laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter, laminin 511), laminin ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter, laminin 111), etc.
  • laminin 511E8, etc. examples include extracellular matrices such as Max (Corning) and Matrigel, and polymers such as polylysine and polyornithine.
  • Neural crest cells that can be used in step 1 are: 1. As described in the medium composition, it may be derived from a living organism or from a pluripotent stem cell. When neural crest cells derived from pluripotent stem cells are used, cells immediately after differentiation into neural crest cells may be used. may be used. Purification as used herein refers to increasing the proportion of a specific type of cell (eg, neural crest cell) in a cell population (eg, a cell population containing neural crest cells).
  • a specific type of cell eg, neural crest cell
  • the concentration of neural crest cells to be cultured is about 1 ⁇ 10 2 to about 1 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , preferably about 3 ⁇ 10 2 to about 5 ⁇ 10 6 cells/cm 2 , more preferably About 4 ⁇ 10 2 to about 2 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , more preferably about 4 ⁇ 10 2 to about 1 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , even more preferably about 3 ⁇ 10 3 to about 1 ⁇ It can be 10 4 cells/cm 2 .
  • the concentration of neural crest cells to be cultured is from about 1 ⁇ 10 2 to about 1 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , preferably from about 3 ⁇ 10 2 to about 5 ⁇ 10 6 cells/cm 2 , more preferably.
  • Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration can be appropriately set.
  • the culture temperature is, for example, about 30°C to about 40°C, preferably about 37°C.
  • the CO2 concentration is for example about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • markers for mesenchymal stem cells include CD90, CD44, CD73 and CD105. Therefore, the majority of the mesenchymal stem cell population obtained by the above method (e.g., 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more of the cell composition) , most preferably 100% of the cells) are positive for any one of CD90, CD44, CD73 and CD105, preferably a combination of any two, more preferably a combination of three, most preferably all markers preferable. Furthermore, it is more preferable that the cell composition of the present invention does not express molecules whose expression is not observed in mesenchymal stem cells.
  • Examples of molecules not found expressed in mesenchymal stem cells include CD34 (expressed in hematopoietic stem cells), CD45 (expressed in hematopoietic stem cells), CD14 (expressed in monocytes and macrophages), CD11b (expressed in monocytes, macrophages, NK cells, granulocytes), CD79 (expressed in B cells), CD19 (expressed in B cells) and HLA-DR (expressed in dendritic cells, B cells, monocytes, macrophages), etc. is mentioned.
  • the cell composition of the present invention comprises a majority thereof (e.g., 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and even More preferably 95% or more, most preferably 100% of the cells) are negative for the expression of molecules whose expression is not observed in mesenchymal stem cells.
  • Step A Step of obtaining a cell population containing neural crest cells
  • Step B Step of expanding and culturing the cell population obtained in Step A using an extracellular matrix as a scaffold, may be implemented.
  • a cell population containing neural crest cells can be obtained by a method known per se.
  • the proportion of neural crest cells can vary greatly depending on the tissue collected and conditions for inducing differentiation.
  • the percentage of neural crest cells in a cell population containing neural crest cells is, for example, 1-95%, 1-90%, 1-85%, 1-80%, 1-75%, 1 ⁇ 70%, 1 ⁇ 65%, 1 ⁇ 60%, 1 ⁇ 55%, 1 ⁇ 50%, 1 ⁇ 45%, 1 ⁇ 40%, 1 ⁇ 35%, 1 ⁇ 30%, 1 ⁇ 25%, 1 It can be, but is not limited to, ⁇ 20%, 1-15%, or 1-10%.
  • the percentage of neural crest cells in the cell population containing neural crest cells is, for example, 25-95%, 25-90%, 25-85%, 25-80%, 25-75%, It can be, but is not limited to, 25-70%, 25-65%, 25-60%, 25-55%, 25-50%, 25-45%, 25-40%, or 25-35%.
  • the percentage of neural crest cells in the cell population containing neural crest cells is, for example, 50-95%, 50-90%, 50-85%, 50-80%, 50-75%, It can be, but is not limited to, 50-70%, 50-65%, or 50-60%.
  • the percentage of neural crest cells in the cell population containing neural crest cells can be, for example, 70% or more, 75-95%, 75-90%, or 75-85%. is not limited to
  • step A The cell population containing neural crest cells obtained in step A may then be subjected to a step of purifying neural crest cells, and further subjected to a step of expanding (the purified neural crest cells). good. That is, step B can also be said to be a step of purifying and expanding neural crest cells.
  • expansion culture is a concept that includes culture for maintaining and/or growing desired cells, and preferably culture for growing desired cells.
  • the method for purifying neural crest cells is not particularly limited, and examples thereof include single cell conversion, sorting by a cell sorter using a fluorescently labeled neural crest cell-specific antibody, and magnetic beads bound to the antibody. and sorting using an affinity column on which the antibody is immobilized, but not limited thereto.
  • the cells are subjected to mechanical dispersing treatment, dispersing treatment using enzymes such as collagenase and trypsin, and/or dispersing treatment using a chelating agent such as EDTA. It may be a cell state.
  • a ROCK inhibitor may be added for the purpose of suppressing cell death.
  • ROCK inhibitors are not particularly limited as long as they can inhibit the function of Rho-kinase (ROCK), and examples thereof include Y-27632, Fasudil/HA1077, H-1152, Wf-536, and derivatives thereof. be done.
  • ROCK inhibitors e.g., US Patent Application Publication Nos. 2005/0209261, 2005/0192304, 2004/0014755, 2004/0002508,. , WO 2004/0002507, WO 2003/0125344, WO 2003/0087919, and WO 2003/062227, WO 2003/059913, WO 2003/062225, WO 2002/076976. 2004/039796).
  • a CD271-specific antibody can be used as the neural crest cell-specific antibody.
  • step B culture conditions suitable for maintaining and/or growing neural crest cells can be used.
  • Culture conditions for expanding and culturing neural crest cells are not particularly limited as long as neural crest cells can be expanded and cultured, and culture conditions known per se can be used.
  • One example is a method of culturing in a medium containing a TGF ⁇ inhibitor, EGF (epidermal growth factor) and FGF2 (fibroblast growth factor 2).
  • the medium used for expansion culture of neural crest cells can be prepared using the medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • basal media include IMDM medium, Medium199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, StemPro34 (Invitrogen), RPMI-base medium, StemFit (registered trademark) AK03N medium, and mixed medium thereof are included.
  • StemFit (registered trademark) medium is preferably used in this step.
  • the medium may contain serum or may be serum-free.
  • the medium contains, for example, albumin, transferrin, Knockout Serum Replacement (KSR) (serum replacement for FBS during ES cell culture), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acids, insulin, collagen May contain one or more serum replacements such as precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol (2ME), thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, It may also contain one or more substances such as growth factors, small molecules, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, and the like.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • a TGF ⁇ inhibitor is a substance that inhibits signal transduction from binding of TGF ⁇ to a receptor to SMAD, a substance that inhibits binding to the ALK family receptor, or a substance that inhibits SMAD by the ALK family.
  • the TGF ⁇ inhibitor is, for example, Lefty-1 (exemplified by NCBI Accession No., mouse: NM_010094, human: NM_020997), SB431542, SB202190 (R.K. Lindemann et al., Mol.
  • the TGF ⁇ inhibitor used for expansion culture of neural crest cells can preferably be SB431542.
  • the concentration of the TGF ⁇ inhibitor such as SB431542 in the culture medium is not particularly limited as long as it inhibits ALK5, but is preferably 1 nM to 50 ⁇ M.
  • the concentration of EGF in the medium is preferably 1 ng/ml to 100 ng/ml, for example, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, but not limited to these. More preferably, it is 20 ng/ml.
  • the concentration of FGF2 in the medium is preferably 1 ng/ml to 100 ng/ml, for example, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, but not limited to these. More preferably, it is 20 ng/ml.
  • components other than the above can also be added to the medium as long as expansion culture of neural crest cells can be achieved.
  • the expansion culture of neural crest cells in step B may be either adherent culture or suspension culture, but is preferably performed by adherent culture.
  • Step B is characterized by using an extracellular matrix as a scaffold to achieve purification of neural crest cells.
  • the term "scaffold” refers to (i) a cell-adhesive culture vessel, its material, a substance existing on the surface of the cell-adhesive culture vessel and constituting an adhesion site, and/or (ii) A substance that dissolves, disperses or suspends in a cell culture medium and forms a three-dimensional network in the cell culture medium, to which cells can adhere to the network.
  • cell-adhesive incubators include incubators whose surface is artificially treated for the purpose of improving adhesion to cells, specifically surface-treated incubators, or , an incubator the inside of which is coated with a coating agent.
  • Surface-treated culture vessels include culture vessels that have been surface-treated, such as by positive charge treatment.
  • Such scaffolds also include substances that coat the surface of culture vessels.
  • Coating materials include laminin [including laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1 (laminin 511), laminin ⁇ 2 ⁇ 1 ⁇ 1 (laminin 211), laminin ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 1 (laminin 111), etc. and laminin fragments (laminin 511E8, etc.)], entactin, collagen, gelatin, vitronectin ), synthmax (Corning), extracellular matrices such as Matrigel, or polymers such as polylysine and polyornithine.
  • a substance that forms a three-dimensional network in such a cell culture medium exhibits the effect of uniformly suspending cells and/or tissues in a liquid culture medium.
  • Nanofibers contained in the medium composition of the present invention include nanofibers obtained by refining a relatively large fibrous structure made of a polymer compound by high-pressure treatment or the like.
  • nanofibers form a three-dimensional network that supports cells and tissues, thereby maintaining the cells and tissues in a suspended state.
  • the extracellular matrix used as a scaffold to achieve purification of neural crest cells includes laminin or fibronectin, particularly laminin can be full-length laminin, laminin with ⁇ 2 chain, or laminin-211.
  • Laminin is a glycoprotein that is a major component of the basement membrane. Laminin is known to be involved in various cell functions such as cell adhesion, cell proliferation, metastasis and differentiation. Laminin is composed of heterotrimers with one each of ⁇ , ⁇ , and ⁇ subunit chains. There are currently 5 types of ⁇ -subunit chains ( ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 4, ⁇ 5), 3 types of ⁇ -subunit chains ( ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3), and 3 types of ⁇ -subunit chains ( ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3) Currently, 15 different laminin isoforms have been identified in humans, depending on the combination of these subunit chains.
  • the laminin 211 that can be used in step B can be laminin composed of ⁇ 2, ⁇ 1, and ⁇ 1 subunit chains.
  • the origin of laminin is preferably matched with the organism from which the neural crest cells are derived (for example, when human-derived neural crest cells are used, it is preferable to use human-derived laminin 211).
  • laminin E8 fragment composed only of integrin-binding site has stronger cell adhesion activity than full-length laminin (Miyazaki T. et al., Nat Commun. 2012;3: 1236)
  • the laminin 211 that can be used in step B can be the full length laminin 211 protein rather than a fragment.
  • Laminin-211 may be prepared using a gene recombination technique known per se, or commercially available products may be used.
  • step B when the cell population is expanded in suspension culture, for example, laminin 211 is contained in the medium, and the floating cells use this as a scaffold to form aggregates, thereby obtaining a three-dimensional What is necessary is just to enable floating culture.
  • Floating culture can be performed by a method known per se.
  • One example is a method of expanding a cell population in suspension culture in a medium supplemented with laminin 211 while stirring the medium using a spinner flask or the like.
  • a cell population can be expanded in suspension culture by combining polysaccharides (e.g., methylcellulose, xanthan gum, gellan gum, etc.) that have the effect of suspending cells when added to the medium, and laminin 211.
  • polysaccharides e.g., methylcellulose, xanthan gum, gellan gum, etc.
  • the cells spread three-dimensionally and proliferate in a state attached to nanofibers or in a sphere state.
  • Cells adhere to the nanofibers and proliferate strongly using them as scaffolds, and as a result, the proliferated cells and cell clusters (spheres, etc.) are arranged on the nanofibers in the shape of grape clusters. Therefore, suspension culture of cells becomes possible.
  • the concentration of laminin to be added may be appropriately set in consideration of various conditions such as the seeding density of the cell population and the concentration of the polysaccharide to be used in combination.
  • suspension culture means a culture method in which cells are not adhered to the surface of a culture vessel. Suspension culture may or may not be accompanied by physical agitation. Also, the cells to be cultured may be uniformly dispersed in the medium, or may be unevenly dispersed.
  • the surface of the culture vessel is coated with laminin 211, for example.
  • the coating amount of Laminin 211 is not particularly limited as long as the desired effects of the present invention can be obtained, and a generally recommended coating amount may be used.
  • the coating amount of Laminin 211 is 0.1 ng/cm 2 to 1000 ng/cm 2 , preferably 0.5 ng/cm 2 to 500 ng/cm 2 , more preferably 1 ng/cm 2 to 250 ng/cm 2 . 2 , more preferably 2 ng/cm 2 to 100 ng/cm 2 , but not limited thereto.
  • culture period in step B may vary depending on the culture conditions, culture method, the ratio of neural crest cells contained in the cell population, etc., purification of neural crest cells is achieved in a relatively short period of time.
  • Examples of culture periods include 1 to 21 days, 1 to 20 days, 1 to 19 days, 1 to 18 days, 1 to 17 days, 1 to 16 days, 1 to 15 days, 1 to 14 days, and 1 to 13 days. days, 1-12 days, 1-11 days, 1-10 days, 1-9 days, 1-8 days, 1-7 days, 1-6 days, 1-5 days, 1-4 days, or 1- 3 days, but not limited to.
  • the culture temperature in step B is not particularly limited as long as neural crest cells can be cultured, but it is 30 to 40°C, preferably about 37°C.
  • the CO 2 concentration during culture in step B is not particularly limited as long as neural crest cells can be cultured, but is 2 to 5%, preferably about 5%.
  • Step A Step of obtaining a cell population containing neural crest cells
  • Step C Step of expanding and culturing the cell population obtained in Step A using fibronectin as a scaffold, is carried out.
  • Neural crest cells can be obtained as described in the media composition . Neural crest cells can occur in the cell population used for manufacturing. Cell populations containing neural crest cells can vary greatly in the ratio of neural crest cells depending on the collected tissue and differentiation induction conditions. In one aspect of the present invention, the percentage of neural crest cells in a cell population containing neural crest cells is, for example, 1-95%, 1-90%, 1-85%, 1-80%, 1-75%, 1 ⁇ 70%, 1 ⁇ 65%, 1 ⁇ 60%, 1 ⁇ 55%, 1 ⁇ 50%, 1 ⁇ 45%, 1 ⁇ 40%, 1 ⁇ 35%, 1 ⁇ 30%, 1 ⁇ 25%, 1 It can be, but is not limited to, ⁇ 20%, 1-15%, or 1-10%.
  • the percentage of neural crest cells in the cell population containing neural crest cells is, for example, 25-95%, 25-90%, 25-85%, 25-80%, 25-75%, It can be, but is not limited to, 25-70%, 25-65%, 25-60%, 25-55%, 25-50%, 25-45%, 25-40%, or 25-35%.
  • the percentage of neural crest cells in the cell population containing neural crest cells is, for example, 50-95%, 50-90%, 50-85%, 50-80%, 50-75%, It can be, but is not limited to, 50-70%, 50-65%, or 50-60%.
  • the percentage of neural crest cells in the cell population containing neural crest cells can be 60% or more, 70% or more, 80% or more, for example, 75-95%, 75-90%, or 75-85%, but is not limited to these.
  • cells are passaged as appropriate during step 1. Passaging is performed, for example, every 2-8 days or every 3-7 days after seeding.
  • the passage interval is a period of time sufficient for the expansion of the cell aggregates, and a period shorter than the period during which the cell aggregates become too large and it becomes difficult for oxygen and nutrients to reach the cells inside the cell aggregates. preferably done.
  • the number of passages during step 1 is, for example, 0 to 20 times (0 times, 1 time, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times times, 11 times, 12 times, 13 times, 14 times, 15 times, 16 times, 17 times, 18 times, 19 times, 20 times), preferably 1 to 10 times, more preferably 2 to 8 times is.
  • a portion of the cell population may be preserved as a frozen stock after an appropriate number of passages.
  • cells are passaged as appropriate during step B or C. Passaging is performed, for example, every 2-8 days or every 3-7 days after seeding.
  • the passage interval is a period of time sufficient for the expansion of the cell aggregates, and a period shorter than the period during which the cell aggregates become too large and it becomes difficult for oxygen and nutrients to reach the cells inside the cell aggregates. preferably done.
  • the number of passages during step B or C is, for example, 2 to 8 times (2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times), and 3 to 7 times. is preferred, more preferably 4 to 6 times.
  • a portion of the cell population may be preserved as a frozen stock after an appropriate number of passages.
  • step B or C to step 1 is performed by exchanging the culture medium with the medium composition of the present invention.
  • the timing of replacement may be after an appropriate number of passages, or may be during the final passage of step C. For example, 6 hours before the end of the last passage in step B or C is mentioned.
  • the present invention provides a production method for producing mesenchymal stem cells from a cell population containing neural crest cells
  • the neural crest cells are cells induced to differentiate from pluripotent stem cells
  • the cell population is a cell population containing 70% or more of the neural crest cells, 1.25 ⁇ M or more and 300 ⁇ M or less (1.25 ⁇ M to 300 ⁇ M, or 1.25 ⁇ M or more and less than 300 ⁇ M, 1.25 ⁇ M or more and less than 300 ⁇ M, or 1.25 ⁇ M or more and less than 300 ⁇ M) in the presence of adrenocortical hormone culturing under
  • a production method for producing mesenchymal stem cells from a cell population containing neural crest cells is provided.
  • mesenchymal stem cells are produced by culturing neural crest cells in a medium composition containing adrenocortical hormones.
  • the present invention also provides mesenchymal stem cells and cultures thereof thus produced (hereinafter also referred to as mesenchymal stem cells of the present invention and cultures thereof).
  • “Culture” refers to the result obtained by culturing cells/cell populations in the production method of the present invention, and includes cells, media, and in some cases cell-secreted components.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention are characterized by high expression of TSG-6 (Tumor necrosis factor (TNF)- ⁇ stimulated gene-6).
  • TSG-6 Tumor necrosis factor (TNF)- ⁇ stimulated gene-6.
  • TSG-6 is a member of the hyaluronan-binding protein family, contains a LINK domain that binds to hyaluronan, and its expression is regulated by TNF- ⁇ and IL-1.
  • TSG-6 plays a role in regulating matrix composition and structure, regulating interactions between chemokines and cell surfaces, participating in potent anti-inflammatory and tissue protective functions, and has therapeutic effects in a wide range of disease models. is a characteristic marker of mesenchymal stem cells (Day A.J. and Milner C.M., Matrix Biol. 2019 May; 60-83).
  • high expression of TSG-6 is high expression in response to IFN ⁇ stimulation.
  • the high expression is determined by adding IFN ⁇ to the medium in which the mesenchymal stem cells of the present invention are cultured to stimulate the cells and measuring the expression level of TSG-6 expressed in response to the stimulation. can be detected/quantified by
  • the high expression of TSG-6 means that the expression level of TSG-6 by the mesenchymal stem cells of the present invention (/the expression level of TSG-6 by the mesenchymal stem cells of the present invention in response to IFN ⁇ stimulation) is , means that the expression level of TSG-6 is higher than that of other mesenchymal stem cells, specifically bio-derived mesenchymal stem cells, particularly bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • the high expression of TSG-6 in the mesenchymal stem cells of the present invention means that other 2-fold or more, 2.1-fold or more, 2.2-fold or more, 2.3-fold or more, 2.4-fold or more, 2.5-fold or more, 2.6-fold or more, 2.7-fold or more, 2.8-fold or more, than the expression level of TSG-6 by mesenchymal stem cells, It means 2.9 times higher or 3 times higher.
  • the TSG-6 protein can be isolated and purified from the mesenchymal stem cells of the present invention by methods well known in the art.
  • secretome can be isolated and purified from the mesenchymal stem cells of the present invention by methods well known in the art.
  • Secretome is a concept that includes exosomes and extracellular vesicles in general that have undergone various sizes and production processes other than exosomes that may be included during preparation, and protein components contained in cell culture supernatants. be. Exosomes are around 100 nm in size and contain cholesterol, sphingomyelin, ceramide, and lipid raft constituents in their membranes, as well as many proteins, mRNAs, miRNAs, etc. inside. The secretome secreted from the mesenchymal stem cells of the present invention has an antifibrotic effect.
  • a preventive or therapeutic agent for inflammatory or fibrotic disease containing the purified secretome as an active ingredient, is also provided.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention includes, but is not limited to, the mesenchymal stem cells obtained above suspended in physiological saline or an appropriate buffer (eg, phosphate-buffered saline). Obtained by turbidity. In this case, when the number of mesenchymal stem cells obtained is small, they may be cultured and proliferated until a predetermined number of cells is obtained. Cultivation of the obtained mesenchymal stem cells is not particularly limited, but can be performed in a normal growth medium such as DMEM, EMEM, RPMI-1640, F-12, ⁇ -MEM, MSC growing medium (Bio Whittaker). .
  • the culture temperature is usually in the range of about 30-40°C, preferably about 37°C.
  • the CO 2 concentration is usually in the range of about 1-10%, preferably about 5%.
  • Humidity is usually in the range of about 70-100%, preferably about 95-100%.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • serum albumin etc.
  • antibiotics are used to prevent contamination and growth of bacteria. etc.
  • cell preparations e.g., carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, etc.
  • pharmaceutically acceptable ingredients e.g., carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, etc.
  • One skilled in the art can add these factors and agents to cell preparations at appropriate concentrations.
  • the number of mesenchymal stem cells contained in the prophylactic or therapeutic agent prepared above is determined according to the sex, age, weight, affected area, etc. of the subject so that the desired effect can be obtained in the treatment of inflammatory disease or fibrotic disease. It can be appropriately adjusted in consideration of the state of cells, the state of the cells to be used, and the like.
  • the target individual includes, but is not limited to, mammals such as humans.
  • the cell preparation of the present invention can be administered multiple times (eg, 2 to 10 times) at appropriate intervals (eg, twice a day, once a day, once a week) until the desired therapeutic effect is obtained. twice, once a week, once every two weeks, once a month, once every two months, once every three months, once every six months).
  • therapeutically effective doses may include, for example, 1 to 10 doses of 1 ⁇ 10 3 cells to 1 ⁇ 10 10 cells per individual.
  • the total amount administered to one individual is not limited, but is 1 ⁇ 10 3 cells to 1 ⁇ 10 11 cells, preferably 1 ⁇ 10 4 cells to 1 ⁇ 10 10 cells, more preferably 1 ⁇ 10 5 cells to 1 ⁇ 10 cells. 9 cells and the like.
  • the prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention contains the TSG-6 protein isolated/purified from the mesenchymal stem cells of the present invention as an active ingredient.
  • the content of the TSG-6 protein in the prophylactic or therapeutic drug varies depending on the dosage form, dosage of the TSG-6 protein, etc., but is, for example, about 0.1 to 100% by weight.
  • the dosage of TSG-6 protein is, but not limited to, 0.01 ng/kg to 1 mg/kg, 10 ng/kg to 100 ⁇ g/kg.
  • the preventive or therapeutic agent for fibrotic diseases of the present invention contains the secretome isolated/purified from the mesenchymal stem cells of the present invention as an active ingredient.
  • the content of the secretome in the prophylactic or therapeutic drug varies depending on the dosage form, secretome dose, etc., but is, for example, about 0.1 to 100% by weight in terms of protein content.
  • the dose of secretome is, but not limited to, 0.01 ng/kg to 1 mg/kg, 10 ng/kg to 100 ⁇ g/kg.
  • inflammatory diseases to be prevented or treated by the prophylactic or therapeutic drug for inflammatory diseases of the present invention include hepatitis, liver cirrhosis, Crohn's disease, rheumatoid arthritis, Behcet's disease (eye symptoms), ulcerative colitis, ankylosing Spondylitis, psoriasis (including psoriatic arthritis), HIV infection, multiple myeloma, congestive heart failure, GVHD, giant cell arteritis (GCA), polymyalgia rheumatoid arthritis (PMR), lichen purpura pigmentosa Scoliform dermatitis, sarcoidosis, Wegener's granuloma, pyoderma, Behçet's disease, TNF receptor-associated periodic syndrome (TRAPS), SAPHO syndrome, Takayasu's disease, myositis, Still's disease, periarteritis nodosa (PN), relapse Examples include polychondritis,
  • Fibrotic diseases to be prevented or treated by the preventive or therapeutic agents for fibrotic diseases of the present invention include, for example, skin-related scleroderma (localized scleroderma, generalized morphea or linear sclerosis). fibrosis arising from conditions including pseudoscleroderma caused by spinal cord injury, keloid scarring, psoriasis, hypertrophic scarring from burns, atherosclerosis, restenosis, and spinal cord injury; (including glomerulosclerosis, renal tubulointerstitial fibrosis, progressive kidney disease or diabetic nephropathy), cardiac fibrosis (e.g., myocardial fibrosis), pulmonary fibrosis (e.g., glomerulosclerosis pulmonary fibrosis) pulmonary fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, silicosis, asbestosis, interstitial lung disease, interstitial fibrous lung disease and chemotherapy/radiation-induced pulmonary fibrosis), oral
  • the method of administering the prophylactic or therapeutic agent of the present invention is not particularly limited, but suitable examples include intravascular administration (preferably intravenous administration), intraperitoneal administration, intestinal administration, subcutaneous administration, local administration to the affected area, and the like. Among them, intravascular administration and local administration can be exemplified more preferably.
  • a method for preventing or treating a disease provides a method for administering to a subject a therapeutically effective amount of the mesenchymal stem cells of the present invention and/or an agent for the prevention or treatment of an inflammatory disease or fibrotic disease of the present invention.
  • a method for preventing or treating an inflammatory or fibrotic disease comprising:
  • an effective amount means that amount of active ingredient that produces the desired effect.
  • therapeutically effective amount means that amount of active ingredient that produces the desired therapeutic effect when administered to a subject.
  • a therapeutically effective amount may be administered (implanted) at once or divided into multiple doses (implanted).
  • the number of applications for transplantation depends on the disease and is determined by medical practitioners and guidelines. When transplanting multiple times, the interval is not particularly limited, but a period of several days to several weeks may be provided. 4 above. According to the dosage of mesenchymal stem cells etc. described in the preventive or therapeutic agents for diseases .
  • animals subject to the cell therapy include rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, experimental animals such as rabbits, domestic animals such as pigs, cows, goats, horses, sheep and minks, dogs and cats. and primates such as humans, monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, and chimpanzees, preferably humans.
  • the range of disease sites to which the mesenchymal stem cells of the present invention can be applied is appropriately selected depending on the target disease, animal species to be administered, age, sex, body weight, symptoms, and the like.
  • the present invention provides a method for producing a drug for the prevention or treatment of diseases containing mesenchymal stem cells as an active ingredient.
  • a method for producing a therapeutic agent comprising a step (step 1) of inducing mesenchymal stem cells by culturing neural crest cells in the medium composition of the present invention.
  • Step 1 in the method for producing a preventive or therapeutic agent for a disease of the present invention can be performed in the same manner as Step 1 in the method for producing mesenchymal stem cells of the present invention.
  • neural crest cells that are induced to differentiate into mesenchymal stem cells, pluripotent stem cells when the neural crest cells are derived from pluripotent stem cells, and pluripotent
  • the somatic cells induced into the iPS cells may be either autologous or heterologous (allogeneic or heterologous) to the subject of administration, and the individual that is the source of the cells is not particularly limited, but for example, when the agent of the present invention is produced for administration to an animal in need of disease prevention or treatment, these cells are recipes of mesenchymal stem cells derived from donor cells. It may have tissue compatibility to the extent that it can be engrafted in the ent.
  • the drug for prevention or treatment of a disease of the present invention is used for the prevention or treatment of a disease in humans, from the viewpoint of preventing death from being attacked by the immune system, these cells are the patient himself/herself. or obtained from another person with an HLA type that is identical or substantially identical to the patient's HLA type.
  • substantially the same HLA type means that when the donor's HLA type is transplanted into a patient with the use of an immunosuppressant or the like, the donor's cell-derived mesenchymal It means that the stem cells match those of the patient to the extent that they are engraftable. Examples thereof include HLA types having the same major HLA (3 main loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, or 4 loci including HLA-Cw).
  • the method for producing a drug for preventing or treating a disease of the present invention includes adding dimethylsulfoxide (DMSO), serum albumin, etc. to protect mesenchymal stem cells, and antibiotics, etc. to prevent bacterial contamination and proliferation. into the medicament.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • serum albumin etc.
  • other pharmaceutically acceptable ingredients e.g., carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, etc.
  • a drug may be contained in a drug.
  • One skilled in the art can add these factors and drugs to the drug at appropriate concentrations.
  • the method for producing a preventive or therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention further comprises recovering TSG-6 protein from the induced mesenchymal stem cells and/or the culture supernatant,
  • a preventive or therapeutic agent for sexually transmitted diseases contains the TSG-6 protein as an active ingredient.
  • the method for producing a preventive or therapeutic agent for fibrotic diseases of the present invention further comprises recovering a secretome from the induced mesenchymal stem cells and/or the culture supernatant, Alternatively, a therapeutic drug contains the secretome as an active ingredient.
  • Example 1 Induction of differentiation from iNCCs (iPS cell-derived neural crest cells) to iMSCs (iPS cell-derived mesenchymal stem cells) 1.
  • iNCC neural crest cells
  • iPS portal iPS portal
  • iPS cells were seeded at 6500 cells/well on a 6-well plate coated with laminin 511-E8 fragment (iMatrix511, Nippi) and placed in StemFit (registered trademark) AK03N (Ajinomoto Co.) medium at 37°C. , and cultured for 5 days under 5% CO 2 .
  • the medium is StemFit AK03N (solution A + solution B) with SB431542 (Stemgent, Inc., 10 ⁇ M) and CHIR99021 (Wako, 0.3 ⁇ M (condition 1) or 0.9 ⁇ M (condition 2)) in a medium
  • SB431542 Stemgent, Inc., 10 ⁇ M
  • CHIR99021 Woodo, 0.3 ⁇ M (condition 1) or 0.9 ⁇ M (condition 2)
  • Differentiation into neural crest cells was induced for 14 days at 37°C and 5% CO 2 .
  • the percentage of neural crest cells at the end of induction was calculated by determining the percentage of cells with high CD271 protein expression using FACS.
  • the gene expression status of neural crest cell markers was examined by RT-PCR. The primers used in the RT-PCR method are shown below.
  • the cell population containing neural crest cells produced in 1 above was converted to single cells using TrypLE Select (Thermo Fisher).
  • the single-celled cell population was seeded on a scaffold-coated 6-well plate and cultured under culture conditions suitable for expansion culture of neural crest cells. More specifically, a medium containing StemFit AK03N (solution A + solution B) supplemented with SB431542 (10 ⁇ M), epithelium growth factor (Sigma Chemical, 20 ng/mL) and StemFit AK03N C solution (Ajinomoto Co., Inc., 0.08%) was cultured at 37°C, 5% CO 2 for 9-10 days. After culturing for 9 to 10 days, when the confluency reached about 90%, the percentage of neural crest cells in the cell population cultured on the scaffold material and the expression status of neural crest cell gene markers were evaluated as described in 1. above. determined by the same method as
  • Laminin 211 (Biolamina, 6.3 ng/cm 2 and 62.5 ng/cm 2 ) was used as a scaffold.
  • the scaffold was coated on the 6-well plate surface by directly suspending it in the culture medium.
  • iNCCs obtained iNCCs (iPSC-derived NCCs) were transferred to a 6-well plate coated with vitronectin-N (Thermo Fisher Scientific) at a density of 1.5 ⁇ g/cm 2 at 5.0 ⁇ 10 3 .
  • iMSCs iPSC-derived MSCs were induced by seeding at a cell/well density and culturing for 13 days at 37°C under 5% CO 2 conditions using the following differentiation medium (T3 medium).
  • T3 medium StemFit (registered trademark) For Mesenchymal Stem Cells (Ajinomoto Co., Inc.), 90 nM Dexamethasone (Sigma-Aldrich) Surface antigen analysis of 3 MSC positive markers (CD90, CD44, CD73) and 1 negative marker (CD34) was performed on the induced iMSCs using FACS. Table 1 shows the analysis results.
  • the obtained cells were positive for CD90, CD44, and CD73, and negative for CD34, confirming iMSC induction.
  • Example 2 Analysis of Inflammatory Stimulus Response of iMSCs by IFN ⁇ Stimulation iNCCs were plated at a density of 1.5 ⁇ g/cm 2 onto vitronectin-N coated 6-well plates at a density of 5.0 ⁇ 10 3 cells/well. iMSCs were induced by seeding and culturing for 16 days at 37° C., 5% CO 2 using T3 medium.
  • FIG. 1 shows the results of gene expression analysis of TSG-6.
  • T3 medium-induced iMSCs were found to significantly increase TSG-6 gene expression upon IFN ⁇ stimulation.
  • Example 3 Dexamethasone Concentration Study iNCCs were seeded at a density of 1.5 ⁇ g/cm 2 onto vitronectin-N coated 6-well plates at a density of 3.0 ⁇ 10 4 cells/well and subjected to StemFit® For Dexamethasone was added to Mesenchymal Stem Cells at 50 nM, 100 nM, 1 ⁇ M, 10 ⁇ M and 50 ⁇ M to induce iMSCs under conditions of 37° C. and 5% CO 2 . Eighteen days after initiation of differentiation, each medium was stimulated with 50 ng/mL IFN ⁇ for 48 hours. After stimulation RNA was purified and TNFAIP6 gene expression was analyzed using Real-Time PCR after reverse transcription. FIG.
  • FIG. 2 shows cell growth curves during induction of differentiation. In the group to which 50 ⁇ M dexamethasone was added, cell growth stopped after 13 days.
  • FIG. 3 shows the results of gene expression analysis of TSG-6. iMSCs induced by addition of 50 nM to 10 ⁇ M of dexamethasone were found to significantly increase TSG-6 gene expression upon IFN ⁇ stimulation.
  • Example 4 Examination of types of adrenocortical hormones iMSCs were induced according to Example 1, except that 100 nM Dexamethasone, 100 nM betamethasone, 100 nM prednisolone, and 666 nM prednisolone were used.
  • FACS was used to identify 4 MSC-positive markers (CD90, CD44, CD73, CD105), 1 NCC-positive marker (MSC weakly positive marker) (CD271), and 2 MSC-negative markers (CD45 , CD34) surface antigen analysis was performed. Table 3 shows the analysis results.
  • prednisolone had a limited effect even when added at 100 nM, but when the titer as a glucocorticoid was adjusted to 666 nM, there was an effect of promoting differentiation.
  • the converted concentrations of dexamethasone 50 nM, 90 nM, 100 nM, 1 ⁇ M, 10 ⁇ M, and 50 ⁇ M in this example are 1.333 ⁇ M, 2.3994 ⁇ M, 2.666 ⁇ M, 26.66 ⁇ M, 266.6 ⁇ M, and 1333 ⁇ M, respectively ( converted to a dexamethasone titer of 26.66).
  • the converted concentrations of 100 nM and 666 nM prednisolone in this example are 400 nM and 2.664 ⁇ M, respectively (converted with the titer of prednisolone being 4).
  • the converted concentration of 100 nM betamethasone in this example is 2.666 ⁇ M (converted based on the betamethasone titer of 26.66).
  • i ⁇ SC Secretome Evaluation (Materials and Methods) 1.
  • i ⁇ SC secretome collection Secretome is a protein secreted from cells and is known to contain exosomes.
  • iMSC frozen stocks at passage number p1 were cultured for 3 passages using StemFit (registered trademark) For Mesenchymal Stem Cell (Ajinomoto Co., Inc.) supplemented with 90 nM Dexamethasone (Sigma-Aldrich). After the medium was changed to DMEM/F-12 (Gibco) medium at 80% confluency, the cells were cultured for 2 days and the culture supernatant was collected. Culture supernatants were 0.22 ⁇ m filtered.
  • LX-2 Human Hepatic Stellate Cell Line
  • FBS FBS
  • penicillin-streptomycin Nacalai
  • 2 mM glutamine 2 mM glutamine.
  • Gibco was cultured using a medium supplemented with DMEM high glucose (Life Technologies). At passage 4, 4 ⁇ 10 4 cells were seeded into each well of a 12-well plate.
  • RT-PCR was performed on the synthesized cDNA using primers from TaqMan (registered trademark) Gene Expression Assays in Table 5.
  • the present invention it is possible to provide a medium composition for efficiently inducing mesenchymal stem cells from neural crest cells.
  • an efficient method for producing mesenchymal stem cells, a preventive or therapeutic agent for inflammatory or fibrotic diseases containing the mesenchymal stem cells or the like as an active ingredient, and prevention of the disease Alternatively, it is possible to provide a therapeutic method, a method for producing the therapeutic drug, and the like. Therefore, the present invention is extremely useful, for example, in the medical field.

Abstract

本発明は、間葉系幹細胞を効率よく調製するための、培地組成物、間葉系幹細胞の製造方法、炎症性疾患又は線維性疾患の予防又は治療用薬剤等を提供する。具体的には、基礎培地及び副腎皮質ホルモンを含有する、神経堤細胞から間葉系幹細胞を誘導するための培地組成物であって、培地組成物中の副腎皮質ホルモンの換算濃度が1.25 μM以上である培地組成物中で神経堤細胞を培養して間葉系幹細胞を誘導する工程を含む、炎症性疾患又は線維性疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法を提供する。

Description

間葉系幹細胞の製造方法
　本発明は、間葉系幹細胞の製造方法等に関し、詳細には、基礎培地及び副腎皮質ホルモンを含有する培地組成物を用いた間葉系幹細胞の製造方法等に関する。
　間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cell; MSC）は、生体の骨髄等に存在する体性幹細胞の一種であり、骨、軟骨、脂肪細胞への分化能を有する接着性の細胞と定義される。間葉系幹細胞は癌化の危険性が極めて少ないと考えられており、再生医療に用いられる細胞材料として、大いに有望視されている。また、間葉系幹細胞は組織傷害部位に集積し、様々な液性因子やエクソソームを放出して免疫反応や抗炎症作用を制御する機能を有し、組織修復・恒常性の維持に重要な役割を果たしていることが知られている。従って、間葉系幹細胞自体としての、免疫疾患や炎症性疾患等を治療するための細胞製剤としても有望である。
　しかしながら、間葉系幹細胞は由来する組織等によって異なった分化能や増殖／機能特性を有しているため、目的に応じて有用な性質を示す間葉系幹細胞を効率的に製造することが求められていた。
　神経堤細胞は脊椎動物に特有の細胞であり、発生初期に神経管と予定表皮外胚葉間に一過的に生じ、胚の体内を移動し、末梢神経系の細胞や頭部組織の細胞、色素細胞等の多種多様な細胞に分化する細胞である。神経堤細胞が特許文献１及び非特許文献１に開示されている方法によって製造できること、及びこれから間葉系幹細胞の分化を誘導できること（非特許文献２）は知られていたが、間葉系幹細胞をより効率的に製造する方法が研究されていた。
国際公開第2020/230832号
Fukuta M. et al., PLoS One. 2014 Dec 2;9(12):e 112291. Zhao C. and Ikeya M., Stem Cells Int. 2018 Jul 31; Article ID 9601623
　本発明の課題は、間葉系幹細胞を効率よく製造するための、培地組成物、間葉系幹細胞の製造方法等の提供である。
　本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、副腎皮質ホルモンを含有する培地組成物を用いることで、神経堤細胞から間葉系幹細胞を効率よく誘導することができること、さらに培地組成物中の副腎皮質ホルモンの好適な濃度を見出した。さらに、かかる培地組成物中で神経堤細胞を培養することにより得られた間葉系幹細胞がTSG-6を高発現しており、炎症性疾患の予防又は治療用薬剤として有用であることを見出した。加えて、かかる培地組成物中で神経堤細胞を培養することにより得られた間葉系幹細胞のセクレトームが、線維化のマーカー遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１及びＡＣＴＡ２発現を低下させることから、線維性疾患の予防又は治療用薬剤として有用であることを見出して、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］　基礎培地及び副腎皮質ホルモンを含有する、神経堤細胞から間葉系幹細胞を誘導するための培地組成物であって、培地組成物中の副腎皮質ホルモンの換算濃度が1.25 μM以上である培地組成物中で神経堤細胞を培養して間葉系幹細胞を誘導する工程を含む、炎症性疾患又は線維性疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法。
［２］　該炎症性疾患又は線維性疾患の予防又は治療用薬剤がTSG-6の高発現を特徴とする間葉系幹細胞を有効成分として含有する、［１］に記載の方法。
［３］　炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法であって、誘導された間葉系幹細胞及び／又は培養上清からTSG-6タンパク質を回収することを更に含み、該炎症性疾患の予防又は治療用薬剤がTSG-6タンパク質を有効成分として含有する、［１］に記載の方法。
［４］　線維性疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法であって、誘導された間葉系幹細胞及び／又は培養上清からセクレトームを回収することを更に含み、該線維症の予防又は治療用薬剤が、該セクレトームを有効成分として含有する、［１］に記載の方法。
［５］　副腎皮質ホルモンが、糖質コルチコイドあるいはその誘導体である、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］　糖質コルチコイドあるいはその誘導体が、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プロピオン酸ベクロメタゾンから成る群から選択される、少なくとも１種である、［５］に記載の製造方法。
［７］　糖質コルチコイドあるいはその誘導体が、デキサメタゾンである、［５］又は［６］に記載の製造方法。
［８］　培地組成物中の副腎皮質ホルモンの換算濃度が300 μM以下である［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］　培地組成物中のデキサメタゾンの濃度が10 μM以下である［７］に記載の製造方法。
［１０］　基礎培地が無血清培地である、［１］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］　神経堤細胞が多能性幹細胞由来である、［１］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］　多能性幹細胞が人工多能性幹細胞（iPS細胞）である、［１１］に記載の製造方法。
［１３］　前記工程の前に以下の工程を実施する、［１］～［１２］のいずれかに記載の製造方法：
（工程A）神経堤細胞を含む細胞集団を得る工程、及び
（工程B）工程Aで得られた細胞集団を、細胞外マトリックスを足場として用いて拡大培養する工程。
［１４］　細胞外マトリックスが、ラミニンまたはフィブロネクチンである、［１３］に記載の製造方法。
［１５］　ラミニンが、全長ラミニン、α2鎖を有するラミニン又はラミニン２１１である、［１４］に記載の製造方法。
［１６］　工程Aで得られた神経堤細胞を含む細胞集団が、神経堤細胞のソーティング処理に供されることなく工程Bに供されることを特徴とする、［１３］～［１５］のいずれかに記載の製造方法。
［１７］　炎症性疾患が肝硬変である、［１］～［３］及び［５］～［１６］のいずれかに記載の製造方法。
［１８］　TSG-6の高発現がIFNγ刺激に応答した高発現である、［２］、［３］及び［５］～［１７］のいずれかに記載の製造方法。
［１９］　［１］～［３］及び［５］～［１８］のいずれかの製造方法により製造された、炎症性疾患の予防又は治療用薬剤又は［１］、［２］、［４］～［１８］のいずれかの製造方法により製造された、線維性疾患の予防又は治療用薬剤。
　本発明によれば、神経堤細胞から間葉系幹細胞を効率的に誘導するための培地組成物を提供することができる。また、本発明によれば、効率的な間葉系幹細胞の製造方法、該間葉系幹細胞等を有効成分として含有する、炎症性疾患又は線維性疾患の予防又は治療用薬剤、該疾患の予防又は治療方法、及び該治療用薬剤の製造方法等を提供することができる。
図１は、種々の間葉系幹細胞において５０　ｎｇ／ｍＬ　ＩＦＮγで４８時間刺激後のＴＮＦＡＩＰ６（ＴＳＧ－６）の遺伝子発現を示したグラフである。 図２は分化誘導中の細胞増殖曲線を示したグラフである。 図３は、５０　ｎｇ／ｍＬ　ＩＦＮγで４８時間刺激後のＴＮＦＡＩＰ６（ＴＳＧ－６）の遺伝子発現を示したグラフである。 図４は、本発明の間葉系幹細胞から単離したセクレトームが、ＬＸ－２細胞株において、線維化マーカー遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１及びＡＣＴＡ２発現を著しく低下させたことを示したグラフである。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．培地組成物
　本発明は、基礎培地及び副腎皮質ホルモンを含有する、神経堤細胞から間葉系幹細胞を誘導するための培地組成物であって、培地組成物中の副腎皮質ホルモンの換算濃度が1.25 μM以上である培地組成物（以下、本発明の培地組成物とも称する）を提供する。
　本発明の、培地組成物が含有する基礎培地には、自体公知の基礎培地を用いることができ、神経堤細胞から間葉系幹細胞への誘導を阻害しない限り特に限定されない。当該基礎培地には、例えば、IMDM培地、Medium199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（Invitrogen）、RPMI-base medium、StemFit(登録商標)、MCDB201培地及びこれらの混合培地などが包含される。本工程において、好ましくは、StemFit(登録商標)培地が用いられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、或いは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
　前記培地は、副腎皮質ホルモンを含む。副腎皮質ホルモンとしては、例えば、糖質コルチコイド及びその誘導体などが挙げられ、該糖質コルチコイド及びその誘導体としては、例えば、コルチゾン、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プロピオン酸ベクロメタゾンが挙げられる。これらのうち、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾンが好ましく、なかでも、デキサメタゾンが好ましい。培地に添加される副腎皮質ホルモンは１種又は2種以上であってもよいが、好ましくは1種である。
　デキサメタゾン（CAS番号:50-02-2、CA index名:Pregna-1,4-diene-3,20-dione,9-fluoro-11,17,21-trihydroxy-16-methyl-,(11β,16α)-）は、下式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
で表される構造を有する公知の合成副腎皮質ホルモンである。デキサメタゾンは市販されているので、かかる市販品を本発明に使用することもできる。デキサメタゾンを用いることによって神経堤細胞から間葉系幹細胞への分化が誘導されるため、本発明の培地組成物中で神経堤細胞を培養することにより、高い効率で、間葉系幹細胞を製造することができる。
　培地組成物中に含まれる副腎皮質ホルモンの濃度は、神経堤細胞から間葉系幹細胞への分化を促進しうる濃度であれば特に限定されないが、例えば、デキサメタゾンを1種単独で使用する場合、50 nM以上（又は50 nM超）、55 nM以上（又は55 nM超）、60 nM以上（又は60 nM超）、65 nM以上（又は65 nM超）、70 nM以上（又は70 nM超）、75 nM以上（又は75 nM超）、80 nM以上（又は80 nM超）、85 nM以上（又は85 nM超）、90 nM以上（又は90 nM超）、95 nM以上（又は95 nM超）、100 nM以上（又は100 nM超）、150 nM以上（又は150 nM超）、200 nM以上（又は200 nM超）、250 nM以上（又は250 nM超）、300 nM以上（又は300 nM超）、350 nM以上（又は350 nM超）、400 nM以上（又は400 nM超）、450 nM以上（又は450 nM超）、500 nM以上（又は500 nM超）、550 nM以上（又は550 nM超）、600 nM以上（又は600 nM超）、650 nM以上（又は650 nM超）、700 nM以上（又は700 nM超）、750 nM以上（又は750 nM超）、800 nM以上（又は800 nM超）、850 nM以上（又は850 nM超）、900 nM以上（又は900 nM超）、950 nM以上（又は950 nM超）であり、10 μM以下（又は10 μM未満）、9 μM以下（又は9 μM未満）、8 μM以下（又は8 μM未満）、7 μM以下（又は7 μM未満）、6 μM以下（又は6 μM未満）、5 μM以下（又は5 μM未満）、4 μM以下（又は4 μM未満）、3 μM以下（又は3 μM未満）、2 μM以下（又は2 μM未満）、1 μM以下（又は1 μM未満）である。デキサメタゾン以外の副腎皮質ホルモンを使用する場合、前記濃度のデキサメタゾンと同等の糖質コルチコイドとしての力価を示す濃度で用いられることが望ましい。培地中の副腎皮質ホルモン濃度が低すぎると培養の維持や間葉系幹細胞の誘導を促進するのに十分ではなくなる可能性があり、一方副腎皮質ホルモン濃度が高すぎると、細胞増殖を抑制し、効率的に間葉系幹細胞が得られない。例えば、ヒト間葉系幹細胞への分化を誘導する場合には、培地組成物中に含まれる副腎皮質ホルモンの濃度は、デキサメタゾンを1種単独で使用する場合、例えば50 nM～10 μM（又は50 nM以上10 μM未満、50 nM超10 μM以下、若しくは50 nM超10 μM未満）、好ましくは60 nM～5 μM（又は60 nM以上5 μM未満、60 nM超5 μM以下、若しくは60 nM超5 μM未満）、より好ましくは70 nM～2 μM（又は70 nM以上2 μM未満、70 nM超2 μM以下、若しくは70 nM超2 μM未満）、更により好ましくは100 nM～1 μM（又は100 nM以上1 μM未満、100 nM超1 μM以下、若しくは100 nM超1 μM未満）である。
　副腎皮質ホルモンの糖質コルチコイドとしての力価は、ヒドロコルチゾンを1としたとき、コルチゾンが0.8、プレドニゾロンが4、メチルプレドニゾロンが5、トリアムシノロンが5、パラメタゾンが10、デキサメタゾンが25～30、ベタメタゾンが25～30である。各副腎皮質ホルモンの糖質コルチコイドとしての力価が製造元や保存状態によって上記値と異なる可能性がある場合は、事前に試験的に確認しておき、力価が上記値となる、品質及び保存状態が良好なものを用いることが望ましい。
　また、ベタメタゾンを1種単独で使用する場合、培地組成物中に含まれるベタメタゾンの濃度は、神経堤細胞から間葉系幹細胞への分化を促進しうる濃度であれば特に限定されないが、例えば、50 nM以上（又は50 nM超）、55 nM以上（又は55 nM超）、60 nM以上（又は60 nM超）、65 nM以上（又は65 nM超）、70 nM以上（又は70 nM超）、75 nM以上（又は75 nM超）、80 nM以上（又は80 nM超）、85 nM以上（又は85 nM超）、90 nM以上（又は90 nM超）、95 nM以上（又は95 nM超）、100 nM以上（又は100 nM超）、150 nM以上（又は150 nM超）、200 nM以上（又は200 nM超）、250 nM以上（又は250 nM超）、300 nM以上（又は300 nM超）、350 nM以上（又は350 nM超）、400 nM以上（又は400 nM超）、450 nM以上（又は450 nM超）、500 nM以上（又は500 nM超）、550 nM以上（又は550 nM超）、600 nM以上（又は600 nM超）、650 nM以上（又は650 nM超）、700 nM以上（又は700 nM超）、750 nM以上（又は750 nM超）、800 nM以上（又は800 nM超）、850 nM以上（又は850 nM超）、900 nM以上（又は900 nM超）、950 nM以上（又は950 nM超）であり、10 μM以下（又は10 μM未満）、9 μM以下（又は9 μM未満）、8 μM以下（又は8 μM未満）、7 μM以下（又は7 μM未満）、6 μM以下（又は6 μM未満）、5 μM以下（又は5 μM未満）、4 μM以下（又は4 μM未満）、3 μM以下（又は3 μM未満）、2 μM以下（又は2 μM未満）、1 μM以下（又は1 μM未満）である。培地中のベタメタゾン濃度が低すぎると培養の維持や間葉系幹細胞の誘導を促進するのに十分ではなくなる可能性があり、一方ベタメタゾン濃度が高すぎると、細胞増殖を抑制し、効率的に間葉系幹細胞が得られない。例えば、ヒト間葉系幹細胞への分化を誘導する場合には、培地組成物中に含まれるベタメタゾンの濃度は、例えば50 nM～10 μM（又は50 nM以上10 μM未満、50 nM超10 μM以下、若しくは50 nM超10 μM未満）、好ましくは60 nM～5 μM（又は60 nM以上5 μM未満、60 nM超5 μM以下、若しくは60 nM超5 μM未満）、より好ましくは70 nM～2 μM（又は70 nM以上2 μM未満、70 nM超2 μM以下、若しくは70 nM超2 μM未満）、更により好ましくは100 nM～1 μM（又は100 nM以上1 μM未満、100 nM超1 μM以下、若しくは100 nM超1 μM未満）である。
　また、プレドニゾロンを1種単独で使用する場合、培地組成物中に含まれるプレドニゾロンの濃度は、神経堤細胞から間葉系幹細胞への分化を促進しうる濃度であれば特に限定されないが、例えば、300 nM以上（又は300 nM超）、330 nM以上（又は330 nM超）、360 nM以上（又は360 nM超）、390 nM以上（又は390 nM超）、420 nM以上（又は420 nM超）、450 nM以上（又は450 nM超）、480 nM以上（又は480 nM超）、510 nM以上（又は510 nM超）、540 nM以上（又は540 nM超）、570 nM以上（又は570 nM超）、600 nM以上（又は600 nM超）、900 nM以上（又は900 nM超）、1.2 μM以上（又は1.2 μM超）、1.5 μM以上（又は1.5 μM超）、1.8 μM以上（又は1.8 μM超）、2.1μM以上（又は2.1μM超）、2.4 μM以上（又は2.4 μM超）、2.7 μM以上（又は2.7 μM超）、3 μM以上（又は3 μM超）、3.3 μM以上（又は3.3 μM超）、3.6 μM以上（又は3.6 μM超）、3.9 μM以上（又は3.9 μM超）、4.2 μM以上（又は4.2 μM超）、4.5 μM以上（又は4.5 μM超）、4.8 μM以上（又は4.8 μM超）、5.1 μM以上（又は5.1 μM超）、5.4 μM以上（又は5.4 μM超）、5.7 μM以上（又は5.7 μM超）であり、70 μM以下（又は70 μM未満）、63 μM以下（又は63 μM未満）、56 μM以下（又は56 μM未満）、49 μM以下（又は49 μM未満）、42 μM以下（又は42 μM未満）、35 μM以下（又は35 μM未満）、28 μM以下（又は28 μM未満）、21 μM以下（又は21 μM未満）、14 μM以下（又は14 μM未満）、7 μM以下（又は7 μM未満）である。培地中のプレドニゾロン濃度が低すぎると培養の維持や間葉系幹細胞の誘導を促進するのに十分ではなくなる可能性があり、一方プレドニゾロン濃度が高すぎると、細胞増殖を抑制し、効率的に間葉系幹細胞が得られない。例えば、ヒト間葉系幹細胞への分化を誘導する場合には、培地組成物中に含まれるプレドニゾロンの濃度は、例えば300 nM～70 μM（又は300 nM以上70 μM未満、300 nM超70 μM以下、若しくは300 nM超70 μM未満）、好ましくは360 nM～35 μM（又は360 nM以上35 μM未満、360 nM超35 μM以下、若しくは360 nM超35 μM未満）、より好ましくは420 nM～14 μM（又は420 nM以上14 μM未満、420 nM超14 μM以下、若しくは420 nM超14 μM未満）、更により好ましくは600 nM～7 μM（又は600 nM以上7 μM未満、600 nM超7 μM以下、若しくは600 nM超7 μM未満）である。
　一態様において、培地組成物中に含まれる副腎皮質ホルモンの濃度は、それぞれを1種単独で使用する場合、デキサメタゾン又はベタメタゾンは50 nM以上10 μM以下（又は50 nM以上10 μM未満、50 nM超10 μM以下、若しくは50 nM超10 μM未満）であり、パラメタゾンは100 nM以上30 μM以下（又は100 nM以上30 μM未満、100 nM超30 μM以下、若しくは100 nM超30 μM未満）であり、トリアムシノロン又はメチルプレドニゾロンは250 nM以上60 μM以下（又は250 nM以上60 μM未満、250 nM超60 μM以下、若しくは250 nM超60 μM未満）であり、プレドニゾロンは300 nM以上70 μM以下（又は300 nM以上70 μM未満、300 nM超70 μM以下、若しくは300 nM超70 μM未満）であり、コルチゾンは1.50 μM以上375 μM以下（又は1.50 μM以上375 μM未満、1.50 μM超375 μM以下、若しくは1.50 μM超375 μM未満）であり、ヒドロコルチゾンは1.250 μM以上300 μM以下（又は1.250 μM以上300 μM未満、1.250 μM超300 μM以下、若しくは1.250 μM超300 μM未満）である。
　一態様において、培地組成物中に含まれる副腎皮質ホルモンの濃度は、それぞれを1種単独で使用する場合、50 nM以上375 μM以下（又は50 nM以上375 μM未満、50 nM超375 μM以下、若しくは50 nM超375 μM未満）である。
　一態様において、副腎皮質ホルモンを1種以上用いる場合は、当該副腎皮質ホルモンの濃度に糖質コルチコイドとしての力価を乗じて換算し、且つそれを合計した濃度を、1種以上の副腎皮質ホルモンの換算濃度と定義し、該換算濃度は、例えば、1.25 μM以上（又は1.25 μM超）、1.375 μM以上（又は1.375 μM超）、1.5 μM以上（又は1.5 μM超）、1.625 μM以上（又は1.625 μM超）、1.75 μM以上（又は1.75 μM超）、1.875 μM以上（又は1.875 μM超）、2 μM以上（又は2 μM超）、2.125 μM以上（又は2.125 μM超）、2.25 μM以上（又は2.25 μM超）、2.375 μM以上（又は2.375 μM超）、2.5 μM以上（又は2.5 μM超）、3.75 μM以上（又は3.75 μM超）、5 μM以上（又は5 μM超）、6.25 μM以上（又は6.25 μM超）、7.5 μM以上（又は7.5 μM超）、8.75 μM以上（又は8.75 μM超）、10 μM以上（又は10 μM超）、11.25 μM以上（又は11.25 μM超）、12.5 μM以上（又は12.5 μM超）、13.75 μM以上（又は13.75 μM超）、15 μM以上（又は15 μM超）、16.25 μM以上（又は16.25 μM超）、17.5 μM以上（又は17.5 μM超）、18.75 μM以上（又は18.75 μM超）、20 μM以上（又は20 μM超）、21.25 μM以上（又は21.25 μM超）、22.5 μM以上（又は22.5 μM超）、23.75 μM以上（又は23.75 μM超）であり、300 μM以下（又は300 μM未満）、270 μM以下（又は270 μM未満）、240 μM以下（又は240 μM未満）、210 μM以下（又は210 μM未満）、180 μM以下（又は180 μM未満）、150 μM以下（又は150 μM未満）、120 μM以下（又は120 μM未満）、90 μM以下（又は90 μM未満）、60 μM以下（又は60 μM未満）、30 μM以下（又は30 μM未満）である。例えば、副腎皮質ホルモンを1種以上用いる場合は、副腎皮質ホルモンの換算濃度は、1.25 μM～300 μM（又は1.25 μM以上300 μM未満、1.25 μM超300 μM以下、若しくは1.25 μM超300 μM未満）、好ましくは1.5 μM～150μM（又は1.5 μM以上150 μM未満、1.5 μM超150μM以下、若しくは1.5 μM超150μM未満）、より好ましくは17.5 μM～60 μM（又は17.5 μM以上60 μM未満、17.5 μM超60 μM以下、若しくは17.5 μM以上60 μM未満）、更により好ましくは2.5 μM～30 μM（又は2.5 μM以上30 μM未満、2.5 μM超30 μM以下、若しくは2.5 μM超30 μM未満）である。
　本発明の培地組成物には、血清が含まれていてもよい。血清としては、動物由来の血清であれば、間葉系幹細胞の誘導を阻害するものでない限り特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来の血清（例えばウシ胎仔血清、ヒト血清等）である。血清の濃度は、自体公知の濃度範囲内であればよい。更に、培養後の間葉系幹細胞を医療目的で使用する場合、他の動物由来成分は血液媒介病原菌の感染源や異種抗原となる可能性があるため、血清を含まない培地も好適に使用し得る。血清を含まない場合、血清の代替添加物（例えばKnockout Serum Replacement (KSR) (Invitrogen)、Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco) 等) を用いてもよい。
　本発明の培地組成物により誘導され培養された間葉系幹細胞を細胞医療等の医療目的で使用する場合、病原菌の感染を起こしたり、異種抗原となったりする可能性があるため、本発明の培地には非ヒト動物由来成分が含まれないことがより好ましい。
　「幹細胞」とは、自己複製能及び分化／増殖能を有する未熟な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）、複能性幹細胞（multipotent stem cell）、単能性幹細胞（unipotent stem cell）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　本発明において対象とする間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、肝細胞、神経細胞等に分化可能な複能性幹細胞の一種であり、生体に移植した際に腫瘍を形成する可能性が低い細胞として知られている。本発明における間葉系幹細胞は、好ましくは、１以上の間葉系幹細胞マーカー(例えば、CD90、CD44、CD73、CD105等)陽性であり得、より好ましくは、該マーカー陽性であり、かつ、間葉系幹細胞で発現が認められない分子の発現が陰性であり得る。間葉系幹細胞で発現が認められない分子の例としては、CD34、CD45、CD14、CD11b、CD79、CD19、HLA-DR等が挙げられる。
　本発明の培地組成物は、いずれの動物由来の間葉系幹細胞の誘導にも好適に使用することができる。本発明の培地組成物を使用して誘導され、培養され得る間葉系幹細胞は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等由来の間葉系幹細胞であり、好ましくは、ヒト由来の間葉系幹細胞である。
　本発明の培地組成物は、間葉系幹細胞の分化を誘導する因子（例えば、グルココルチコイド、トランスフォーミング成長因子-βファミリーと呼ばれる因子、例えば骨形態形成タンパク質（望ましくはBMP-2或いはBMP-4）、塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF)、インヒビンＡ或いは軟骨形成刺激活性因子 (CSA)、Ｉ型コラーゲン（とりわけゲル形態にあるもの）などのコラーゲン性細胞外基質、及びレチノイン酸などのビタミンＡ類似体）を含み得るが好ましくは間葉系幹細胞の分化（例えば軟骨への分化）を誘導しない濃度で含み得る。一実施形態においては、該培地は、副腎皮質ホルモン以外の、間葉系幹細胞の分化を誘導する因子を含まなくてもよい。一実施形態においては、該培地は、デキサメタゾン以外の、間葉系幹細胞の分化を誘導する因子を含まなくてもよい。
　本発明の培地組成物は、足場成分を含んでもよい。該足場成分としては、ラミニン[ラミニンα5β1γ1（以下、ラミニン511）、ラミニンα1β1γ1（以下、ラミニン111）等及びラミニン断片（ラミニン511E8等）を含む]、エンタクチン、フィブロネクチン、ゼラチン、ビトロネクチン、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリックス等が挙げられ、好ましくは、ラミニン511である。これらの足場成分は、一般的には、0.001 μg/ml～1000 μg/ml、好ましくは0.01 μg/ml～100 μg/ml、より好ましくは0.1 μg/ml～10 μg/ml、より好ましくは0.1 μg/ml～1 μg/ml、最も好ましくは0.2 μg/mlで培地に添加する。
　本発明の培地組成物は、神経堤細胞を間葉系幹細胞へと分化誘導するために用いられる。
　「神経堤細胞（Neural Crest Cell：「NCC」とも称される）」とは、脊椎動物の初期発生において表皮外胚葉と神経板の間に一時的に形成される神経堤という構造から脱上皮化し、上皮から間葉への転換後に胚体内の様々な部位に誘導される細胞を意味する。本明細書における用語「神経堤細胞」には、生体より採取された細胞のみならず、多能性幹細胞由来の神経堤細胞や、それらを継代した細胞も含まれる。本発明において、神経堤細胞の由来は特に限定されず、いかなる脊椎動物のものであってもよいが、哺乳動物由来の神経堤細胞が好ましい。かかる哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、及びヒトが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくはヒトである。
　神経堤細胞は、生体由来の神経堤細胞を用いてもよく、例えば、生体における神経堤由来の組織（例えば、骨髄、脊髄後根神経節、心臓、角膜、虹彩、歯髄、及び嗅粘膜等）から製造することができる。また、多能性幹細胞由来の神経堤細胞も好適に用いることができる。多能性幹細胞から神経堤細胞を得る方法としては、自体公知の方法を用いることができ、一例としては、TGFβ阻害剤及びGSK-3β阻害剤を含有する培養液中で多能性幹細胞を培養して分化誘導する方法が例示される。このように、自体公知の方法を用いることにより、神経堤細胞、より詳細には神経堤細胞を含む細胞集団を容易に得ることが可能である。
　かくして得られた細胞集団に神経堤細胞が含まれるか否かは、TFAP2a、SOX9、SOX10、TWISTI、PAX3等の神経堤細胞特異的マーカー遺伝子の1以上の発現を自体公知の方法により確認すればよい。また、CD271タンパク質（「p75(NTR)」とも称される）等の神経堤細胞の細胞表面に存在するタンパク質を神経堤細胞特異的マーカーとして用いることもできる。本発明において神経堤細胞は、多能性幹細胞由来であることが好ましく、iPS細胞由来であることがより好ましい。
　尚、多能性幹細胞には、増殖能も併せもつ中間中胚葉細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、***幹細胞（GS細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹（iPS）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、iPS細胞であり、より好ましくはヒトiPS細胞である。
　iPS細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3又はGlis1等の遺伝子又は遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, etal. (2008), Nat. Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 47 4:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
　体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、及び成熟した健全な又は疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、及び株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞及び脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
　体細胞を採取する由来となる哺乳動物は特に限定されないが、好ましくはヒトである。
　本発明は、副腎皮質ホルモンを含む、間葉系幹細胞の分化促進剤を提供し得る。該分化促進剤を含む培地を用いて、神経堤細胞を培養することにより、間葉系幹細胞への誘導効率を上昇させることが可能である。
　本発明の分化促進剤は、副腎皮質ホルモンのみからなっていてもよいが、更に生理学的に許容される担体（例えば、生理的な等張液（生理食塩水、上述の基礎培地、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張液等）、賦形剤、防腐剤、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、保存剤、酸化防止剤、上述の添加物など）を含む組成物として提供することもできる。
　本発明の分化促進剤に含まれる副腎皮質ホルモンの含有量は、本発明の分化促進剤が培地に添加されるなどして用いられた場合に、該培地中の副腎皮質ホルモン濃度が、間葉系幹細胞の誘導を促進するのに十分な濃度含まれるように構成されていることが好ましい。
　本発明の分化促進剤は、等張な水溶液、或いは粉末等の状態で、培地に添加されるなどして用いられる。
　上記の通り、副腎皮質ホルモンを基礎培地に添加することにより本発明の培地組成物を製造することができるが、副腎皮質ホルモンと、基礎培地とを含有するキットの形態で使用することもできる。即ち、副腎皮質ホルモンと、基礎培地とを別々に組み合わせてキットの形態で供給し、使用者が使用時に副腎皮質ホルモンを基礎培地に添加することにより、本発明の培地組成物を調製して使用することができる。
　当該キットにおいては、基礎培地を構成する成分とそれ以外の成分が別々に提供されていてもよい。両成分は同一又は異なって液体又は粉末であり、各成分が単独で別々に提供されていてもよいし、いくつかの成分が混合された状態で提供されてもよい。また、キット中には、必ずしも本発明の培地組成物の全成分が含まれていなくてもよく、水等の極めて容易に入手できる成分は、省略されていてもよい。成分が粉末の場合、所望により用時緩衝液等で溶解して使用することができる。
２．間葉系幹細胞の製造方法
　本発明は、本発明の培地組成物中で神経堤細胞を培養して間葉系幹細胞を誘導する工程（工程１）を含む、間葉系幹細胞の製造方法（以下、本発明の製造方法とも称する）を提供する。本発明の製造方法においては、基礎培地及び副腎皮質ホルモンを含む培地組成物中で神経堤細胞を培養することにより、間葉系幹細胞への分化が誘導される。本発明の製造方法によれば、効率よく間葉系幹細胞を製造することが可能である。副腎皮質ホルモンを含む培地中で神経堤細胞を培養することにより、神経堤細胞を間葉系幹細胞としての能力を保持する細胞に効率よく分化させることが可能となる。
　工程１における培養は、浮遊培養若しくは接着培養又はそれらの組合せであり得る。本発明における「浮遊培養」は、細胞（又は細胞の凝集塊）が培養液に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養することを言う。「接着培養」は、細胞（又は細胞の凝集塊）を培養器材等に接着させる条件で行う培養をいう。この場合、細胞が接着するとは、細胞又は細胞の凝集塊と培養器材の間に、強固な細胞-基質間結合（cell-substratum junction）ができることをいう。より詳細には、浮遊培養とは、細胞又は細胞の凝集塊と培養器材等との間に強固な細胞-基質間結合を作らせない条件での培養をいい、接着培養とは、細胞又は細胞の凝集塊と培養器材等との間に強固な細胞-基質間結合を作らせる条件での培養をいう。
　浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、浮遊培養することが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿（ディッシュ）、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バッグ、三角フラスコ、スピナーフラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を低下させる目的で人工的に処理（例えば、MPCポリマー等の超親水性処理、タンパク低吸着処理等）されたもの等を使用できる。スピナーフラスコやローラーボトル等を用いて回転培養してもよい。培養器の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。
　接着培養を行う際に用いられる培養器は、接着培養することが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜培養のスケール、培養条件及び培養期間に応じた培養器を選択することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿（ディッシュ）、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バッグ、マイクロキャリア、ビーズ、スタックプレート、スピナーフラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、接着培養を可能とするために、細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には表面加工された培養器、又は、内部がコーティング剤で被覆された培養器が挙げられる。表面加工された培養器としては、正電荷処理等の表面加工された培養容器が挙げられる。コーティング剤としては、例えば、ラミニン[ラミニンα5β1γ1（以下、ラミニン511）、ラミニンα1β1γ1（以下、ラミニン111）等及びラミニン断片（ラミニン511E8等）を含む]、エンタクチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ビトロネクチン、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリックス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。
　工程１で用いることができる神経堤細胞は、１．培地組成物において記載した通り、生体由来または多能性幹細胞由来のいずれであってもよい。多能性幹細胞由来の神経堤細胞を用いる場合には、神経堤細胞に分化した直後の細胞を使用してもよく、後述するように、さらに純化したもの、または純化と拡大培養を経たものを使用してもよい。
　ここで純化とは、細胞集団（例えば、神経堤細胞を含む細胞集団）中の特定の種類の細胞（例えば、神経堤細胞）の割合を増加させることをいう。
　培養する神経提細胞の濃度は、一態様において、約1×102～約1×107細胞／cm2、好ましくは約3×102～約5×106細胞／cm2、より好ましくは約4×102～約2×105細胞／cm2、更に好ましくは、約4×102～約1×105細胞／cm2、更により好ましくは、約3×103～約1×104細胞／cm2とすることができる。
　他の態様において、培養する神経堤細胞の濃度は、約1×102～約1×107細胞／cm2、好ましくは約3×102～約5×106細胞／cm2、より好ましくは約4×102～約2×105細胞／cm2、更に好ましくは、約4×102～約1×105細胞／cm2、更により好ましくは、約1.5×104～約3×104細胞／cm2とすることができる。
　培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
　間葉系幹細胞の公知のマーカーの例として、CD90、CD44、CD73及びCD105が挙げられる。従って、上記方法によって得られる間葉系幹細胞の細胞集団は、その大部分（例えば、細胞組成物中の60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上、最も好ましくは100%の細胞）が、CD90、CD44、CD73及びCD105いずれか１つ、好ましくはいずれか2つの組合せ、より好ましくは3つの組み合わせ、最も好ましくは全てのマーカーに陽性であることが好ましい。更に、本発明の細胞組成物は、間葉系幹細胞では発現が認められない分子を発現していないことがより好ましい。間葉系幹細胞で発現が認められない分子としては、例えば、CD34（造血幹細胞において発現する）、CD45（造血幹細胞において発現する）、CD14（単球、マクロファージにおいて発現する）、CD11b（単球、マクロファージ、NK細胞、顆粒球において発現する）、CD79（B細胞において発現する）、CD19（B細胞において発現する）及びHLA-DR（樹状細胞、B細胞、単球、マクロファージにおいて発現する）などが挙げられる。よって、好ましい態様において、本発明の細胞組成物は、その大部分（例えば、細胞組成物中の60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上、更により好ましくは95%以上、最も好ましくは100%の細胞）が、間葉系幹細胞で発現が認められない分子の発現が陰性である。
　一実施形態においては、工程１の前に以下の工程：
（工程A）神経堤細胞を含む細胞集団を得る工程、及び
（工程B）工程Aで得られた細胞集団を、細胞外マトリックスを足場として用いて拡大培養する工程、
が実施されてもよい。
　工程Aにおいては、１．培地組成物において記載したように、自体公知の方法によって神経堤細胞を含む細胞集団を得ることができる。一般、神経堤細胞を含む細胞集団は、採取した組織や分化誘導条件により、神経堤細胞の割合が大きく変化し得る。本発明の一態様において、神経堤細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の割合は、例えば、1～95%、1～90%、1～85%、1～80%、1～75%、1～70%、1～65%、1～60%、1～55%、1～50%、1～45%、1～40%、1～35%、1～30%、1～25%、1～20%、1～15%、又は1～10%であり得るが、これらに限定されない。また、別の一態様において、神経堤細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の割合は、例えば、25～95%、25～90%、25～85%、25～80%、25～75%、25～70%、25～65%、25～60%、25～55%、25～50%、25～45%、25～40%、又は25～35%であり得るが、これらに限定されない。また、別の一態様において、神経堤細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の割合は、例えば、50～95%、50～90%、50～85%、50～80%、50～75%、50～70%、50～65%、又は50～60%であり得るが、これらに限定されない。また、別の一態様において、神経堤細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の割合は、例えば、70%以上、75～95%、75～90%、又は75～85%であり得るが、これらに限定されない。
　工程Aにおいて得られた神経堤細胞を含む細胞集団は、その後、神経堤細胞を純化する工程に供してもよく、さらに、（該純化された神経堤細胞を）拡大培養する工程に供してもよい。すなわち、工程Bは、神経堤細胞を純化および拡大培養する工程ということもできる。本明細書において「拡大培養」とは、所望の細胞を維持及び/又は増殖させる培養を包含する概念であり、好ましくは、所望の細胞を増殖させる培養であり得る。
　神経堤細胞を純化する方法としては、特に限定されることはなく、例えば、シングルセル化や、蛍光標識された神経堤細胞特異的抗体を用いたセルソーターによるソーティング、前記抗体を結合させた磁気ビーズによるソーティング、及び前記抗体を固層化したアフィニティカラムによるソーティング等のソーティング処理が挙げられるが、これらに限定されない。
　シングルセル化によって純化する方法では、必要に応じて、細胞に対し、力学的な分散処理、コラゲナーゼやトリプシン等の酵素による分散処理、及び／又はEDTA等のキレート剤による分散処理等を行い、シングルセルの状態としてもよい。その際には、細胞死を抑制する目的でROCK阻害剤を添加してもよい。ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632、Fasudil/HA1077、H-1152、Wf-536、及びそれらの誘導体等が挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。
　前記ソーティング処理によって純化する方法では、前記神経堤細胞特異的抗体として、例えば、CD271特異的抗体を使用することができる。
　工程Bにおける拡大培養では、神経堤細胞の維持及び/又は増殖に適した培養条件が用いられ得る。
　神経堤細胞を拡大培養するための培養条件は、神経堤細胞が拡大培養できる限り特に限定されず、自体公知の培養条件を用いることができる。一例としては、TGFβ阻害剤、EGF(epidermal growth factor)及びFGF2(fibroblast growth factor 2)を含有する培養液中で培養する方法が例示される。
　神経堤細胞の拡大培養に用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（Invitrogen）、RPMI-base medium、StemFit(登録商標)AK03N培地、及びこれらの混合培地などが包含される。本工程において、好ましくは、StemFit(登録商標)培地が用いられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、或いは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
　本発明において、TGFβ阻害剤は、TGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、又はALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されない。本発明において、TGFβ阻害剤は、例えば、Lefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345 、SD093、SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A-83-01(WO 2009/146408) 及びこれらの誘導体などが例示される。神経堤細胞の拡大培養に使用されるTGFβ阻害剤は、好ましくは、SB431542であり得る。
　培養液中におけるSB431542などのTGFβ阻害剤の濃度は、ALK5を阻害する濃度であれば特に限定されないが、1 nM～50 μMが好ましく、例えば、1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、500 nM、750 nM、1 μM、2 μM、3 μM、4 μM、5 μM、6 μM、7 μM、8 μM、9 μM、10 μM、15 μM、20 μM、25 μM、30 μM、40 μM、50 μMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10 μMである。
　また、培地中のEGFの濃度は、1 ng/ml～100 ng/mlが好ましく、例えば、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、20 ng/mlである。
　また、培地中のFGF2の濃度は、1 ng/ml～100 ng/mlが好ましく、例えば、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、20 ng/mlである。
　また、神経堤細胞の拡大培養が達成され得る限り、培地中に上記以外の成分を添加することもできる。
　工程Bにおける神経堤細胞の拡大培養は、接着培養及び浮遊培養のいずれであってもよいが、好ましくは接着培養によって行われる。
　工程Bにおいては、神経堤細胞の純化を達成するために細胞外マトリックスを足場として用いることを特徴とする。
　本明細書において、「足場」とは、（ｉ）細胞接着性の培養器、その材料物質、細胞接着性の培養器の表面に存在し、接着部位を構成する物質、及び／又は（ｉｉ）細胞培地中に溶解、分散若しくは懸濁していて、該細胞培地中で３次元ネットワークを形成する物質であり、細胞が、該ネットワークに接着し得る、物質を指す。
　かかる細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には表面加工された培養器、又は、内部がコーティング剤で被覆された培養器が挙げられる。表面加工された培養器としては、正電荷処理等の表面加工された培養容器が挙げられる。
　かかる足場には、培養容器の表面にコーティングする物質も含まれる。コーティングする物質には、ラミニン[ラミニンα5β1γ1（ラミニン511）、ラミニンα2β1γ1（ラミニン211）、ラミニンα1β1γ1（ラミニン111）等及びラミニン断片（ラミニン511E8等）を含む]、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Vitronectin）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリックス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が含まれる。
　かかる細胞培地中で３次元ネットワークを形成する物質は、液体培地中で、細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる効果を示すものである。より詳細には、低分子化合物や高分子化合物が共有結合やイオン結合、静電相互作用や疎水性相互作用、ファンデルワールス力などを介して集合及び自己組織化し液体培地中でナノファイバーを形成したもの、あるいは、高分子化合物からなる比較的大きな線維構造体を高圧処理などにより微細化することにより得られたナノファイバー等が、本発明の培地組成物中に含まれるナノファイバーとして挙げられる。理論には拘束されないが、本発明の培地組成物においては、ナノファイバーが三次元のネットワークを形成し、これが細胞や組織を支えることにより、細胞や組織の浮遊状態が維持される。
　工程Bにおいては、神経堤細胞の純化を達成するために足場として用いられる細胞外マトリックスとしては、ラミニンまたはフィブロネクチンが挙げられ、特にラミニンは全長ラミニン、α2鎖を有するラミニンまたはラミニン211であり得る。
　ラミニンは基底膜の主要な構成分子である糖タンパク質である。ラミニンは、細胞接着、細胞増殖、転移、分化等の様々な細胞機能に関与することが知られている。ラミニンは、α、β、及びγサブユニット鎖をそれぞれ1本ずつ有するヘテロ3量体で構成される。現在5種類のαサブユニット鎖（α1、α2、α3、α4、α5）、3種類のβサブユニット鎖(β1、β2、β3)、及び3種類のγサブユニット鎖(γ1、γ2、γ3)が存在することが知られており、これらのサブユニット鎖の組み合わせに応じて、現在ヒトにおいては15種類のラミニンアイソフォームの存在が確認されている。工程Bに用いられ得るラミニン211は、α2鎖、β1鎖、γ1鎖のサブユニット鎖から構成されるラミニンであり得る。ラミニンの由来は神経堤細胞が由来する生物と一致させることが好ましい（例えば、ヒト由来の神経堤細胞を用いる場合は、ヒト由来のラミニン211を用いることが好ましい）。尚、ラミニンはインテグリン結合部位のみから構成されるラミニンE8断片の方が、全長ラミニンよりも細胞接着活性が強いことが知られているが(Miyazaki T. et al., Nat Commun. 2012;3:1236参照)、工程Bで用いられ得るラミニン211は、断片ではなくラミニン211全長タンパク質であり得る。ラミニン211は自体公知の遺伝子組み換え技術を用いて調製してもよいし、市販されているものを用いてもよい。
　工程Bにおいて、細胞集団を浮遊培養において拡大培養する場合は、例えば、ラミニン211を培地中に含有させ、浮遊している細胞がこれを足場として利用して凝集塊を形成することで、３次元浮遊培養ができるようにすればよい。浮遊培養は、自体公知の方法により実施することができる。一例としては、スピナーフラスコ等を用いて培地を撹拌しながら、ラミニン211を添加した培地中で細胞集団を浮遊培養において拡大培養する方法が挙げられる。或いは、培地に添加することで細胞を浮遊させる効果を有する多糖類（例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、ジェランガム等）とラミニン211を併用することで、細胞集団を浮遊培養において拡大培養することもできる。当該態様では、細胞が三次元的な広がりをもって分散し、ナノファイバーに付着した状態、或いはスフェアの状態で増殖する。細胞がナノファイバーに付着し、そこを足場として強力に増殖し、その結果、増殖した細胞や細胞塊（スフェア等）が、ぶどうの房状にナノファイバー上に連なる状態となる。そのため、細胞の浮遊培養が可能となる。ラミニンを添加する濃度等は細胞集団の播種密度や併用する多糖類の濃度等の各種条件を考慮の上、適宜設定すればよい。尚、本明細書において、浮遊培養とは、細胞が培養容器の表面に細胞接着することなく行われる培養方法を意味する。浮遊培養は、物理的な撹拌を伴ってもよいし、伴わなくてもよい。また、培養される細胞が培地中に均一に分散していてもよいし、不均一に分散していてもよい。
　工程Bにおいて、細胞集団を接着培養において拡大培養する場合は、例えば、ラミニン211を培養容器の表面にコーティングする。ラミニン211のコーティング量は、本発明の所望の効果が得られる限り特に限定されず、通常推奨されるコーティング量を用いればよい。一例としては、ラミニン211のコーティング量は、0.1 ng/cm2～1000 ng/cm2、好ましくは0.5 ng/cm2～500 ng/cm2、より好ましくは1 ng/cm2～250 ng/cm2、更に好ましくは2 ng/cm2～100 ng/cm2であるが、これらに限定されない。
　また、工程Bにおける培養期間は、培養条件、培養方法、細胞集団に含まれる神経堤細胞の割合などにより変動し得るものの、比較的短期間で神経堤細胞の純化が達成される。培養期間の一例としては、1～21日間、1～20日間、1～19日間、1～18日間、1～17日間、1～16日間、1～15日間、1～14日間、1～13日間、1～12日間、1～11日間、1～10日間、1～9日間、1～8日間、1～7日間、1～6日間、1～5日間、1～4日間、又は1～3日間であるが、これらに限定されない。
　工程Bにおける培養温度としては、神経堤細胞が培養できる限り特に限定されないが、30～40℃、好ましくは約37℃である。また、工程Bにおける培養時のCO2濃度としては、神経堤細胞が培養できる限り特に限定されないが、2～5％、好ましくは約5％である。
　一実施形態においては、工程１の前に以下の工程：
（工程A）神経堤細胞を含む細胞集団を得る工程、及び
（工程C）工程Aで得られた細胞集団を、フィブロネクチンを足場として用いて拡大培養する工程、
が実施される。
　工程Aにおいては、１．培地組成物において記載したように神経堤細胞を得ることができる。神経堤細胞は、製造に用いられた細胞集団中に生じ得る。神経堤細胞を含む細胞集団は、採取した組織や分化誘導条件により、神経堤細胞の割合が大きく変化し得る。本発明の一態様において、神経堤細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の割合は、例えば、1～95%、1～90%、1～85%、1～80%、1～75%、1～70%、1～65%、1～60%、1～55%、1～50%、1～45%、1～40%、1～35%、1～30%、1～25%、1～20%、1～15%、又は1～10%であり得るが、これらに限定されない。また、別の一態様において、神経堤細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の割合は、例えば、25～95%、25～90%、25～85%、25～80%、25～75%、25～70%、25～65%、25～60%、25～55%、25～50%、25～45%、25～40%、又は25～35%であり得るが、これらに限定されない。また、別の一態様において、神経堤細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の割合は、例えば、50～95%、50～90%、50～85%、50～80%、50～75%、50～70%、50～65%、又は50～60%であり得るが、これらに限定されない。また、別の一態様において、神経堤細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の割合は、60%以上、70%以上、80%以上であり得、例えば、75～95%、75～90%、又は75～85%であり得るが、これらに限定されない。
　一実施形態においては、工程１の間、適宜細胞の継代が行われる。継代は、例えば播種後2～8日毎、又は3～7日毎に行われる。継代間隔は、細胞凝集塊の拡大に十分な期間であって、かつ細胞凝集塊が大きくなりすぎて酸素や栄養素が細胞凝集塊内部の細胞に到達し難くなると考えられる期間よりも短い期間で行われることが好ましい。
　工程１の間の継代の回数としては、例えば、0～20回（0回、1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回、20回）が挙げられ、1～10回が好ましく、より好ましくは2～8回である。適切な回数の継代後に細胞集団の一部が凍結ストックとして保存されてもよい。
　一実施形態においては、工程B又はCの間、適宜細胞の継代が行われる。継代は、例えば播種後2～8日毎、又は3～7日毎に行われる。継代間隔は、細胞凝集塊の拡大に十分な期間であって、かつ細胞凝集塊が大きくなりすぎて酸素や栄養素が細胞凝集塊内部の細胞に到達し難くなると考えられる期間よりも短い期間で行われることが好ましい。
　工程B又はCの間の継代の回数としては、例えば、2～8回（2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回）が挙げられ、3～7回が好ましく、より好ましくは4～6回である。適切な回数の継代後に細胞集団の一部が凍結ストックとして保存されてもよい。
　工程B又はCから工程１への移行は、培養培地を本発明の培地組成物に交換することにより行われる。交換時期は適切な回数の継代後であってもよいし、又は工程Cの最後の回の継代の途中であってもよい。例えば、工程B又はCの最後の回の継代の終了6時間前が挙げられる。
　一態様において、本発明は、神経堤細胞を含む細胞集団から間葉系幹細胞を製造する製造方法であって、
前記神経堤細胞は、多能性幹細胞から分化誘導された細胞であり、
前記細胞集団は、前記神経堤細胞を70%以上含む細胞集団であり、
前記細胞集団を、1.25 μM以上300 μM以下（1.25 μM～300 μM、又は1.25 μM以上300 μM未満、1.25 μM超300 μM以下、若しくは1.25 μM超300 μM未満）の換算濃度の副腎皮質ホルモンの存在下で培養する工程を含む、
神経堤細胞を含む細胞集団から間葉系幹細胞を製造する製造方法を提供する。
３．間葉系幹細胞
　上述のように、副腎皮質ホルモンを含む培地組成物中で神経堤細胞を培養することにより、間葉系幹細胞が製造される。本発明は、かくして製造された間葉系幹細胞及びその培養物も提供する（以下、本発明の間葉系幹細胞、その培養物とも称する）。「培養物」とは、本発明の製造方法において細胞／細胞集団を培養することにより得られる結果物をいい、細胞、培地、場合によっては細胞分泌性成分等が含まれる。
　本発明の間葉系幹細胞は、TSG-6(Tumor necrosis factor (TNF)-α stimulated gene-6)の高発現を特徴とする。TSG-6は、ヒアルロナン結合タンパク質ファミリーのメンバーであり、ヒアルロナンに結合するLINKドメインを含んでおり、TNF-αやIL-1等により発現が調節される。TSG-6は、基質の構成や構造の調節、ケモカインと細胞表面との相互作用の調節、強力な抗炎症作用及び組織保護機能への関与等の役割を果たし、広範囲の疾患モデルで治療効果を示す間葉系幹細胞の特性マーカーである（Day A.J. and Milner C.M., Matrix Biol. 2019 May; 60-83）。
　一実施形態においては、TSG-6の高発現は、IFNγ刺激に応答した高発現である。当該高発現は、本発明の間葉系幹細胞を培養している培地中に、IFNγを添加することで、細胞を刺激し、その刺激に対する応答として発現するTSG-6の発現量を測定することにより、検出／定量することができる。
　本発明において、TSG-6の高発現とは、本発明の間葉系幹細胞によるTSG-6の発現量（／IFNγ刺激に応答した本発明の間葉系幹細胞によるTSG-6の発現量）が、他の間葉系幹細胞、具体的には生体由来の間葉系幹細胞、特に骨髄由来の間葉系幹細胞によるTSG-6の発現量と比較して、高いことを意味する。より詳細には、本発明の間葉系幹細胞におけるTSG-6の高発現とは、本発明の培地組成物中で同様（好ましくは、同一）の培養条件で培養（／IFNγ刺激）した他の間葉系幹細胞によるTSG-6の発現量よりも、2倍以上、2.1倍以上、2.2倍以上、2.3倍以上、2.4倍以上、2.5倍以上、2.6倍以上、2.7倍以上、2.8倍以上、2.9倍以上、又は3倍以上高いことを意味する。
　本発明の間葉系幹細胞からは、当該技術分野において周知の方法により、前記TSG-6タンパク質を単離・精製することができる。
　また、本発明の間葉系幹細胞からは、当該技術分野において周知の方法により、セクレトームを単離・精製することができる。
　セクレトームは、本願明細書中で用いられる場合、エクソソーム及び、調製時に含まれ得るエクソソーム以外の様々なサイズ・生産過程を経た細胞外小胞全般、細胞培養上清に含まれるタンパク質成分も含む概念である。エクソソームは大きさが100 nm前後で膜にコレステロール、スフィンゴミエリン、セラミド、脂質ラフト構成成分を含み、また内部に多くのタンパク質、mRNA、miRNA等を含む。本発明の間葉系幹細胞から分泌されるセクレトームは、抗線維化作用を有する。
４．疾患の予防又は治療用薬剤
　更に、本発明は、本発明の間葉系幹細胞、本発明の間葉系幹細胞から単離／精製されたTSG-6タンパク質又は本発明の間葉系幹細胞から単離／精製されたセクレトームを有効成分として含有する、炎症性疾患又は線維性疾患の予防又は治療用薬剤も提供する。
　一実施形態においては、本発明の予防又は治療用薬剤は、限定されないが、上記で得られた間葉系幹細胞を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。この場合、得られた間葉系幹細胞の数が少ない場合には、培養して、所定の細胞数が得られるまで増殖させてもよい。得られた間葉系幹細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地、例えばDMEM、EMEM、RPMI-1640、F-12、α-MEM、MSC growing medium (Bio Whittaker)において行うことができる。培養温度は通常約30～40℃の範囲であり、好ましくは約37℃である。CO2濃度は通常約1～10％の範囲であり、好ましくは約5％である。湿度は通常約70～100％の範囲であり、好ましくは約95～100％である。
　また、間葉系幹細胞の疾患の予防又は治療用薬剤への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（DMSO）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤に含有させてもよい。更に、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を細胞製剤に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で細胞製剤に添加することができる。
　上記で調製される予防又は治療用薬剤中に含有する間葉系幹細胞の数は、炎症性疾患又は線維性疾患の治療において所望の効果が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。なお、対象とする個体はヒトなどの哺乳動物を含むがこれに限定されない。また、本発明の細胞製剤は、所望の治療効果が得られるまで、複数回（例えば、2～10回）、適宜、間隔（例えば、1日に2回、1日に1回、1週間に2回、1週間に1回、2週間に1回、1ヶ月に1回、2ヶ月に1回、3ヶ月に1回、6ヶ月に1回）をおいて投与されてもよい。従って、対象の状態にもよるが、治療上有効量としては、例えば、一個体あたり一回につき1×103細胞～1×1010細胞で1～10回の投与量が挙げられる。一個体における投与総量としては、限定されないが、1×103細胞～1×1011細胞、好ましくは1×104細胞～1×1010細胞、更に好ましくは1×105細胞～1×109細胞などが挙げられる。
　他の実施形態においては、本発明の炎症性疾患の予防又は治療用薬剤は、本発明の間葉系幹細胞から単離／精製されたTSG-6タンパク質を有効成分として含有する。該予防又は治療用薬剤中のTSG-6タンパク質の含量は、剤型やTSG-6タンパク質の投与量等により異なるが、例えば、約0.1～100重量％である。TSG-6タンパク質の投与量は、限定されないが、例えば、0.01 ng/kg～1 mg/kg、10 ng/kg～100 μg/kgである。
　更に他の実施形態においては、本発明の線維性疾患の予防又は治療用薬剤は、本発明の間葉系幹細胞から単離／精製されたセクレトームを有効成分として含有する。該予防又は治療用薬剤中のセクレトームの含量は、剤型やセクレトームの投与量等により異なるが、例えば、タンパク質量として約0.1～100重量％である。セクレトームの投与量は、限定されないが、例えば、0.01 ng/kg～1 mg/kg、10 ng/kg～100 μg/kgである。
　本発明の炎症性疾患の予防又は治療用薬剤によって予防又は治療される炎症性疾患としては、例えば、肝炎、肝硬変、クローン病、関節リウマチ、ベーチェット病(眼症状)、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、乾癬（乾癬性関節炎も含む）、HIV感染症、多発性骨髄腫、うっ血性心不全、GVHD、巨細胞動脈炎（GCA）、リウマチ性多発筋痛症（PMR）、色素性紫斑性苔癬様皮膚炎、サルコイドーシス、ヴェーゲナー肉芽腫、膿皮症、ベーチェット病、TNF受容体関連周期性症候群（TRAPS）、SAPHO症候群、高安病、筋炎、スティル病、結節性動脈周囲炎（PN）、再発性多発軟骨炎、強皮症多発性筋炎、血球貪食症候群、天疱瘡、川崎病アトピー性皮膚炎が挙げられる。
　本発明の線維性疾患の予防又は治療用薬剤によって予防又は治療される線維性疾患としては、例えば、皮膚に関連して、強皮症（限局性強皮症、汎発性モルフェアまたは線状強皮症を含む）、ケロイド瘢痕化、乾癬、火傷による肥厚性瘢痕化、アテローム性動脈硬化、再狭窄、および脊髄損傷によって引き起こされた偽性強皮症を含む状態から生じる線維症、腎線維症（糸球体硬化症、腎尿細管間質線維症、進行性腎疾患または糖尿病性腎症を含む）、心線維症（例えば、心筋線維症）、肺線維症（例えば、糸球体硬化症肺線維症、特発性肺線維症、珪肺症、石綿肺症、間質性肺疾患、間質線維性肺疾患および化学療法／放射線照射により誘導される肺線維症）、口腔線維症、心内膜心線維症、三角筋線維症、膵炎、炎症性大腸炎、クローン病、結節性筋膜炎、好酸球性筋膜炎、多様な程度で正常な筋肉組織が線維状組織により置換されることを特徴とする一般的な線維症候群、後腹膜線維症、肝線維症、肝硬変、慢性腎不全；骨髄線維症、コラーゲン蓄積大腸炎および急性線維症、眼に関連して、角膜線維症、手術による角膜瘢痕化、柵状織切除術誘発線維症、および他の眼線維症を含む状態から生じる線維症が挙げられる。
　本発明の予防又は治療用薬剤の投与方法としては特に制限されないが、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与、患部への局所投与等を好適に例示することができ、中でも、血管内投与及び局所投与をより好適に例示することができる。
５．疾患の予防又は治療方法
　更に、本発明は、被験体に治療上有効量の本発明の間葉系幹細胞及び／又は本発明の炎症性疾患又は線維性疾患の予防又は治療用薬剤を投与することを含む、炎症性疾患又は線維性疾患の予防又は治療方法を提供する。
　本明細書中、「有効量」とは、所望の効果を生み出す活性成分の量を意味する。
　本明細書中使用される「治療上有効量」とは、被験体に投与される時、所望の治療効果をもたらす活性成分の量を意味する。治療上有効量は、一度に投与（移植）されてもよく、複数回に分けて投与（移植）されてもよい。移植の適用回数は疾患に応じて医療従事者、ガイドラインに従って決定される。また複数回移植を行う場合、インターバルは特に限定されないが、数日～数週間の期間を置いても良い。上記４．疾患の予防又は治療用薬剤で述べた間葉系幹細胞等の投与量に準じる。
　当該細胞医療の対象となる動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等が挙げられ、好ましくはヒトである。
　本発明の間葉系幹細胞の適用可能な疾患部位の範囲は、対象疾患、投与対象の動物種、年齢、性別、体重、症状などに依存して適宜選択される。
６．疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法
　本発明は、間葉系幹細胞を有効成分として含有する炎症性疾患又は線維性疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法（以下、本発明の疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法）であって、本発明の培地組成物中で神経堤細胞を培養して間葉系幹細胞を誘導する工程（工程１）を含む、方法を提供する。本発明の疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法における工程１は、上記本発明の間葉系幹細胞の製造方法の工程１と同様に行うことができる。
　本発明の疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法において、間葉系幹細胞へと分化誘導される神経堤細胞、神経堤細胞が多能性幹細胞由来である場合はその多能性幹細胞、多能性幹細胞がiPS細胞である場合はそのiPS細胞へと誘導される体細胞は、投与対象にとって自家又は他家（同種異系、異種）のいずれであってもよく、その細胞のソースとなる個体は特に制限されないが、例えば、疾患の予防又は治療を必要とする動物への投与のため、本発明の薬剤を作製する場合、これらの細胞は、ドナーの細胞に由来する間葉系幹細胞がレシピエントに生着可能である程度に組織適合性を有するものであってもよい。
　例えば、本発明の疾患の予防又は治療用薬剤を、ヒトにおける疾患の予防又は治療に使用する場合、免疫系の攻撃を受けて死滅するのを予防するという観点から、これらの細胞は、患者本人の細胞であるか、あるいは患者のHLA型と同一又は実質的に同一であるHLA型を有する他人から採取されたものであり得る。本明細書中使用される「実質的に同一であるHLA型」とは、ドナーのHLA型が、免疫抑制剤等の使用を伴う患者に移植した場合に、ドナーの細胞に由来する間葉系幹細胞が生着可能である程度に、患者のものと一致することを意味する。例えば、主たるHLA（HLA-A、HLA-B及びHLA-DRの主要な３遺伝子座、あるいはさらにHLA-Cwを含む４遺伝子座）が同一であるHLA型等が挙げられる。
　また、本発明の疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法は、間葉系幹細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（DMSO）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を薬剤に含有させる工程を含み得る。更に、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を薬剤に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で薬剤に添加することができる。
　一実施形態において、本発明の炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法は、誘導された間葉系幹細胞及び／又は培養上清からTSG-6タンパク質を回収することを更に含み、該炎症性疾患の予防又は治療用薬剤はTSG-6タンパク質を有効成分として含有する。
　一実施形態において、本発明の線維性疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法は、誘導された間葉系幹細胞及び／又は培養上清からセクレトームを回収することを更に含み、該線維症の予防又は治療用薬剤は、該セクレトームを有効成分として含有する。
　以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
実施例１：ｉＮＣＣ（ｉＰＳ細胞由来の神経提細胞）からｉＭＳＣ（ｉＰＳ細胞由来の間葉系幹細胞）への分化誘導
1.iPS細胞から神経堤細胞(iNCC)への分化誘導
　iPS細胞株として201B7(iPS portal)を用いた。ラミニン511-E8フラグメント(iMatrix511、Nippi)でコートした6ウェルプレートに、iPS細胞を6500細胞/ウェルとなるように播種し、StemFit(登録商標)AK03N(味の素(株))培地中で、37℃、5%CO2下、5日間培養した。次いで、培地をStemFit AK03N(A液+B液)にSB431542(Stemgent, Inc.、10μM)およびCHIR99021(Wako、0.3μM（条件1）または0.9μM(条件2))を添加した培地中にて、37℃、5%CO2下で、14日間神経堤細胞への分化誘導を行った。誘導終了時の神経堤細胞の割合はCD271タンパク質高発現細胞の割合を、FACSを用いて決定することにより算出した。加えて、神経堤細胞マーカーの遺伝子発現状況はRT-PCR法にて調べた。尚、RT-PCR法に用いたプライマーを以下に示す。
マーカー遺伝子　　Primer ID　　　　　Taqman Cat.No.
TFAP2a　　　　　　Hs00271528_CE　　　A15629
SOX9　　　　　　　Hs01001343_g1　　　4331182
TWIST1　　　　　　Hs01675818_s1　　　4331182　　　 
(βactinをレファレンス遺伝子として使用（Hs01101944_s1、4331182）)
2.神経堤細胞(iNCC)の純化と拡大培養
　上記1.で製造した神経堤細胞を含む細胞集団をTrypLE Select（Thermo Fisher）を用いてシングルセル化した。シングルセル化した細胞集団を、足場材でコートした6ウェルプレート上に播種し、神経堤細胞の拡大培養に適した培養条件において培養した。より具体的には、StemFit AK03N(A液＋B液)にSB431542(10μM)、Epithelium growth factor(Sigma Chemical、20 ng/mL)およびStemFit AK03N C液(味の素(株)、0.08%)を添加した培地で、37℃、5%CO2下、9～10日間培養した。9～10日間培養後、コンフルエンシーが約90％となった時点で、足場材で培養した細胞集団の神経堤細胞の割合および神経堤細胞遺伝子マーカーの発現状況を上記1．と同様の方法により決定した。
　足場材はラミニン211(Biolamina、6.3 ng/cm2および62.5 ng/cm2)を用いた。
　尚、足場材は、培養培地に直接懸濁することにより6ウェルプレート表面上にコーティングした。
3. ｉＮＣＣからｉＭＳＣへの分化誘導
　得られたｉＮＣＣ（ｉＰＳＣ由来ＮＣＣ）を、１．５　μｇ／ｃｍ２の密度でビトロネクチン－Ｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）コーティングした６ウェルプレートに５．０×１０３細胞／ウェルの密度で播種し、下記の分化用培地（Ｔ３培地）を用いて、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で１３日間培養し、ｉＭＳＣ（ｉＰＳＣ由来ＭＳＣ）を誘導した。
Ｔ３培地：ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　Ｆｏｒ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ（味の素（株）），　９０　ｎＭ　Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
　誘導したｉＭＳＣに関して、ＦＡＣＳを用いて、ＭＳＣポジティブマーカーを３種類（ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ７３）、ネガティブマーカーを１種類（ＣＤ３４）の表面抗原解析を実施した。表１に解析結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　得られた細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ７３がポジティブ、ＣＤ３４はネガティブであり、ｉＭＳＣ誘導が確認された。
実施例２：ＩＦＮγ刺激によるｉＭＳＣの炎症性刺激応答性の解析
　ｉＮＣＣを、１．５　μｇ／ｃｍ２の密度でビトロネクチン－Ｎコーティングした６ウェルプレートに５．０×１０３細胞／ウェルの密度で播種し、Ｔ３培地を用いて、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で１６日間培養し、ｉＭＳＣを誘導した。
　誘導開始１６日後に、Ｔ３培地に５０　ｎｇ／ｍＬ　ＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加することで、４８時間刺激した。刺激後、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商品商標）　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のプロトコールに従ってＲＮＡを精製し、逆転写後Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲを用いて炎症性疾患治療マーカーであるＴＳＧ－６（ＴＮＦＡＩＰ６）の遺伝子発現を解析した。比較対象として、１０％　ＦＢＳ含有αＭＥＭ培地で分化誘導したｉＮＣＣ由来ｉＭＳＣ、Ｔ３培地で１２日～１６日間培養した生体骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭＭＳＣ）（Ｌｏｎｚａまたは、ＲｏｏｓｔｅｒＢｉｏ）２ロットを使用した（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図１にＴＳＧ－６の遺伝子発現解析結果を示す。Ｔ３培地で誘導したｉＭＳＣは、ＩＦＮγ刺激により、有意にＴＳＧ－６の遺伝子発現が上昇することが認められた。
実施例３：Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ濃度検討
　ｉＮＣＣを、１．５　μｇ／ｃｍ２の密度でビトロネクチン－Ｎコーティングした６ウェルプレートに３．０×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　Ｆｏｒ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓに５０　ｎＭ、１００　ｎＭ、１　μＭ、１０　μＭ、５０　μＭのＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅを添加して、３７℃、５％　ＣＯ２条件下でｉＭＳＣを誘導した。分化開始１８日後に、各培地に５０　ｎｇ／ｍＬ　ＩＦＮγを添加することで、４８時間刺激した。刺激後ＲＮＡを精製し、逆転写後Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲを用いてＴＮＦＡＩＰ６の遺伝子発現を解析した。
　図２に分化誘導中の細胞増殖曲線を示す。５０　μＭのＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅを添加した群は、１３日目以降細胞の増殖が止まった。
　図３にＴＳＧ－６の遺伝子発現解析結果を示す。５０　ｎＭから１０　μＭのＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅを添加して誘導したｉＭＳＣは、ＩＦＮγ刺激により、有意にＴＳＧ－６の遺伝子発現が上昇することが認められた。
実施例４：副腎皮質ホルモンの種類の検討
　１００　ｎＭ　Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（デキサメタゾン）、１００　ｎＭ　ベタメタゾン、１００　ｎＭ　プレドニゾロン、６６６　ｎＭ　プレドニゾロンを用いた以外は、実施例１に従ってｉＭＳＣを誘導した。
　誘導したｉＭＳＣに関して、ＦＡＣＳを用いて、ＭＳＣ陽性マーカーを４種類（ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５）、ＮＣＣ陽性マーカー（ＭＳＣ微陽性マーカー）を１種類（ＣＤ２７１）、ＭＳＣ陰性マーカーを２種類（ＣＤ４５、ＣＤ３４）の表面抗原解析を実施した。表３に解析結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　プレドニゾロンはデキサメタゾンと同様に100 nM添加しても効果が限定的であったが、糖質コルチコイドとしての力価を揃えて666 nMにすると分化促進の効果があった。
　なお、本実施例中のデキサメタゾン50 nM、90 nM、100 nM、1 μM、10 μM、50 μMの換算濃度は、それぞれ1.333 μM 2.3994 μM、2.666 μM、26.66 μM、266.6 μM、1333 μMである（デキサメタゾンの力価を26.66として換算）。
　本実施例中のプレドニゾロン100 nM、666 nMの換算濃度は、それぞれ400 nM、2.664 μMである（プレドニゾロンの力価を4として換算）。本実施例中のベタメタゾン100 nMの換算濃度は、2.666 μMである（ベタメタゾンの力価を26.66として換算）。
実施例５：ｉМＳＣセクレトーム評価
（材料と方法）
１．ｉМＳＣのセクレトーム回収
　セクレトームは細胞から分泌されるタンパク質で、エクソソームなどを含むことが知られている。継代数ｐ１のｉＭＳＣ凍結ストックを、９０　ｎＭ　Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えたＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　Ｆｏｒ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ（味の素(株)）を用いて３継代培養した。８０％コンフルエンシーでＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ）　培地に培地交換した後、２日間培養し、培養上清を回収した。培養上清は、０．２２　μｍ　フィルタリングを実施した。その後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）　Ｐｌｕｓ－７０のカラムに充填し、３，５００×ｇ、２５分間遠心することで、限外ろ過を実施した。濃縮した培養上清を回収する際は、カラムを逆さにし１，０００×ｇ、２分間遠心することで回収した。得られたセクレトームを表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
２．ｉМＳＣから得られたセクレトームの抗線維化作用評価
　ＬＸ－２　Ｈｕｍａｎ　Ｈｅｐａｔｉｃ　Ｓｔｅｌｌａｔｅ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ（ＥＤＭ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、以下、ＬＸ－２細胞）を１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｎａｃａｌａｉ）及び２ｍＭ　Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）をＤＭＥＭ　ｈｉｇｈ　Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に添加した培地を用いて培養した。４継代目に４×１０４ずつ１２ウェルプレートの各ウェルに播種した。培養２日後、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した培地に、ｉМＳＣから得られた濃縮セクレトームを１×の濃度になるようにそれぞれ添加した培地に切り替え、培養を継続した。培地切り替え後２日目に、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で細胞を剥離し、回収後Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）　１６　ＬＥＶ　ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＲＮＡを抽出精製し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔｔｍ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を用いて逆転写を行った。合成したｃＤＮＡについて、表５のＴａｑＭａｎ（登録商標）　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓの プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（結果）
　ＲＴ－ＰＣＲの結果を図４に示す。ＬＸ－２細胞は、ＴＧＦ－β１刺激により、線維化マーカー遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１及びＡＣＴＡ２発現を著しく上昇させた。それに対し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２そのものを添加しても特に効果が見られないが、ｉМＳＣセクレトームは、ＴＧＦ－β１刺激で上昇するＣＯＬ１Ａ１及びＡＣＴＡ２発現を低下させた。更にｉМＳＣセクレトームはＴＧＦ－β１無刺激のＬＸ－２細胞のＣＯＬ１Ａ１及びＡＣＴＡ２発現も低下させた。
　本発明によれば、神経堤細胞から間葉系幹細胞を効率的に誘導するための培地組成物を提供することができる。また、本発明によれば、効率的な間葉系幹細胞の製造方法、該間葉系幹細胞等を有効成分として含有する、炎症性疾患又は線維性疾患の予防又は治療用薬剤、該疾患の予防又は治療方法、及び該治療用薬剤の製造方法等を提供することができる。従って、本発明は例えば医療分野において極めて有用である。
　本出願は日本国で出願された特願２０２１－０９７６１９（出願日：２０２１年６月１０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (19)

  1. 　基礎培地及び副腎皮質ホルモンを含有する、神経堤細胞から間葉系幹細胞を誘導するための培地組成物であって、培地組成物中の副腎皮質ホルモンの換算濃度が1.25 μM以上である培地組成物中で神経堤細胞を培養して間葉系幹細胞を誘導する工程を含む、炎症性疾患又は線維性疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法。
  2. 　該炎症性疾患又は線維性疾患の予防又は治療用薬剤がTSG-6の高発現を特徴とする間葉系幹細胞を有効成分として含有する、請求項１に記載の方法。
  3. 　炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法であって、誘導された間葉系幹細胞及び／又は培養上清からTSG-6タンパク質を回収することを更に含み、該炎症性疾患の予防又は治療用薬剤がTSG-6タンパク質を有効成分として含有する、請求項１に記載の方法。
  4. 　線維性疾患の予防又は治療用薬剤の製造方法であって、誘導された間葉系幹細胞及び／又は培養上清からセクレトームを回収することを更に含み、該線維症の予防又は治療用薬剤が、該セクレトームを有効成分として含有する、請求項１に記載の方法。
  5. 　副腎皮質ホルモンが、糖質コルチコイドあるいはその誘導体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　糖質コルチコイドあるいはその誘導体が、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プロピオン酸ベクロメタゾンから成る群から選択される、少なくとも１種である、請求項５に記載の製造方法。
  7. 　糖質コルチコイドあるいはその誘導体が、デキサメタゾンである、請求項５又は６に記載の製造方法。
  8. 　培地組成物中の副腎皮質ホルモンの換算濃度が300 μM以下である請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　培地組成物中のデキサメタゾンの濃度が10 μM以下である請求項７に記載の製造方法。
  10. 　基礎培地が無血清培地である、請求項１～９のいずれか１項に記載の製造方法。
  11. 　神経堤細胞が多能性幹細胞由来である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 　多能性幹細胞が人工多能性幹細胞（iPS細胞）である、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 　前記工程の前に以下の工程を実施する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の製造方法：
    （工程A）神経堤細胞を含む細胞集団を得る工程、及び
    （工程B）工程Aで得られた細胞集団を、細胞外マトリックスを足場として用いて拡大培養する工程。
  14. 　細胞外マトリックスが、ラミニンまたはフィブロネクチンである、請求項１３に記載の製造方法。
  15. 　ラミニンが、全長ラミニン、α2鎖を有するラミニン又はラミニン２１１である、請求項１４に記載の製造方法。
  16. 　工程Aで得られた神経堤細胞を含む細胞集団が、神経堤細胞のソーティング処理に供されることなく工程Bに供されることを特徴とする、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の製造方法。
  17. 　炎症性疾患が肝硬変である、請求項１～３及び５～１６のいずれか１項に記載の製造方法。
  18. 　TSG-6の高発現がIFNγ刺激に応答した高発現である、請求項２、３及び５～１７のいずれか１項に記載の製造方法。
  19. 　請求項１～３及び５～１８のいずれか１項の製造方法により製造された、炎症性疾患の予防又は治療用薬剤又は請求項１、２、４～１８のいずれか１項の製造方法により製造された、線維性疾患の予防又は治療用薬剤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117431209A (zh) * 2023-12-22 2024-01-23 上海元戊医学技术有限公司 通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法及作为骨关节炎药物的应用

Citations (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002076976A2 (en) 2001-03-23 2002-10-03 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
US20030087919A1 (en) 2001-03-23 2003-05-08 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
WO2003059913A1 (en) 2002-01-10 2003-07-24 Bayer Healthcare Ag Roh-kinase inhibitors
WO2003062225A1 (en) 2002-01-23 2003-07-31 Bayer Pharmaceuticals Corporation Pyrimidine derivatives as rho-kinase inhibitors
WO2003062227A1 (en) 2002-01-23 2003-07-31 Bayer Pharmaceuticals Corporation Rho-kinase inhibitors
WO2004039796A1 (de) 2002-10-28 2004-05-13 Bayer Healthcare Ag Heteroaryloxy-substituierte phenylaminopyrimidine als rho-kinaseinhibitoren
WO2007069666A1 (ja) 2005-12-13 2007-06-21 Kyoto University 核初期化因子
WO2008118820A2 (en) 2007-03-23 2008-10-02 Wisconsin Alumni Research Foundation Somatic cell reprogramming
WO2009007852A2 (en) 2007-06-15 2009-01-15 Izumi Bio, Inc Multipotent/pluripotent cells and methods
WO2009032194A1 (en) 2007-08-31 2009-03-12 Whitehead Institute For Biomedical Research Wnt pathway stimulation in reprogramming somatic cells
WO2009057831A1 (ja) 2007-10-31 2009-05-07 Kyoto University 核初期化方法
WO2009058413A1 (en) 2007-10-29 2009-05-07 Shi-Lung Lin Generation of human embryonic stem-like cells using intronic rna
WO2009075119A1 (ja) 2007-12-10 2009-06-18 Kyoto University 効率的な核初期化方法
WO2009079007A1 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Gliamed, Inc. Stem-like cells and method for reprogramming adult mammalian somatic cells
WO2009091659A2 (en) 2008-01-16 2009-07-23 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant rna agents
WO2009101084A1 (en) 2008-02-13 2009-08-20 Fondazione Telethon Method for reprogramming differentiated cells
WO2009102983A2 (en) 2008-02-15 2009-08-20 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2009101407A2 (en) 2008-02-11 2009-08-20 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
WO2009114949A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 UNIVERSITé LAVAL Methods for deprogramming somatic cells and uses thereof
WO2009117439A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
WO2009126655A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of a small molecule modulator
WO2009146408A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Summa Health Systems Llc Methods for using tgf-b receptor inhibitors or activin-like kinase (alk) 5 inhibitors a-83-01 and sb-431542 to treat eye disease and wound healing conditions
WO2009157593A1 (en) 2008-06-27 2009-12-30 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
WO2010009015A2 (en) 2008-07-14 2010-01-21 Oklahoma Medical Research Foundation Production of pluripotent cells through inhibition of bright/arid3a function
WO2010033920A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for enhancing cell reprogramming
WO2010033906A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2010042800A1 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Nevada Cancer Institute Methods of reprogramming somatic cells and methods of use for such cells
WO2010050626A1 (en) 2008-10-30 2010-05-06 Kyoto University Method for producing induced pluripotent stem cells
WO2010056831A2 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an hdac modulator
WO2010068955A2 (en) 2008-12-13 2010-06-17 Dna Microarray MICROENVIRONMENT NICHE ASSAY FOR CiPS SCREENING
WO2010098419A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Kyoto University Novel nuclear reprogramming substance
WO2010102267A2 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Ipierian, Inc. Tgf-beta pathway inhibitors for enhancement of cellular reprogramming of human cells
WO2010111422A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Induced pluripotent stem cell generation using two factors and p53 inactivation
WO2010111409A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Pluripotent stem cells
WO2010115050A2 (en) 2009-04-01 2010-10-07 The Regents Of The University Of California Embryonic stem cell specific micrornas promote induced pluripotency
WO2010124290A2 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for deriving or culturing pluripotent cells
WO2010147395A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Medium composition comprising neuropeptide y for the generation, maintenance, prologned undifferentiated growth of pluripotent stem cells and method of culturing pluripotent stem cell using the same
WO2010147612A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Lixte Biotechnology, Inc. Methods of modulating cell regulation by inhibiting p53
WO2018123968A1 (ja) * 2016-12-28 2018-07-05 株式会社ツーセル 生体組織損傷の修復剤および当該修復剤の製造方法
WO2019107485A1 (ja) * 2017-11-30 2019-06-06 国立大学法人京都大学 細胞の培養方法
WO2020230832A1 (ja) * 2019-05-15 2020-11-19 味の素株式会社 神経堤細胞または角膜上皮細胞の純化方法
JP2021097619A (ja) 2019-12-20 2021-07-01 株式会社クボタ 農業機械

Patent Citations (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002076976A2 (en) 2001-03-23 2002-10-03 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
US20030087919A1 (en) 2001-03-23 2003-05-08 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
US20030125344A1 (en) 2001-03-23 2003-07-03 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
WO2003059913A1 (en) 2002-01-10 2003-07-24 Bayer Healthcare Ag Roh-kinase inhibitors
US20040014755A1 (en) 2002-01-10 2004-01-22 Dhanapalan Nagarathnam Rho-kinase inhibitors
WO2003062225A1 (en) 2002-01-23 2003-07-31 Bayer Pharmaceuticals Corporation Pyrimidine derivatives as rho-kinase inhibitors
WO2003062227A1 (en) 2002-01-23 2003-07-31 Bayer Pharmaceuticals Corporation Rho-kinase inhibitors
US20040002507A1 (en) 2002-01-23 2004-01-01 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
US20040002508A1 (en) 2002-01-23 2004-01-01 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
US20050192304A1 (en) 2002-01-23 2005-09-01 Dhanapalan Nagarathnam Rho-kinase inhibitors
US20050209261A1 (en) 2002-01-23 2005-09-22 Dhanapalan Nagarathnam Rho-kinase inhibitors
WO2004039796A1 (de) 2002-10-28 2004-05-13 Bayer Healthcare Ag Heteroaryloxy-substituierte phenylaminopyrimidine als rho-kinaseinhibitoren
WO2007069666A1 (ja) 2005-12-13 2007-06-21 Kyoto University 核初期化因子
WO2008118820A2 (en) 2007-03-23 2008-10-02 Wisconsin Alumni Research Foundation Somatic cell reprogramming
WO2009007852A2 (en) 2007-06-15 2009-01-15 Izumi Bio, Inc Multipotent/pluripotent cells and methods
WO2009032194A1 (en) 2007-08-31 2009-03-12 Whitehead Institute For Biomedical Research Wnt pathway stimulation in reprogramming somatic cells
WO2009058413A1 (en) 2007-10-29 2009-05-07 Shi-Lung Lin Generation of human embryonic stem-like cells using intronic rna
WO2009057831A1 (ja) 2007-10-31 2009-05-07 Kyoto University 核初期化方法
WO2009075119A1 (ja) 2007-12-10 2009-06-18 Kyoto University 効率的な核初期化方法
WO2009079007A1 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Gliamed, Inc. Stem-like cells and method for reprogramming adult mammalian somatic cells
WO2009091659A2 (en) 2008-01-16 2009-07-23 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant rna agents
WO2009101407A2 (en) 2008-02-11 2009-08-20 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
WO2009101084A1 (en) 2008-02-13 2009-08-20 Fondazione Telethon Method for reprogramming differentiated cells
WO2009102983A2 (en) 2008-02-15 2009-08-20 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2009117439A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
WO2009114949A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 UNIVERSITé LAVAL Methods for deprogramming somatic cells and uses thereof
WO2009126655A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of a small molecule modulator
WO2009126250A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through rna interference
WO2009126251A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an hdac modulator
WO2009146408A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Summa Health Systems Llc Methods for using tgf-b receptor inhibitors or activin-like kinase (alk) 5 inhibitors a-83-01 and sb-431542 to treat eye disease and wound healing conditions
WO2009157593A1 (en) 2008-06-27 2009-12-30 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
WO2010009015A2 (en) 2008-07-14 2010-01-21 Oklahoma Medical Research Foundation Production of pluripotent cells through inhibition of bright/arid3a function
WO2010033920A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for enhancing cell reprogramming
WO2010033906A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2010042800A1 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Nevada Cancer Institute Methods of reprogramming somatic cells and methods of use for such cells
WO2010050626A1 (en) 2008-10-30 2010-05-06 Kyoto University Method for producing induced pluripotent stem cells
WO2010056831A2 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an hdac modulator
WO2010068955A2 (en) 2008-12-13 2010-06-17 Dna Microarray MICROENVIRONMENT NICHE ASSAY FOR CiPS SCREENING
WO2010098419A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Kyoto University Novel nuclear reprogramming substance
WO2010102267A2 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Ipierian, Inc. Tgf-beta pathway inhibitors for enhancement of cellular reprogramming of human cells
WO2010111422A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Induced pluripotent stem cell generation using two factors and p53 inactivation
WO2010111409A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Pluripotent stem cells
WO2010115050A2 (en) 2009-04-01 2010-10-07 The Regents Of The University Of California Embryonic stem cell specific micrornas promote induced pluripotency
WO2010124290A2 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for deriving or culturing pluripotent cells
WO2010147395A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Medium composition comprising neuropeptide y for the generation, maintenance, prologned undifferentiated growth of pluripotent stem cells and method of culturing pluripotent stem cell using the same
WO2010147612A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Lixte Biotechnology, Inc. Methods of modulating cell regulation by inhibiting p53
WO2018123968A1 (ja) * 2016-12-28 2018-07-05 株式会社ツーセル 生体組織損傷の修復剤および当該修復剤の製造方法
WO2019107485A1 (ja) * 2017-11-30 2019-06-06 国立大学法人京都大学 細胞の培養方法
WO2020230832A1 (ja) * 2019-05-15 2020-11-19 味の素株式会社 神経堤細胞または角膜上皮細胞の純化方法
JP2021097619A (ja) 2019-12-20 2021-07-01 株式会社クボタ 農業機械

Non-Patent Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"NCBI", Database accession no. NM_010094
CHUNG KUEI-FANG, SICARD FLAVIE, VUKICEVIC VLADIMIR, HERMANN ANDREAS, STORCH ALEXANDER, HUTTNER WIELAND B., BORNSTEIN STEFAN R., EH: "Isolation of Neural Crest Derived Chromaffin Progenitors from Adult Adrenal Medulla", STEM CELLS, vol. 27, no. 10, 1 October 2009 (2009-10-01), pages 2602 - 2613, XP093014200, ISSN: 1066-5099, DOI: 10.1002/stem.180 *
DAY A.J.MILNER C.M., MATRIX BIOL, May 2019 (2019-05-01), pages 60 - 83
EMINLI S ET AL., STEM CELLS., vol. 26, 2008, pages 2467 - 2474
FENG B ET AL., NAT. CELL BIOL., vol. 11, 2009, pages 197 - 203
FUKUTA M. ET AL., PLOS ONE., vol. 9, no. 12, 2 December 2014 (2014-12-02), pages 112291
HAN J ET AL., NATURE, vol. 463, 2010, pages 1096 - 100
HENG JC ET AL., CELL STEM CELL, vol. 6, 2010, pages 167 - 74
HUANGFU D ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 26, 2008, pages 1269 - 1275
ICHIDA JK ET AL., CELL STEM CELL, vol. 5, 2009, pages 491 - 503
KIM JB ET AL., NATURE, vol. 461, 2009, pages 649 - 643
LINDEMANN ET AL., MOL. CANCER, vol. 2, 2003, pages 20
LYSSIOTIS CA ET AL., PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 106, 2009, pages 8912 - 8917
MAEKAWA M ET AL., NATURE, vol. 47, no. 4, 2011, pages 225 - 9
MALI P ET AL., STEM CELLS., vol. 28, 2010, pages 713 - 720
MINAMINO, YUKI ET AL.: "Differentiation of neural crest cells from spheres of mouse ES cells cultured in a serum-free culture", SHIKA IGAKU - JOURNAL OF THE OSAKA ODONTOLOGICAL SOCIETY, OSAKA SHIKA GAKKAI, OSAKA,, JP, vol. 75, no. 2, 1 January 2012 (2012-01-01), JP , pages 65 - 69, XP009542180, ISSN: 0030-6150 *
MIYAZAKI T. ET AL., NAT COMMUN., vol. 3, 2012, pages 1236
R.L. JUDSON ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 27, 2009, pages 459 - 461
VOGEL, K.S. ; WESTON, J.A.: "The sympathoadrenal lineage in avian embryos - II. Effects of glucocorticoids on cultured neural crest cells", DEVELOPMENTAL BIOLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 139, no. 1, 1 May 1990 (1990-05-01), AMSTERDAM, NL , pages 13 - 23, XP024851574, ISSN: 0012-1606, DOI: 10.1016/0012-1606(90)90274-M *
ZHAO C.IKEYA M., STEM CELLS INT., 31 July 2018 (2018-07-31)
ZHAO Y ET AL., CELL STEM CELL, vol. 3, 2008, pages 132 - 135

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117431209A (zh) * 2023-12-22 2024-01-23 上海元戊医学技术有限公司 通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法及作为骨关节炎药物的应用

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