JP7330466B2 - 細胞の培養方法 - Google Patents
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Description
[発明の背景]
[1]以下の工程を含む、神経堤細胞の製造方法:
(1)神経堤細胞を得る工程、
(2)GSK3β阻害剤及び塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を含む培地中で神経堤細胞を浮遊培養する工程であって、1μMを超える濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤を、該培地が含む工程。
[1a]前記GSK3β阻害剤の濃度が、1μMを超え5μM未満の濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度である、[1]の製造方法。
[1b]前記効果が、GSK3β阻害剤のGSK3β阻害活性に基づいて評価され、
GSK3β阻害剤のGSK3β阻害活性は、以下の手順によって決定される、[1]の製造方法。
(i)GSK3βの制御下でレポーター遺伝子の発現が抑制された細胞を、GSK3β阻害剤の存在下及び非存在下で培養する手順、
(ii)GSK3β阻害剤の存在下及び非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量を測定する手順、及び、
(iii)GSK3β阻害剤の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量に対するGSK3β阻害剤の存在下でのレポーター遺伝子の発現量の増加量に基づいて、GSK3β阻害剤のGSK3β阻害活性を決定する手順。
[2]前記培地がさらにTGFβ阻害剤を含む、[1]の製造方法。
[3]前記培地がCDM培地である、[1]の製造方法。
[4]前記培地がさらに上皮成長因子(EGF)を含む、[1]の製造方法。
[5]前記GSK3β阻害剤がCHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、ケンパウロン、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及びSB415286からなる群より選択される少なくとも一つである、[1]の製造方法。
[6]前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である、[5]の製造方法。
[6a]CHIR99021の濃度が1μMを超え5μM未満である、[6]の製造方法。
[6b]CHIR99021の濃度が2以上4.5μM以下である、[6a]の製造方法。
[6c]前記GSK3β阻害剤がCP21R7である、[5]の製造方法。
[6d]CP21R7の濃度が0.5以上1μM以下である、[6c]の製造方法。
[7]前記TGFβ阻害剤がSB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3a/BIO、BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及びSB505124からなる群より選択される少なくとも一つである、[2]の製造方法。
[7a]前記bFGFの濃度が20-40ng/mlである、[1]-[7]のいずれかの製造方法。
[8]前記工程(2)において、神経堤細胞が播種後5~8日毎に継代される、[1]のいずれかの製造方法。
[9]前記工程(1)が、幹細胞から神経堤細胞を分化誘導する工程である、[1]のいずれかの製造方法。
[10]以下の工程を含む、神経堤細胞の増殖方法:
(I)GSK3β阻害剤及び塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を含む培地中で神経堤細胞を浮遊培養する工程であって、1μMを超える濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤を、該培地が含む工程。
[10a]前記GSK3β阻害剤の濃度が、1μMを超え5μM未満の濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度である、[10]の増殖方法。
[10b]前記培地がさらにTGFβ阻害剤を含む、[10]の増殖方法。
[10c]前記培地がCDM培地である、[10]の増殖方法。
[10d]前記培地がさらに上皮成長因子(EGF)を含む、[10]の増殖方法。
[10e]前記GSK3β阻害剤がCHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、ケンパウロン、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及びSB415286からなる群より選択される少なくとも一つである、[10]の増殖方法。
[10f]前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である、[10e]の増殖方法。
[10g]CHIR99021の濃度が1μMを超え5μM未満である、[10f]の製造方法。
[10h]CHIR99021の濃度が2以上4.5μM以下である、[10g]の製造方法。
[10i]前記GSK3β阻害剤がCP21R7である、[10e]の製造方法。
[10j]CP21R7の濃度が0.5以上1μM以下である、[10i]の製造方法。
[10k]前記TGFβ阻害剤がSB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3a/BIO、BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及びSB505124からなる群より選択される少なくとも一つである、[10b]の増殖方法。
[10l]前記工程(I)において、神経堤細胞が播種後5~8日毎に継代される、[10]の増殖方法。
[11]GSK3β阻害剤、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)及び神経堤細胞を含む培地であって、1μMを超える濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤を含む培地。
[11a]前記GSK3β阻害剤の濃度が、1μMを超え5μM未満の濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度である、[11]の培地。
[12]さらにTGFβ阻害剤を含む、[11]の培地。
[13]前記培地がCDM培地である、[11]の培地。
[14]さらに上皮成長因子(EGF)を含む、[11]の培地。
[15]前記GSK3β阻害剤がCHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、ケンパウロン、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及びSB415286からなる群より選択される少なくとも一つである、[11]の培地。
[16]前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である、[15]の培地。
[16a]CHIR99021の濃度が1μMを超え5μM未満である、[16]の培地。
[16b]CHIR99021の濃度が2以上4.5μM以下である、[16a]の培地。
[16c]前記GSK3β阻害剤がCP21R7である、[15]の培地。
[16d]CP21R7の濃度が0.5以上1μM以下である、[16c]の製造方法。
[17]前記TGFβ阻害剤がSB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3a/BIO、BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及びSB505124からなる群より選択される少なくとも一つである、[12]の培地。
[18][1]の製造方法で得られた神経堤細胞を含む凍結ストック。
[18a][1]の工程で得られた神経堤細胞を分離する工程と、
分離された神経堤細胞を細胞保存液に懸濁し、凍結する工程と、により得られる、[18]の凍結ストック。
[19]以下の工程を含む、神経細胞、グリア細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞又は色素細胞の製造方法:
(i)GSK3β阻害剤及び塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を含む培地中で神経堤細胞を浮遊培養する工程であって、1μMを超える濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤を、該培地が含む工程、及び、
(ii)工程(i)で得られた神経堤細胞を、神経細胞、グリア細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及び色素細胞からなる群より選択される少なくとも一つの細胞に分化させる工程。
[19a]前記GSK3β阻害剤の濃度が、1μMを超え5μM未満の濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度である、[19]の製造方法。
[19b]前記培地がさらにTGFβ阻害剤を含む、[19]の製造方法。
[19c]前記培地がCDM培地である、[19]の製造方法。
[19d]前記培地がさらに上皮成長因子(EGF)を含む、[19]の製造方法。
[19e]前記GSK3β阻害剤がCHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、ケンパウロン、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及びSB415286からなる群より選択される少なくとも一つである、[19]の製造方法。
[19f]前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である、[19e]の製造方法。
[19g]CHIR99021の濃度が1μMを超え5μM未満である、[19f]の培地。
[19h]CHIR99021の濃度が2以上4.5μM以下である、[19g]の培地。
[19i]前記GSK3β阻害剤がCP21R7である、[19e]の培地。
[19j]CP21R7の濃度が0.5以上1μM以下である、[19i]の製造方法。
[19k]前記TGFβ阻害剤がSB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3a/BIO、BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及びSB505124からなる群より選択される少なくとも一つである、[19b]の製造方法。
[19l]前記工程(i)において、神経堤細胞が播種後5~8日毎に継代される、[19]の製造方法。
[20] 以下の工程を含む、多能性を有する神経堤細胞を長期間培養する方法:
(1)神経堤細胞を得る工程、
(2)GSK3β阻害剤及び塩基性線維芽細胞成長因子を含む培地中で神経堤細胞を浮遊培養する工程であって、1μMを超える濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤を、該培地が含む工程。
[20a]前記GSK3β阻害剤の濃度が、1μMを超え5μM未満の濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度である、[20]の培養方法。
[20b]前記培地がさらにTGFβ阻害剤を含む、[20]の培養方法。
[20c]前記培地がCDM培地である、[20]の増殖方法。
[20d]前記培地がさらに上皮成長因子(EGF)を含む、[20]の増殖方法。
[20e]前記GSK3β阻害剤がCHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、ケンパウロン、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及びSB415286からなる群より選択される少なくとも一つである、[20]の増殖方法。
[20f]前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である、[20e]の増殖方法。
[20g]CHIR99021の濃度が1μMを超え5μM未満である、[20f]の製造方法。
[20h]CHIR99021の濃度が2以上4.5μM以下である、[20g]の製造方法。
[20i]前記GSK3β阻害剤がCP21R7である、[20e]の製造方法。
[20j]CP21R7の濃度が0.5以上1μM以下である、[20i]の製造方法。
[20k]前記TGFβ阻害剤がSB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3a/BIO、BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及びSB505124からなる群より選択される少なくとも一つである、[20b]の増殖方法。
[20l]前記工程(I)において、神経堤細胞が播種後5~8日毎に継代される、[20]の増殖方法。
[21] 塩基性線維芽細胞成長因子と、1μMを超える濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤と、を含む培地の、多能性を有する神経堤細胞を長期間培養するための使用。
[21a]塩基性線維芽細胞成長因子と、1μMを超える濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤の、神経堤細胞の培養における使用。
[21b]塩基性線維芽細胞成長因子と、1μMを超える濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤の、神経堤細胞培地の製造のための使用。
また、「浮遊培養」とは、細胞を容器に付着させずに適切な培地中に単一細胞又は2以上の細胞からなる細胞隗(cell sphere)として分散させた状態で培養することを意味する。
マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ELISA、免疫染色、フローサイトメトリーなどを利用して行うことができる。マーカータンパク質に特異的な抗体としては、マーカータンパク質における特定のアミノ酸配列又はマーカータンパク質に結合した特定の糖鎖等に結合する抗体を用いることができる。また、細胞内に発現し、細胞表面には現れないマーカータンパク質(例えば転写因子またはそのサブユニットなど)の場合は、当該マーカータンパク質とともにレポータータンパク質を発現させ、当該レポータータンパク質を検出することによって対象とするマーカータンパク質を検出できる(例えば、非特許文献4)。この方法は、適当な細胞表面マーカーが認められない場合に好ましく用いられ得る。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法及び/又は核酸検出方法、例えば、RT-PCR、マイクロアレイ、バイオチップ及びRNAseq等を利用して行うことができる。
本発明に係る神経堤細胞の製造方法は以下の工程を含む。このうち工程(2)は、特に、本発明に係る神経堤細胞の増殖方法である。
(1)神経堤細胞を得る工程、
(2)GSK3β阻害剤及び塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を含む培地中で神経堤細胞を浮遊培養する工程であって、1μMを超える濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤を、該培地が含む工程。
神経堤細胞を得る工程(1)は、工程(2)に供するための神経堤細胞を得る工程である。工程(1)における神経堤細胞を得る方法は特に限定されず、例えば、幹細胞から神経堤細胞を分化誘導する方法、市販の神経堤細胞を購入する方法、及び、天然に存在する神経堤細胞を採取する方法等が挙げられる。
このほか、公開されているすべての論文(例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574;、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650;Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797)、あるいは特許(例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852)に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
人工多能性幹細胞株としては、NIH、理研、京都大学等が樹立した各種iPSC株が利用可能である。例えば、ヒトiPSC株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株等、京都大学の253G1株、253G4株、1201C1株、1205D1株、1210B2株、1383D2株、1383D6株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A3株、FfI-01s04株等が挙げられ、1231A3株が好ましい。
SB431542(4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide)を用いる場合、添加濃度は、特には10μMとできる。
GSK3β阻害剤はこれらに限定されるものではなく、GSK3βのmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA、GSK3βに結合する抗体、ドミナントネガティブGSK3β変異体等もGSK3β阻害剤として使用することができ、これらは商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
CHIR99021を用いる場合、添加濃度は、特に限定されないが、例えば0.1~1μM、好ましくは0.5~1μM、特には1μMとできる。
なお、「マトリゲル」は、細胞外マトリックスタンパク質を豊富に含むEngelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫から抽出した可溶性基底膜調製品のことであり、マトリゲルをコーティングした培養容器は商業的に入手が可能である。マトリゲルの主成分は、ラミニン、コラーゲンIV、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン/ニドジェン1,2である。マトリゲルは、これらの主成分に加えて、TGFβ、上皮細胞増殖因子、インシュリン様成長因子、線維芽細胞増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子3,4、およびEHS腫瘍に自然に産生される他の増殖因子を含む。
培養温度は、特に限定されないが、30~40℃(例えば、37℃)で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5%程度である。
, 127(8):1607-1616、 Dupin et al., Developmental biology, 2012, 366(1):83-95、Nagoshi et al., Cell Stem Cell 2, April 2008, 392-403)。このような神経堤細胞を公知の方法(例えば、Motohashi et al., Biology open, 2016, 5:311-322、Pfaltzgraffet al., Journal of Visualized Experiments, 2012, 64:4134)を用いて採取し、工程(2)に供することも可能である。
神経堤細胞の拡大培養工程(2)は、GSK3β阻害剤及び塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を含む培地中で神経堤細胞を浮遊培養する工程である。
好ましいGSK3β阻害剤は、CHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、ケンパウロン、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及びSB415286からなる群より選択される少なくとも一つである。特に好ましいGSK3β阻害剤は、CHIR99021又はCP21R7である。
当該濃度のGSK3β阻害剤とbFGFとの存在下で神経堤細胞を浮遊培養することによって、9週(63日)を超えるような長期の培養期間にわたって、多能性(multipotency)を維持した神経堤細胞を培養し増殖させることが可能となる。
当該測定結果において、GSK3β阻害剤が1μMを超える濃度のCHIR99021が示すGSK3β阻害活性(阻害%)と同等の阻害活性を示す場合、当該GSK3β阻害剤は「1μMを超える濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果」(CHIR99021が示す効果と同等のGSK3β阻害活性)を示すと判断される。ここで、「同等」な値(阻害%)とは、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%又は1%まで変動する値を示し、好ましくはプラス又はマイナスそれぞれ15%、10%、5%、又は1%の範囲を示す。
また、GSK3β阻害剤としてCP21R7を用いる場合、添加濃度は、0.1μMを超える濃度とされ、好ましくは0.5μM以上、より好ましくは1μM以上とされる。CP21R7に関しては、長期期間分化能を維持したまま神経堤細胞を増殖させる効果は、0.5μM以上1μM以下で高いことが明らかとなっている。具体的には、CP21R7濃度0.5-1μMでは、84日(12週)以上にわたって多能性(multipotency)を維持した神経堤細胞を培養し増殖させることが可能であった。一方、0.1μMでは、培養3週(21日)において多能性を維持する細胞数の低下がみられた。
好ましいTGFβ阻害剤は、SB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3A/BIO、BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及びSB505124からなる群より選択される少なくとも一つである。特に好ましいTGFβ阻害剤は、SB431542である。
また、TGFβ阻害剤の添加濃度は、添加するTGF3β阻害剤の種類によって適宜調整されるが、例えば1~50μM、好ましくは5~20μMである。
SB431542を用いる場合、添加濃度は、特に限定されないが、例えば1~40μM、好ましくは5~20μM、特には10μMとできる。
EGFの添加濃度は、特に限定されないが、例えば5~100 ng/ml、好ましくは20~40ng/mlとされる。
培養温度は、特に限定されないが、30~40℃(例えば、37℃)で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5%程度である。
この間、適宜細胞の継代が行われる。継代は、例えば播種後5~8日毎に行われる。継代間隔は、細胞凝集塊の拡大に十分な期間であって、かつ細胞凝集塊が大きくなりすぎて酸素や栄養素が細胞凝集塊内部の細胞に到達し難くなると考えられる期間よりも短い期間で行われることが好ましい。
本工程により、多能性(multipotency)を維持した神経堤細胞を培養し増殖させることが可能な期間としては、特に限定されないが、例えば、7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、56日、63日、70日、77日、84日、91日、98日、105日、又は112日以上となり得、35日以上が好ましく、42日以上がより好ましく、63日以上がさらに好ましく、84日以上が特に好ましく、112日以上が最も好ましい。
本発明は、上述の神経堤細胞の製造方法及び増殖方法で用いられる、神経堤細胞を含む培地をも提供する。培地の好ましい組成は上述したとおりである。
また、本発明は、上述の神経堤細胞の製造方法及び増殖方法で得られる、神経堤細胞を含む凍結ストックをも提供する。この神経堤細胞は、SOX10発現陽性かつNCCの細胞表面抗原マーカーのp75発現陽性である。
本発明に係る神経細胞、グリア細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞又は色素細胞の製造方法は以下の工程を含む。これらのうち工程(i)は、本発明に係る神経堤細胞の製造方法の工程(2)あるいは本発明に係る神経堤細胞の増殖方法と同一である。
(i)GSK3β阻害剤及び塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を含む培地中で神経堤細胞を浮遊培養する工程であって、1μMを超える濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤を、該培地が含む工程、及び、
(ii)工程(i)で得られた神経堤細胞を、神経細胞、グリア細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及び色素細胞からなる群より選択される少なくとも一つの細胞に分化させる工程。
本発明に係る神経堤細胞の製造方法及び増殖方法によれば、神経細胞、グリア細胞及び間葉系間質細胞へ分化する多能性(multipotency)、あるいはこれらに加えて骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及び色素細胞へ分化する多能性(multipotency)を維持した神経堤細胞を得ることができる。
神経堤細胞の神経細胞、グリア細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及び色素細胞のそれぞれの細胞への分化誘導は、文献公知(例えば、非特許文献1~4)の方法に従って行うことができる。
例えば、神経堤細胞をFibronectinでコーティングしたプレートに播種し、N-2 Supplement (17502-048、Gibco)、BDNF(028-16451、和光純薬)、GDNF(074-06264、和光純薬)、NT-3(141-06643、和光純薬)、NGF(141-07601、和光純薬)を添加したDMEM/F12に交換し、37℃、5%CO2下で14日間培養する。
あるいは、神経堤細胞をプレートに播種し、10μM SB431542および1μM CHIR99021を含むCDM培地で1日間培養した後、B-27 Supplement (17504-044、Gibco)、N-2 Supplement、L-glutamine (073-05391、和光純薬)、 Penicillin/Streptomycin (15140-122、Gibco)、BDNF、GDNF、NT-3、NGFを添加したNeurobasal medium (21103-049、Gibco社)に交換し、37℃、5%CO2下で35日間培養する。
培養後、4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、免疫染色法によりTUBB3タンパク質を発現する神経細胞の分化出現を確認する。
[iPSCからのNCCの分化誘導]
非特許文献1記載の方法に従ってヒトiPSCを神経堤細胞(Neural Crest Cell: NCC)に分化させた。iPSCには、非特許文献4記載のSOX10-Nano-Lantern Reporter Human iPSC(201B7株)を用いた。同細胞株は、NCCのマーカー遺伝子であるSOX10遺伝子の下流に蛍光タンパクNano-Lantern(Saito K. et al., "Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging." Nat. Commun., 2012; 3: 1262.)をコードする塩基配列を挿入したものであり、SOX10のプロモーターの制御下でSOX10とNano-Lanternとの融合タンパクを発現する。
NCCをディッシュから剥離し、10μM SB431542、3μM CHIR99021、40ng/ml bFGF及び40ng/ml EGFを含むCDM培地で浮遊培養した。細胞の継代は7日毎に行った。
NCCの拡大培養におけるGSK3β阻害剤、bFGF及びEGFの濃度が、NCCの自己増殖能及び分化能に及ぼす影響を検討した。以下に特に言及しない条件については、実施例1と同様にして拡大培養を行った。
NCCの拡大培養に用いたGSK3β阻害剤をCHIR99021からCP21R7に変更した以外は実施例1と同様にしてNCCの拡大培養を行った。CP21R7の濃度は、0.1, 0.5または1μMとした。
実施例1で拡大培養したNCCの神経細胞への分化能を確認した。
非特許文献4に記載の方法に基づいて神経細胞への分化誘導を行った。
30日間拡大維持培養したNCCをプレートに5×105個播種し、10μM SB431542および1μM CHIR99021を含むCDM培地で1日間培養した。1日後、B-27 Supplement (17504-044、Gibco)、N-2 Supplement (17502-048、Gibco)、L-glutamine(073-05391、和光純薬)、 Penicillin/Streptomycin (15140-122、 Gibco)、BDNF (028-16451、和光純薬)、GDNF (074-06264、和光純薬)、NT-3 (141-06643、和光純薬)、NGF (141-07601、和光純薬)を添加したNeurobasal medium (21103-049、Gibco社)に交換し、37℃、5%CO2下で35日間培養した。上記培養期間中3~4日毎に培地交換を行った。
30日間維持培養されたNCCからTUBBタンパク質を発現する神経細胞、およびGFAPタンパク質を発現するグリア細胞が分化出現しているのが確認された。
実施例1で拡大培養したNCCの神経細胞への分化能を確認した。
非特許文献1に記載の方法に基づいてメラノサイトへの分化誘導を行った。
84日間拡大維持培養したNCCをFibronectinでコーティングした6wellプレートに播種し、10μM SB431542および1μM CHIR99021を含むCDM培地で1日間培養した。1日後、BMP4およびEndothelin-3 (和光純薬)を添加したCDM培地に交換し、37℃、5%CO2下で7日間培養した。上記培養期間中2日毎に培地交換を行った。
実施例1で拡大培養したNCCの間葉系間質細胞への分化能を確認した。
非特許文献1に記載の方法に基づいて間葉系間質細胞への分化誘導を行った。
84日間拡大維持培養したNCCをFibronectinでコーティングした直径6cmの細胞培養用ディッシュに播種し、10μM SB431542および1μM CHIR99021を含むCDM培地で1日間培養した。1日後、培地をCTS StemPro MSC SFM (Gibco, A1033201) に交換した。細胞の継代はStemPro Accutase Cell Dissociation Reagent (Invitrogen社)で細胞を剥がし、1.0-2.0×106個 / dish (10cm dishの場合)の密度で播種することで行った。
実施例1で拡大培養したNCCの骨細胞、軟骨細胞または脂肪細胞への分化能を確認した。
非特許文献1に記載の方法に基づいて骨細胞、軟骨細胞または脂肪細胞への分化誘導を行った。
84日間拡大維持培養したNCCを実施例6記載の方法で間葉系間質細胞へと分化させた。間葉系間質細胞をFibronectinでコーティングした12wellプレートに4.0×104個/ wellで播種し、10%FBS、0.1μM dexa-methasone、50μg/ml ascorbic acidおよび10mM β-glycerophosphateを含むαMEMで4週間培養し、骨細胞への分化誘導を行った。培地は2-3日に1回交換した。アリザニンレッド染色により石灰化ノジュールを検出し、骨細胞への分化を確認した。
軟骨細胞のアルシアンブルー染色は、4%パラホルムアルデヒド(和光純薬)を添加して室温で30分インキュベートし固定した細胞を、1%アルシアンブルー染色液 (MUTO PURE CHEMICALS CO.)と反応させた後、水で洗浄し乾燥させることで行った。
脂肪細胞のオイルレッドO染色は、細胞を10%ホルマリンで室温で1時間固定し、Oil Red O Solution をisopropanolで0.5%に希釈したものと水を3 : 2で混合した染色液と室温で1時間反応させ、水で洗浄することで行った。油滴の観察は顕微鏡で行った。
NCCの拡大培養におけるbFGFの濃度が、NCCの自己増殖能及び分化能に及ぼす影響を検討した。以下に特に言及しない条件については、実施例1と同様にして拡大培養を行った。
GSK3β阻害剤のGSK3β阻害活性を評価するための実験系を確立した。
具体的には、LEF/TCF-bla HCT-116 Cellをアッセイ培地(OPTI-MEM, 0.5% dialyzed FBS, 0.1 mM NEAA, 1 mM Sodium Pyruvate, 100 U/mL/100 μg/mL Pen/Strep)に懸濁した(312,500 cells/mL)。細胞懸濁液をアッセイプレートの各ウェルに播種し(10,000 cells/well)、16-24時間培養した。
GSK3β阻害剤(ここでは、CHIR99021を用いた)をウェルに添加し(濃度0.316, 1.00, 3.16, 10.0, 31.6, 100, 316, 1000, 3160, 10000 nM)、5時間培養した。
beta-lactamaseの基質溶液(LiveBLAzer-FRET B/G (CCF4-AM) Substrate Mixture)を各ウェルに添加し(8 μL / well)、2時間インキュベートした。蛍光プレートリーダーで蛍光値を測定した。測定は、各濃度条件につき2つのウェルで行った。
CHIR99021以外のGSK3β阻害剤についても、本実験系により各濃度条件における蛍光値を測定し、定法にしたがって検量線を作成することで、1μMのCHIR99021が示すGSK3β阻害活性(蛍光値で113.5)と同等のGSK3β阻害活性を示す濃度を決定可能である。
Claims (13)
- 以下の工程を含む、神経堤細胞の製造方法:
(1)神経堤細胞を得る工程、
(2)GSK3β阻害剤及び塩基性線維芽細胞成長因子を含む培地中で神経堤細胞を浮遊培養する工程であって、前記培地が2μMを超え5μM未満の濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤を含み、神経堤細胞の多能性が35日以上維持される工程。 - 前記培地がさらにTGFβ阻害剤を含む、請求項1記載の製造方法。
- 前記培地がCDM培地である、請求項1記載の製造方法。
- 前記培地がさらに上皮成長因子を含む、請求項1記載の製造方法。
- 前記GSK3β阻害剤がCHIR99021、CP21R7、CHIR98014、LY2090314、ケンパウロン、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119及びSB415286からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項1記載の製造方法。
- 前記GSK3β阻害剤がCHIR99021である、請求項5記載の製造方法。
- 前記TGFβ阻害剤がSB431542、A83-01、LDN193189、Wnt3a/BIO、BMP4、GW788388、SM16、IN-1130、GW6604及びSB505124からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項2記載の製造方法。
- 前記工程(2)において、神経堤細胞が播種後5~8日毎に継代される、請求項1記載の製造方法。
- 前記工程(1)が、幹細胞から神経堤細胞を分化誘導する工程である、請求項1記載の製造方法。
- 以下の工程を含む、神経堤細胞の増殖方法:
(I)GSK3β阻害剤及び塩基性線維芽細胞成長因子を含む培地中で神経堤細胞を浮遊培養する工程であって、前記培地が2μMを超え5μM未満の濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤を含み、神経堤細胞の多能性が35日以上維持される工程。 - 以下の工程を含む、神経細胞、グリア細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞又は色素細胞の製造方法:
(i)GSK3β阻害剤及び塩基性線維芽細胞成長因子を含む培地中で神経堤細胞を浮遊培養する工程であって、前記培地が2μMを超え5μM未満の濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤を含み、神経堤細胞の多能性が35日以上維持される工程、及び、
(ii)工程(i)で得られた神経堤細胞を、神経細胞、グリア細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及び色素細胞からなる群より選択される少なくとも一つの細胞に分化させる工程。 - 以下の工程を含む、多能性を有する神経堤細胞を35日以上の期間培養する方法:
(1)神経堤細胞を得る工程、
(2)GSK3β阻害剤及び塩基性線維芽細胞成長因子を含む培地中で神経堤細胞を浮遊培養する工程であって、前記培地が2μMを超え5μM未満の濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤を含む工程。 - 塩基性線維芽細胞成長因子と、2μMを超え5μM未満の濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK3β阻害剤と、を含む培地の、多能性を有する神経堤細胞を35日以上の期間培養するための使用。
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