CN111448213A - Cd47抗体及其用于治疗癌症的用途 - Google Patents

Cd47抗体及其用于治疗癌症的用途 Download PDF

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CN111448213A CN201880077186.7A CN201880077186A CN111448213A CN 111448213 A CN111448213 A CN 111448213A CN 201880077186 A CN201880077186 A CN 201880077186A CN 111448213 A CN111448213 A CN 111448213A
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Abstract

本发明提供了特异性结合至CD47的人源化抗体，包括经掩蔽的抗体。提供了使用抗CD47抗体(包括经掩蔽的抗体)以调节CD47表达细胞的活性(例如，抑制CD47表达细胞的增殖)的方法以及用于治疗与CD47表达细胞相关的一种或多种疾病或病症(例如癌症)的方法。

Description

CD47抗体及其用于治疗癌症的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月1日提交的美国临时申请号62/593,712的优先权益，所述临时申请出于任何目的以全文引用的方式并入本文中。
发明领域
本发明涉及基于抗体的癌症治疗领域。特别是，本发明涉及可任选地与可去除的掩蔽剂缔合的新颖的人源化抗CD47抗体和其抗原结合片段或缀合物，以及其在治疗CD47表达癌症中的用途。
发明背景
分化簇47(CD47)(也称为整合素相关蛋白(IAP))是属于免疫球蛋白超家族蛋白的跨膜受体。CD47在细胞上普遍表达并且充当自体识别的标志物，通过充当“别吃我(don'teat me)”信号防止吞噬作用。CD47经由与几种其它蛋白质(包括血小板反应蛋白(TSP)和信号调控蛋白-α(SIRPα))相互作用而介导CD47的效应。吞噬细胞上的SIRPα与靶细胞上的CD47之间的相互作用帮助确保靶细胞不被吞没。
某些癌症通过增加癌细胞的细胞表面上的CD47的表达来选择基于CD47的免疫逃避机制，由此避免被免疫***清除。然而，本领域中已知的疗法靶向受试者标靶(癌细胞和非癌细胞)中的CD47表达细胞，此在受试者中会导致毒性，例如外周红血球和血小板的耗竭。因此，需要选择性靶向癌细胞中的CD47而不靶向非癌细胞的组合物和方法。
发明内容
本公开是基于新颖的人源化抗CD47抗体和其抗原结合片段的发现。在本发明的某些方面，提供了人源化抗CD47抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗CD47抗体或其抗原结合片段包含防止抗CD47抗体或其抗原结合片段结合至CD47蛋白的可去除的掩蔽剂(例如，卷曲螺旋掩蔽剂)。在某些实施方案中，掩蔽剂可由癌细胞环境中所存在的一个或多个分子(例如，蛋白酶)去除(例如，裂解)。去除掩蔽剂将恢复抗CD47抗体或其抗原结合片段结合CD47的能力，由此在癌细胞情形中使得抗CD47抗体或其抗原结合片段特异性靶向CD47蛋白。
在一些实施方案中，提供了一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:16、19、21和23的HCDR1；选自SEQ ID NO:17、20、22和24的HCDR2；以及SEQ ID NO:18的HCDR3；其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:31和34的LCDR1；选自SEQID NO:32和35的LCDR2；以及选自SEQ ID NO:33和36的LCDR3；其中所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:16、19、21和23的HCDR1；选自SEQ ID NO:17、20、22和24的HCDR2；以及SEQID NO:18的HCDR3；其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:31和34的LCDR1；选自SEQ IDNO:32和35的LCDR2；以及选自SEQ ID NO:33和36的LCDR3；其中所述重链可变区包含：
a)以SEQ ID NO:88所列的人类IGHV3-23/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H44、H49、H82、H89、H91和H94是供体残基；或
b)以SEQ ID NO:89所列的人类IGHV3-48/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基；或
c)以SEQ ID NO:90所列的人类IGHV3-66/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H29、H49和H82是供体残基；或
d)以SEQ ID NO:91所列的人类IGHV3-74/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基；并且
其中所述轻链可变区包含：
a)以SEQ ID NO:92所列的人类IGKV6-21/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L4、L21、L69和L85是供体残基；或
b)以SEQ ID NO:93所列的人类IGKV1-27/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L21、L49和L69是供体残基。
在一些实施方案中，重链可变区包含选自以下的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ IDNO:16、17和18；SEQ ID NO:19、20和18；SEQ ID NO:21、22和18；SEQ ID NO:16、20和18；以及SEQ ID NO:23、24和18。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自以下的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:31、32和33；SEQ ID NO:31、32和36；以及SEQ ID NO:34、35和33。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:16、17、18、31、32和33；SEQ ID NO:16、17、18、34、35和33；SEQ ID NO:19、20、18、31、32和33；SEQ ID NO:19、20、18、34、35和33；SEQ ID NO:21、22、18、31、32和33；SEQID NO:21、22、18、34、35和33；SEQ ID NO:16、20、18、31、32和33；SEQ ID NO:16、20、18、34、35和33；SEQ ID NO:23、24、18、31、32和33；SEQ ID NO:23、24、18、34、35和33；SEQ ID NO:16、17、18、31、32和36；SEQ ID NO:19、20、18、31、32和36；SEQ ID NO:21、22、18、31、32和36；16、20、18、31、32和36；以及SEQ ID NO:23、24、18、31、32和36。
在一些实施方案中，提供了一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:25、28和29的HCDR1；选自SEQ ID NO:26和30的HCDR2；以及SEQ ID NO:27的HCDR3；并且其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:37和40的LCDR1；SEQ ID NO:38的LCDR2；以及选自SEQ ID NO:39和41的LCDR3；其中所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:25、28和29的HCDR1；选自SEQ ID NO:26和30的HCDR2；以及SEQ ID NO:27的HCDR3；并且其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:37和40的LCDR1；SEQ ID NO:38的LCDR2；以及选自SEQ ID NO:39和41的LCDR3；其中所述重链可变区包含：
a)以SEQ ID NO:88所列的人类IGHV3-23/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H44、H49、H82、H89、H91和H94是供体残基；或
b)以SEQ ID NO:89所列的人类IGHV3-48/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基；或
c)以SEQ ID NO:90所列的人类IGHV3-66/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H29、H49和H82是供体残基；或
d)以SEQ ID NO:91所列的人类IGHV3-74/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基；并且
其中所述轻链可变区包含：
a)以SEQ ID NO:92所列的人类IGKV6-21/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L4、L21、L69和L85是供体残基；或
b)以SEQ ID NO:93所列的人类IGKV1-27/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L21、L49和L69是供体残基。
在一些实施方案中，重链可变区包含选自以下的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ IDNO:25、26和27；SEQ ID NO:28、26和27；SEQ ID NO:29、30和27；以及SEQ ID NO:29、26和27。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自以下的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:37、38和39；SEQ ID NO:40、38和39；以及SEQ ID NO:37、38和41。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:25、26、27、37、38和39；SEQ ID NO:25、26、27、40、38和39；SEQ ID NO:25、26、27、37、38和41；SEQ IDNO:28、26、27、37、38和39；SEQ ID NO:28、26、27、40、38和39；SEQ ID NO:28、26、27、37、38和41；SEQ ID NO:29、30、27、37、38和39；SEQ ID NO:29、30、27、40、38和39；SEQ ID NO:29、30、27、37、38和41；SEQ ID NO:29、26、27、37、38和39；SEQ ID NO:29、26、27、40、38和39；以及SEQ ID NO:29、26、27、37、38和41。
在一些实施方案中，重链可变区包含选自SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链可变区和轻链可变区包含SEQ ID NO:2和10；SEQ ID NO:3和11；SEQ ID NO:3和12；SEQ ID NO:3和13；SEQ ID NO:3和14；SEQ ID NO:4和11；SEQ ID NO:4和12；SEQ ID NO:4和13；SEQ ID NO:4和14；SEQ ID NO:5和11；SEQ ID NO:5和12；SEQ IDNO:5和13；SEQ ID NO:5和14；SEQ ID NO:6和11；SEQ ID NO:6和12；SEQ ID NO:6和13；SEQID NO:6和14；SEQ ID NO:7和11；SEQ ID NO:7和12；SEQ ID NO:7和13；SEQ ID NO:7和14；SEQ ID NO:8和11；SEQ ID NO:8和12；SEQ ID NO:8和13；SEQ ID NO:8和14；SEQ ID NO:3和15。
在一些实施方案中，提供了一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:16的HCDR1、SEQ ID NO:17的HCDR2和SEQ ID NO:18的HCDR3；并且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:31的LCDR1、SEQ ID NO:32的LCDR2和SEQ ID NO:33的LCDR3；并且其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；并且其中所述抗体相较于Ab47具有减少的红血球凝集。在一些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
在本文所提供的人源化抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，重链可变区包含：
a)以SEQ ID NO:88所列的人类IGHV3-23/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H44、H49、H82、H89、H91和H94是供体残基；或
b)以SEQ ID NO:89所列的人类IGHV3-48/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基；或
c)以SEQ ID NO:90所列的人类IGHV3-66/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H29、H49和H82是供体残基；或
d)以SEQ ID NO:91所列的人类IGHV3-74/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基。
在一些此类实施方案中，根据Kabat编号，H29是F，H44是R或G，H49是A，H82是M或I，H89是I或V，H91是F或Y，并且H94是R。
在本文所提供的人源化抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，轻链可变区包含：
a)以SEQ ID NO:92所列的人类IGKV6-21/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L4、L21、L69和L85是供体残基；或
b)以SEQ ID NO:93所列的人类IGKV1-27/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L21、L49和L69是供体残基。
在一些此类实施方案中，根据Kabat编号，L4是M，L21是L，L49是K，L69是T或S，并且L85是V或T。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是IgG1同型物。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段相较于其亲本抗体具有增强的抗体依赖型细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段相较于其亲本抗体具有增强的抗体依赖型细胞吞噬作用(ADCP)。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段相较于其亲本抗体具有增强的补体依赖型细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、双功能抗体、单链抗体、scFv片段或scFv-Fc。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段在体外和/或体内诱导CD47表达细胞凋亡。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段相较于其亲本抗体具有减少的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段经去岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段阻断CD47与SIRPα之间的相互作用。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段相较于Ab47具有减少的红血球凝集。
在一些实施方案中，提供了一种编码本文所提供的抗体或抗原结合片段的核酸序列。在一些实施方案中，提供了一种包含核酸序列的表达载体。在一些实施方案中，提供了一种包含核酸或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了一种表达本文所提供的抗体或抗原结合片段的宿主细胞。在一些实施方案中，一种生产本文所提供的抗体或抗原结合片段的方法包括培养宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括分离抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，提供了治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，提供了治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括：
a)将受试者鉴定为患有CD47表达癌症；以及
b)向所述受试者施用治疗有效量的本文所提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段。
在一些此类实施方案中，步骤a)包括：
i)分离癌组织；以及
ii)检测所分离的癌组织中的CD47。
在一些实施方案中，提供了用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括：
a)将受试者鉴定为具有癌组织相对于非癌组织升高的巨噬细胞浸润水平；以及
b)向所述受试者施用治疗有效量的本文所提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段。
在一些此类实施方案中，步骤a)包括：
i)从受试者分离癌组织和周围非癌组织；
ii)检测所分离的癌组织和非癌组织中的巨噬细胞；以及
iii)比较所述癌组织相对于所述非癌组织中的染色量。在一些实施方案中，巨噬细胞染色是利用抗CD163抗体进行。
在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括将受试者鉴定为患有CD47表达癌症以及具有癌组织相对于非癌组织升高的巨噬细胞浸润水平。
在一些实施方案中，提供了一种诱导CD47表达细胞凋亡的方法，所述方法包括使所述细胞与本文所提供的抗体或其抗原结合片段接触。在一些实施方案中，所述细胞是在体外。在一些实施方案中，所述细胞是在体内。
在一些实施方案中，提供了一种经掩蔽的抗体，所述经掩蔽的抗体包含特异性结合至人类CD47蛋白的抗体或其抗原结合片段和至少一个掩蔽结构域，其中至少一个掩蔽结构域包含选自SEQ ID NO:44-55、75-86、94和95的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种经掩蔽的抗体，所述经掩蔽的抗体包含本文所提供的抗体或其抗原结合片段和至少一个掩蔽结构域。在一些实施方案中，至少一个掩蔽结构域包含选自SEQ ID NO:44-55、75-86、94和95的氨基酸序列。
在一些实施方案中，相较于无至少一个掩蔽结构域的抗体或其抗原结合片段，至少一个掩蔽结构域减小抗体或抗原结合片段对人类CD47蛋白的结合亲和力。在一些实施方案中，相较于无至少一个掩蔽结构域的抗体或其抗原结合片段，结合亲和力减小至少约100倍。在一些实施方案中，相较于无至少一个掩蔽结构域的抗体或其抗原结合片段，结合亲和力减小约200倍与约1500倍之间。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中所述重链连接至第一掩蔽结构域；或其中所述轻链连接至第二掩蔽结构域；或其中所述重链连接至第一掩蔽结构域并且所述轻链连接至第二掩蔽结构域。在一些实施方案中，第一掩蔽结构域包含选自SEQ ID NO:44、46、48、50、52、54、75、77、79、81、83、85和94的氨基酸序列；并且第二掩蔽结构域包含选自SEQ ID NO:45、47、49、51、53、55、76、78、80、82、84、86和95的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一掩蔽结构域和第二掩蔽结构域是选自以下的一对掩蔽结构域：SEQ ID NO:44和45；SEQ ID NO:46和47；SEQ ID NO:48和49；SEQ ID NO:50和51；SEQ IDNO:52和53；SEQ ID NO:54和55；SEQ ID NO:75和76；SEQ ID NO:77和78；SEQ ID NO:79和80；SEQ ID NO:81和82；SEQ ID NO:83和84；SEQ ID NO:85和86；以及SEQ ID NO:94和95。在一些实施方案中，第一掩蔽结构域连接至重链的N端并且第二掩蔽结构域连接至轻链的N端。
在一些实施方案中，每个掩蔽结构域包含可蛋白酶裂解的连接子并且经由所述可蛋白酶裂解的连接子连接至重链或轻链。在一些实施方案中，可蛋白酶裂解的连接子包含基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点。在一些实施方案中，MMP裂解位点选自MMP2裂解位点、MMP7裂解位点、MMP9裂解位点和MMP13裂解位点。在一些实施方案中，在由MMP裂解之后，抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链包含MMP裂解位点的短氨基酸残基(stub amino acidremnant)。在一些实施方案中，短氨基酸残基包含在抗体的N端的序列LRSG、SG或VR。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是本文所提供的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，经掩蔽的抗体包含连接至第一掩蔽结构域并且具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链和连接至第二掩蔽结构域并且具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，提供了一种编码本文所提供的经掩蔽的抗体的核酸序列。在一些实施方案中，提供了一种包含核酸的表达载体。在一些实施方案中，提供了一种表达本文所提供的经掩蔽的抗体的宿主细胞。在一些实施方案中，一种生产本文所提供的经掩蔽的抗体的方法包括培养宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括分离经掩蔽的抗体。
在一些实施方案中，提供了治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所提供的经掩蔽的抗体。
在一些实施方案中，提供了用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括：
a)将受试者鉴定为具有癌症相对于周围非癌组织升高的MMP水平；以及
b)向所述受试者施用治疗有效量的本文所提供的经掩蔽的抗体，其中经掩蔽的抗体的每个掩蔽结构域包含可蛋白酶裂解的连接子并且其中所述可蛋白酶裂解的连接子包含基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点。在一些实施方案中，MMP裂解位点选自MMP2裂解位点、MMP7裂解位点、MMP9裂解位点和MMP13裂解位点。在一些实施方案中，MMP选自MMP2、MMP7、MMP9和MMP13。在一些实施方案中，步骤a)包括：
i)从受试者分离癌组织和非癌组织；
ii)检测所分离的癌组织和非癌组织中的MMP；以及
iii)比较所述癌组织相对于所述非癌组织中的染色量。
在一些实施方案中，提供了用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括：
a)将受试者鉴定为患有CD47表达癌症；以及
b)向所述受试者施用治疗有效量的本文所提供的经掩蔽的抗体。
在一些实施方案中，步骤a)包括：
i)分离癌组织；以及
ii)检测所分离的癌组织中的CD47。
在一些实施方案中，提供了用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括：
a)将受试者鉴定为具有癌组织相对于非癌组织升高的巨噬细胞浸润水平；以及
b)向所述受试者施用治疗有效量的本文所提供的经掩蔽的抗体。
在一些实施方案中，步骤a)包括：
i)从受试者分离癌组织和周围非癌组织；
ii)检测所分离的癌组织和非癌组织中的巨噬细胞；以及
iii)比较所述癌组织相对于所述非癌组织中的染色量。在一些实施方案中，巨噬细胞染色是利用抗CD163抗体进行。
在一些实施方案中，提供了用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括将受试者鉴定为(a)具有癌症相对于周围非癌组织升高的MMP水平，以及(b)患有CD47表达癌症。在一些实施方案中，提供了用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括将受试者鉴定为(a)具有癌症相对于周围非癌组织升高的MMP水平，以及(b)具有癌组织相对于非癌组织升高的巨噬细胞浸润水平。在一些实施方案中，提供了用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括将受试者鉴定为(a)患有CD47表达癌症，以及(b)具有癌组织相对于非癌组织升高的巨噬细胞浸润水平。在一些实施方案中，提供了用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括将受试者鉴定为(a)具有癌症相对于周围非癌组织升高的MMP水平，(b)患有CD47表达癌症，以及(c)具有癌组织相对于非癌组织升高的巨噬细胞浸润水平。
在一些实施方案中，经掩蔽的抗体包括包含可蛋白酶裂解的连接子的至少一个掩蔽结构域，并且其中所述可蛋白酶裂解的连接子在肿瘤微环境中裂解。在一些实施方案中，可蛋白酶裂解的连接子在肿瘤微环境中裂解之后，掩蔽结构域从抗CD47抗体或其抗原结合片段释放。在一些实施方案中，可蛋白酶裂解的连接子包含氨基酸序列IPVSLRSG(SEQ IDNO:73)或GPLGVR(SEQ ID NO:57)。在一些实施方案中，可蛋白酶裂解的连接子包含MMP裂解位点。在一些实施方案中，MMP裂解位点选自MMP2裂解位点、MMP7裂解位点、MMP9裂解位点和MMP13裂解位点。在一些实施方案中，在释放抗CD47抗体或其抗原结合片段之后，抗CD47抗体或其抗原结合片段具有可蛋白酶裂解的连接子的短氨基酸残基。在一些实施方案中，短氨基酸残基包含在抗体的N端的LRSG、SG或VR序列。
在各种实施方案中，CD47表达癌症是血液癌症或实体癌症。在一些实施方案中，CD47表达癌症选自非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、B淋巴母细胞性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤、瑞特氏综合征(Richter's syndrome)、滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓纤维化、真性红血球增多症、皮肤T细胞淋巴瘤、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、脊髓发育不良综合征(MDS)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)和间变性大细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，CD47表达癌症选自肺癌、胰脏癌、乳癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、脊椎癌、脑癌、子***、子宫内膜癌、结肠直肠癌、***癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠癌、胃癌、癌瘤、头颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、***癌、垂体癌、胃部癌、子宫癌、***癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，CD47表达癌症选自肺癌、肉瘤、结肠直肠癌、头颈癌、卵巢癌、胰脏癌、胃癌、黑色素瘤和乳癌。
在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段或经掩蔽的抗体与选自以下一者或多者的免疫检查点分子的抑制剂组合施用：程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序化死亡配体1(PD-L1)、PD-L2、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM-1)、CEACAM-5、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白血球相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、CD160、2B4或TGFR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段或经掩蔽的抗体与激动性抗CD40抗体组合施用。在一些实施方案中，激动性抗CD40抗体具有低的岩藻糖基化水平或经去岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段或经掩蔽的抗体与抗体药物缀合物(ADC)组合施用，其中所述ADC的所述抗体特异性结合至癌细胞的细胞外表面上表达的蛋白质并且所述抗体缀合至包含细胞毒性剂的药物-连接子。在一些实施方案中，细胞毒性剂是奥瑞司他汀(auristatin)。在一些实施方案中，ADC的抗体缀合至选自vcMMAE和mcMMAF的药物-连接子。
在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段或经掩蔽的抗体的抗CD47抗体或其抗原结合片段相较于其亲本抗CD47抗体在体外展现减少的血球凝集。在一些实施方案中，亲本抗体是Ab47。在一些实施方案中，抗CD47抗体或经掩蔽的抗体的施用并不诱导受试者的血球凝集。在一些实施方案中，抗CD47抗体或经掩蔽的抗体在体外和/或体内诱导CD47表达细胞凋亡。在一些实施方案中，抗CD47抗体或经掩蔽的抗体在体内诱导CD47表达细胞凋亡。在一些实施方案中，CD47表达细胞是癌细胞。
在一个方面，提供了一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含以SEQ IDNO:16(GYGMS)、17(TITSGGTYTYYPDSVKG)和18(SLAGNAMDY)所列的CDR和以SEQ ID NO:88[图1A]所列的人类IGHV3-23/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H44、H49、H82、H89、H91和H94是供体残基。
在另一个方面，提供了一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含以SEQID NO:16(GYGMS)、17(TITSGGTYTYYPDSVKG)和18(SLAGNAMDY)所列的CDR和以SEQ ID NO:89[图1B]所列的人类IGHV3-48/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基。
在又另一个方面，提供了一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含以SEQID NO:16(GYGMS)、17(TITSGGTYTYYPDSVKG)和18(SLAGNAMDY)所列的CDR和以SEQ ID NO:90[图1C]所列的人类IGHV3-66/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H29、H49和H82是供体残基。
在又另一个方面，提供了一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含以SEQID NO:16(GYGMS)、17(TITSGGTYTYYPDSVKG)和18(SLAGNAMDY)所列的CDR和以SEQ ID NO:91[图1D]所列的人类IGHV3-74/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基。
在又另一个方面，提供了一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含以SEQID NO:31(RASQTISDYLH)、32(FASQSIS)和33(QNGHGFPRT)所列的CDR和以SEQ ID NO:92[图1G]所列的人类IGKV6-21/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L4、L21、L69和L85是供体残基。
在又另一个方面，提供了一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含以SEQID NO:31(RASQTISDYLH)、32(FASQSIS)和33(QNGHGFPRT)所列的CDR和以SEQ ID NO:93[图1H]所列的人类IGKV1-27/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L21、L49和L69是供体残基。
在一个实施方案中，根据Kabat编号，构架位置L4被M所占据，L21被L所占据，L49被K所占据，L69被T或S所占据，并且L85被V或T所占据。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8中的任一者具有至少90％序列同一性的重链可变区(HCVR)以及与SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15中的任一者具有至少90％序列同一性的轻链可变区(LCVR)。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段还包含LCDR3中的G91A突变(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段是IgG1同型物。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段相较于其亲本抗体具有增强的抗体依赖型细胞毒性(ADCC)。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段相较于其亲本抗体具有增强的抗体依赖型细胞吞噬作用(ADCP)。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段相较于其亲本抗体具有减少的核心岩藻糖基化。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段阻断CD47与SIRPα之间的相互作用。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段相较于其亲本抗体具有减少的红血球凝集。
在一个方面，提供了一种编码特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段的核酸序列。
在一个实施方案中，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、双功能抗体、单链抗体、scFv片段或scFv-Fc。
在一个方面，提供了一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含掩蔽剂(也称为“掩蔽结构域”)的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述掩蔽剂包含一个或多个卷曲螺旋肽，相较于无掩蔽剂的抗体或其抗原结合片段，所述一个或多个卷曲螺旋肽减小所述抗体或抗原结合片段对人类CD47的结合亲和力。
在一个实施方案中，可蛋白酶裂解的连接子将掩蔽剂连接至抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，可蛋白酶裂解的连接子具有包含IPVSLRSG(SEQ ID NO:73)或GPLGVR(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列。
在一个实施方案中，可蛋白酶裂解的连接子包含基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点。
在一个实施方案中，MMP裂解位点选自MMP2裂解位点、MMP7裂解位点、MMP9裂解位点和MMP13裂解位点。
在一个实施方案中，MMP裂解位点在肿瘤微环境中由MMP裂解之后，掩蔽剂从抗CD47抗体或其抗原结合片段释放。
在一个实施方案中，经裂解的抗CD47抗体具有MMP裂解位点的短氨基酸残基。
在一个实施方案中，短氨基酸残基包含在抗体的N端的LRSG、SG或VR序列。
在一个实施方案中，一个或多个卷曲螺旋肽包含选自SEQ ID NO:44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和55的一个或多个序列。在一个实施方案中，一个或多个卷曲螺旋肽包含选自SEQ ID NO:75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85和86的一个或多个序列。在一个实施方案中，一个或多个卷曲螺旋肽包含选自SEQ ID NO:94和95的一个或多个序列。
在一个实施方案中，相较于无掩蔽剂的抗体或其抗原结合片段，结合至CD47的抗体或抗原结合片段减少至少约100倍。
在一个实施方案中，相较于无掩蔽剂的抗体或其抗原结合片段，结合至CD47的抗体或抗原结合片段减少约200倍与约1500倍之间。
在一个实施方案中，CD47表达癌症是引起实体癌症的血液癌症。
在一个实施方案中，血液癌症选自非霍奇金淋巴瘤、B淋巴母细胞性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤、瑞特氏综合征、滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓纤维化、真性红血球增多症、皮肤T细胞淋巴瘤、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、脊髓发育不良综合征(MDS)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)和间变性大细胞淋巴瘤。
在一个实施方案中，CD47表达癌症是实体肿瘤。
在一个实施方案中，实体肿瘤选自肺癌、胰脏癌、乳癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、脊椎癌、脑癌、子***、子宫内膜癌、结肠直肠癌、***癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠癌、胃癌、肉瘤、头颈癌、黑色素瘤、皮肤癌、***癌、垂体癌、胃部癌、子宫癌、***癌和甲状腺癌。
在一个实施方案中，实体肿瘤选自肺癌、肉瘤、卵巢癌、胰脏癌、胃癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、头颈癌和乳癌。
在一个实施方案中，受试者是罹患实体癌症的人类。
在一个实施方案中，抗CD47抗体与选自以下一者或多者的免疫检查点分子的抑制剂组合施用：程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序化死亡配体1(PD-L1)、PD-L2、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM-1)、CEACAM-5、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白血球相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、CD160、2B4或TGFR。
在一个方面，提供了特异性结合至人类CD47蛋白的包含掩蔽剂的抗体或其抗原结合片段，其中所述掩蔽剂包括包含SEQ ID NO:95(QGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGS)和/或SEQ ID NO:94(QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQ LRKKVEKLGS)的序列的一个或多个卷曲螺旋肽，并且其中相较于无掩蔽剂的抗体或其抗原结合片段，所述一个或多个卷曲螺旋肽减小所述抗体或抗原结合片段对人类CD47蛋白的结合亲和力。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8中的任一者具有至少90％序列同一性的重链可变区(HCVR)以及与SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15中的任一者具有至少90％序列同一性的轻链可变区(LCVR)。
在一个实施方案中，掩蔽剂经由可蛋白酶裂解的连接子连接至抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，可蛋白酶裂解的连接子具有包含IPVSLRSG(SEQ ID NO:73)或GPLGVR(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列。
在一个实施方案中，可蛋白酶裂解的连接子包含基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点。
在一个实施方案中，MMP裂解位点选自MMP2裂解位点、MMP7裂解位点、MMP9裂解位点和MMP13裂解位点。
在一个实施方案中，在MMP裂解位点由MMP裂解之后，从抗CD47抗体去除掩蔽剂。
在一个实施方案中，在MMP裂解位点由MMP裂解之后，抗CD47抗体具有MMP裂解位点的短氨基酸残基。
在一个实施方案中，短氨基酸残基包含在抗体的N端的LRSG、SG或VR序列。
在一个实施方案中，相较于无掩蔽剂的抗体或其抗原结合片段，结合减少至少约100倍。
在一个实施方案中，相较于无掩蔽剂的抗体或其抗原结合片段，结合减少约200倍与约1500倍之间。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:42的重链序列和SEQ IDNO:43的轻链序列。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含赋予选自ADCC和/或CDC活性的增强的效应功能的变体Fc区。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段经去岩藻糖基化。
在一个方面，提供了一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG1同型物。
在一个实施方案中，抗体包括增强的ADCC、增强的ADCP和/或增强的CDC活性。
在一个方面，提供了一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将受试者鉴定为具有癌症相对于周围非癌组织升高的MMP水平；以及
b)向受试者施用治疗有效量的包含掩蔽剂的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述掩蔽剂包含卷曲螺旋肽，如果受试者具有癌症相对于周围非癌组织升高的MMP水平，那么相较于无掩蔽剂的抗体或其抗原结合片段，所述卷曲螺旋肽减小抗体或抗原结合片段对人类CD47的结合亲和力。
在一个实施方案中，MMP选自由以下组成的组：MMP2、MMP7、MMP9和MMP13。
在一个实施方案中，步骤a)包括：
i)从受试者分离癌组织和非癌组织；
ii)检测所分离的癌组织和非癌组织中的MMP；以及
iii)比较所述癌组织相对于所述非癌组织中的染色量。
在一个方面，提供了一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将受试者鉴定为具有癌症相对于周围非癌组织升高的CD47水平；以及
b)向受试者施用治疗有效量的包含掩蔽剂的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述掩蔽剂包含卷曲螺旋肽，如果受试者具有癌症相对于周围非癌组织升高的CD47水平，那么相较于无掩蔽剂的抗体或其抗原结合片段，所述卷曲螺旋肽减小抗体或抗原结合片段对人类CD47的结合亲和力。
在一个实施方案中，步骤a)包括：
i)从受试者分离癌组织和周围非癌组织；
ii)检测所分离的癌组织和周围非癌组织中的CD47；以及
iii)相对于非癌组织中的CD47染色来比较癌组织中的CD47染色量。
在一个方面，提供了一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将受试者鉴定为具有癌组织相对于非癌组织升高的巨噬细胞浸润水平；以及
b)向受试者施用治疗有效量的包含掩蔽剂的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述掩蔽剂包含一个或多个卷曲螺旋肽，如果受试者具有癌症相对于非癌组织升高的巨噬细胞浸润水平，那么相较于无掩蔽剂的抗体或其抗原结合片段，所述一个或多个卷曲螺旋肽减小抗体或抗原结合片段对人类CD47的结合亲和力。
在一个实施方案中，步骤a)包括：
i)从受试者分离癌组织和周围非癌组织；
ii)检测所分离的癌组织和非癌组织中的巨噬细胞；以及
iii)比较所述癌组织相对于所述非癌组织中的染色量。
在一个实施方案中，巨噬细胞染色是利用抗CD163抗体进行。
在一个方面，提供了一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8中的任一者具有至少90％序列同一性的重链可变区(HCVR)以及与SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15中的任一者具有至少90％序列同一性的轻链可变区(LCVR)，其中所述抗体还包含在HCVR和/或LCVR的N端的序列LRSG、SG或VR。
在一个方面，提供了一种通过施用本发明的经掩蔽的CD47抗体与激动性CD40抗体的组合来治疗癌症的方法。
在一个实施方案中，激动性CD40抗体具有低的岩藻糖基化水平，例如SEA-CD40抗体。
在一个方面，提供了一种通过施用如技术方案37所述的经掩蔽的CD47抗体与抗体药物缀合物(ADC)的组合来治疗癌症的方法，其中所述ADC的所述抗体特异性结合至癌细胞的细胞外表面上表达的蛋白质并且所述抗体缀合至包含细胞毒性剂的药物-连接子。
在一个实施方案中，细胞毒性剂是奥瑞司他汀。
在一个实施方案中，ADC的抗体缀合至选自vcMMAE和mcMMAF的药物连接子。
上文所描述的本公开的发明内容是非限制性的，并且从以下附图说明、具体实施方式、实施例和权利要求书，所公开的抗体以及其制造和使用方法的其它特征和优点将显而易见。
附图说明
图1A-图1J描绘了抗体序列比对。图1A示出了具有人类VH供体序列HV3-23/HJ4的hB6H12重链变体的序列比对。图1B示出了具有人类VH供体序列HV3-48/HJ4的hB6H12重链变体的序列比对。图1C示出了具有人类VH供体序列HV3-66/HJ4的hB6H12重链变体的序列比对。图1D示出了具有人类VH供体序列HV3-74/HJ4的hB6H12重链变体的序列比对。图1E示出了hB6H12重链变体的序列比对。图1F示出了hB6H12.3重链(hvH1)与mB6H12和Ab47相比较的序列比对。图1G示出了具有人类VH供体序列KV1-3/KJ2的hB6H12轻链变体的序列比对。图1H示出了具有人类VH供体序列KV1-27/KJ2的hB6H12轻链变体的序列比对。图1I示出了hB6H12轻链变体的序列比对。图1J示出了hB6H12.3轻链(hvK3)与mB6H12和Ab47相比较的序列比对。
图2A-2C描绘了抗体结合亲和力和动力学。图2A示出了例示性抗CD47抗体的CD47饱和细胞FACS。图2B示出了例示性抗CD47抗体的CD47饱和ELISA。图2C示出了例示性抗CD47抗体的CD47结合动力学。
图3A-图3B描绘了抗体介导的吞噬作用。图3A和图3B示出了例示性抗CD47抗体的CD47+人类红血球(RBC)的抗体介导的吞噬作用。
图4A-图4B描绘了抗体介导的血球凝集。图4A示出了经分散的非沉降RBC的形成的图像捕捉。图4B示出了具有抗CD47抗体Ab47和hB6H12.3的RBC的血球凝集百分比。
图5A-图5B描绘了抗体介导的Fcγ受体活化。从经FcγRI(图5A)或高亲和力FcγRIIIa-H(图5B)转染并且暴露至经渐增浓度的小鼠B6H12、Ab47或hB6H12.3中任一者涂覆的WIL2S细胞的Jurkat细胞测量NFAT荧光素酶报告体活性。
图6A-图6B描绘了NK细胞介导的ADCC和FcγRIIIa活化。将经mB6H12、Ab47或hB6H12.3涂覆的负载铬的WIL2S细胞暴露至Jurkat细胞，所述Jurkat细胞稳定地表达FcγRIIIa的高亲和力V/V变体并且受体活化评定为NFAT驱动的荧光素酶活性。比较mB6H12、Ab47和hB6H12.3之间的ADCC(图6A)和FcγRIIIa活化(图6B)。
图7A-图7D描绘了抗CD47抗体的抑制功能。具有肿瘤相关巨噬细胞(TAM)表型的分化单核细胞在暴露至抗CD47抗体时显示增加的巨噬细胞活化标记物CD86(图7A)和MHCII(图7B)水平。TCR介导的T细胞活化是通过检测T细胞中的MHCII(图7C)和IFNγ分泌(图7D)的上调来评定。
图8A-图8D描绘了hB6H12.3与抗CD47抗体5F9之间的比较。在NFAT荧光素酶报告体Jurkat细胞中检测FcγRI活化(图8A)。在NFAT荧光素酶报告体Jurkat细胞中评定FcγRII活化(图8B)。确定NK介导的ADCC活性(图8C)。评定T细胞IFNγ分泌(图8D)。
图9A-图9B描绘了MMP2再活化的经掩蔽的抗体的质谱数据。在用重组人类MMP2裂解之前(图9A)和之后(图9B)的Vel-IPV-hB6H12.3的解卷积轻链质量。完整轻链的预期m/z为28681(观测值：28680.8)。经MMP2裂解的抗体(LRSG-hB6H12.3)的预期m/z为23969(观测值：23968.4)。
图10描绘了抗CD47抗体对SW780人类膀胱癌细胞的饱和结合。测试Vel-IPV掩蔽的hB6H12抗体以及MMP2预活化的比较物。经裂解的Vel-IPV-抗体在抗体N端具有残余LRSG序列。
图11描绘了抗CD47抗体对SW780人类膀胱癌细胞的饱和结合。测试Vel-IPV掩蔽的hB6H12抗体以及MMP2预活化的比较物。经裂解的Vel-IPV和短-IPV抗体在抗体N端具有残余LRSG序列。经裂解的抗体是通过用MMP2裂解产生，而短-IPV抗体是重组产生的。
图12描绘了抗CD47抗体对人类红血球的饱和结合。测试Vel-IPV掩蔽的hB6H12抗体以及再活化的比较物(短IPV-hB6H12.3或经MMP2裂解的Vel-IPV-hB6H12.3)。经裂解的Vel-IPV抗体和经裂解的短-IPV抗体在抗体N端具有残余LRSG序列。经裂解的抗体是通过用MMP2裂解产生，而短-IPV抗体是重组产生的。
图13描绘了抗CD47抗体对rhCD47的饱和结合，依ELISA检测。Vel-IPV-hB6H12.3呈现显著受损的结合。结合可在经rhMMP2裂解后恢复。
图14描绘了抗CD47抗体对rhCD47的饱和结合，依ELISA检测。hB6H12.3和hB6H12.3G91A两者均比Ab47呈现更高的Bmax。
图15描绘了抗CD47抗体对SW780人类膀胱癌细胞的饱和结合。将Ab47和hB6H12.3的结合与在CDR-L3中具有G91A突变的变体进行比较。
图16描绘了抗CD47抗体对人类红血球的饱和结合。将Ab47和hB6H12.3的结合与在CDR-L3中具有G91A突变的变体进行比较。
图17A-图17B描绘了抗CD47抗体在NSG小鼠的L428异种移植肿瘤模型中的活性。抗体以1mg/kg或10mg/kg每四天经腹膜内(i.p.)施用四个剂量(q4dx4)(图17A)。使用抗F4/80巨噬细胞标记物的肿瘤组织分析显示L428异种移植肿瘤模型中鼠类巨噬细胞的百分比(图17B)。
图18A-图18D描绘了抗CD47抗体在NSG小鼠的L428异种移植肿瘤模型中的活性。抗体以1mg/kg或10mg/kg i.p.施用，q4dx4(图18A)。使用抗F4/80巨噬细胞标记物的肿瘤组织分析揭示Detroit 562异种移植肿瘤模型中存在鼠类巨噬细胞(图18B)。还分析抗CD47抗体在NSG小鼠的SUDHL8异种移植肿瘤模型中的活性(图18C)。抗体以1mg/kg或10mg/kg i.p.施用，q4dx4。使用抗F4/80巨噬细胞标记物的肿瘤组织分析显示SUDHL8异种移植肿瘤模型中存在鼠类巨噬细胞(图18D)。
图19A-图19D描绘了抗CD47抗体在具有低固有巨噬细胞含量的肿瘤模型中的活性。描绘了HT1080纤维肉瘤癌模型(图19A和图19B)和HepG2肝细胞癌模型(图19C和图19D)。抗体以10mg/kg i.p.施用，q4dx4。使用抗F4/80巨噬细胞标记物的肿瘤组织分析显示HT1080纤维肉瘤癌模型(图19B)和HepG2肝细胞癌模型(图19D)中均存在鼠类巨噬细胞。
图20描绘了抗CD47抗体在具有低固有巨噬细胞含量的肿瘤模型中的活性，当与单甲基奥瑞司他汀E(MMAE)抗体-药物缀合物(ADC)(已知其驱动巨噬细胞浸润)组合时，巨噬细胞含量可被扩增。抗CD47抗体以5mg/kg i.p.施用，q4dx4，而MMAE ADC以1mg/kg一次性给予。
图21A-图21B描绘了小鼠反应性抗CD47抗体mIAP301可使用用于人类hB6H12.3抗体的相同VEL和IPV序列掩蔽(图21A)。以这些构建体掩蔽将阻断抗体结合至鼠类CD47阳性肿瘤(图21B)，并且妨碍功能性，依RBC吞噬作用测量。在具有低固有巨噬细胞含量的肿瘤模型中，抗CD47抗体以5mg/kg i.p.施用，q4dx4，而MMAE ADC以1mg/kg一次性给予。
图22A-图22B描绘了向BALB/c小鼠施用的经3H标记的亲本抗体和经掩蔽的抗体。通过闪烁计数法监测抗体。示出了小鼠血小板计数(图22A)和鼠类抗体药物动力学(图22B)。在图22B中，分析mIAP301抗体的时间点是抗体的最后一个剂量之后24小时。
图23A-图23D：抗小鼠CD47抗体mIAP301在A20淋巴瘤模型中驱动抗肿瘤活性，但引起伴随的RBC耗竭(图23A)。经掩蔽的Vel-IPV-mIAP301抗体赋予相似的活性，但消除对RBC耗竭的效应(图23B)。Vel-IPV-mIAP301避免RBC抗原下沉(antigen sink)，但维持肿瘤结合(图23C和图23D)。
图24描绘了抗小鼠CD47抗体mIAP301在MC38结肠癌模型中驱动抗肿瘤活性，已知MC38结肠癌模型对免疫肿瘤学(I/O)剂具有反应性。这种模型中经掩蔽的mIAP301抗体的活性显示优异的功效，如展现完全反应的动物所指示。这种动物的再攻毒导致肿瘤的完全排斥，证实诱导长期记忆T细胞反应。
图25A-图25B：亲本抗体和经掩蔽的抗鼠类CD47抗体mIAP301与抗PD-1替代抗体的组合驱动增加的抗肿瘤活性，这导致4/6动物展现完全反应(CR)(图25A)。亲本抗体和经掩蔽的抗鼠类CD47抗体mIAP301与巨噬细胞活化CD40靶向的SEA增强的替代抗体1C10的组合驱动增加的抗肿瘤活性(图25B)。
图26描绘了各种卷曲螺旋、人源化B6H12变体在BALB/c小鼠中给药后三天的稳定性。稳定性是在通过还原SDS-PAGE分离经掩蔽和未经掩蔽的重链之后，通过西方墨点密度测定法(Western blot densitometry)来评定。
图27A-图27B。检测在单次IV推注剂量为0.1、1、10或30mg/kg的人源化IgG1hB6H12“Ab47”之后的红血球水平(图27A)。大于1mg/kg的剂量不耐受，并且动物在所有剂量水平下均展现由血球溶解性和用测试品处理所造成的临床征兆。示出了在单次IV推注剂量为0.1、1或10mg/kg的经Vel-IPV掩蔽的替代性人源化IgG1 hB6H12“Ab47”之后的红血球水平，这证实在所测试的最大剂量水平下耐受性增加约10倍(图27B)。所有剂量的Vel-IPV-Ab47均耐受，并且在任何剂量水平下未检测到临床征兆。
图28描绘了在单次IV推注剂量为1mg/kg的Ab47和Vel-IPV-Ab47之后的循环抗体水平。虽然1mg/kg剂量的Ab47低于研究第3天的Generic Tab(总抗体)测定的检测限，但在整个研究过程(于研究第15天结束)中，1mg/kg Vel-IPV-Ab47是可检测的。
图29描绘了在单次IV推注剂量为1mg/kg的Ab47、hB6H12.3或对照之后的红血球水平。Ab47和hB6H12.3两者均证实红血球的耗竭。
图30描绘了在单次IV推注剂量为1mg/kg的Ab47、hB6H12.3或对照之后的血小板水平。Ab47证实给药前血小板水平降低60％，而hB6H12.3的血小板减少不超过20％，对照组也观测到这一情况。Ab47和hB6H12.3两者均导致从第7天至研究结束(第15天)血小板增加。
图31描绘了在单次IV推注剂量为10或20mg/kg的Vel-IPV-hB6H12.3之后的红血球水平，这显示相比1mg/kg的未经掩蔽的hB6H12.3耐受性增加约20倍。除了通过血液学参数增强耐受性外，在经掩蔽的抗体处理组中未观测到临床征兆，而未经掩蔽的hB6H12.3于1mg/kg下观测到临床征兆。
图32描绘了在单次IV推注剂量为20mg/kg的Vel-IPV-hB6H12.3、20mg/kg的SEA-Vel-IPV-hB6H12.3、1mg/kg的hB6H12.3和参考对照之后的红血球水平。不管是否通过抗体工程改造增强效应功能性，经SEA掩蔽和未经SEA掩蔽的hB6H12.3抗体的耐受性相似。
图33描绘了使用抗CD163抗体经由免疫组织化学在乳癌和正常***组织样品中的巨噬细胞检测。
图34描绘了M11、M15和Vel卷曲螺旋序列。还示出了MMP2裂解序列。
图35A-图35B：所选鼠类和人类癌症中的肿瘤MMP水平相对于细胞培养***中所存在的那些肿瘤MMP水平。
图36A-图36B描绘了在针对Liv1A ADC的乳癌异种移植模型MCSF7和针对CD30 ADC的L428淋巴瘤模型中与抗CD47抗体组合的所选的含MMAE的奥瑞司他汀(LIV1A和CD30)。
图37A-图37F描绘了血浆(图37A和图37B)、脾脏(图37C和图37D)和肿瘤(图37E和图37F)中mIAP301和经掩蔽的Vel-IPV-mIAP301和Vel-M2-mIAP301的浓度。
图38A-图38B描绘了血浆、肝脏和肿瘤(图38A)中经裂解的抗体的百分比。使从经Ab47或Vel-IPV-Ab47处理4天或7天的小鼠收集的HT1080肿瘤经受流动式细胞测量术来确定抗体能够结合至肿瘤表达的CD47并饱和的程度(图38B)。
图39A-图39C：通过测量循环血浆细胞因子单核细胞化学引诱蛋白-1(MCP-1)来确定经掩蔽的Ab47(图39A)或经掩蔽的hB6H12.3(图39B)的耐受性。对经掩蔽和未经掩蔽的hB6H12.3进行使用Generic TAb ELISA的药物动力学分析(图39C)。
图40A-图40B描绘了在高(Detroit562)(图40A)和低(HT1080)(图40B)巨噬细胞模型中，通过测量Vel-IPV-hB6H12.3和SEA-Vel-IPV-hB6H12.3以及岩藻糖基化和非岩藻糖基化SEA hB6H12.3的异种移植模型中的平均肿瘤体积所得的相对抗肿瘤活性。
图41A-图41B描绘了以Vel-IPV-hB6H12.3和SEA-Vel-IPV-hB6H12.3抗体测量循环MCP-1细胞因子水平(图41A)。在SEA和无SE A Vel-IPV-hB6H12.3抗体之间进行使用Generic TAb ELISA的药物动力学分析(图41B)。
图42描绘了在用hB6H12.3(“抗CD47”)、Vel-IPV-hB6H12.3(“经掩蔽的抗CD47”)、经MMP裂解的Vel-IPV-hB6H12.3(“经MMP活化的经掩蔽的抗CD47”)或无抗体(“未经处理”)培养之后CD47阳性人类红血球的吞噬作用的测量。
图43描绘了在用Vel-IPV-Ab47(“经掩蔽的Ab47”)、经MMP裂解的Vel-IPV-Ab47(“经MMP裂解的经掩蔽的Ab47”)或无抗体(“未经处理”)培养之后圆底板中的人类红血球。
图44描绘了在用hB6H12.3、5F9或IgG1同型对照培养之后膜联蛋白V阳性细胞的测量。
图45A-图45C描绘了Vel-IPV-hB6H12.3-FITC和hB6H12.3-FITC结合至代表17个患者样品中的16个(图45A)或一个离群样品(图45B)的全血样品的测量；以及使用ELISA在用重组CD47和hB6H12.3(“外加的供体1-hB6H12.3”)或Vel-IPV-hB6H12.3(肉瘤Pt1-10)培养血浆之后获得的EC50值(图45C)。
图46A-图46B描绘了通过培养在37C下经hB6H12.3或Vel-IPV-hB6H12.3培养20小时的癌症患者全血样品诱导的代表性细胞因子产生。图46A示出了IP-10的产生并且图46B示出了IL-1RA的产生。
图47示出了来自施用hB6H12.3、Vel-IPV-hB6H12.3或hIgG1同型对照(“h00同型物”)的HT1080异种移植模型小鼠的HT1080肿瘤细胞的膜联蛋白V染色。
具体实施方式
本领域中在归档时已知的抗CD47 IgG3抗体展现毒性，例如外周红血球耗竭和血小板耗竭，这降低了所述抗体作为针对CD47相关病症(例如CD47表达癌症)的有效治疗剂的适用性。申请人已惊讶地发现可通过在肿瘤微环境的情形中不掩蔽来活化新颖的抗CD47IgG1抗体和其抗原结合片段，以使本发明的抗体和其抗原结合片段有效地特异性靶向CD47表达实体肿瘤。本文所描述的人源化抗CD47抗体和其抗原结合片段(经掩蔽或未经掩蔽)可用于治疗CD47相关病症，例如CD47表达癌症。
在某些例示性实施方案中，提供了抗体和其抗原结合片段，所述抗体和其抗原结合片段包含阻断抗体或其抗原结合片段结合至其抗原靶的可去除的掩模(例如卷曲螺旋掩模)。在某些实施方案中，可去除的掩模经由可基质金属蛋白酶(MMP)裂解的连接子序列连接至抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链中的一者或多者的N端。
在肿瘤微环境中，改变的蛋白水解导致不受调控的肿瘤生长、组织再塑、发炎、组织侵入和转移(Kessenbrock(2011)Cell 141:52)。MMP代表与肿瘤发生相关的最主要的蛋白酶家族，并且MMP在肿瘤进展期间介导微环境中的许多变化(同上)。将本发明的抗体或其抗原结合片段暴露至MMP后，裂解MMP连接子序列，由此允许去除卷曲螺旋掩模并且使得抗体或其抗原结合片段以肿瘤微环境特异性方式结合其靶抗原。
本发明的新颖的抗CD47 IgG1抗体和其抗原结合片段(经掩蔽和未经掩蔽)有利地证实相较于本领域中在归档时已知的抗CD47 IgG3抗体增加的药物动力学和减少的脱靶效应。本文所描述的新颖的人源化抗CD47抗体有利地展示以下一者或多者：1)相对于参考抗体(例如鼠类亲本抗体)增强的抗原结合；2)相对于参考抗体(例如鼠类亲本抗体)增强的抗体依赖型细胞毒性(ADCC)；3)相对于参考抗体(例如鼠类亲本抗体)增强的吞噬作用(例如，增强的抗体依赖型细胞吞噬作用(ADCP))；4)相对于参考抗体(例如鼠类亲本抗体)减少的红血球凝集(HA)；5)结合至相同三维(即非线性)CD47表位。
因此，可更容易地理解本发明，下文明确地定义某些技术和科学术语。除非本文献中另外明确定义，否则本文所使用的所有其它技术和科学术语具有本发明所属领域的一般技术人员通常所理解的含义。
I.定义
如本文(包括随附权利要求书)所使用，除非上下文清楚地另作指明，否则词语的单数形式(例如“一个”、“一种”和“所述”)包括其对应的参考物复数形式。
“抗体-药物缀合物”是指缀合至细胞毒性剂或细胞生长抑制剂的抗体。通常，抗体-药物缀合物结合至细胞表面上的靶抗原(例如CD47)，继而抗体-药物缀合物内化至细胞中并且随后将药物释放至细胞中。
“多肽”或“多肽链”是经肽键连接的氨基酸残基的聚合物(无论是天然产生还是以合成方式产生)。小于约10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。
“蛋白质”是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质还可包含非肽组分，例如碳水化合物基团。碳水化合物和其它非肽取代基可通过产生蛋白质的细胞添加至蛋白质，并且将随细胞类型而改变。本文依蛋白质的氨基酸主链结构来定义蛋白质。取代基(例如碳水化合物基团)一般是不指定的，但可能存在。
术语“氨基端”和“羧基端”表示多肽中的位置。在上下文允许的情况下，这些术语是参考多肽的特定序列或部分而使用以表示附近或相对位置。举例来说，多肽中定位至参考序列的羧基端的特定序列位于参考序列的羧基端附近，但不一定是在完整多肽的羧基端。
出于将氨基酸取代归类为保守性或非保守性的目的，以下氨基酸取代视作保守性取代：苏氨酸、丙氨酸或天冬酰胺取代丝氨酸；脯氨酸或丝氨酸取代苏氨酸；天冬氨酸、组氨酸或丝氨酸取代天冬酰胺；谷氨酸或天冬酰胺取代天冬氨酸；谷氨酰胺、赖氨酸或天冬氨酸取代谷氨酸；精氨酸、赖氨酸或谷氨酸取代谷氨酰胺；酪氨酸或天冬酰胺取代组氨酸；赖氨酸或谷氨酰胺取代精氨酸；异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸取代甲硫氨酸；亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸取代异亮氨酸；缬氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸取代亮氨酸；酪氨酸或色氨酸取代苯丙氨酸；色氨酸、组氨酸或苯丙氨酸取代酪氨酸；苏氨酸取代脯氨酸；丝氨酸取代丙氨酸；谷氨酸、谷氨酰胺或精氨酸取代赖氨酸；甲硫氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代缬氨酸；以及苯丙氨酸或酪氨酸取代色氨酸。保守性取代还可意指相同类别中的氨基酸之间的取代。类别如下：第I组(疏水性侧链)：met、ala、val、leu、ile；第II组(中性亲水性侧链)：cys、ser、thr；第III组(酸性侧链)：asp、glu；第IV组(碱性侧链)：asn、gin、his、lys、arg；第V组(影响链取向的残基)：gly、pro；以及第VI组(芳香族侧链)：trp、tyr、phe。
如果两个氨基酸序列的氨基酸残基在比对最大一致性时相同，那么这两个氨基酸序列具有“100％氨基酸序列同一性”。序列比较可使用标准软件程序(例如由DNASTAR(Madison,Wisconsin)生产的LASERGENE生物信息计算套件中所包括的那些标准软件程序)进行。本领域技术人员熟知通过确定最佳比对来比较两个核苷酸或氨基酸序列的其它方法。(参见例如Peruski和Peruski,The Internet and the New Biology:Tools forGenomic and Molecular Research(ASM Press,Inc.1997)；Wu等(编),“InformationSuperhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins”,Methods inGene Biotechnology 123-151(CRC Press,Inc.1997)；Bishop(编),Guide to HumanGenome Computing(第2版,Academic Press,Inc.1998))。如果两个序列相对于彼此具有至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％序列同一性，那么这两个氨基酸序列被视作具有“实质序列同一性”。
依Kabat编号惯例最大程度地比对抗体序列来确定序列同一性百分比。在比对后，如果比较主题抗体区域(例如，重链或轻链的整个可变结构域)与参考抗体的相同区域，那么主题抗体区域与参考抗体区域之间的序列同一性百分比是主题抗体区域和参考抗体区域中被相同氨基酸所占据的位置的数量除以两个区域的比对位置的总数(空位不计)，乘以100以换算成百分比。
“包含”一个或多个所列举要素的组合物或方法可包括未专门列举的其它要素。举例来说，包含抗体的组合物可单独地或以与其它成分组合的方式含有抗体。
值范围的表示方法包括在所述范围内或界定所述范围的所有整数。
在本文所描述的抗体或其它蛋白质中，提及的对应于由SEQ ID NO指示的那些的氨基酸残基包括此类残基的翻译后修饰。
术语“抗体”表示由身体响应抗原的存在所产生并且结合至抗原的免疫球蛋白，以及其抗原结合片段和工程改造的变体。因此，术语“抗体”包括例如完整单克隆抗体(例如，使用杂交瘤技术产生的抗体)和抗原结合抗体片段，例如F(ab')2、Fv片段、双功能抗体、单链抗体、scFv片段或scFv-Fc。还包括基因工程改造的完整抗体和片段，例如嵌合抗体、人源化抗体、单链Fv片段、单链抗体、双功能抗体、微型抗体(minibodies)、线性抗体、多价或多特异性(例如双特异性)杂交抗体等等。因此，术语“抗体”广泛用于包括包含抗体的抗原结合位点并且能够特异性结合至其抗原的任何蛋白质。
术语抗体或其抗原结合片段包括未结合(即，共价或非共价结合)至本发明的掩蔽化合物的“裸”抗体或其抗原结合片段。术语抗体还涵盖共价或非共价结合至如本文进一步描述的一种或多种掩蔽化合物(例如卷曲螺旋肽)的“经掩蔽的”抗体或其抗原结合片段。术语抗体或其抗原结合片段包括“缀合”抗体或其抗原结合片段或“抗体-药物缀合物(ADC)”，其中抗体或其抗原结合片段共价或非共价结合至药剂，例如，结合至细胞生长抑制药物或细胞毒性药物。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是任选地缀合至药剂(例如，缀合至细胞生长抑制药物或细胞毒性药物)的裸抗体或抗原结合片段。在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段是任选地缀合至药剂(例如，缀合至细胞生长抑制药物或细胞毒性药物)的经掩蔽的抗体或抗原结合片段。
术语“基因工程改造的抗体”是指氨基酸序列已从原生抗体或亲本抗体的氨基酸序列改变的抗体。可能的变异有许多，并且范围从改变仅一个或几个氨基酸至完全再设计例如可变区或恒定区。一般来说，对恒定区作改变以改善或改变特征，例如补体结合或其它效应功能。通常，对可变区作改变以改善抗原结合特征，改善可变区稳定性，和/或降低免疫原性风险。
术语“嵌合抗体”是指重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种(例如人类)或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而这个(这些)链的其余部分与来源于另一物种(例如小鼠)或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源的抗体以及此类抗体的片段，只要所述片段展示所需生物活性即可。
“抗体的抗原结合位点”是抗体的足以结合至其抗原的那个部分。通常，最小的此种区域是可变结构域或其基因工程改造的变体。单结构域结合位点可产自骆驼抗体(参见Muyldermans和Lauwereys,Mol.Recog.12:131-140,1999；Nguyen等,EMBO J.19:921-930,2000)或其它物种的VH结构域以产生单结构域抗体(“dAb”，参见Ward等,Nature 341:544-546,1989；Winter等的美国专利号6,248,516)。通常，抗体的抗原结合位点包含结合至共同表位的重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域两者。在本发明的上下文中，抗体除了抗原结合位点外还可包括一个或多个组分，例如抗体的第二抗原结合位点(其可结合至相同或不同表位或结合至相同或不同抗原)、肽连接子、免疫球蛋白恒定区、免疫球蛋白铰链、两性螺旋(参见Pack和Pluckthun,Biochem.31:1579-1584,1992)、非肽连接子、寡核苷酸(参见Chaudri等,FEBS Letters 450:23-26,1999)、细胞生长抑制药物或细胞毒性药物等等，并且可为单体或多聚体蛋白。包含抗体的抗原结合位点的分子的实例在本领域中已知并且包括例如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、双功能抗体、微型抗体、纳米抗体、Fab-scFv融合体、双特异性(scFv)4-IgG和双特异性(scFv)2-Fab。(参见例如Hu等,Cancer Res.56:3055-3061,1996；Atwell等,Molecular Immunology 33:1301-1312,1996；Carter和Merchant,Curr.Op.Biotechnol.8:449-454,1997；Zuo等,Protein Engineering13:361-367,2000；以及Lu等,J.Immunol.Methods 267:213-226,2002。)
术语“免疫球蛋白”是指由大体上由一个或多个免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽组成的蛋白质。免疫球蛋白的一种形式构成脊椎动物中原生(即，天然或亲本)抗体的基本结构单元。这种形式是四聚体并且由两对相同的免疫球蛋白链组成，每对具有一个轻链和一个重链。在每对中，轻链和重链可变区(VL和VH)共同主要负责结合至抗原，并且恒定区主要负责抗体效应功能。已在高等脊椎动物中鉴别出免疫球蛋白的五个类别(IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)。IgG构成主要类别，并且其通常呈血浆中所发现的第二丰富的蛋白质存在。在人类中，IgG由四个亚类组成，命名是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。每个免疫球蛋白重链具有由对于物种中所给亚类来说基本上不变的恒定区蛋白结构域(CH1、铰链、CH2和CH3；IgG3还含有CH4结构域)组成的恒定区。
编码人类和非人类免疫球蛋白链的DNA序列在本领域中已知。(参见例如Ellison等,DNA 1:11-18,1981；Ellison等,Nucleic Acids Res.10:4071-4079,1982；Kenten等,Proc.Natl.Acad.Set USA 79:6661-6665,1982；Seno等,Nucl.Acids Res.11:719-726,1983；Riechmann等,Nature 332:323-327,1988；Amster等,Nucl.Acids Res.8:2055-2065,1980；Rusconi和Kohler,Nature 314:330-334,1985；Boss等,Nucl.Acids Res.12:3791-3806,1984；Bothwell等,Nature 298:380-382,1982；van der Loo等,Immunogenetics 42:333-341,1995；Karlin等,J.Mol.Evol.22:195-208,1985；Kindsvogel等,DNA 1:335-343,1982；Breiner等,Gene 18:165-174,1982；Kondo等,Eur.J.Immunol.23:245-249,1993；以及GenBank寄存编号J00228。)对于免疫球蛋白结构和功能的评述，参见Putnam,The PlasmaProteins,第V卷,Academic Press,Inc.,49-140,1987；以及Padlan,Mol.Immunol.31:169-217,1994。本文中术语“免疫球蛋白”用于指其通用含义，表示完整抗体、其组分链或链的片段，视上下文而定。
全长免疫球蛋白“轻链”(约25kDa或214个氨基酸)经氨基端的可变区基因(编码约110个氨基酸)和羧基端的κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白“重链”(约50kDa或446个氨基酸)由可变区基因(编码约116个氨基酸)和γ、μ、α、δ或ε恒定区基因(编码约330个氨基酸)编码，所述γ、μ、α、δ或ε恒定区基因分别将抗体同型物定义为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区经约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，并且重链还包括多约10个氨基酸的“D”区。(一般参见Fundamental Immunology(Paul编,Raven Press,N.Y.,第2版1989),第7章)。
免疫球蛋白轻链或重链可变区(本文中也分别称为“轻链可变结构域”(“VL结构域”)或“重链可变结构域”(“VH结构域”))由间插三个“互补决定区”或“CDR”的“构架”区组成。构架区用于比对特异性结合至抗原的表位的CDR。因此，术语“CDR”是指抗体的主要负责抗原结合的氨基酸残基。从氨基端至羧基端，VL和VH结构域两者均包含以下构架(FR)区和CDR区：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
氨基酸于每个可变区结构域中的分配是依照Kabat,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987和1991)的定义。Kabat还提供了在不同重链可变区之间或在不同轻链可变区之间的对应残基被分配相同编号的广泛使用的编号惯例(Kabat编号)。本文中VL结构域的CDR 1、2和3也分别称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。本文中VH结构域的CDR 1、2和3也分别称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。如果这样指定，那么CDR的分配可依照
Figure BDA0002513470550000391
(Lefranc等,Developmental&Comparative Immunology 27:55-77；2003)，代替Kabat。
重链恒定区的编号是经由如Kabat(Kabat,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987和1991)中所陈述的EU索引。
除非上下文另作指明，否则术语“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”可包括来源于单一无性系(包括任何真核、原核或噬菌体无性系)的抗体。在特定实施方案中，本文所描述的抗体是单克隆抗体。
术语“人源化VH结构域”或“人源化VL结构域”是指包含完全或大体上来自非人类供体免疫球蛋白(例如小鼠或大鼠)的一些或所有CDR和完全或大体上来自人类免疫球蛋白序列的可变结构域构架序列的免疫球蛋白VH或VL结构域。提供CDR的非人类免疫球蛋白称为“供体”并且提供构架的人类免疫球蛋白称为“接受体”。在一些情况下，人源化抗体将在人类可变结构域构架区内保留一些非人类残基以增强适当的结合特征(例如，可需要构架中的突变以在抗体人源化时维持结合亲和性)。
“人源化抗体”是包含人源化VH结构域和人源化VL结构域中的一者或两者的抗体。一个或多个免疫球蛋白恒定区无需存在，但如果存在的话，那么其完全或大体上来自人类免疫球蛋白恒定区。
人源化抗体是基因工程改造的抗体，其中来自非人类“供体”抗体的CDR接枝至人类“接受体”抗体序列中(参见例如Queen，US 5,530,101和5,585,089；Winter，US 5,225,539；Carter，US 6,407,213；Adair，US 5,859,205；以及Foote，US 6,881,557)。接受体抗体序列可为例如成熟人类抗体序列、此类序列的复合物、人类抗体序列的共有序列或生殖区序列。可选择人类接受体序列以使可变区构架与供体序列具有高程度序列同一性，以匹配接受体CDR与供体CDR之间的典型形式和其它准则。因此，人源化抗体是CDR完全或大体上来自供体抗体和可变区构架序列并且恒定区(如果存在的话)完全或大体上来自人类抗体序列的抗体。类似地，人源化重链通常具有完全或大体上来自供体抗体重链和重链可变区构架序列的所有三个CDR以及大体上来自人类重链可变区构架和恒定区序列的重链恒定区(如果存在的话)。类似地，人源化轻链通常具有完全或大体上来自供体抗体轻链和轻链可变区构架序列的所有三个CDR以及大体上来自人类轻链可变区构架和恒定区序列的轻链恒定区(如果存在的话)。当各别CDR之间对应的残基(如依Kabat编号定义)的至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同时或其中对应的残基(如依Kabat编号定义)的约100％相同，人源化抗体中的CDR大体上来自非人类抗体中的对应的CDR。当对应的残基(可变区依Kabat编号定义并且恒定区依EU编号定义)的至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同或对应的残基(可变区依Kabat编号定义并且恒定区依EU编号定义)的约100％相同时，抗体链的可变区构架序列或抗体链的恒定区分别大体上来自人类可变区构架序列或人类恒定区。
虽然人源化抗体常常合并有来自小鼠抗体的所有六个CDR(优选如依Kabat或
Figure BDA0002513470550000401
定义)，但人源化抗体还可由来自小鼠抗体的少于所有六个CDR(例如，至少3个、4个或5个)CDR组成(例如，Pascalis等,J.Immunol.169:3076,2002；Vajdos等,Journal ofMolecular Biology,320:415-428,2002；Iwahashi等,Mol.Immunol.36:1079-1091,1999；Tamura等,Journal of Immunology,164:1432-1441,2000)。
当各别CDR之间对应的残基(如依Kabat(或IMGT)定义)的至少60％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同时，人源化抗体中的CDR“大体上来自”非人类抗体中的对应的CDR。在CDR大体上来自非人类免疫球蛋白的人源化VH或VL结构域的特定变化中，人源化VH或VL结构域的CDR相对于对应的非人类VH或VL CDR跨越所有三个CDR具有不多于六个(例如，不多于五个、不多于四个、不多于三个、不多于两个或不多于一个)氨基酸取代(优选保守性取代)。当对应的残基(可变区依Kabat编号定义并且恒定区依EU编号定义)的至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同或对应的残基(可变区依Kabat编号定义并且恒定区依EU编号定义)的约100％相同时，抗体VH或VL结构域的可变区构架序列或免疫球蛋白恒定区的序列(如果存在的话)分别“大体上来自”人类VH或VL构架序列或人类恒定区。因此，人源化抗体的所有部分(CDR除外)通常完全或大体上来自天然人类免疫球蛋白序列的对应部分。
抗体通常以经分离形式提供。这意指抗体通常为至少约50％w/w纯的从其生产或纯化中产生的干扰蛋白和其它污染物，但不排除抗体与过量的一种或多种药学可接受的载体或意图促进所述抗体的使用的其它媒剂组合的可能性。有时，抗体为至少约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％w/w纯的从生产或纯化中产生的干扰蛋白和污染物。抗体(包括经分离抗体)可缀合至细胞毒性剂并且呈抗体药物缀合物提供和/或例如经相关的卷曲螺旋掩蔽。
抗体特异性结合至其靶抗原通常是指至少约106、约107、约108、约109或约1010M-1的亲和力。特异性结合可检测更高量级并且可与对至少一个非特异性标靶发生的非特异性结合区别开。特异性结合可为在特定官能团之间形成键或特定空间装配(例如，锁匙式(lockand key type))的结果，而非特异性结合通常是范德华力(van der Waals force)的结果。
术语“表位”是指抗体所结合的抗原的位点。表位可由连续氨基酸或通过一种或多种蛋白质三级折叠并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露至变性剂(例如溶剂)后通常会保留，而由三级折叠形成的表位在用变性剂(例如溶剂)处理后通常会消失。表位通常包括呈独特空间构形的至少约3个并且更通常至少约5个、至少约6个、至少约7个或约8-10个氨基酸。确定表位的空间构形的方法包括例如x射线结晶学和二维核磁共振。参见例如Epitope Mapping Protocols,Methods in Molecular Biology,第66卷,Glenn E.Morris编(1996)。
识别相同或重叠表位的抗体可依简单的免疫测定来鉴别，所述免疫测定显示一种抗体与另一种抗体竞争结合至靶抗原的能力。抗体的表位还可通过抗体结合至其抗原的X射线结晶学以鉴别接触残基来定义。
或者，如果降低或消除一种抗体的结合的抗原中的所有氨基酸突变会降低或消除另一种抗体的结合(限制条件为此类突变不产生抗原结构的全局变化)，那么两种抗体具有相同表位。如果降低或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变会降低或消除另一种抗体的结合，那么两种抗体具有重叠表位。
抗体之间的竞争可通过其中测试抗体抑制参考抗体特异性结合至共同抗原的测定来确定(参见例如Junghans等,Cancer Res.50:1495,1990)。如果过量的测试抗体抑制参考抗体的结合，那么测试抗体与参考抗体竞争。
通过竞争测定所鉴别的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合至相同表位的抗体和结合至足够接近参考抗体所结合的表位的相邻表位以产生立***阻的抗体。通过竞争测定所鉴别的抗体还包括通过引起靶蛋白构形改变，从而防止参考抗体结合至与测试抗体所结合的表位不同的表位而与参考抗体间接竞争的那些抗体。
抗体效应功能是指由Ig的Fc区贡献的功能。此类功能可为例如抗体依赖型细胞毒性(ADCC)、抗体依赖型细胞吞噬作用(ADCP)或补体依赖型细胞毒性(CDC)。此类功能可通过例如使Fc区结合至具有吞噬或溶解活性的免疫细胞上的Fc受体或通过使Fc区结合至补体***的组分来实现。通常，由Fc结合细胞或补体组分介导的一种或多种效应导致CD47靶向细胞的抑制和/或耗竭。抗体的Fc区可募集Fc受体(FcR)表达细胞并且将其与涂覆抗体的靶细胞并列。表达用于IgG的表面FcR(包括FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD64))的细胞可充当用于破坏涂覆IgG的细胞的效应细胞。此类效应细胞包括单核细胞、巨噬细胞、天然杀手(NK)细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。IgG与FcγR接合会活化ADCC或ADCP。ADCC是由CD16+效应细胞经由分泌膜孔形成蛋白和蛋白酶介导，而吞噬作用是由CD32+和CD64+效应细胞介导(参见Fundamental Immunology,第4版,Paul编,Lippincott-Raven,N.Y.,1997,第3章、第17章和第30章；Uchida等,J.Exp.Med.199:1659-69,2004；Akewanlop等,Cancer Res.61:4061-65,2001；Watanabe等,Breast Cancer Res.Treat.53:199-207,1999)。
除了ADCC和ADCP以外，细胞结合的抗体的Fc区还可活化补体传统路径以引起CDC。在抗体与抗原复合时，补体***的C1q结合至抗体的Fc区。C1q结合至细胞结合的抗体可引发涉及C4和C2蛋白水解活化以产生C3转化酶的一连串事件。C3经C3转化酶裂解为C3b能够活化末端补体组分，包括C5b、C6、C7、C8和C9。这些蛋白质共同地在涂覆抗体的细胞上形成膜攻击(membrane-attack)复杂孔。这些孔破坏细胞膜完整性，杀死靶细胞(参见Immunobiology,第6版,Janeway等,Garland Science,N.Y.,2005,第2章)。
术语“抗体依赖型细胞毒性”或“ADCC”是指用于诱导细胞死亡的机制，其取决于涂覆抗体的靶细胞与具有溶解活性的免疫细胞(也称为效应细胞)的相互作用。此类效应细胞包括天然杀手细胞、单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞经由其抗原组合位点连接至Ig的结合至靶细胞的Fc区。涂覆抗体的靶细胞的死亡因效应细胞活性而发生。在某些例示性实施方案中，本发明的抗CD47 IgG1抗体介导相对于亲本抗体和/或相对于抗CD47IgG3抗体同等或增加的ADCC。
术语“抗体依赖型细胞吞噬作用”或“ADCP”是指涂覆抗体的细胞由结合至Ig的Fc区的吞噬免疫细胞(例如，由巨噬细胞、嗜中性粒细胞和/或树突细胞)完全或部分内化的过程。在某些例示性实施方案中，本发明的抗CD47 IgG1抗体介导相对于亲本抗体和/或相对于抗CD47 IgG3抗体同等或增加的ADCP。
术语“补体依赖型细胞毒性”或“CDC”是指用于诱导细胞死亡的机制，其中标靶结合的抗体的Fc区活化一系列酶反应，使靶细胞膜中的孔的形成达到最佳。
通常，抗原-抗体复合物(例如在涂覆抗体的靶细胞上的那些)结合并活化补体组分C1q，继而活化补体级联，导致靶细胞死亡。补体的活化还可导致补体组分沉积于靶细胞表面上，这通过结合白血球上的补体受体(例如CR3)而促进ADCC。
“细胞毒性效应”是指靶细胞的耗竭、消除和/或杀死。“细胞毒性剂”是指对细胞具有细胞毒性效应，从而介导靶细胞的耗竭、消除和/或杀死的化合物。在某些实施方案中，细胞毒性剂缀合至抗体或以与抗体组合方式施用。本文进一步描述适合的细胞毒性剂。
“细胞生长抑制效应”是指细胞增殖的抑制作用。“细胞生长抑制剂”是指对细胞具有细胞生长抑制效应，从而介导特定细胞类型和/或细胞亚组的生长和/或扩充的抑制作用的化合物。本文进一步描述适合的细胞生长抑制剂。
本文中术语“表达单元”和“表达盒”可互换使用并且表示编码所关注多肽的核酸区段并且在宿主细胞中能够提供核酸区段的表达。表达单元通常包含转录启动子、编码所关注多肽的开放阅读框架和以可操作方式连接的转录终止子。除了转录启动子和终止子以外，表达单元还可包括其它核酸区段，例如增强子或聚腺苷酸化信号。
术语“表达载体”是指包含一个或多个表达单元的线性或环状核酸分子。除了一个或多个表达单元以外，表达载体还可包括额外核酸区段，例如一个或多个复制起点或一个或多个可选择标记物。
表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或可含有两者的元件。
术语“患者”或“受试者”包括接受预防性或治疗性处理中任一者的人类和其它哺乳动物受试者，例如非人类的灵长类动物、兔、大鼠、小鼠等等和它们的转基因物种。在某些例示性实施方案中，受试者是罹患或处在发展癌症(例如实体肿瘤)风险中的人类患者，癌症任选地分泌能够裂解本文所描述的抗CD47抗体的掩蔽结构域(例如卷曲螺旋掩蔽结构域)的一种或多种蛋白酶。
在通过施用如本文所描述的抗CD47抗体治疗CD47表达病症的情形中，术语“有效量”是指此种抗体足以抑制CD47相关病症(例如CD47表达癌症)的一种或多种症状发生或改善所述一种或多种症状的量。抗体的有效量以“有效疗法”方式施用。术语“有效疗法”是指足够达成病症的预防性或治疗性处理(例如CD47表达癌症的预防性或治疗性处理)的所施用抗体的量与给药频率的组合。
术语“药学上可接受”意指由联邦或州政府的管理机构已核准或可核准或在美国药典或用于动物中并且更特别地用于人类中的其它普遍公认的药典中列出的。术语“药学上相容的成分”是指与抗CD47抗体一起配制的药学上可接受的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。
短语“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的有机或无机盐。例示性盐包括硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1,1'-亚甲基双-(2-羟基-3-萘酸盐)。药学上可接受的盐还可包含额外分子，例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子。抗衡离子可为稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可具有超过一个带电原子。多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的情况可具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
除非上下文另外显而易见，否则当值以“约”X或“近似”X表示时，所叙述的X值应理解为精确至±10％。
在本发明的情形中，溶剂化物是本发明的化合物经由与溶剂分子配位而形成固态或液态的复合物的那些形式。水合物是溶剂化物的一种特定形式，其中所述配位是利用水进行。在某些例示性实施方案中，在本发明的情形中，溶剂化物是水合物。
术语“血球凝集”是指红血球聚集在一起的过程。血球凝集是本领域中抗CD47抗体的已知的不合需要的副作用。本发明的人源化抗CD47抗体任选地介导相对于鼠类亲本抗CD47抗体和/或相对于本领域中已知的一种或多种抗CD47抗体减少的血球凝集。
II.抗CD47抗体和抗原结合片段
本发明提供了经分离的重组和/或合成抗CD47人类、灵长类、啮齿动物、哺乳动物、嵌合、人源化和/或CDR接枝型抗体和其抗原结合片段，以及包含编码一个抗CD47抗体分子的至少一部分的至少一个多核苷酸的组合物和核酸分子。本发明还包括但不限于制造和使用此类核酸和抗体的方法，包括诊断性和治疗性组合物、方法和装置。在某些例示性实施方案中，提供了人源化抗CD47 IgG1抗体。在其它例示性实施方案中，提供了经掩蔽的人源化抗CD47 IgG1抗体。在其它例示性实施方案中，提供了包含短氨基酸残基的人源化抗CD47IgG1抗体。
在本发明的特定实施方案中，提供了人源化抗CD47抗体，其具有以下活性中的一种或多种：1)相对于参考抗体(例如鼠类亲本抗体)增强的抗原结合；2)相对于参考抗体(例如鼠类亲本抗体)增强的抗体依赖型细胞毒性(ADCC)；3)相对于参考抗体(例如鼠类亲本抗体)增强的吞噬作用(例如抗体依赖型细胞吞噬作用(ADCP))；4)相对于参考抗体(例如鼠类亲本抗体)减少的红血球凝集(HA)；5)结合至三维(即，非线性)CD47表位。
本发明的例示性抗CD47抗体和其抗原结合片段包括以下CD47抗体重链/轻链对：hB6H12.1-hvH1/hvK1；hB6H12.2-hvH1/hvK2；hB6H12.3-hvH1/hvK3；hB6H12.4-hvH1/hvK4；hB6H12.5-hvH2/hvK1；hB6H12.6-hvH2/hvK2；hB6H12.7-hvH2/hvK3；hB6H12.8-hvH2/hvK4；hB6H12.9-hvH3/hvK1；hB6H12.10-hvH3/hvK2；hB6H12.11-hvH3/hvK3；hB6H12.12-hvH3/hvK4；hB6H12.13-hvH4/hvK1；hB6H12.14-hvH4/hvK2；hB6H12.15-hvH4/hvK3；hB6H12.16-hvH4/hvK4；hB6H12.17-hvH5/hvK1；hB6H12.18-hvH5/hvK2；hB6H12.19-hvH5/hvK3；hB6H12.20-hvH5/hvK4；hB6H12.21-hvH6/hvK1；hB6H12.22-hvH6/hvK2；hB6H12.23-hvH6/hvK3；hB6H12.24-hvH6/hvK4；hB6H12.3(脱酰胺突变体)-hvH1/hvK3 G91A；Ab47-HV3-7/HJ4/KV3D-11/KJ1；以及mB6H12-vH1/vL。例示性抗CD47抗体重链可变区序列、轻链可变区、重链CDR和轻链CDR可见于表1-表6。例示性人源化抗CD47抗体的重链和轻链的氨基酸序列可见于表7。
表1.来源于鼠类B6H12抗体的重链可变序列。Kabat CDR加下划线，并且IMGT CDR为粗体。
Figure BDA0002513470550000471
Figure BDA0002513470550000481
表2.来源于鼠类B6H12抗体的轻链可变序列。Kabat CDR加下划线，并且IMGT CDR为粗体。
Figure BDA0002513470550000482
Figure BDA0002513470550000491
表3.变体抗体的重链CDR序列(Kabat)。
Figure BDA0002513470550000492
Figure BDA0002513470550000501
表4.变体抗体的重链CDR序列(IMGT)。
Figure BDA0002513470550000502
表5.变体抗体的轻链CDR序列(Kabat)。
CDR 序列
hvK1-hvK3 LCDR1(Kabat) RASQTISDYLH(SEQ ID NO:31)
hvK1-hvK3 LCDR2(Kabat) FASQSIS(SEQ ID NO:32)
hvK1-hvK4 LCDR3(Kabat) QNGHGFPRT(SEQ ID NO:33)
hvK4 LCDR1(Kabat) RASQTISNYLA(SEQ ID NO:34)
hvK4 LCDR2(Kabat) FASTLQS(SEQ ID NO:35)
hvK3(G91A)LCDR3(Kabat) QNAHGFPRT(SEQ ID NO:36)
表6.变体抗体的轻链CDR序列(IMGT)。
CDR 序列
hvK1-hvK3 LCDR1(IMGT) QTISDY(SEQ ID NO:37)
hvK1-hvK4 LCDR2(IMGT) FAS(SEQ ID NO:38)
hvK1-hvK4 LCDR3(IMGT) QNGHGFPRT(SEQ ID NO:39)
hvK4 LCDR1(IMGT) QTISNY(SEQ ID NO:40)
hvK3(G91A)LCDR3(IMGT) QNAHGFPRT(SEQ ID NO:41)
表7.根据本发明的一个优选实施方案的经掩蔽的抗CD47抗体的完整重链和轻链序列。重链和轻链序列为纯文本(分别是SEQ ID NO:42和43)，掩蔽序列为粗体文本，并且蛋白酶裂解序列加下划线。
Figure BDA0002513470550000503
Figure BDA0002513470550000511
hB6H12.1
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:3所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:11所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16、17和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:25、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:11。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:3具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:11具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.2
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:3所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:12所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16、17和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:25、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:12。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:3具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:12具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.3
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:3所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:13所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16、17和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:25、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:13。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:3具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:13具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.4
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:3所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:14所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16、17和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:34、35和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:25、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:40、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:14。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:3具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:14具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.5
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:4所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:11所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:19、20和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:28、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:11。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:4具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:11具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.6
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:4所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:12所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:19、20和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:28、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:12。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:4具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:12具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.7
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:4所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:13所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:19、20和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:28、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:13。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:4具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:13具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.8
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:4所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:14所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:19、20和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:34、35和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:28、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:40、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:14。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:4具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:14具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.9
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:5所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:11所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:19、20和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:28、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:11。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:5具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:11具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.10
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:5所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:12所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:19、20和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:28、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:12。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:5具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:12具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.11
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:5所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:13所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:19、20和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:28、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:13。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:5具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:13具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.12
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:5所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:14所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:19、20和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:34、35和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:28、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:40、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:14。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:5具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:14具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.13
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:6所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:11所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:21、22和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:29、30和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:6/SEQ ID NO:11。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:6具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:11具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.14
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:6所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:12所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:21、22和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:29、30和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:6/SEQ ID NO:12。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:6具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:12具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.15
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:6所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:13所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:21、22和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:29、30和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:6/SEQ ID NO:13。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:6具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:13具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.16
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:6所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:14所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:21、22和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:34、35和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:29、30和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:40、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:6/SEQ ID NO:14。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:6具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:14具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.17
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:7所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:11所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16、20和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:25、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:11。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:7具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:11具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.18
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:7所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:12所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16、20和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:25、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:12。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:7具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:12具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.19
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:7所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:13所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16、20和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:25、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:13。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:7具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:13具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.20
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:7所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:14所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16、20和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:34、35和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:25、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:40、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:14。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:7具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:14具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.21
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:8所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:11所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:23、24和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:29、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:11。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:8具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:11具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.22
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:8所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:12所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:23、24和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:29、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:12。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:8具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:12具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.23
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:8所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:13所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:23、24和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:29、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:13。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:8具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:13具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.24
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:8所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:14所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:23、24和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:34、35和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:29、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:40、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:14。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:8具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:14具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
hB6H12.3 G91A
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:3所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:15所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16、17和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:34、35和36的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:25、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:40、38和41的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:15。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:3具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:15具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
Ab47
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:2所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:10所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16、17和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:25、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:10。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:2具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQID NO:10具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
mB6H12
在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含来自以SEQ ID NO:1所列的HCVR的CDR和/或来自以SEQ ID NO:9所列的LCVR的CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16、17和18的重链CDR和/或SEQ ID NO:31、32和33的轻链CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:25、26和27的重链CDR和/或SEQ ID NO:37、38和39的轻链CDR。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR对SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:9。在其它实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:1具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的HCVR和/或包含与SEQ IDNO:9具有至少约80％同源性或同一性(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的LCVR。
本文所描述的抗CD47抗体和其抗原结合片段可依修饰形式表达。举例来说，可将额外氨基酸(特别是带电氨基酸)的区域添加至抗CD47抗体或其抗原结合片段的N端以改善在宿主细胞中于纯化期间或于随后的处理和储存期间的稳定性和持续性。此外，可将肽部分添加至本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段以有助于纯化。此类区域可在最后制备抗体分子或其至少一个片段之前去除。此类方法在许多标准实验室手册中描述，例如Sambrook,同上；Ausubel等编,Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2001)。
本文所描述的抗CD47抗体或其抗原结合片段通常以≦1μM，例如，≦100nM，优选≦10nM，并且更优选≦1nM的平衡结合常数结合CD47，如使用标准结合测定(例如基于Biacore的结合测定)测量。
本发明的抗体分子可相对于参考抗CD47抗体(例如，B6H12、2D3、MABL、CC2C6或BRIC126)来表征。抗体B6H12在例如美国专利号5,057,604和9,017,675中描述，可购自Abcam,PLC,Santa Cruz Biotechnology,Inc.和eBioscience,Inc。
糖基化变体
抗CD47抗体和其抗原结合片段可在其恒定区中的保守位置糖基化(Jefferis和Lund,(1997)Chem.Immunol.65:111-128；Wright和Morrison,(1997)TibTECH 15:26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质的功能(Boyd等,(1996)Mol.Immunol.32:1311-1318；Wittwe和Howard,(1990)Biochem.29:4175-4180)和糖蛋白的部分之间的分子内相互作用，所述相互作用可影响糖蛋白的构形并且呈现糖蛋白的三维表面(Jefferis和Lund,同上；Wyss和Wagner,(1996)Current Op.Biotech.7:409-416)。寡糖还可用于基于特定识别结构将所给糖蛋白靶向某些分子。举例来说，已报告在非半乳糖基化IgG中，寡糖部分从CH2间空间中“翻”出来并且末端N-乙酰氨基葡萄糖残基变得可结合甘露糖结合蛋白(Malhotra等,(1995)Nature Med.1:237-243)。从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中所产生的CAMPATH-1H(识别人类淋巴细胞的CDw52抗原的重组人源化鼠类单克隆IgG1抗体)去除寡糖的糖肽酶导致补体介导的溶解(CMCL)的完全减少(Boyd等,(1996)Mol.Immunol.32:1311-1318)，而使用神经胺糖酸酶选择性去除唾液酸残基未导致DMCL损失。还已报告抗体的糖基化会影响抗体依赖型细胞毒性(ADCC)。特别地，报告由四环素调节α(1,4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)(一种催化平分型GlcNAc的形成的糖基转移酶)的表达的CHO细胞具有改善的ADCC活性(Umana等,(1999)Mature Biotech.17:176-180)。
抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接。N-连接是指将碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为任何氨基酸，脯氨酸除外)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链进行酶连接的识别序列。因此，这些三肽序列中任一者在多肽中的存在均创造潜在糖基化位点。O-连接糖基化是指将糖N-乙酰氨基半乳糖、半乳糖或木糖中的一者连接至羟氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但还可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
抗体的糖基化变体是抗体的糖基化模式改变的变体。改变意指删除抗体中所发现的一个或多个碳水化合物部分，将一个或多个碳水化合物部分添加至抗体，改变糖基化的组成(糖基化模式)、糖基化的程度等等。
糖基化位点添加至抗CD47抗体或其抗原结合片段可通过改变氨基酸序列使其含有上述三肽序列(提供N-连接糖基化位点)中的一者或多者来达成。改变还可通过在原始抗体序列上添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或被所述残基取代(提供O-连接糖基化位点)来实现。类似地，糖基化位点的去除可通过在抗体的原生糖基化位点内的氨基酸改变来达成。
氨基酸序列通常通过改变基本核酸序列而改变。这些方法包括从天然来源分离(在天然产生的氨基酸序列变体的情况下)，或通过对初期制备的抗体的变体或非变体型式进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变而制备。
还可改变抗体的糖基化(包括糖基化模式)而不改变氨基酸序列或基本核苷酸序列。糖基化主要取决于用于表达抗体的宿主细胞。由于用于表达作为潜在治疗剂的重组糖蛋白(例如抗体)的细胞类型很少为原生细胞，因此可预期抗体的糖基化模式显著改变。参见例如Hse等,(1997)J.Biol.Chem.272:9062-9070。除了宿主细胞的选择以外，在重组产生抗体期间影响糖基化的因素包括生长模式、培养基配制、培养密度、氧合、pH值、纯化方案等等。已提出多种方法以改变在特定宿主生物体中达成的糖基化模式，包括引入或过度表达涉及寡糖产生的某些酶(美国专利号5047335；5510261；5278299)。糖基化或某些类型的糖基化可例如使用糖苷内切酶H(Endo H)从糖蛋白酶促去除。另外，重组宿主细胞可经过基因工程改造，例如，造成在处理某些类型的多糖中有缺陷。本领域中熟知这些和类似技术。
抗体的糖基化结构可通过使用高pH值阴离子交换色谱法基于电荷分离寡糖的常规碳水化合物分析技术(包括凝集素色谱法、NMR、质谱法、HPLC、GPC、单糖组成分析、连续酶消化和HPAEC-PAD)轻易地分析。用于释放寡糖以达成分析目的的方法也是已知的，并且包括但不限于酶处理(通常使用肽-N-糖苷酶F/内-β-半乳糖苷酶进行)、使用苛刻碱性环境以主要释放O-连接结构的消除，以及使用无水肼释放N-连接和O-连接寡糖两者的化学方法。
抗体的糖基化修饰的一种优选形式是减少的核心岩藻糖基化。“核心岩藻糖基化”是指在N-连接多糖的还原端将岩藻糖(“岩藻糖基化”)添加至N-乙酰氨基葡萄糖(“GlcNAc”)。
“复合物N-糖苷-连接糖链”通常结合至天冬酰胺297(依Kabat编号)。如本文所使用，复合物N-糖苷-连接糖链具有双触复合糖链，其主要具有以下结构：
Figure BDA0002513470550000691
其中+/-指示糖分子可存在或不存在，并且编号指示糖分子之间的连接位置。在上述结构中，结合至天冬酰胺的糖链末端称为还原端(在右侧)，并且相对侧称为非还原端。岩藻糖通常经α1,6键(GlcNAc的6-位置连接至岩藻糖的1-位置)结合至还原端的N-乙酰氨基葡萄糖(“GlcNAc”)。“Gal”是指半乳糖，并且“Man”是指甘露糖。
“复合物N-糖苷-连接糖链”包括1)复合型，其中核心结构的非还原端侧具有半乳糖-N-乙酰氨基葡萄糖(也称为“gal-GlcNAc”)的一个或多个分支并且Gal-GlcNAc的非还原端侧任选地具有唾液酸、平分型N-乙酰氨基葡萄糖等等；或2)杂交型，其中核心结构的非还原端侧具有高甘露糖N-糖苷-连接糖链和复合物N-糖苷-连接糖链的两个分支。
在一些实施方案中，“复合物N-糖苷-连接糖链”包括复合型，其中核心结构的非还原端侧具有半乳糖-N-乙酰氨基葡萄糖(也称为“gal-GlcNAc”)的零个、一个或多个分支并且Gal-GlcNAc的非还原端侧任选地还具有例如唾液酸、平分型N-乙酰氨基葡萄糖等结构。
根据本发明方法，人源化、嵌合或镶嵌SG16.17或SG16.45抗体的一个或多个复合物N-糖苷-连接糖链中通常仅并入少量的岩藻糖。举例来说，在各种实施方案中，抗体的分子的小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％或小于约3％具有由岩藻糖所致的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体的分子的约2％具有由岩藻糖所致的核心岩藻糖基化。
在某些实施方案中，一个或多个复合物N-糖苷-连接糖链中仅并入少量的岩藻糖类似物(或岩藻糖类似物的代谢物或产物)。举例来说，在各种实施方案中，人源化、嵌合或镶嵌SG16.17或SG16.45抗体的小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％或小于约3％具有由岩藻糖类似物或岩藻糖类似物的代谢物或产物所致的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，人源化、嵌合或镶嵌SG16.17抗体的约2％具有由岩藻糖类似物或岩藻糖类似物的代谢物或产物所致的核心岩藻糖基化。
通过用岩藻糖类似物孵育产生抗体的细胞来制造非岩藻糖基化抗体的方法在例如WO2009/135181中描述。简单地说，在岩藻糖类似物或岩藻糖类似物的细胞内代谢物或产物存在下孵育已经过工程改造以表达人源化、嵌合或镶嵌SG16.17抗体的细胞。细胞内代谢物可为例如GDP修饰的类似物或完全或部分去酯化的类似物。产物可为例如完全或部分去酯化的类似物。在一些实施方案中，在岩藻糖补救路径中岩藻糖类似物可抑制一种或多种酶。举例来说，岩藻糖类似物(或岩藻糖类似物的细胞内代谢物或产物)可抑制岩藻糖激酶或GDP-岩藻糖-焦磷酸化酶的活性。在一些实施方案中，岩藻糖类似物(或岩藻糖类似物的细胞内代谢物或产物)抑制岩藻糖转移酶(优选1,6-岩藻糖转移酶，例如，FUT8蛋白)。在一些实施方案中，岩藻糖类似物(或岩藻糖类似物的细胞内代谢物或产物)可抑制岩藻糖重新合成路径中酶的活性。举例来说，岩藻糖类似物(或岩藻糖类似物的细胞内代谢物或产物)可抑制GDP-甘露糖4,6-脱水酶和/或GDP-岩藻糖合成酶的活性。在一些实施方案中，岩藻糖类似物(或岩藻糖的细胞内代谢物或产物)可抑制岩藻糖转运体(例如，GDP-岩藻糖转运体)。
在一个实施方案中，岩藻糖类似物是2-氟岩藻糖。将岩藻糖类似物用于生长培养基和其它岩藻糖类似物中的方法在例如WO/2009/135181中公开，所述文献以引用的方式并入本文中。
用于对细胞系进行工程改造以减少核心岩藻糖基化的其它方法包括基因剔除、基因敲入和RNA干扰(RNAi)。在基因剔除中，编码FUT8(α1,6-岩藻糖转移酶)的基因失活。FUT8催化岩藻糖基残基从GDP-岩藻糖转移至N-聚糖的Asn-连接(N-连接)GlcNac的位置6。报告FUT8是负责将岩藻糖添加至Asn297的N-连接双触碳水化合物的唯一酶。基因敲入添加编码酶，例如GNTIII或Golgiα甘露糖苷酶II的基因。细胞中此类酶的水平增加会产生来自岩藻糖基化路径(导致核心岩藻糖基化减少)并且具有增加量的平分型N-乙酰氨基葡萄糖的单克隆抗体。RNAi通常还靶向FUT8基因表达，导致降低的mRNA转录物水平或完全剔除基因表达。这些方法中的任一方法可用于生成能够产生非岩藻糖基化抗体(例如，人源化、嵌合或镶嵌SG16.17抗体)的细胞系。
许多方法可用于确定抗体上岩藻糖基化的量。方法包括例如经由PLRP-S色谱法和电喷雾电离四极TOF MS的LC-MS。
卷曲螺旋掩蔽剂
在本发明的某些实施方案中，抗CD47抗体或其抗原结合片段与防止抗CD47抗体或其抗原结合片段结合至CD47的卷曲螺旋掩蔽剂(也称为“卷曲螺旋掩蔽结构域”或“掩蔽结构域”)缔合。在各种实施方案中，与掩蔽结构域缔合的抗CD47抗体或其抗原结合片段称为“经掩蔽的抗体”。
卷曲螺旋是蛋白质和肽中的结构基序，其中两个或更多个α-螺旋彼此缠绕形成超螺旋。卷曲螺旋束中可存在两个、三个或四个螺旋并且所述螺旋可沿相同(平行)方向或沿相反(反平行)方向运行。
卷曲螺旋通常包含三个和四个残基的序列元件，其疏水性模式和残基组成与两性α-螺旋的结构相容。交替的三个和四个残基序列元件构成七联体重复序列，其中氨基酸命名为‘a’、‘b’、‘c’、‘d’、‘e’、‘f’和‘g’。在位置‘a’和‘d’中的残基一般是疏水性的并且形成杵和臼的锯齿形模式，杵和臼与另一股上的类似模式互锁形成紧密配合的疏水性核心。在剩余的残基中，‘b’、‘c’和‘f’易于带电。因此，七联体重复序列的形成取决于特定位置处所需的疏水性和电荷的物理特性，而非特定氨基酸。在某些例示性实施方案中，本发明的卷曲螺旋由两个卷曲螺旋形成肽形成。
卷曲螺旋形成肽中的七联体重复序列的共同式的实例由W02011034605提供，所述文献出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
下文列出根据某些实施方案的例示性共同式：
式1：(X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7)n，其中：
X1为疏水性氨基酸或天冬酰胺；
X2、X3和X6为任何氨基酸；
X4为疏水性氨基酸；
X5和X7各自为带电氨基酸残基；并且
n为正整数。
式2：(X1'、X2'、X3'、X4'、X5、X6、X7)n，其中：
X1'为疏水性氨基酸或天冬酰胺；
X2'、X'3和X'6各自为任何氨基酸残基；
X4'为疏水性氨基酸；
X5'和X7'各自为带电氨基酸残基；
其中式1和式2中的n大于或等于2；并且
n为正整数。
在式1和式2的肽形成卷曲螺旋的某些实施方案中，式1的X5与式2的X'7带相反电荷，并且式1的X7与式2的X'5带相反电荷。依照式1和/或2，卷曲螺旋形成肽中的七联体重复序列可彼此相同或不同。
卷曲螺旋可为同源二聚或异源二聚的。可形成根据某些例示性实施方案的卷曲螺旋的肽的实例示于表8中。肽序列可按原样使用，或其组分可以其它组合方式使用。举例来说，Vel卷曲螺旋形成肽可与其它连接子序列一起使用。轻链的所示序列还可与重链一起使用，反之亦然。
在某些例示性实施方案中，提供了包含两个轻链和重链对的二价抗体，其中轻链和/或重链中的一者或多者的N端经由包含蛋白酶裂解位点的连接子连接至卷曲螺旋形成肽，所述卷曲螺旋形成肽缔合形成卷曲螺旋，降低轻链和重链对对标靶的结合亲和力。任选地，所述肽缔合而不形成二硫键。
任选地，两个轻链和重链对是相同的。任选地，两个轻链和重链对是不同的。任选地，轻链包括轻链可变区和轻链恒定区并且重链包括重链可变区和重链恒定区。任选地，重链区包括CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。任选地，两个轻链连接至第一异源肽并且两个重链连接至第二异源肽。
任选地，蛋白酶裂解位点是MMP1或MMP2裂解位点。
任选地，标靶是CD47。
任选地，因掩蔽剂(例如，卷曲螺旋掩蔽剂)的存在使抗原结合降低至少100倍。任选地，因掩蔽剂(例如，卷曲螺旋掩蔽剂)的存在使抗原结合降低200-1500倍。任选地，因掩蔽剂(例如，卷曲螺旋掩蔽剂)的存在使缀合物的细胞毒性减小至少100倍。任选地，因掩蔽剂(例如，卷曲螺旋掩蔽剂)的存在使缀合物的细胞毒性减小至少200-1500倍。
任选地，卷曲螺旋形成肽以相同取向连接至重链和轻链的N端。任选地，卷曲螺旋形成肽以相反取向连接至重链和轻链的N端。任选地，卷曲螺旋形成肽的多个拷贝以串接方式连接至重链和轻链的N端。
根据本发明的某些实施方案的例示性卷曲螺旋形成肽连接子和蛋白酶位点示于图34中。
根据某些例示性实施方案，使用包含SEQ ID NO:51(表8中的Vel LC)或由其组成的肽以提供包括蛋白酶裂解位点和连接至轻链N端的卷曲螺旋形成肽的连接子，并且使用序列SEQ ID NO:50(表8中的Vel HC)的肽以提供包括蛋白酶裂解位点和连接至重链N端的卷曲螺旋形成肽的连接子，或反之亦然。包含这些序列的肽可连接至本文所公开的抗体中的任一者。
在某些例示性实施方案中，形成卷曲螺旋的变体肽中的氨基酸取代是保守性取代。在其它例示性实施方案中，重复七联体模式保留在变体肽中，由此卷曲螺旋形成肽可细分为连续的七联体区段，其依照由氨基酸类型将式(例如式1和/或式2)中氨基酸占据位置分类的所述式。在某些实施方案中，每个七联体的氨基酸中存在不超过1个或2个取代，并且任何此类取代是保守的。在其它实施方案中，变体与本文所描述的卷曲螺旋形成肽可具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且能够形成卷曲螺旋。
形成卷曲螺旋的例示性肽在表8A和表8B中列出。
表8A.根据某些例示性实施方案的掩蔽结构域序列。裂解序列加下划线。
Figure BDA0002513470550000751
Figure BDA0002513470550000761
表8B.根据某些例示性实施方案的掩蔽结构域序列。裂解序列加下划线。包括EAC残基。
Figure BDA0002513470550000762
连接子和裂解位点
在本发明的某些实施方案中，使用连接子以将卷曲螺旋掩蔽剂结合至抗CD47抗体或其抗原结合片段。连接子可为常规上用作用于接合肽结构域的连接子的氨基酸的任何区段。适合的连接子的长度可改变，例如1-20个、2-15个、3-12个、4-10个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。一些此类连接子包括聚甘氨酸的区段。一些此类连接子包括一个或多个丝氨酸残基，常常在甘氨酸残基两侧的位置。其它连接子包括一个或多个丙氨酸残基。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，并且因此能够充当组件之间的中性系链。甘氨酸相比甚至丙氨酸进入显著更多的phi-psi空间，并且相比具有更长侧链的残基受限小得多(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。一些例示性连接子呈S(G)nS形式，其中n为5-20。其它例示性连接子为(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n[(GSGGS)为SEQ ID NO:59)和(GGGS)n[(GGGS)为SEQ ID NO:60)，其中n为至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域中已知的其它柔性连接子。连接子的一些实例为Ser-(Gly)10-Ser(SEQ ID NO:61)、Gly-Gly-Ala-Ala(SEQ ID NO:62)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:63)、Leu-Ala-Ala-Ala-Ala(SEQ ID NO:64)、Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:65)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:66)、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:67)、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:68)、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(SEQID NO:69)、Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO:70)等等。
蛋白酶位点优选地由细胞外表达的蛋白酶识别并裂解，因此所述蛋白酶位点接触经掩蔽的抗体，释放经掩蔽的抗体并且允许所述抗体接触其抗原，例如受体细胞外结构域或可溶性配体。若干基质金属蛋白酶位点(MMP1-28)是适合的。MMP在组织再塑中发挥作用并且与肿瘤性过程(例如形态发生、血管生成和转移)相关。一些例示性蛋白酶位点是PLG-XXX(SEQ ID NO:71)(MMP的熟知内源性序列)、PLG-VR(SEQ ID NO:72)(W02014193973)和IPVSLRSG(SEQ ID NO:73)(Turk等,Nat.Biotechnol.,2001,19,661-667)、LSGRSDNY(SEQID NO:74)(Cytomyx)和GPLGVR(SEQ ID NO:57)(Chang等,Clin.Cancer Res.2012年1月1日；18(1):238-47)。MMP的额外实例在US 2013/0309230、WO 2009/025846、WO 2010/081173、WO 2014/107599、WO 2015/048329、US 20160160263以及Ratnikov等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,111:E4148-E4155(2014)中提供。
表9.蛋白酶裂解序列。MMP裂解位点由*指示，而uPA/间质蛋白酶/豆蛋白酶裂解位点由**指示。
裂解位点名称 序列
M2 GPLG*VR**(SEQ ID NO:57)
IPV IPVS*LR**SG(SEQ ID NO:58)
将卷曲螺旋掩蔽剂连接至抗CD47抗体
卷曲螺旋形成肽经由包括蛋白酶位点的连接子连接至抗体可变区的N端。典型抗体包含重链和轻链可变区，在这种情况下，将卷曲螺旋形成肽连接至每一者的N端。二价抗体具有两个结合位点，所述结合位点可能相同或可能不相同。在正常单特异性抗体中，结合位点是相同的并且所述抗体具有两个相同的轻链和重链对。在这种情况下，将每个重链连接至相同的卷曲螺旋形成肽并且每个轻链连接至相同的卷曲螺旋形成肽(其与连接至重链的肽可能相同或可能不相同)。在双特异性抗体中，结合位点是不同的并且由两个不同的重链和轻链对形成。在这种情况下，一个结合位点的重链和轻链可变区分别连接至卷曲螺旋形成肽，另一个结合位点的重链和轻链可变区也如此。通常，两个重链可变区连接至相同类型的卷曲螺旋形成肽，两个轻链可变区也如此。
卷曲螺旋形成肽可经由包括蛋白酶位点的连接子连接至抗体可变区。通常，具有相同蛋白酶裂解位点的相同连接子用于将抗体的每个重链或轻链可变区连接至卷曲螺旋肽。蛋白酶裂解位点应为适于通过细胞外存在于预期靶组织或病理(例如癌症)中的蛋白酶裂解的位点，以使得连接子的裂解将抗体从掩蔽其活性的卷曲螺旋释放，从而允许抗体结合至其预期标靶，例如细胞表面抗原或可溶性配体。
与可变区一样，经掩蔽的抗体通常包括恒定区的全部或一部分，其可包括轻链恒定区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区中的任一者或全部。如同其它抗体一样，一个或多个C端残基可经蛋白水解处理或衍生化。
卷曲螺旋可由形成同源二聚物的相同肽或形成异源二聚物的两个不同肽形成。为形成同源二聚物，抗体轻链和重链连接至相同卷曲螺旋形成肽。为形成异源二聚物，抗体轻链和重链连接至不同卷曲螺旋肽。为达成几对的卷曲螺旋形成肽，优选将所述对中的一者连接至抗体的重链并且将其它对连接至抗体的轻链，不过也可能是相反取向。
每个抗体链可连接至单一的卷曲螺旋形成肽或串接的多个此类肽(例如，两个、三个、四个或五个肽拷贝)。如果是后者，那么串接连接的肽通常是相同的。此外，如果采用串接连接，那么轻链和重链通常连接至相同数量的肽。
抗体链连接至卷曲螺旋形成肽可使抗体的结合亲和力相对于无此种连接或在此种连接裂解后的相同抗体降低至少约10倍、约50倍、约100倍、约200倍、约500倍、约1000倍或约1500倍。在一些此类抗体中，结合亲和力降低约50-1500倍、约100-1500倍、约200-1500倍、约500-1500倍、约50-1000倍、约100-1000倍、约200-1000倍、约500-1000倍、约50-500倍或约100-500倍。因连接至抗体药物缀合物中的药物所致的抗体的效应功能(例如ADCC、吞噬作用和CDC或细胞毒性)可减小相同倍数或范围。在蛋白水解裂解以使抗体去掩蔽或以其它方式从抗体去除掩模后，恢复的抗体相较于从未掩蔽的其它方面相同的对照抗体通常具有于2倍、1.5倍内或在实验误差内优选不变的亲和力或效应功能。
抗体-药物缀合物
在某些实施方案中，本发明的抗CD47抗体可与抗体药物缀合物(ADC)组合。特定ADC可包含细胞毒性剂(例如化疗剂)、前药转化酶、放射性同位素或化合物、或毒素(这些部分统称为治疗剂)。举例来说，ADC可缀合至细胞毒性剂(例如化疗剂)或毒素(例如，细胞生长抑制剂或杀细胞剂，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)。有用的细胞毒性剂类别的实例包括例如DNA小沟结合剂、DNA烷基化剂和微管蛋白抑制剂。例示性细胞毒性剂包括例如奥瑞司他汀、喜树碱(camptothecin)、卡奇霉素(calicheamicin)、多卡米星(duocarmycin)、依托泊苷(etoposide)、类美登素(maytansinoid)(例如，DM1、DM2、DM3、DM4)、紫杉烷(taxane)、苯并二氮呯(benzodiazepine)(例如，吡咯并[l,4]苯并二氮呯、吲哚啉并苯并二氮呯和恶唑烷并苯并二氮呯，包括吡咯并[l,4]苯并二氮呯二聚物、吲哚啉并苯并二氮呯二聚物和恶唑烷并苯并二氮呯二聚物)和长春花生物碱。
ADC可缀合至前药转化酶。前药转化酶可以重组方式融合至抗体或使用已知方法化学缀合至抗体。例示性前药转化酶是羧基肽酶G2、β-葡萄糖苷酸酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、β-葡糖苷酶、硝基还原酶和羧基肽酶A。
熟知用于使治疗剂缀合至蛋白质并且特别缀合至抗体的技术。(参见例如Alley等,Current Opinion in Chemical Biology 2010 14:1-9；Senter,Cancer J.,2008,14(3):154-169)。治疗剂可以降低其活性的方式缀合，除非其从抗体裂解(例如，通过水解、通过蛋白水解降解或通过裂解剂)。在一些方面，治疗剂经由对CD47表达癌细胞的胞内环境中的裂解敏感但对胞外环境大体上不敏感的可裂解连接子连接至抗体，使得缀合物在由CD47表达癌细胞(例如在核内体中，或例如在溶酶体环境中或在胞膜窖环境中借助于pH值敏感性或蛋白酶敏感性)内化时从抗体裂解。在一些实施方案中，治疗剂还可经由不可裂解的连接子连接至抗体。
在某些例示性实施方案中，ADC可包括介于细胞毒性剂或细胞生长抑制剂与抗体之间的连接子区。如上文所提及，通常，连接子可在胞内条件下裂解，以使得连接子的裂解从抗体释放治疗剂于胞内环境中(例如，于溶酶体或核内体或胞膜窖内)。连接子可为例如通过胞内肽酶或蛋白酶(包括溶酶体或核内体蛋白酶)裂解的肽基连接子。裂解剂可包括组织蛋白酶B和D以及胞浆素(参见例如Dubowchik和Walker,Pharm.Therapeutics 83:67-123,1999)。最典型的是可由CD47表达细胞中所存在的酶裂解的肽基连接子。举例来说，可使用可由癌组织中大量存在的硫醇依赖型蛋白酶组织蛋白酶-B裂解的肽基连接子(例如，包含Phe-Leu或Val-Cit肽的连接子)。
可裂解的连接子可为pH值敏感的，即，在某些pH值下对水解敏感。通常，pH值敏感性连接子可在酸性条件下水解。举例来说，可使用可在溶酶体中水解的酸不稳定性连接子(例如，腙、半卡腙(semicarbazone)、硫半卡腙(thiosemicarbazone)、顺-乌头酸酰胺(aconitic amide)、原酸酯、缩醛、缩酮等等)。(参见例如美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik和Walker,Pharm.Therapeutics 83:67-123,1999；Neville等,Biol.Chem.264:14653-14661,1989)。此类连接子在中性pH值条件下(例如在血液中)相对稳定，但在低于pH5.5或5.0(近似溶酶体pH值)下不稳定。
其它连接子可在还原条件下裂解(例如，二硫连接子)。二硫连接子包括可使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫基乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯)、SPDB和SMPT形成的那些。(参见例如Thorpe等,Cancer Res.47:5924-5931,1987；Wawrzynczak等,Immunoconjugates:AntibodyConjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel编,Oxford U.Press,1987。还可参见美国专利号4,880,935。)
连接子也可为丙二酸酯连接子(Johnson等,Anticancer Res.15:1387-93,1995)、马来酰亚胺基苯甲酰基连接子(Lau等,Bioorg-Med-Chem.3:1299-1304,1995)或3'-N-酰胺类似物(Lau等,Bioorg-Med-Chem.3:1305-12,1995)。
连接子也可为不可裂解的连接子，例如直接连接至治疗剂并且通过蛋白水解降解抗体释放的马来酰亚胺基-亚烷基或马来酰亚胺-芳基连接子。
通常，连接子对胞外环境大体上不敏感，意指当ADC存在于胞外环境中(例如，存在于血浆中)时ADC的样品中连接子的不大于约20％、通常不大于约15％、更通常不大于约10％并且甚至更通常不大于约5％、不大于约3％或不大于约1％裂解。连接子对胞外环境是否大体上不敏感可例如通过用血浆独立地培养(a)ADC(“ADC样品”)和(b)等摩尔量的未缀合的抗体或治疗剂(“对照样品”)持续一段预定的时间(例如，2、4、8、16或24小时)，然后将ADC样品中所存在的未缀合的抗体或治疗剂的量与对照样品中所存在的量(例如通过高效液相色谱法测量)进行比较来确定。
连接子还可促进细胞内化。连接子在缀合至治疗剂时(即，在如本文所描述的ADC或ADC衍生物的连接子-治疗剂部分的环境中)可促进细胞内化。或者，连接子在缀合至治疗剂和抗体两者时(即，在如本文所描述的ADC的环境中)可促进细胞内化。
抗体可经由抗体的杂原子缀合至连接子。这些杂原子可以其自然状态存在于抗体上或可引入抗体中。在一些方面，抗体将经由赖氨酸残基的氮原子缀合至连接子。在其它方面，抗体将经由半胱氨酸残基的硫原子缀合至连接子。将连接子和药物-连接子缀合至抗体的方法在本领域中已知。
例示性抗体-药物缀合物包括基于奥瑞司他汀的抗体-药物缀合物，意指药物组分是奥瑞司他汀药物。奥瑞司他汀结合微管蛋白，已显示会干扰微管动力学以及核和细胞***，并且具有抗癌活性。通常，基于奥瑞司他汀的抗体-药物缀合物包含介于奥瑞司他汀药物与抗CD47抗体之间的连接子。连接子可为例如可裂解的连接子(例如，肽基连接子)或不可裂解的连接子(例如，通过抗体降解而释放的连接子)。奥瑞司他汀包括MMAF和MMAE。例示性奥瑞司他汀的合成及结构在美国公布号7,659,241、7,498,298、2009-0111756、2009-0018086和7,968,687中描述，每个公布出于所有目的以全文引用方式并入本文中。
其它例示性抗体-药物缀合物包括类美登素抗体-药物缀合物，意指药物组分是类美登素药物；和苯并二氮呯抗体药物缀合物，意指药物组分是苯并二氮呯(例如，吡咯并[1,4]苯并二氮呯二聚物、吲哚啉并苯并二氮呯二聚物和恶唑烷并苯并二氮呯二聚物)。
在某些实施方案中，本发明的抗CD47抗体可与对不同标靶具有结合特异性的ADC组合。可与抗CD47抗体组合的例示性ADC包括布妥昔单抗(brentuximab vedotin)(抗CD30ADC)、浮图单抗(enfortumab vedotin)(抗粘连蛋白-4ADC)、迪拉图珠单抗(ladiratuzumabvedotin)(抗LIV-1ADC)、地泥土珠单抗(denintuzumab mafodotin)(抗CD19 ADC)、格莱莫单抗(glembatumumab vedotin)(抗GPNMB ADC)、抗TIM-1ADC、泊拉图珠单抗(polatuzumabvedotin)(抗CD79b ADC)、抗MUC16 ADC、地帕西珠单抗(depatuxizumab mafodotin)、特里图珠单抗(telisotuzumab vedotin)、抗PSMA ADC、抗C4.4a ADC、抗BCMA ADC、抗AXL ADC、特索图单抗(tisotuumab vedotin)(抗组织因子ADC)。
抗体分子表达
本发明的核酸可在宿主细胞中表达，所述宿主细胞含有编码本发明的抗体或经掩蔽的抗体的内源性DNA。本领域中熟知此类方法，例如，如美国专利号5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761中所描述。还参见例如Sambrook等，同上；以及Ausubel等，同上。本领域普通技术人员知晓可用于表达编码本发明蛋白质的核酸的许多表达***。可用于产生抗体、经掩蔽的抗体、其特定部分或变体的细胞培养物的示例为哺乳动物细胞。哺乳动物细胞***通常呈细胞单层的形式，不过也可使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。本领域中已开发能够表达完整糖基化蛋白质的许多适合的宿主细胞系，并且包括COS-1(例如，ATCC CRL 1650)、COS-7(例如，ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如，ATCC CRL-10)、CHO(例如，ATCC CRL 1610)和BSC-1(例如，ATCC CRL-26)细胞系、hep G2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、HeLa细胞等等，这些宿主细胞系可从例如美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)(Manassas,VA)轻易获得。还可使用酵母和细菌宿主细胞并且为本领域技术人员所熟知。可用于产生本发明的核酸或蛋白质的其它细胞是已知的和/或可例如从美国模式培养物保藏所细胞系和杂交瘤目录(American TypeCulture Collection Catalogue of Cell Lines and hybridomas)或其它已知或商业来源获得。
表达载体可包括以下表达控制序列中的一者或多者，例如但不限于复制起点；启动子(例如，晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(美国专利号5,168,062；5,385,839)、HSVtk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利号5,266,491)、至少一个人类免疫球蛋白激活子；增强子和/或处理信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如，SV40大T Ag poly A添加位点)和转录终止序列)。参见例如Ausubel等，同上；Sambrook等，同上。
表达载体任选地包括至少一种可选择标记物。此类标记物包括但不限于例如甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR，美国专利号4,399,216；4,634,665；4,656,134；4,956,288；5,149,636；5,179,017)、胺苄西林(ampicillin)、新霉素(G418)、麦考酚酸(mycophenolic acid)或抗真核细胞培养物的谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利号5,122,464；5,770,359；和5,827,739)，以及用于在大肠杆菌和其它细菌或原核生物中培养的四环素或胺苄西林抗性基因。本领域中已知用于上述宿主细胞的适当培养基和条件。本领域技术人员将显而易见适合的载体。将载体构建体引入宿主细胞中可通过磷酸钙转染、DEAE-聚葡萄糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它已知方法实现。本领域中描述此类方法，例如Sambrook，同上；Ausubel，同上。
核酸***物应以操作方式连接至适当启动子。表达构建体还将含有用于转录起始、终止的位点和(在转录区中)用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分将优选包括起始于开始时的翻译和适当位于待翻译mRNA末端的终止密码子(例如，UAA、UGA或UAG)，其中哺乳动物或真核细胞表达以UAA和UAG为优选。
核酸***物任选地与卷曲螺旋序列和/或MMP裂解序列同框，例如在一个或多个重链和/或轻链序列的N端。或者，卷曲螺旋序列和/或MMP裂解序列可例如经由二硫键等等在翻译后添加至抗体或其抗原结合片段中。
当采用真核宿主细胞时，将聚腺苷酸化或转录终止序列通常并入载体中。终止序列的一个实例为来自牛生长激素基因的聚腺苷酸化序列。还可包括用于准确剪接转录物的序列。剪接序列的一个实例为来自SV40的VP1内含子(Sprague等(1983)J.Virol.45:773-781)。或者，如本领域中所知，可将控制宿主细胞中的复制的基因序列并入载体中。
抗体分离和纯化
本文所描述的抗CD47抗体或经掩蔽的抗体可从重组细胞培养物通过熟知的方法回收并纯化，所述方法包括但不限于蛋白质A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法和凝集素色谱法。高效液相色谱法(HPLC)也可用于纯化。参见例如Colligan,CurrentProtocols in Immunology或Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,(1997-2001)。
本文所描述的抗体和经掩蔽的抗体可包括纯化产物、化学合成程序的产物和通过重组技术从真核宿主(包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。取决于重组产生程序中所采用的宿主，本发明的抗体或经掩蔽的抗体可经糖基化或可未经糖基化，以糖基化为优选。此类方法在许多标准实验室手册中描述，例如Sambrook，同上；Ausubel，同上，Colligan，Protein Science，同上。
核酸分子
本发明的核酸分子可呈RNA形式(例如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其它形式)或呈DNA形式(包括但不限于cDNA和通过克隆获得或合成产生的基因组DNA)或它们的任何组合。DNA可为三股、双股或单股或它们的任何组合。DNA或RNA的至少一股的任何部分可为编码股(也称为有义股)或可为非编码股(也称为反义股)。
本发明的经分离核酸分子可包括包含任选地具有一个或多个内含子，例如但不限于至少一个CDR(例如至少一个重链或轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少一个特定部分的开放阅读构架(ORF)的核酸分子；包含抗CD47抗体或经掩蔽的抗体或抗CD47抗体或经掩蔽的抗体可变区的编码序列的核酸分子；以及包含核苷酸序列大体上不同于上述那些但由于遗传密码简并性仍编码如本文所描述和/或如本领域中已知的至少一种抗CD47抗体或经掩蔽的抗体的核酸分子。由于本领域中熟知遗传密码，本领域技术人员常规上产生编码本发明的特异性抗CD47抗体或经掩蔽的抗体的此类简并核酸变体。
如本文所指示，包含编码抗CD47抗体分子的核酸的本发明的核酸分子可包括但不限于独立地编码抗体片段的氨基酸序列的那些；整个抗体或其部分的编码序列；抗体、片段或部分的编码序列，以及额外序列，例如掩蔽剂(例如，卷曲螺旋掩蔽剂)和/或MMP裂解序列中的一者或两者，或例如具有或不具有上述额外编码序列(例如至少一个内含子)的至少一个信号前导子或融合肽的编码序列，连同额外非编码序列，包括但不限于非编码5'和3'序列，例如在转录、mRNA处理(包括剪接和聚腺苷酸化信号(例如-mRNA的核糖体结合和稳定性))中发挥作用的转录、非翻译序列；编码额外氨基酸(例如提供额外功能的那些)的额外编码序列。在一些实施方案中，可将编码抗体的序列融合至标记序列，例如编码有利于纯化包含抗体片段或部分的融合抗体的肽的序列。
核酸的构建
如本领域中所熟知，本发明的经分离核酸可使用(a)重组方法、(b)合成技术、(c)纯化技术或它们的组合来制造。核酸可简便地包含除了本发明的多核苷酸以外的序列。举例来说，可将包含一个或多个核酸内切酶限制位点的多克隆位点***核酸中以帮助分离多核苷酸。此外，可***可翻译序列以帮助分离本发明的经翻译多核苷酸。举例来说，六联组氨酸标记序列提供纯化本发明的蛋白质的简便方法。本发明的核酸-编码序列除外-任选地是用于本发明的多核苷酸的克隆和/或表达的载体、转接子或连接子。可将额外序列添加至此类克隆和/或表达序列以优化其在克隆和/或表达中的功能，以帮助分离多核苷酸，或改善多核苷酸引入细胞中。本领域中熟知克隆载体、表达载体、转接子和连接子的用途。(参见例如Ausubel，同上；或Sambrook，同上。)
本发明的经分离核酸组合物(例如RNA、cDNA、基因组DNA或它们的任何组合)可从生物来源使用本领域技术人员已知的许多克隆方法获得。在一些实施方案中，使用寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针在严苛条件下与本发明的多核苷酸选择性杂交以鉴别cDNA或基因组DNA文库中的所需序列。本领域普通技术人员熟知RNA的分离以及cDNA和基因组文库的构建。(参见例如Ausubel，同上；或Sambrook，同上。)
III.治疗应用
本发明提供了治疗与表达CD47的细胞相关的病症(例如癌症)的方法。所述细胞可能表达或可能不表达相对于与所关注的病症无关的细胞提高的CD47水平。因此，本发明提供了一种使用本文所描述的抗CD47抗体或经掩蔽的抗体治疗受试者(例如患有癌症的受试者)的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的抗CD47抗体或经掩蔽的抗体或包含抗CD47抗体或经掩蔽的抗体的组合物。
如本文所使用，术语“受试者”和“患者”是指有待通过本发明的方法治疗的生物体。此类生物体优选包括但不限于哺乳动物(例如，鼠、猿、马、牛、猪、犬、猫等等)，并且更优选包括人类。如本文所使用，术语“治疗”包括任何效应，例如降低、减轻、调节、改善或消除，此引起疾患、疾病、病症等改善；或改善疾患、疾病、病症等的症状，例如癌细胞数减少、肿瘤尺寸减小、癌细胞浸润至外周器官中的速率减小或肿瘤转移或肿瘤生长速率减小。
癌症中的正向治疗效应可依许多方式测量(参见W.A.Weber,J.Null.Med.50:1S-10S(2009)；Eisenhauer等，同上)。在一些优选实施方案中，对抗CD47抗体或经掩蔽的抗体的反应是使用RECIST 1.1准则来评定。在一些实施方案中，由治疗有效量达成的治疗为部分反应(PR)、完全反应(CR)、无进展存活期(PFS)、无疾病存活期(DFS)、客观反应(OR)或总存活期(OS)中的任一者。有效治疗原发性或继发性肝癌患者的本文所描述的疗法的给药方案可根据以下因素而改变，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及疗法引起受试者的抗癌反应的能力。虽然本发明的治疗方法、药剂和用途的实施方案可能未有效达成每个受试者的正向治疗效应，但应在统计上显著数目的受试者中达成正向治疗效应，如通过本领域中已知的任何统计检验，例如学生t检验、chi2检验、根据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验所确定。
如本文所使用，“RECIST 1.1反应准则”意指Eisenhauer等,E.A.等,Eur.J Cancer45:228-247(2009)中所陈述的针对标靶病灶或非标靶病灶的定义(适当时，基于测量反应的情形)。
“肿瘤”在应用于诊断患有或疑似患有原发性或继发性肝癌的受试者时，是指恶性或潜在恶性肿瘤或任何尺寸的组织团块。实体肿瘤是异常生长或通常不含囊肿或液体区域的组织团块。不同类型的实体肿瘤是针对于形成其的细胞类型命名的。实体肿瘤的实例为肉瘤、癌瘤和淋巴瘤。白血病(血液癌症)一般不形成实体肿瘤(国家癌症研究所(NationalCancer Institute)，癌症术语词典(Dictionary of Cancer Terms))。非限制性例示性肉瘤包括软组织肉瘤和骨肉瘤。
“肿瘤负担”(也称为“肿瘤负荷”)是指分布于全身的肿瘤物质总量。肿瘤负担是指全身(包括***和骨髓)的癌细胞总数或一个或多个肿瘤的总尺寸。肿瘤负担可通过本领域中已知的多种方法确定，例如通过测量从受试者去除后一个或多个肿瘤的尺寸，例如，使用光标卡尺，或在体内时，使用成像技术，例如，超声波、骨骼扫描、计算机断层摄影术(CT)或磁共振成像(MRI)扫描。
术语“肿瘤尺寸”是指可用肿瘤长度和宽度测量的肿瘤总尺寸。肿瘤尺寸可通过本领域中已知的多种方法确定，例如通过测量从受试者去除后一个或多个肿瘤的尺寸，例如，使用光标卡尺，或在体内时，使用成像技术，例如，骨骼扫描、超声波、CT或MRI扫描。
如本文所使用，术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的化合物(例如，抗CD47抗体或经掩蔽的抗体)的量。有效量可以一次或多次施用、施加或给药方式施用并且无意受限于特定配方或施用途径。一般来说，活性组分的治疗有效量在0.1mg/kg至100mg/kg，例如1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至10mg/kg的范围内。所施用的剂量可取决于以下已知因素而改变，例如特定剂的药效动力学特征和其施用模式和途径；接受者的年龄、健康状况和体重；有待治疗的疾病或适应症的类型和程度、症状的性质和程度、合并治疗的种类、治疗频率和所需效应。初始剂量可增加超过上限水平以快速地达成所需血液水平或组织水平。或者，初始剂量可小于最佳值，并且日剂量可在治疗过程中逐渐增加。人类剂量可例如在设计为从0.5mg/kg至20mg/kg进行的常规I期剂量递增研究中优化。给药频率可取决于以下因素而改变，例如施用途径、剂量、抗体的血清半衰期和所治疗的疾病。例示性给药频率是每天一次、每周一次和每两周一次。基于单克隆抗体的药物的配方处于本领域的一般技术范围内。在一些实施方案中，单克隆抗体经冻干，然后在施用时于缓冲盐水中复原。
在某些例示性实施方案中，本发明提供了一种用于治疗细胞、组织、器官、动物或患者的癌症的方法。在特定实施方案中，本发明提供了一种用于治疗人类的实体癌症的方法。例示性癌症是在具有癌症(即“CD47表达癌症”)的细胞中具有CD47表达的那些。癌症的实例包括但不限于实体肿瘤、软组织肿瘤、产生实体肿瘤的血液***肿瘤(hematopoietictumor)和转移性病灶。具有产生实体肿瘤潜力的血液***肿瘤的实例包括但不限于弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、脊髓发育不良综合征(MDS)、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、多发性骨髓瘤、瑞特氏综合征(瑞特氏转化)等等。实体肿瘤的实例包括但不限于恶性肿瘤，例如，各种器官***的肉瘤(包括软组织肉瘤和骨肉瘤)、腺癌和癌瘤，例如，影响以下的那些：头部和颈部(包括咽)、甲状腺、肺(小细胞或非小细胞肺癌(NSCLC))、***、淋巴、胃肠道(例如，口腔、食道、胃、肝、胰脏、小肠、结肠和直肠以及肛管)、生殖器和泌尿生殖道(例如，肾、尿路上皮、膀胱、卵巢、子宫、子宫颈、子宫内膜、***、睾丸)、中枢神经***(例如，神经或神经胶质细胞，例如，神经母细胞瘤或胶质瘤)、皮肤(例如，黑色素瘤)等等。在某些实施方案中，实体肿瘤是NMDA受体阳性畸胎瘤。在其它实施方案中，癌症选自乳癌、结肠癌、胰脏癌(例如，胰脏神经内分泌肿瘤(PNET)或胰脏导管腺癌(PDAC))、胃癌、子宫癌和卵巢癌。
在某些实施方案中，癌症选自但不限于白血病，例如急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)、T细胞前淋巴球性白血病(T-PLL)、大颗粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病和急性单核细胞白血病(AMoL)。
在一个实施方案中，癌症是与腹水相关的实体肿瘤。腹水是许多类型的癌症的症状并且还可由许多疾患(例如晚期肝病)引起。可能引起腹水的癌症的类型包括但不限于乳癌、肺癌、大肠癌(结肠癌)、胃癌、胰脏癌、卵巢癌、子宫癌(子宫内膜癌)、腹膜癌等等。在一些实施方案中，与腹水相关的实体肿瘤选自乳癌、结肠癌、胰脏癌、胃癌、子宫癌和卵巢癌。在一些实施方案中，癌症与胸膜积液相关，例如，肺癌。
引起实体肿瘤的额外血液***癌症包括但不限于非霍奇金淋巴瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B淋巴母细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤和伯奇氏淋巴瘤)、B淋巴母细胞性淋巴瘤；B细胞慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤；淋巴浆细胞性淋巴瘤；脾边缘区B细胞淋巴瘤(±绒毛淋巴细胞)；血浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤；MALT类型的结节外边缘区B细胞淋巴瘤；结节边缘区B细胞淋巴瘤(±单核细胞样B细胞)；滤泡性淋巴瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；伯奇氏淋巴瘤；前体T淋巴母细胞性淋巴瘤；T成人T细胞淋巴瘤(HTLV 1-阳性)；结节外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型；肠病型T细胞淋巴瘤；肝脾γ-δT细胞淋巴瘤；皮肤脂膜炎样T细胞淋巴瘤；蕈样霉菌病/塞扎里综合征(sezary syndrome)；间变性大细胞淋巴瘤、T细胞/裸细胞，原发性皮肤类型；间变性大细胞淋巴瘤、T细胞/裸细胞，原发性全身类型；外周T细胞淋巴瘤，未以其它方式表征；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、真性红血球增多症或骨髓纤维化、皮肤T细胞淋巴瘤、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、边缘区淋巴瘤、CNS淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤等等。
在特定实施方案中，癌症是肉瘤、结肠直肠癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰脏癌、胃癌、黑色素瘤和/或乳癌。
如本文所描述的抗CD47抗体和经掩蔽的抗体还可用于治疗与癌症相关的病症，例如，癌症诱发的脑病变。
本发明的方法和组合物可与其它治疗剂和/或疗法组合使用。如本文所使用，术语“以组合方式”施用应理解为意指在受试者遭受病症折磨过程中将两种(或更多种)不同治疗递送至受试者，使得所述治疗对患者的效应在一个时间点重叠。在某些实施方案中，一种治疗的递送在第二种治疗的递送开始时仍进行，因此，就施用来说存在重叠。这在本文中有时称为“同时”或“并行递送”。在其它实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方案中，治疗由于组合施用而更有效。举例来说，第二种治疗是更有效的，例如，在较少的第二种治疗中观察到等同效应，或相比在不存在第一种治疗下施用第二种治疗的情况将观察到的，第二种治疗更大程度地减轻症状，或在第一种治疗中观察到类似情形。在一些实施方案中，递送使得症状减轻或与病症相关的其它参数相比不存在另一种治疗下递送一种治疗所观测到的程度更大。两种治疗的效应可为部分相加，完全相加，或大于相加(即，协同反应)。递送可使得所递送的第一种治疗的效应在递送第二种治疗时仍可检测到。
在一个实施方案中，本发明的方法包括向受试者施用如本文所描述的抗CD47抗体或经掩蔽的抗体(例如，组合物或制剂)与一种或多种额外疗法(例如，手术、放射疗法或施用另一种治疗性制剂)的组合。在一个实施方案中，额外疗法可包括化疗，例如，细胞毒性剂。在一个实施方案中，额外疗法可包括靶向疗法，例如，酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂或蛋白酶抑制剂。在一个实施方案中，额外疗法可包括消炎、抗血管生成、抗纤维化或抗增生化合物，例如，类固醇、生物免疫调节剂，例如免疫检查点分子的抑制剂、单克隆抗体、抗体片段、适体、siRNA、反义分子、融合蛋白、细胞因子、细胞因子受体、支气管扩张剂、他汀(statin)、消炎剂(例如甲氨蝶呤)或NSAID。在另一个实施方案中，额外疗法可包括组合不同类别的治疗剂。抗CD47抗体或经掩蔽的抗体制剂和额外疗法可同时或依序施用。
如本文所使用，“免疫检查点分子”是指免疫***中的打开信号(刺激分子)或关闭信号(抑制分子)的分子。许多癌症通过抑制T细胞信号传导来避开免疫***。
例示性免疫检查点分子包括但不限于程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序化死亡配体1(PD-L1)、PD-L2、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM-1)、CEACAM-5、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白血球相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、CD160、TGFR、腺苷2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B7-H4(也称为VTCN1)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、2B4、杀手细胞免疫球蛋白样受体(KIR)等等。
如本文所使用，“免疫检查点抑制剂”是指抑制和/或阻断一个或多个抑制性检查点分子的分子(例如，小分子、单克隆抗体、抗体片段等等)。
例示性免疫检查点抑制剂包括但不限于以下单克隆抗体：PD-1抑制剂，例如帕姆单抗(pembrolizumab)(Keytruda，Merck)和纳武单抗(nivolumab)(Opdivo，Bristol-MyersSquibb)；PD-L1抑制剂，例如阿特珠单抗(atezolizumab)(Tecentriq，Genentech)、阿维单抗(avelumab)(Bavencio，Pfizer)、度伐鲁单抗(durvalumab)(Imfinzi，AstraZeneca)；以及CTLA-1抑制剂，例如易普利单抗(ipilimumab)(Yervoy，Bristol-Myers Squibb)。
例示性细胞毒性剂包括抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、蛋白质合成和降解抑制剂、有丝***抑制剂、烷基化剂、铂化剂、核酸合成的抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDAC抑制剂，例如，伏立诺他(vorinostat)(SAHA、MK0683)、恩替司他(entinostat)(MS-275)、帕比司他(panobinostat)(LBH589)、曲古抑菌素A(trichostatin A)(TSA)、莫赛替诺司他(mocetinostat)(MGCD0103)、贝林司他(belinostat)(PXD101)、罗咪酯肽(romidepsin)(FK228，缩肽))、DNA甲基转移酶抑制剂、氮芥、亚硝基脲、乙烯亚胺、磺酸烷酯、三氮烯、叶酸盐类似物、核苷类似物、核糖核苷酸还原酶抑制剂、长春花生物碱、紫杉烷、埃坡霉素(epothilone)、嵌入剂、能够干扰信号转导路径的剂、促进细胞凋亡和辐射的剂，或结合表面蛋白以递送毒性剂的抗体分子缀合物。在一个实施方案中，可与本文所描述的制剂一起施用的细胞毒性剂是铂剂(例如顺铂(cisplatin))、环磷酰胺(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、卡培他滨(capecitabine)、羟基脲、拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、氮杂胞苷(azacytidine)、伏立诺他(vorinostat)、伊沙匹隆(ixabepilone)、硼替佐米(bortezomib)、紫杉烷(例如，太平洋紫杉醇(paclitaxel)或多烯紫杉醇(docetaxel))、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、秋水仙碱(colchicin)、蒽环霉素(anthracycline)(例如，多柔比星(doxorubicin)或表柔比星(epirubicin))、道诺霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、阿霉素(adriamycin)、1-去氢睾固酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、***(propranolol)、嘌呤霉素(puromycin)、蓖麻毒素(ricin)或类美登素。
本发明的方法和组合物可用于治疗患有CD47阳性癌症的受试者。在一个实施方案中，CD47阳性癌症表达一种或多种基质金属蛋白酶(MMP)。例示性MMP包括但不限于MMP1至MMP28。特定例示性MMP包括MMP2和MMP9。在一个实施方案中，CD47阳性癌症是其中存在浸润性巨噬细胞的肿瘤。
本发明的方法和组合物可用于治疗患有表达一种或多种MMP并且包含浸润性巨噬细胞的CD47阳性癌症的受试者。
本领域中已知确定CD47阳性癌症的存在、MMP表达和肿瘤浸润性巨噬细胞的存在的方法。
受试者中CD47阳性癌症的评定可通过包括免疫组织化学(IHC)、西方墨点法、流动式细胞测量术或RNA测序方法的常规方法来确定。IHC、西方墨点法和流动式细胞测量术可用本领域中已知的任何抗CD47抗体以及本文所公开的抗CD47抗体进行分析。
组织中巨噬细胞浸润的评定可通过包括免疫组织化学(IHC)、西方墨点法、流动式细胞测量术或RNA测序方法的常规方法监测巨噬细胞的表面标记物(包括小鼠巨噬细胞的F4/80，或CD163、CD68或CD11b)来进行。
组织中蛋白酶的评定可使用多种技术(包括监测蛋白酶活性的那些以及可检测蛋白水解活性的那些)来监测。可检测组织中蛋白酶(可包括蛋白酶的非活性形式和活性形式)的存在的常规方法包括IHC、RNA测序、西方墨点法或基于ELISA的方法。可使用额外技术以检测组织中的蛋白酶活性，包括酶谱法(zymography)、通过荧光显微术的原位酶谱法或荧光蛋白水解底物的使用。另外，可将荧光蛋白水解底物的使用与特定蛋白酶的免疫捕捉组合。另外，针对蛋白酶的活性位点的抗体可通过多种技术(包括IHC、荧光显微术、西方墨点法、ELISA或流动式细胞测量术)使用(参见Sela-Passwell等Nature Medicine.18:143-147.2012；LeBeau等Cancer Research.75:1225-1235.2015；Sun等Biochemistry.42:892-900.2003；Shiryaev等2:e80.2013。)
在通篇描述中，在组合物和试剂盒被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，或在工艺和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下，预期另外存在基本上由或由所列举组分组成的本发明的组合物和试剂盒，并且存在基本上由或由所列举处理和方法步骤组成的根据本发明的工艺和方法。
IV.药物组合物和配方
就治疗用途来说，优选将抗CD47抗体或经掩蔽的抗体与药学上可接受的载体组合。如本文所使用，“药学上可接受的载体”意指适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏性反应或其它问题或并发症并且符合合理的效益/风险比的缓冲剂、载体和赋形剂。这种(这些)载体应在与配方的其它成分相容的意义上是“可接受”的并且对接受者无害。药学上可接受的载体包括与药学施用相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等等。此项技术中已知此类介质和剂对药学活性物质的用途。
因此，本发明的抗CD47抗体或经掩蔽的抗体组合物可包含任何适合赋形剂中的至少一者，例如但不限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等等。以药学上可接受的赋形剂为优选。本领域中熟知制备此类无菌溶液的非限制性实例和方法，例如但不限于Gennaro编,Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,MackPublishing Co.(Easton,Pa.)1990中所描述的那些。可例行地选择适于如本领域中所熟知或如本文所描述的抗体分子、片段或变体组合物的施用模式、溶解性和/或稳定性的药学上可接受的载体。
可用于本发明组合物中的医药赋形剂和添加剂包括但不限于蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，例如醛醇、醛糖酸、酯化糖等等；以及多糖或糖聚合物)，这些物质可单独地或以组合方式(包括单独地或以1-99.99％(以重量或体积计)组合方式)存在。例示性蛋白赋形剂包括血清白蛋白，例如人类血清白蛋白(HSA)、重组人类白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等等。还可在缓冲能力上起作用的代表性氨基酸/抗体分子组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜(aspartame)等等。
适用于本发明中的碳水化合物赋形剂包括例如单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、葡聚糖、淀粉等等；以及醛醇，例如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)、肌醇等等。用于本发明中的优选碳水化合物赋形剂是甘露醇、海藻糖和棉子糖。
抗体分子组合物还可包括缓冲剂或pH值调节剂；通常，缓冲剂是由有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，例如柠檬酸盐、乙酸盐、抗坏血酸盐、葡萄糖酸、碳酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐或苯二甲酸盐；Tris(缓血酸胺盐酸盐)或磷酸盐缓冲液。
另外，本发明的抗体分子组合物可包括聚合赋形剂/添加剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、菲科尔(ficolls)(聚合糖)、葡萄糖结合剂(dextrates)(例如，环糊精，例如2-羟基丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，例如“吐温20(TWEEN 20)”和“吐温80(TWEEN 80)”)、脂质(例如，磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如，胆固醇)和螯合剂(例如，EDTA)。
本领域中已知适用于根据本发明的抗体分子组合物的这些和额外已知医药赋形剂和/或添加剂，例如，如“Remington:The Science&Practice of Pharmacy”,第19版,Williams&Williams,(1995)和“Physician's Desk Reference”,第52版,MedicalEconomics,Montvale,N.J.(1998)中所列出。优选的载体或赋形剂物质是碳水化合物(例如，糖和醛醇)和缓冲剂(例如，柠檬酸盐)或聚合剂。
本发明提供了在药学上可接受的配方中包含至少一种抗CD47抗体分子的稳定组合物。所保存的配方含有至少一种已知防腐剂或任选地选自至少一种苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧基乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(例如，六水合物)、对羟基苯甲酸烷酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等等)、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethoniumchloride)、去水乙酸钠和硫柳汞(thimerosal)或它们于水性稀释剂中的混合物。任何适合的浓度或混合物可依本领域中所知而使用，例如0.001-5％或任何范围或其中的值，例如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或任何范围或其中的值。非限制性实例包括(无防腐剂)0.1-2％间甲酚(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.9或1.0％)、0.1-3％苯甲醇(例如，0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0或2.5％)、0.001-0.5％硫柳汞(例如，0.005或0.01％)、0.001-2.0％苯酚(例如，0.05、0.25、0.28、0.5、0.9或1.0％)、0.0005-1.0％对羟基苯甲酸烷酯(例如，0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9或1.0％)等等。
含有如本文所公开的抗CD47抗体或经掩蔽的抗体的药物组合物可呈单位剂型存在或可通过任何适合的方法制备。药物组合物应配制成与其预期施用途径相容。施用途径的实例为静脉内(IV)、皮内、吸入、经皮、局部、经粘膜和直肠施用。单克隆抗体的优选施用途径是IV输注。有用的配方可通过药学领域中已知的方法来制备。举例来说，参见Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)同上。适于肠道外施用的配制组分包括无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如EDTA；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节渗透性的剂，例如氯化钠或右旋糖。
就静脉内施用来说，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体应在制造和储存条件下稳定，并且应抗微生物保存。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)和它们的适合混合物的溶剂或分散介质。
药物配方优选是无菌的。灭菌可通过任何适合的方法(例如，滤过无菌过滤膜)来达成。在组合物经冻干的情况下，过滤器灭菌可在冻干和复原之前或之后进行。
本发明的组合物可呈多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散液或悬浮液和脂质体。优选的形式取决于预期施用模式和治疗应用。典型优选的组合物呈可注射或可输注溶液形式。优选的施用模式是肠道外(例如，静脉内、皮下、眼内、腹膜内、肌肉内)。在一个优选实施方案中，制剂是通过静脉内输注或注射施用。在另一个优选实施方案中，制剂是通过肌肉内或皮下注射施用。
如本文所使用，短语“肠道外施用”和“以肠道外方式施用”意指除了经肠和局部施用以外的施用模式，通常是通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、皮下、动脉内、鞘内、囊内、眼窝内、玻璃体内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、吸入、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括包装材料和包含至少一种抗CD47抗体或经掩蔽的抗体与规定缓冲剂和/或防腐剂任选地于水性稀释剂中的溶液的至少一个小瓶。水性稀释剂任选地还包含药学上可接受的防腐剂。防腐剂包括选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、去水乙酸钠和硫柳汞或它们的混合物的那些。用于配方中的防腐剂的浓度为足以产生抗微生物效应的浓度。此类浓度取决于所选防腐剂并且由本领域技术人员轻易地确定。
可任选地并且优选地将其它赋形剂，例如等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、防腐增强剂添加至稀释剂中。等渗剂(例如甘油)通常以已知浓度使用。优选地添加生理上耐受的缓冲剂以改善pH值控制。配方可涵盖大范围的pH值，例如约pH 4.0至约pH 10.0、约pH 5.0至约pH 9.0或约pH 6.0至约pH 8.0。
可任选地将其它添加剂，例如药学上可接受的增溶剂，如吐温20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、吐温40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、吐温80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、Pluronic F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇)或非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯20或80或泊洛沙姆(poloxamer)184或188)、
Figure BDA0002513470550001001
多元醇、其它嵌段共聚物和螯合剂(例如EDTA和EGTA)添加至配方或组合物中以减少聚集。这些添加剂在使用泵或塑料容器以施用配方的情况下尤其有用。药学上可接受的表面活性剂的存在减少蛋白质聚集的倾向。
可使用各种递送***以向受试者施用抗CD47抗体或经掩蔽的抗体。在某些例示性实施方案中，抗CD47抗体或经掩蔽的抗体的施用是通过静脉内输注。在一些实施方案中，施用是通过两小时静脉内输注。
上文所描述的任何配方可呈液体或冷冻形式储存并且可任选地经受防腐工艺。在一些实施方案中，上文所描述的配方是冻干的，即，经受冻干。在一些实施方案中，上文所描述的配方经受防腐工艺，例如冻干，并且随后用适合的液体(例如水)复原。冻干意指组合物已在真空下冷冻干燥。冻干通常是通过冷冻特定配方以使溶质与一种或多种溶剂分离来达成。溶剂然后通过升华(即，初级干燥)并且接着通过解吸附(即，二级干燥)来去除。
本发明的配方可与本文所描述的方法一起或与其它方法一起用于治疗疾病。抗CD47抗体或经掩蔽的抗体配方可在向受试者施用前进一步稀释。在一些实施方案中，配方将用盐水稀释并且在向受试者施用前保存在IV袋或注射器中。因此，在一些实施方案中，用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法将包括向有需要的受试者施用周剂量的包含抗CD47抗体或经掩蔽的抗体的药物组合物。
本领域技术人员轻易地明了可在不偏离本文所描述的实施方案的范围下使用适合的等同物进行本文所描述的方法的其它适合修改和调适。现已详细描述某些实施方案，参考以下实施例将更清楚地了解所述实施方案，所述实施例仅出于说明的目的而包括在内并且无意具限制性。本文所描述的所有专利、专利申请和参考文献出于所有目的以全文引用的方式并入。
实施例
实施例1：抗体的生成
生成鼠类B6H12抗CD47抗体的人源化变体。就DNA和载体生成来说，使用非模板PCR合成抗体可变结构域序列。简单地说，使用ATUM专用软件套件将虚拟基因序列转化成寡核苷酸序列。合成寡核苷酸，汇集并且使用PCR扩增。使用SapI位点将来自PCR反应的全长扩增子克隆至载体中，转形至大肠杆菌中并且分离独特的无性系。使无性系在液体培养基中生长过夜并且分离质粒DNA，纯化(Machery-Nagel Midi Prep试剂盒)并使用Sanger测序来验证序列。将轻链可变结构域克隆至Kappa-Hs载体中并且将重链结构域克隆至IgG1.01-Fc-Hs载体中。就抗体表达来说，用PolyPlus FectoPro转染试剂将1:1比率的抗体重链和轻链载体稀释于LifeTech Optimem培养基中。然后，将DNA/转染试剂添加至含Atum-特异性HEK293细胞的LifeTech ExpiExpression培养基中并且培养5天。通过离心和0.2um过滤收集培养物。就抗体纯化来说，所选GE mAb的确用于IgG的纯化。在洗脱之前，用PBS中的10CV1M NaCl、和10CV PBS洗涤树脂。使用20mM柠檬酸钠pH3.2缓冲液洗脱IgG。使用Pierce Zeba柱使样品缓冲液交换至PBS中。然后，无菌过滤样品，接着获取样品用于表征。表征包括A280浓度和使用具有p200 Tapescreen的Agilent P200 Tape Station 2200的还原和非还原电泳。
亲本B6H12抗体的特异性突变在表10-13中描述，如下文所列。
表10.hB6H12重链变体中的人源化突变
Figure BDA0002513470550001021
表11.hB6H12κ轻链变体中的人源化突变
Figure BDA0002513470550001022
表12.hB6H12重链变体中的特异性鼠类构架突变
变体 29 44 49 82 89 91 94 人类％
hvH1 F R* A* M I* F* R* 87.8
hvH2 F G A* M V F* R* 92.9
hvH3 F G A* I* V F* R* 91.8
hvH4 F G A* M V Y R 92.9
hvH5 F* G A* I* V Y R 89.8
hvH6 F G A* M V Y R 92.9
*鼠类残基。
表13.hB6H12κ轻链变体中的特异性鼠类构架突变
变体 4 21 49 69 85 人类％
hvK1 M* L* K T V* 85.3
hvK2 M* L* K T T 86.3
hvK3 M* L* K S* T 85.3
hvK4 M L* K* S* T 89.5
*鼠类残基。
实施例2：人源化抗CD47抗体
抗体的产生
抗体经由瞬时转染Expi HEK或Expi CHO细胞或稳定转染CHO-DG44而表达并且使用MabSelect SuRe柱(GE Healthcare)纯化。使用Superdex柱(GE Healthcare)对小于90％单体的经掩蔽的抗体进行额外制备型尺寸排阻色谱纯化。
通过流动式细胞测量术和ELISA评定饱和结合
通过饱和ELISA或细胞FACS分析中的任一种来评定具有不同重链和轻链序列的人源化抗CD47 B6H12抗体对人类CD47的结合亲和力并且计算EC50或Kd。只有包含重链1序列(hvH1)(bin A；抗体1-4)或重链5序列(hvH5)(bin B，抗体17-20)的抗体能够结合至CD47。来自这些bin的抗体以与鼠类抗体mB6H12和替代人源化抗体Ab47相似的Kd(图2A)和EC50(图2B)亲和力结合。
就细胞FACS分析来说，用渐增浓度的人源化B6H12抗体处理L450cy癌淋巴细胞，发现所述人源化B6H12抗体保持结合至CD47并且确定Kd值。替代人源化架构保持与鼠类亲本和替代人源化抗体Ab47(图2A)相似的结合Kd。
除了细胞结合评定以外，通过Elisa确定人源化B6H12抗体对CD47的亲和力。用渐增浓度的人源化B6H12抗体处理经人类CD47包被的板，发现所述人源化B6H12抗体保持结合至CD47并且确定EC50值。替代人源化架构保持与鼠类亲本和替代人源化抗体Ab47(图2B)相似的结合Kd。
除了在ELISA测定中评定结合EC50以外，还评定结合动力学。出人意料的是，Bin A中的抗体(hB6H12.3和hB6H12.4)显示比亲本抗体mB6H12、Bin B中的抗体(hB6h12.19和hB6H12.20)或替代人源化抗体Ab47显著更高的最大结合(BMax)(图2C)。
通过流动式细胞测量术评定饱和结合
将2x105个指定细胞(SW780或人类红血球)与指定抗体于染色缓冲液(PBS、5％FBS、0.2％NaN3)中的连续稀释液组合。将样品在冰上孵育1小时并且用冰冷染色缓冲液洗涤两次。在冰上用抗人类IgG-AF647(JacksonImmunoResearch，于染色缓冲液中的1:200稀释液)再悬浮细胞1小时。将细胞用冰冷染色缓冲液洗涤两次并且再悬浮于染色缓冲液中。通过流动式细胞测量术在门控排除非活细胞的Invitrogen Attune NxT流动式细胞计数器上检查经标记的细胞并且使用FlowJo 10软件分析。使用GraphPad Prism 6利用非线性回归计算Kd。
通过ELISA评定饱和结合
将可溶性重组人类CD47-Fc(R&D Systems)于50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中稀释至适当浓度。添加100μL可溶性抗原至96孔Maxisorb ELISA板的每个孔中。密封所述板并且储存于4℃下过夜。然后用PBS-T缓冲液(PBS、pH 7.4+0.05％吐温-20)将板洗涤3-5次。在室温下使用300μL/孔的含BSA的PBS-T缓冲液封闭所述孔1小时，然后用PBS-T洗涤3-5次。在封闭缓冲液中制备抗体的稀释液并且以100μL体积添加至每个孔中。在室温下孵育抗体1小时，然后用PBS-T洗涤3-5次。然后添加HRP缀合的二级抗体(抗人类Fc或抗人类κ轻链中的任一者)并且在室温下孵育1小时。用PBS-T将板洗涤3-5次。通过添加100μL TMB溶液并且在室温下孵育3-15分钟使ELISA显色。为停止反应，添加100μL 1N硫酸至每个孔中。使用Spectramax 190板式读取器(Molecular Biosciences)确定在450nm下的吸光度并且使用GraphPad Prism 6绘制数据。
B6H12介导的吞噬作用
进行人源化B6H12抗体的功能表征，包括人类红血球的人类吞噬作用和血球凝集。用渐增浓度的来自bin A和B的人源化B6H12抗体调理经荧光红PKH染料标记的人类红血球30分钟。洗涤RBC并且以10:1比率馈至单核细胞巨噬细胞2小时。用允许溶解并去除未消化红血球的ACK低渗溶解缓冲液洗涤样品3次。使样品经受流动式细胞测量术并且评定吞噬作用。来自Bin A和B的抗体展现介导人类红血球吞噬作用的类似能力。令人意外的是，来自bin A的抗体hB6H12.3介导比鼠类亲本抗体更好并且与替代人源化抗体Ab47相当的吞噬作用。
来自抗体bin A和B的人源化B6H12抗体类似地介导CD47阳性人类红血球的吞噬作用。hB6H12.3在1μg/ml下刺激相较于鼠类mB6H12优异的促吞噬活性和相较于Ab47类似的促吞噬活性(图3A和图3B)。
B6H12介导的血球凝集
B6H12的印记特征是促进人类红血球的血球凝集的能力。血球凝集是在用CD47抗体处理时允许两种CD47表达细胞聚集或结块的同型相互作用的实例。凝集的晶格以悬浮分布方式维持RBC，这可通过图像分析或通过聚集程度(通过流动式细胞测量术监测)目测定量。将悬浮于PBS中并且涂于圆底96孔板中的人类红血球暴露以增加抗CD47抗体的浓度。在37℃下30分钟后，通过RBC密度改变并且通过流动式细胞测量术以细胞聚集的增加来光学监测血球凝集。在Bin A中的抗体(特别是hB6H12.3)显示相较于亲本抗体mB6H12和替代人源化抗体Ab47减少的血球凝集(图4A)。
为评定血球凝集，进行标准图像捕捉并且评定经分散的非沉降RBC的形成。另外，使用GE In Cell分析仪扫描板并且评定细胞中视光点的直径。为试图评定适于临床监测的测定中的血球凝集，使用流动式细胞测量术并且以表观RBC SSC/FSC的总体增加评定血球凝集，这是监测聚集的方法。这种方法用于评定由人源化抗CD47抗体hB6H12.3和Ab47(图4A和图4B)诱导的血球凝集。
B6H12介导的Fcγ受体活化
在活体内，单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞可经由FcγRIIa、FcγRI和FcγRIIIa介导ADCP。虽然所有三种受体均可参与ADCP，但据信FcγRIIa是这个过程中所涉及的主要Fcγ受体。将经人类FcγRI稳定转染的Jurkat细胞或连接至NFAT-荧光素酶报告体构建体的高亲和力FcγRIIa-H暴露至经渐增浓度的小鼠B6H12、Ab47或hB6H12.3中任一者涂覆的WIL2S细胞。通过荧光素酶产生来监测FcγR活化。结果示于图5A和5B中。涂覆Ab47和hB6H12.3的细胞剂量依赖性地活化FcγRI受体，然而，仅hB6H12.3能够驱动FcγRIIa-H(最密切关联以直接介导ADCP活性的受体)的活化。
抗体介导的细胞吞噬作用中所涉及的抗体介导的Fcγ受体活化是使用稳定地表达FcγRI或FcγRIIa-H(高亲和力H131变体)的工程改造的Jurkat细胞和驱动萤火虫荧光素酶的表达的NFAT反应元件作为效应细胞来评定。通过由NFAT路径活化产生的荧光素酶定量抗体生物活性；通过发光读取值定量效应细胞中的荧光素酶活性(图5A和图5B)。
NK细胞介导的ADCC活性
检查NK细胞介导的抗体依赖型细胞毒性(ADCC)和mB6H12、Ab47和hB6H12.3对FcγRIIIa的活化。将经渐增浓度的抗体涂覆的载铬Wils-2细胞暴露至初级人类自然杀手(NK)细胞4小时并且通过放射性铬释放至组织培养基中来评定特异性溶解。或者，将经渐增浓度的mB6H12、Ab47或hB6H12.3涂覆的Wils-2细胞暴露至稳定地表达FcγRIIIa的高亲和力V/V变体的Jurkat细胞并且以NFAT驱动的荧光素酶活性评定受体活化。hB6H12.3展现相较于Ab47或鼠类B6H12亲本抗体优异的ADCC和FcγRIIIa活化。结果示于图6A和6B中。hB6H12.3的IgG1主链介导ADCC活性并驱动FcγRIII信号传导(一种当前IgG4临床抗体不存在的功能性)。
为进行ADCC测定，将负向选自Astarte Biologics的经纯化的人类NK细胞解冻并以7.2x105个CD16+细胞/Ml(使得70μL含有约5x104个效应细胞)的浓度再悬浮于RPMI/1％FBS中。收集5x106个靶细胞(WIL2S细胞)，离心，并且再悬浮于100μL FBS中。将100μL(约100μCi)Cr-51添加至细胞中并轻轻地混合。将细胞置于37℃CO2-增湿孵育箱中以标记1小时。偶尔轻叩细胞以维持悬浮。用RPMI/1％FBS洗涤细胞三次，小心地将放射性上清液丢弃于适当废物容器中。然后将细胞再悬浮于10mL RPMI/1％FBS中并计数。移出7.2x105个细胞并且悬浮于总体积为10mL的测定培养基中，使得70μL等同于约5x103个靶细胞。
就抗体稀释和板组合来说，在测定培养基(prep@3X)中稀释抗体。将抗体添加至板中，紧接着添加经Cr标记的靶细胞。将70μL和140μL测定培养基代替抗体添加至对照孔中。这些孔分别代表总体和自发释放对照。将靶细胞混合并且将70μL添加至96孔板的每个测试孔和对照孔中。在37℃孵育箱中孵育标靶与抗体30分钟。将70μL(5x104个)效应细胞添加至每个测试孔中。将70μL 3％triton X-100添加至全部的释放孔中并且上下吸移三次而混合。将板恢复至37℃、CO2-增湿孵育箱中维持4小时。
总之，数据证实本发明的新颖人源化抗CD47抗体具有超过鼠类亲本抗体的优异并且意想不到的特性。人源化抗CD47抗体呈现优异的吞噬作用/ADCP能力，如由RBC吞噬作用(图3B)和FcγRII信号传导(图5B)证实。人源化抗CD47抗体呈现优异的细胞溶解/ADCC，如由NK细胞介导的细胞溶解(图6A)和FcγRIII信号传导(图6B)证实。人源化抗CD47抗体呈现优异的FcγRI信号传导(图5A)。最后，人源化抗CD47抗体还呈现优异的毒性型态，如减少的红血球凝集证实，如在血球凝集测定(图4A和图4B)中证实。发现人源化抗CD47抗体hB6H12.3特别有效。
抗CD47抗体的抑制功能
除了阻断吞噬活性以外，CD47与SIRPα之间的相互作用还通过SHP1的活化和下游信号(例如Vav)的失活而减少发炎细胞因子的产生。人类单核细胞经LPS处理以驱动在存在或不存在亲本和各种人源化抗CD47抗体下产生细胞因子。用所有CD47靶抗体处理能够显著增强LPS驱动的细胞因子。较佳细胞因子产生和固有细胞活化的一种结果是驱动二级T细胞反应的能力。已知肿瘤相关巨噬细胞展现无法抑制并且可主动抑制二级T细胞活化的抑制表型。人类单核细胞经分化并且用IL10和MSCF偏极化以将其驱向免疫抑制TAM样表型。这些经分化的单核细胞能够抑制CD3/CD28驱动的自体T细胞增殖。在这个范例中添加抗CD47处理能够活化TAM并且将其移向更多M0/M1表型(CD86/MHCII增加)。参见例如图7A、7B和7C。TAM样表型的这种变化与抑制CD3/CD28介导的T细胞增殖和活化的能力有关。参见例如图7D。
抑制因子测定利用以IL-10分化成肿瘤样巨噬细胞的人类单核细胞与自体T细胞共培养并且评定支持T细胞受体介导的活化的能力。将CD47添加至培养物中并且发现引起巨噬细胞的活化标记物上调，如通过CD86和MHCII的上调所测量。另外，TCR介导的T细胞活化的支持是通过T细胞上的MHCII的上调和IFNγ的分泌来评定(图7A-图7D)。
与其它抗CD47抗体的比较
比较hB6H12.3与其它已知的CD47抗体5F9和CC-9002(参见WO2011/143624)。在比较中，在如上文所描述的相同NFAT-荧光素酶Jurkat细胞测定中测量FcγRI和FcγRII活性。hB6H12.3呈现相对于5F9和CC-90002IgG4抗体(图8A和图8B)优异的活化FcγRI和FcγRII的能力。
另外，如上文所描述测量NK介导的ADCC和IFNγ分泌。再次地，hB6H12.3呈现相对于5F9和CC-90002(图8C和图8D)优异的介导ADCC和刺激IFNγ分泌的能力。
实施例3：具有掩模的人源化抗CD47抗体
使用重组人类MMP裂解经掩蔽的抗体以用于结合和功能研究
通过在37℃下用1.25mM 4-氨基苯基乙酸汞(APMA)孵育1-2小时使重组MMP全部活化。通常，添加1-2μg经活化的rhMMP2至0.25-0.5mg经掩蔽的抗体并且在37℃下孵育4-16小时。采用减少的抗体反相LC-MS使用配备有PLRP-MS 3μm柱(Agilent)的Waters Acquity/Xevo UPLC来评定抗体裂解的程度。使用UNIFI软件(Waters)分析数据。用MMP再活化引起预期裂解位点处的掩模定点裂解。在经掩蔽的抗体完全再活化之后，使用MabSelect SuRe蛋白质A树脂纯化裂解产物，接着用于结合测定。
生成MMP2再活化的经掩蔽的抗体的质谱数据。在用重组人类MMP2裂解之前(图9A)和之后(图9B)的Vel-IPV-hB6H12.3的解卷积轻链质量。完整轻链的预期m/z为28681(观测值：28680.8)。MMP2裂解抗体(LRSG-hB6H12.3)的预期m/z为23969(观测值：23968.4)。
还通过在Expi-HEK或Expi-CHO细胞中瞬时表达来产生N端具有“短”序列的在蛋白水解后将保留的抗CD47抗体。举例来说，就采用IPVS-LRSG MMP裂解序列的经掩蔽的抗体来说，LRSG序列在MMP活化后保留。
基于MMP的裂解序列的蛋白酶特异性的评定
通过在37℃下用1.25mM 4-氨基苯基乙酸汞(APMA)孵育1小时并且长达24小时而使MMP活化。通过在37℃下于50mM乙酸钠、100mM NaCl(pH 4.0)中孵育2小时而使豆蛋白酶活化。
为评定裂解序列的裂解型态，在37℃下用400pmol/min标准化蛋白酶孵育抗体(10μg)过夜，以制造商报告值指示。采用减少的抗体反相LC-MS使用配备有PLRP-MS 3μm柱(Agilent)的Waters Acquity/Xevo UPLC来评定抗体裂解的程度。使用UNIFI软件(Waters)分析数据。
针对一组肿瘤相关蛋白酶(例如人类和鼠类/大鼠MMP、ADAM家族、uPA、间质蛋白酶和豆蛋白酶)测试两个蛋白酶裂解位点(IPV及M2)的蛋白酶裂解型态。另外，还测试通过胞外蛋白酶tPA和因子Xa的序列裂解。在这三个蛋白酶裂解位点处的蛋白酶裂解型态示于表14中。
在37℃下用400pmol/min标准化蛋白酶孵育肽(N端融合至hBU12抗体主链)过夜并且评定裂解。M2位点被大多数MMP以及uPA和间质蛋白酶裂解。IPV位点被除了MMP13以外的几乎所有MMP裂解并且不受其它蛋白酶类别影响。
表14.在两个不同蛋白酶裂解位点处的蛋白酶裂解型态。
Figure BDA0002513470550001111
MMP裂解位点由*指示，而uPA/间质蛋白酶/豆蛋白酶裂解位点由**指示。在任一位点处的裂解足以恢复抗体结合
经掩蔽的抗CD47抗体的饱和结合
进行抗CD47抗体与SW780人类膀胱癌细胞的饱和结合。测试Vel-IPV-掩蔽的hB6H12抗体以及MMP2预活化的比较物。经裂解的Vel-IPV-抗体在抗体N端具有残基-LRSG序列(图10和表15)。
表15.通过饱和结合获得的对SW780细胞的结合亲和力(Kd)的确定(图10)。
Figure BDA0002513470550001112
Figure BDA0002513470550001121
测试Vel-IPV-掩蔽的hB6H12抗体以及MMP2预活化的比较物。经裂解的Vel-IPV-和短-IPV抗体在抗体N端具有残基-LRSG序列。经裂解的抗体经由用MMP2裂解产生，而短-IPV抗体以重组方式产生(图11和表16)。如本文所使用，“短”、“短抗体”或“短抗原结合片段”是指以重组方式产生(即，在无卷曲螺旋结构域下产生并且因此不进行裂解)的MMP或抗体或抗原结合片段裂解后的抗体或抗原结合片段。MMP裂解得到短的氨基酸序列残基。就IPV裂解位点来说，残基(或短)序列应是LRSG或SG。就M2裂解位点来说，残基(或短)序列应是VR。
表16.通过饱和结合获得的对SW780细胞的结合亲和力(Kd)的确定(图11)。
抗体 Kd(nM)
hB6H12.3 19.2
Ab47 8.0
Vel-IPV-hB6H12.3 >2000
短IPV-hB6H12.3 18.1
经裂解的Vel-IPV-hB6H12.3 14.2
进行抗CD47抗体与人类红血球的饱和结合。测试Vel-IPV-掩蔽的hB6H12抗体以及再活化的比较物(短IPV-hB6H12.3或经MMP2裂解的Vel-IPV-hB6H12.3)。经裂解的Vel-IPV-和短-IPV抗体在抗体N端具有残基-LRSG序列。经裂解的抗体经由用MMP2裂解产生，而短IPV抗体以重组方式产生(图12和表17)。
表17.通过饱和结合获得的对人类红血球的结合亲和力(Kd)的确定(图12)。
Figure BDA0002513470550001122
Figure BDA0002513470550001131
通过ELISA进行抗CD47抗体与rhCD47的饱和结合。Vel-IPV-hB6H12.3呈现显著受损的结合。结合可在由rhMMP2裂解后恢复(图13和表18)。
表18.通过ELISA确定对rhCD47的结合亲和力(Kd)(图13)。
抗体 Kd(nM)
hB6H12.3 1.7
Vel-IPV-hB6H12.3 1.7
经裂解的Vel-IPV-hB6H12.3 >250
通过ELISA，用hB6H12.3 G91A(在LCDR3中具有G91A点突变)进行抗CD47抗体与rhCD47的饱和结合。hB6H12.3和hB6H12.3G91A均呈现比Ab47高的Bmax(图14和表19)。
表19.通过ELISA确定对rhCD47的结合亲和力(Kd)(图14)。
抗体 Kd(nM)
Ab47 1.0
hB6H12.3 1.4
hB6H12.3G91A 2.7
进行抗CD47抗体与SW780人类膀胱癌细胞的饱和结合。比较Ab47和hB6H12.3的结合与在LCDR3中具有G91A突变的变体的结合(图15和表20)。
表20.通过饱和结合获得的对SW780人类膀胱癌细胞的结合亲和力(Kd)的确定(图15)。
Figure BDA0002513470550001132
Figure BDA0002513470550001141
进行抗CD47抗体与人类红血球的饱和结合。比较Ab47和hB6H12.3的结合与在LCDR3中具有G91A突变的变体的结合(图16和表21)。
表21.通过饱和结合获得的对红血球的结合亲和力(Kd)的确定(图16)。
抗体 Kd(nM)
Ab47 12.1
Ab47G91A 100.3
hB6H12.3 68.9
hB6H12.3G91A >150
实施例4：体内实验
组织中巨噬细胞浸润的评定可通过包括免疫组织化学(IHC)、西方墨点法、流动式细胞测量术或RNA测序方法的常规方法监测巨噬细胞的表面标记物(包括小鼠巨噬细胞的F4/80，或CD163、CD68或CD11b)来进行。
组织中蛋白酶的评定可使用多种技术(包括监测蛋白酶活性的那些以及可检测蛋白水解活性的那些)来监测。可检测组织中蛋白酶(可包括蛋白酶的非活性形式和活性形式)的存在的常规方法包括IHC、RNA测序、西方墨点法或基于ELISA的方法。可使用额外技术以检测组织中的蛋白酶活性，包括酶谱法、通过荧光显微术的原位酶谱法或荧光蛋白水解底物的使用。另外，可将荧光蛋白水解底物的使用与特定蛋白酶的免疫捕捉组合。另外，针对蛋白酶活性位点的抗体可通过多种技术(包括IHC、荧光显微术、西方墨点法、ELISA或流动式细胞测量术)使用(参见Sela-Passwell等Nature Medicine.18:143-147.2012；LeBeau等Cancer Research.75:1225-1235.2015；Sun等Biochemistry.42:892-900.2003；Shiryaev等2:e80.2013)。
确定抗CD47抗体于NSG小鼠的L428淋巴瘤异种移植肿瘤模型中的活性。这种异种移植模型具有高度巨噬细胞浸润，如通过小鼠F4/80经IHC稳固染色所证明。参见例如图17B。抗体以1或10mg/kg i.p.施用，q4dx4。在整个研究持续期间经掩蔽的抗体Vel-IPV-hB6H12.3和未经掩蔽的抗体Ab47和hB6H12.3在10mg/kg的剂量下均有效地减小肿瘤体积。在1mg/kg的剂量下，Vel-IPV-hB6H12.3和未经掩蔽的hB6H12.3两者均使肿瘤生长延迟。在这种剂量下，经掩蔽的抗体Vel-IPV-hB6H12.3的活性比未经掩蔽的hB6H12.3略小。(图17A)。
确定抗CD47抗体于NSG小鼠的Detroit 562异种移植头颈肿瘤模型中的活性。这种异种移植模型具有高度巨噬细胞浸润，如通过小鼠F4/80经IHC稳固染色所证明。参见图18B。q4dx4，5mg/kg。在整个研究持续期间抗体Ab47、hB6H12.3和Vel-IPV-hB6H12.3有效地减小肿瘤体积(图18A)。
确定抗CD47抗体于NSG小鼠的HT1080异种移植纤维肉瘤肿瘤模型(图19A和19B)和HEPG2异种移植肝细胞肿瘤模型(图19C和19D)中的活性。这些异种移植模型具有低度巨噬细胞浸润，如通过小鼠F4/80经IHC有限的染色所证明。q4dx4，10mg/kg。在整个研究持续时间期间抗体Ab47、hB6H12.3和Vel-IPV-hB6H12.3有效地减小和/或减缓肿瘤体积。
除了评定抗肿瘤活性和其与巨噬细胞浸润的关系以外，已评定这些肿瘤内MMP的水平以及抗体去掩蔽的评定。收集来自异种移植和同基因肿瘤模型的肿瘤并且经受蛋白质和RNA序列评定以监测这些肿瘤内MMP的水平以及理解TME内RNA与蛋白质水平之间的关系。使用Luminex多重平台的蛋白质分析揭示用于研究Vel-IPV-hB6H12.3的抗肿瘤活性的肿瘤均含有稳固水平的MMP2和9两者(表22)。另外，当我们比较肿瘤MMP水平与细胞培养***内所存在的那些时，我们发现在肿瘤部位的MMP水平明显增加，远远超过仅在体外组织培养条件中所观察到的水平(图35A和35B)。
表22.所选肿瘤中的MMP2和MMP9水平(pg/ml)。
Figure BDA0002513470550001161
抗CD47抗体于具有低固有巨噬细胞含量的肿瘤模型中的活性可在与已知驱动巨噬细胞浸润的MMAE奥瑞司他汀ADC组合时得到扩增。这在NSG小鼠的HepG2异种移植肿瘤模型中得到证实。抗CD47抗体在5mg/kg下i.p.施用(q4dx4)，而MMAE ADC在1mg/kg下一次性施用。抗体的组合比单独的任一种抗体更有效地减小肿瘤体积(图20)。利用含奥瑞司他汀(LIV1A和CD30)的其它MMAE的额外实验已证实与针对Liv1A ADC的乳癌异种移植模型MCSF7和针对CD30 ADC的L428淋巴瘤模型(图36A和36B)中抗CD47抗体相似的可组合性。
可使用用于人类hB6H12.3抗体的相同VEL和IPV序列掩蔽小鼠反应性抗CD47抗体mIAP301(Oldenborg等,J.Exp.Med.193:855-861,2001)。利用这些构建体的掩蔽阻断抗体结合至鼠类CD47阳性肿瘤(图21A)并且防止功能性，如通过RBC吞噬作用所测量(图21B)。
抗小鼠CD47抗体mIAP301在以10mg/kg的单次IV剂量施用时驱动BALB/c小鼠中血小板的耗竭。相比之下，这种耗竭在向小鼠施用10mg/kg IV剂量的经掩蔽的Vel-IPV-mIAP301和Vel-M2-mIAP301抗体时未观测到(图22A)。
经掩蔽的Vel-IPV-mIAP301抗体相较于未经掩蔽的mIAP301具有在BALB/c小鼠的血浆中大大改善的药物动力学，证实经掩蔽的抗体能够避免典型抗CD47抗体所遭遇的标靶介导的药物处置。Vel-IPV-mIAP301和mIAP301抗体经由赖氨酸缀合经3H-丙酸盐标记并且以1mg/kg IV剂量向BALB/c小鼠施用。抗体浓度是通过在不同时间点抽取的血浆的闪烁计数来确定(图22B)。mIAP301于血浆中的浓度在15分钟内低于可检测量，而可测量Vel-IPV-mIAP301浓度直至给药后7天。
在带有A20的BALB/c小鼠中使用1和10mg/kg剂量的3H-标记抗体测试经掩蔽的Vel-IPV-mIAP301和Vel-M2-mIAP301以及未经掩蔽的mIAP301的生物分布。在肿瘤已达到250mm3后立刻施用抗体。在指定的时间点，将小鼠杀死并且通过闪烁计数确定抗体于血浆、血液、肿瘤、脾脏和肝脏中的浓度。如图37A和37B中所示，mIAP301于血浆中的浓度在施用后一小时内可忽略不计。然而，当相较于未经掩蔽的mIAP301抗体时，脾脏中存在显著更少的经掩蔽的抗体(图37C和37D)。在肝脏中观察到类似结果。(数据未示出)。相比之下，通过避免正常组织中CD47的标靶介导的处置，经掩蔽的Vel-IPV-mIAP301和Vel-M2-mIAP301抗体证实相较于mIAP301在肿瘤中增加的水平(图37E和37F)。
抗小鼠CD47抗体mIAP301驱动A20淋巴瘤模型中的抗肿瘤活性，但引起伴随的RBC耗竭(图23A和图23B)。经掩蔽的Vel-IPV-mIAP301抗体赋予类似活性，但消除对RBC耗竭的效应。Vel-IPV-mIAP301抗体避免RBC抗原下沉，但也维持肿瘤结合(图23C和图23D)。A20淋巴瘤模型在Donnou等(Advances in Hematology,文章编号701704,2012)和Liu等(NatureMedicine,21:1209-1215,2015)中更详细地描述。
抗小鼠CD47抗体mIAP301驱动MC38结肠癌模型中的抗肿瘤活性，已知MC38结肠癌模型对免疫肿瘤剂具有反应性。这种模型中经掩蔽的mIAP301抗体的活性显示优异的功效，如展现完全反应的动物所表示(图24)。这种动物的再攻毒导致肿瘤的完全排斥，证实诱导长期记忆T细胞反应(数据未示出)。MC38结肠癌模型在Liu等(同上)中更详细地描述。
除了测试人类抗CD47抗体与ADC针对Liv1a或CD30的组合活性以外，我们还评定了与其它免疫调节剂的组合活性。为达成此点，我们进入到免疫完全小鼠***并且利用鼠类靶向抗CD47替代抗体mIAP。使用A20模型，我们证实经掩蔽的抗CD47抗体与抗PD-1替代抗体以及抗SEA-CD40抗体SEA-1C10协同作用。这些数据提供免疫***的先天性和适应性部分与经掩蔽的CD47靶向剂接合能够组合驱动稳固的抗肿瘤反应的证据。
亲本和经掩蔽的抗鼠类CD47抗体mIAP301与抗PD-1替代抗体的组合驱动增加的抗肿瘤活性，这导致4/6动物展现CR反应(参见Dahan等Cancer Cell.28:285-295.2015，参考PD-1抗体，无性系RMP1-14)(图25A)。亲本抗鼠类CD47抗体mIAP301与巨噬细胞活化CD40靶向SEA增强的替代抗体1C10的组合驱动增加的抗肿瘤活性(参见WO2016/069919，参考1C10抗体；参见Lindberg等J.Biol.Chem.269:1567-1570.1994，参考mIAP301抗体)(图25B)。
显示抗CD47与抗PD-1或抗CD40的组合的数据指示抗CD47疗法可增强T细胞活性增强剂的活性，如在检查点抑制剂抗体(抗PD-1抗体)以及增强先天性细胞活性的那些剂(抗CD40抗体或其它CD40抑制剂)的情形中。这支持抗CD47抗体可与诊所中的多种免疫调节剂配对以支持抗肿瘤反应的适应性和先天性部分的观点。
实施例5：经卷曲螺旋结构域掩蔽的抗体
使用向BALB/c小鼠的静脉内施用来评定具有不同卷曲螺旋结构域的经掩蔽的人源化B6H12抗体的稳定性。抗体以5mg/kg给药。在所给定的时间点(3天)，从经给药的小鼠收集血浆。使用IgSelect树脂从血浆中纯化人类抗体。通过SDS-PAGE还原并分离所捕捉的抗体，然后通过西方墨点法使用HRP缀合的抗人类Fc抗体进行探测。通过对应于尺寸相差约5kDa的经掩蔽和未经掩蔽的重链的带的密度测定法来评定经裂解的抗体百分比(图26)。
表23示出了用并入包含重链(SEQ ID NO:2)和轻链(SEQ ID NO:10)的人源化B6H12抗体上的不同卷曲螺旋形成肽对掩蔽的效应并且对不同细胞系进行测试。在本实施例中，抗体也称为Ab47。示出每个抗体的Kd(nM)，Kd(nM)由每个细胞系上的饱和结合得到。每个结合实验使用2000nM的高浓度。如表23中所示，甚至当在大于2微摩尔的浓度下测试时，多种卷曲螺旋结构域能够抑制Ab47结合至细胞表面上表达的CD47，而未经掩蔽的Ab47抗体呈现3.3-21nM的IC50。
在具有人类HT1080纤维肉瘤异种移植物的裸小鼠中评定具有Vel-IPV卷曲螺旋和裂解序列的经掩蔽的人类B6H12抗体的稳定性和活化。抗体以5mg/kg IP给药。在所给定的时间点(1天、3天、4天)，将小鼠杀死并且收集组织和血浆。将组织均质化并且使用IgSelect树脂从生物样品中纯化人类抗体。通过SDS-PAGE还原并分离所捕捉的抗体，然后通过西方墨点法使用HRP缀合的抗人类Fc抗体进行探测。通过对应于尺寸相差约5kDa的经掩蔽和未经掩蔽的重链的带的密度测定法来评定经裂解的抗体百分比(图38A和38B)。在所测试的任何时间点于血浆或肝脏中检测到极少的未经掩蔽的抗体(<5％)。同时，在肿瘤中检测到20-30％以上的裂解，并且最大裂解量出现在给药后3-4天。另外，从经Ab47或Vel-IPV-Ab47处理4或7天的小鼠收集的HT1080肿瘤经受流动式细胞测量术以确定能够结合至肿瘤表达的CD47并饱和的抗体的程度(图38B)。
表23.具有不同抗体掩蔽结构域的人源化B6H12抗体(Ab47)的亲和力(nM)(通过饱和结合流动式细胞测量术得到)。
Figure BDA0002513470550001191
Figure BDA0002513470550001201
人源化抗CD47抗体的活性和药物动力学并证实经由掩蔽改善在石蟹猕猴中的耐 受性
为测试掩蔽改善抗CD47 IgG1抗体变体的药物动力学和耐受性的能力，在石蟹猕猴中实施一系列IV单剂量研究。所测试的抗CD47IgG1抗体与跨越这些物种的表达和序列高度保守的人类和石蟹猕猴CD47具有交叉反应性。通过一组石蟹猕猴和人类组织的原位凝胶酶谱法对蛋白酶活性的评估指示蛋白酶活性水平跨越这些物种也高度保守。此外，石蟹猕猴具有高度相似的FcγR与IgG1抗体的相互作用，并且被视为人类IgG1抗体的效应功能相关效应的毒物学预测，使其成为评估IgG1抗CD47抗体的效应的适合模型(Warncke等J.Immunol.188:4405-4411.2012)。总之，石蟹猕猴代表用于评估单独抗CD47抗体的不同活性并且进一步评估这种活性如何通过掩蔽和经修饰的效应子功能而改变的相关物种。
替代人源化B6H12、Ab47
为确定B6H12对替代人源化IgG1构建体的耐受性和PK并且进一步证实Vel-IPV掩模和裂解序列改变耐受性和药物动力学的能力的概念论证，向未经处理的食蟹猕猴静脉内施用0.1、1、10和30mg/kg替代人源化IgG1 B6H12抗CD47抗体Ab47。相较于人源化IgG4平台上的mB6H12抗体的公开数据(Liu,2015)，基于人源化IgG1的Ab47证实活性增加，如通过血液学分析以红血球质量损失所证实。然而，除了阻断与CD47相互作用以外缺乏实现高ADCC、ADCP和CDC活性的效应功能的IgG4 B6H12证实在石蟹猕猴中高达30mg/kg的剂量的耐受性(Liu,2015)，在大于1mg/kg的剂量下Ab47不具耐受性(图27A)。
Ab47对比Vel-IPV-Ab47
为证实Vel-IPV掩模减小Ab47活性的能力，以0.1、1和10mg/kg的剂量施用食蟹猕猴。尤其，高约10倍的剂量比未经掩蔽的Ab47耐受性更好，如通过从经1.0mg/kg Ab47和10mg/kg Vel-IPV-Ab47处理的动物中收集用于血液学分析的血液样品中的相似红血球质量损失水平所证实(图27B)。经Ab47处理的动物证实与血球溶解性和耐受性缺失相关的一致临床征兆(红色泌尿生殖器***物、经血球溶解的样品、呕吐和活动过少)，而在经掩蔽的抗体处理的动物中观测到完全没有不良临床征兆。经掩蔽的Ab47的这种耐受性增加还证实掩蔽减小循环血浆细胞因子(例如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1))的增加的能力。Vel-IPV-Ab47的最高测试剂量(10mg/kg)证实类似于对照和Ab47的最低测试剂量(0.1mg/kg)的水平(图39A)。另外，掩蔽显著改善分子的PK。在研究第3天Ab47的1mg/kg剂量低于Generic TAb(总抗体)测定的检测限的情况下，在整个研究过程中、研究第15天，1mg/kg Vel-IPV-Ab47是可检测的(图28)。Generic TAb ELISA使用经结合至Ab47和Vel-IPV-Ab47的人类轻链κ的抗人类轻链κmAb包被的96孔微量滴定板。抗人类轻链κmAb不与食蟹猕猴轻链κ交叉反应。用未经处理的汇集的食蟹猕猴K2EDTA血浆将研究样品稀释至动力学测定范围内，对于Ab47(10(LLOQ)至1280ng/mL(ULOQ))，或对于Vel-IPV-Ab47(20(LLOQ)至2560ng/mL(ULOQ))。经稀释的样品连同QC和校准器经受分析缓冲液的1:20最低所需稀释(MRD)，接着添加至经封闭并洗涤的板中。在室温下孵育1小时后，洗涤板并且用生物素化抗人类轻链κmAb(与捕捉剂相同的无性系)检测经结合的分析物(Ab47或Vel-IPV-Ab47)，接着添加缀合至链霉亲和素的聚合物辣根过氧化物酶(聚-HRP-SA)。在孵育和洗涤后，将HRP底物3,3',5,5'-四甲基-联苯胺(TMB)添加至板中并且显色10分钟。通过1N HCl停止反应并且在Spectromax M5板式读取器上于450nm-630nm下读取板。将净吸光度值输入Watson LIMS版本7.4.2中并且进行5-PL非线性回归以将吸光度换算成样品中存在的ng/mL总抗体。
Ab47对比hB6H12.3
将人源化B6H12.3(其特征为差示Kd、增加的Bmax和减少的血球凝集)以1mg/kg剂量单次IV快速注射向食蟹猕猴施用以测试差示活体内活性。虽然1mg/kg的hB6H12.3和Ab47均导致类似的红血球耗竭水平(图29)，但Ab47还证实在1mg/kg下耗竭至给药前血小板水平的约40％，而hB6H12.3具有仅20％耗竭，类似于可能由于采样偏差造成的对照水平(图30)。在用两种抗体处理后，在研究第7天开始血小板出现增加，这可能是由于一般刺激骨髓造成。
hB6H12.3对比Vel-IPV-hB6H12
为证实Vel-IPV掩模减小hB6H12.3活性的能力，向食蟹猕猴施用10和20mg/kg抗体的剂量。20mg/kg(最高测试剂量)的血液学测试证实红血球质量损失降低，与用1mg/kghB6H12.3所观测到的类似，然而，在低20倍的剂量下比未经掩蔽的hB6H12.3的耐受性增加(图31)。类似地，hB6H12.3的掩蔽还证实循环细胞因子(包括MCP-1)减少，需要20倍的经掩蔽的hB6H12.3的剂量以产生与通过未经掩蔽的hB6H12.3所达成的那些反应类似的反应(图39B)。施用Vel-IPV-hB6H12.3的动物未出现与治疗相关的临床症状，而通过1mg/kg的未经掩蔽的hB6H12.3观测到与血球溶解性相关的临床症状。使用Generic TAb ELISA的药物动力学分析证实相较于未经掩蔽的hB6H12.3改善的药物动力学型态(图39C)。
Vel-IPV-hB6H12.3对比SEA-Vel-IPV-hB6H12.3
为进一步增强经IgG1掩蔽的抗CD47抗体Vel-IPV-hB6H12.3的活性，所述抗体是利用产生糖工程改造的抗体、SEA、具有增强效应功能的非岩藻糖基化抗体的SeattleGenetics专属技术(US 8,163,551)来产生。在高(Detroit562)和低(HT1080)巨噬细胞模型中评定Vel-IPV-hB6H12.3和SEA-Vel-IPV-hB6H12.3以及岩藻糖基化和非岩藻糖基化SEAhB6H12.3的异种移植模型中的相对抗肿瘤活性。去除核心岩藻糖基化以及所得SEA-hB6H12.3和SEA-Vel-IPV-hB6H12.3在任一种模型中均未提供有益于抗肿瘤活性的证据(图40A和40B)。因为这些模型在免疫不完全小鼠中运作，其可能无法充分利用通过SEA主链赋予的增强的效应功能，所以鼠类替代抗体mIAP301也是非岩藻糖基化的，并且在高活性A20同基因淋巴瘤模型以及较低活性CT26同基因模型中测试岩藻糖基化和非岩藻糖基化vel-IPV-mIAP301的抗肿瘤活性。去除核心岩藻糖以产生SEA抗体似乎并不赋予额外的抗肿瘤效益。
虽然利用其它抗体的SEA技术已导致增加的活性，但当掩蔽抗体时，SEA和非SEA两种型式均良好耐受，在血液学分析中具有类似红血球质量损失，达到相同最大测试剂量水平20mg/kg(图32)。在用任一种抗体处理期间未观测到不良临床征兆，然而，就SEA抗体来说，循环MCP-1细胞因子水平增加(图41A)。使用Generic TAb ELISA的药物动力学分析证实SEA与无SEA Vel-IPV-hB6H12.3抗体之间的药物动力学型态一般是类似的，并且相较于未经掩蔽的hB6H12.3均改善(图41B)。
实施例6：以所选生物标记物治疗受试者的肿瘤
本公开进一步设想用本发明的抗CD47抗体基于患有肿瘤的受试者内的所选生物标记物治疗所述受试者。用本发明的抗CD47抗体治疗的受试者的选择将基于1)肿瘤组织相对于周围非肿瘤组织较高的MMP水平和活性；2)肿瘤组织相对于周围非肿瘤组织较高的CD47表达水平；以及3)肿瘤组织相对于周围非肿瘤组织较高的巨噬细胞浸润水平。
确定所选生物标记物的水平和活性的方法包括免疫组织化学和酶学分析。举例来说，巨噬细胞浸润水平可通过免疫组织化学使用抗CD163抗体作为标记物来确定。
为证实检测肿瘤对比非肿瘤组织样品中肿瘤浸润巨噬细胞的能力，使用乳癌核心样品和正常***组织样品。使用抗CD163抗体进行免疫组织化学。结果证实相对于非肿瘤样品，可轻易地在肿瘤样品中检测到肿瘤浸润巨噬细胞(图33)。
实施例7：Vel-IPV-hB6H12.3对CD47阳性细胞的吞噬作用和血球凝集
监测CD47阳性RBC的吞噬作用以评估掩蔽对抗体功能性的影响。人类红血球用荧光红PKH染料标记并且用1μg/mL未经掩蔽的hB6H12.3、经掩蔽的Vel-IPV-hB6H12.3或MMP活化的Vel-IPV-hB6H12.3调理30分钟。洗涤红血球，然后用单核细胞巨噬细胞以10:1比率孵育两小时。然后用ACK低渗溶解缓冲液洗涤样品三次。通过经由流动式细胞测量术监测人类巨噬细胞对经荧光标记的人类RBC的吸收来评估吞噬作用的程度。
如图42中所示，经掩蔽的Vel-IPV-hB6H12.3并未展示吞噬作用增加超过未处理的RBC的背景水平，而hB6H12.3和MMP活化的Vel-IPV-hB6H12.3均显示类似的RBC吞噬作用的水平。
如实施例2中所描述测试经掩蔽的Ab47抗体对人类RBC的血球凝集的促进。在37℃下将人类RBC暴露至渐增浓度的经掩蔽的Vel-IPV-Ab47或经MMP裂解的Vel-IPV-Ab47三十分钟。通过光学评定每个孔内视光点的直径来监测血球凝集。
如图43中所示，当Ab47经掩蔽时血球凝集受抑制，并且当通过MMP去除掩模时血球凝集恢复。
实施例8：hB6H12.3直接诱导细胞凋亡
细胞表面CD47接合可诱导细胞凋亡。已报告抗CD47 mAb无性系B6H12仅在固定至表面时可诱导细胞凋亡；然而，hB6H12.3在未结合至表面下证实细胞凋亡活性。将八种不同的细胞系(A431、HEK293、Hela、HepG2、HPAF11、I540Cy、MCF7和THP1)各自以每孔50,000个细胞涂板24小时。用浓度为5至0.05μg/mL的hB6H12.3、5F9或IgG1同型对照处理细胞18小时。然后收集细胞，洗涤两次，用细胞凋亡标记物膜联蛋白V染色，并且使用流动式细胞测量术定量细胞凋亡。
如图44中所示，在所有八种细胞类型中，经hB6H12.3处理的细胞比经5F9或IgG1同型对照处理的相同类型的细胞展现更高的细胞凋亡水平，如通过膜联蛋白染色的相对水平确定。
实施例9：全血和血浆中的hB6H12.3稳定性
自BioIVT获得从患有各种类型癌症的17位患者(10位肉瘤、3位NSCLC、3位结肠癌和1位黑色素瘤)新鲜收集的全血样品(4％柠檬酸钠)。用荧光素异硫氰酸酯(FITC)直接标记hB6H12.3和经掩蔽的Vel-IPV-hB6H12.3抗体。在37℃下用渐增浓度(最大浓度20μg/ml)的经FITC标记的hB6H12.3或经FITC标记的经掩蔽的Vel-IPV-hB6H12.3孵育新鲜全血样品20小时。通过流动式细胞测量术表征抗体与血球的结合。
使用每个肉瘤全血样品的一部分以提取血浆，并且将20μg/mL重组CD47添加至血浆样品中。然后在37℃下用20μg/mL hB6H12.3或经掩蔽的Vel-IPV-hB6H12.3孵育含有重组CD47的血浆样品四天。如实施例2中所描述，使用CD47结合ELISA评定Vel-IPV掩模的裂解程度。Vel-IPV-hB6H12.3在外加至血浆中的浓度(20μg/mL)下不结合至重组CD47；因此，在经Vel-IPV-hB6H12.3孵育的血浆中所检测到的任何抗体-CD47结合是归因于经裂解的Vel-IPV-hB6H12.3与CD47的结合。
在所测试的17个血液样品中，经掩蔽的Vel-IPV-hB6H12.3显示在最高浓度下时仅与一个离群样品结合超过10％(肉瘤，参见图45B)。在其它16个样品中的任一者中均未检测到被经掩蔽的Vel-IPV-hB6H12.3结合(代表性数据示于图45A中)。如图45C中所示，在患有肉瘤的患者的十个血浆样品中的任一者中，经掩蔽的Vel-IPV-hB6H12.3裂解不大于2％。
实施例10：响应hB6H12.3的细胞因子产生
在37℃下用渐增浓度(最大浓度，20μg/ml)的经FITC标记的hB6H12.3或经FITC标记的Vel-IPV-hB6H12.3或用0.1μg/mL LPS孵育来自癌症患者(10位肉瘤、3位NSCLC、3位结肠癌和1位黑色素瘤)的新鲜全血样品20小时。使用38-plex细胞因子和趋化因子磁珠组评定细胞因子水平。
在大多数所测试患者样品中，通过hB6H12.3诱导产生适量的细胞因子，但通过Vel-IPV-hB6H12.3诱导产生最少的细胞因子。细胞因子IP-10、IL1-Ra、MIP-1α和MIP-1α最常由hB6H12.3诱导。在所测试的hB6H12.3的最大浓度下，IL1-Ra(图46B)、MIP-1α和MIP-1β的水平低于200pg/mL，而IP-10水平达到4000-5000ng/mL(图46A)。在所有情况下，通过Vel-IPV-hB6H12.3产生的细胞因子水平低于通过hB6H12.3产生的细胞因子水平，并且通常低100-1000倍。
实施例11：hB6H12.3在体内诱导细胞凋亡
向带有人类HT1080纤维肉瘤异种移植物的裸小鼠在肿瘤达到200mm3时施用5mg/kg IP剂量的hB6H12.3、Vel-IPV-hB6H12.3或hIgG1同型对照。在所给定的时间点(24和96小时)，将小鼠杀死并且收集肿瘤。将肿瘤均质化并且将人类HT1080异种移植纤维肉瘤肿瘤细胞以1百万个细胞/ml再悬浮于1X膜联蛋白V染色缓冲液(包含50mM HEPES、700mM NaCl、12.5mM CaCl2(pH7.4)1:10稀释于水中的10x染色缓冲液)中。将细胞转移至圆底96孔板(100μl/孔)中并且将5μl FITC膜联蛋白V染色试剂和1μl 100μg/ml紫外线活/死染色缓冲液添加至每个孔中。在室温下将细胞染色30分钟。样品于1550g下离心5分钟，去除上清液，并且用1X冰冷膜联蛋白V染色缓冲液洗涤细胞3次。将细胞再悬浮于100μl 1X膜联蛋白V染色缓冲液中。细胞凋亡是在LSRII细胞计数器上通过流动式细胞测量术以对膜联蛋白V结合至表面磷脂酰丝氨酸呈阳性的细胞百分比来评定。用活/死染色剂阳性染色的细胞排除在分析之外。
如图47中所示，经hB6H12.3和Vel-IPV-hB6H12.3处理的肿瘤相较于未处理的肿瘤样品和经同型对照处理的肿瘤样品在处理后96小时展现增加的膜联蛋白V+凋亡细胞。
某些非限制性实施方案
实施方案1.一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含：
以SEQ ID NO:16(GYGMS)、17(TITSGGTYTYYPDSVKG)和18(SLAGNAMDY)所列的CDR；以及
以SEQ ID NO:88所列的人类IGHV3-23/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H44、H49、H82、H89、H91和H94是供体残基。
实施方案2.一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含：
以SEQ ID NO:16(GYGMS)、17(TITSGGTYTYYPDSVKG)和18(SLAGNAMDY)所列的CDR；以及
以SEQ ID NO:89所列的人类IGHV3-48/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基。
实施方案3.一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含：
以SEQ ID NO:16(GYGMS)、17(TITSGGTYTYYPDSVKG)和18(SLAGNAMDY)所列的CDR；以及
以SEQ ID NO:90所列的人类IGHV3-66/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H29、H49和H82是供体残基。
实施方案4.一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含：
以SEQ ID NO:16(GYGMS)、17(TITSGGTYTYYPDSVKG)和18(SLAGNAMDY)所列的CDR；以及
以SEQ ID NO:91所列的人类IGHV3-74/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基。
实施方案5.如实施方案1至4中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含：
以SEQ ID NO:31(RASQTISDYLH)、32(FASQSIS)和33(QNGHGFPRT)所列的CDR；以及
以SEQ ID NO:92所列的人类IGKV6-21/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L4、L21、L69和L85是供体残基。
实施方案6.如实施方案1至4中任一项所述的人源化抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含：
以SEQ ID NO:31(RASQTISDYLH)、32(FASQSIS)和33(QNGHGFPRT)所列的CDR；以及
以SEQ ID NO:93所列的人类IGKV1-27/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L21、L49和L69是供体残基。
实施方案7.如实施方案1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中根据Kabat编号，H29被F所占据，H44被R或G所占据，H49被A所占据，H82被M或I所占据，H89被I或V所占据，H91被F或Y所占据，并且H94被R所占据。
实施方案8.如实施方案5所述的抗体或抗原结合片段，其中根据Kabat编号，L4被M所占据，L21被L所占据，L49被K所占据，L69被T或S所占据，L85被V或T所占据。
实施方案9.如实施方案1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8中的任一者具有至少90％序列同一性的重链可变区(HCVR)以及与SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15中的任一者具有至少90％序列同一性的轻链可变区(LCVR)。
实施方案10.如实施方案5所述的抗体或抗原结合片段，根据Kabat编号，所述抗体或抗原结合片段还包含LCDR3中的G91A突变。
实施方案11.如实施方案1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是IgG1同型物。
实施方案12.如实施方案1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段相较于其亲本抗体具有增强的抗体依赖型细胞毒性(ADCC)。
实施方案13.如实施方案1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段相较于其亲本抗体具有增强的抗体依赖型细胞吞噬作用(ADCP)。
实施方案14.如实施方案1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段相较于其亲本抗体具有减少的核心岩藻糖基化。
实施方案15.如实施方案1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段阻断CD47与SIRPα之间的相互作用。
实施方案16.如实施方案1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段相较于其亲本抗体具有减少的红血球凝集。
实施方案17.一种核酸序列，所述核酸序列编码如实施方案1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
实施方案18.如实施方案1所述的抗原结合片段，所述抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、双功能抗体、单链抗体、scFv片段或scFv-Fc。
实施方案19.一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含掩蔽剂的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述掩蔽剂包含一个或多个卷曲螺旋肽，所述一个或多个卷曲螺旋肽相较于无所述掩蔽剂的所述抗体或其抗原结合片段减小所述抗体或抗原结合片段对人类CD47的结合亲和力。
实施方案20.如实施方案19所述的方法，其中可蛋白酶裂解的连接子将所述掩蔽剂连接至所述抗体或其抗原结合片段。
实施方案21.如实施方案20所述的方法，其中所述可蛋白酶裂解的连接子具有包含IPVSLRSG(SEQ ID NO:73)或GPLGVR(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列。
实施方案22.如实施方案20所述的方法，其中所述可蛋白酶裂解的连接子包含基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点。
实施方案23.如实施方案22所述的方法，其中所述MMP裂解位点选自由MMP2裂解位点、MMP7裂解位点、MMP9裂解位点和MMP13裂解位点组成的组。
实施方案24.如实施方案22所述的方法，其中MMP裂解位点在肿瘤微环境中由MMP裂解之后，所述掩蔽剂从所述抗CD47抗体或其抗原结合片段释放。
实施方案25.如实施方案24所述的方法，其中所述经裂解的抗CD47抗体具有所述MMP裂解位点的短氨基酸残基。
实施方案26.如实施方案25所述的方法，其中所述短氨基酸残基包含在所述抗体的N端的LRSG、SG或VR序列。
实施方案27.如实施方案19所述的方法，其中一个或多个所述卷曲螺旋肽包含选自由SEQ ID NO:44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55和56组成的组的一个或多个序列。
实施方案28.如实施方案19所述的方法，其中相较于无所述掩蔽剂的所述抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段与CD47的结合减少至少约100倍。
实施方案29.如实施方案19所述的方法，其中相较于无所述掩蔽剂的所述抗体或其抗原结合片段，抗体或抗原结合片段与CD47的结合减少约200倍与约1500倍之间。
实施方案30.如实施方案19所述的方法，其中所述CD47表达癌症是引起实体癌症的血液癌症。
实施方案31.如实施方案30所述的方法，其中所述血液癌症选自由以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、B淋巴母细胞性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤、瑞特氏综合征、滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓纤维化、真性红血球增多症、皮肤T细胞淋巴瘤、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、脊髓发育不良综合征(MDS)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)和间变性大细胞淋巴瘤。
实施方案32.如实施方案19所述的方法，其中所述CD47表达癌症是实体肿瘤。
实施方案33.如实施方案32所述的方法，其中所述实体肿瘤选自由以下组成的组：肺癌、胰脏癌、乳癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、脊椎癌、脑癌、子***、子宫内膜癌、结肠/直肠癌、***癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠癌、皮肤癌、***癌、垂体癌、胃癌、子宫癌、***癌和甲状腺癌。
实施方案34.如实施方案32所述的方法，其中所述实体肿瘤选自由肺癌、软组织肉瘤、结肠直肠癌、头颈癌和乳癌组成的组。
实施方案35.如实施方案19所述的方法，其中所述受试者是罹患实体癌症的人类。
实施方案36.如实施方案19所述的方法，其中所述抗CD47抗体与选自以下一者或多者的免疫检查点分子的抑制剂组合施用：程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序化死亡配体1(PD-L1)、PD-L2、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM-1)、CEACAM-5、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白血球相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、CD160、2B4或TGFR。
实施方案37.一种特异性结合至人类CD47蛋白质的包含掩蔽剂的抗体或其抗原结合片段，其中所述掩蔽剂包含一个或多个卷曲螺旋肽，所述一个或多个卷曲螺旋包含SEQID NO:95(QGASTTVAQL EEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGS)和/或SEQ ID NO:94(QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGS)的序列，并且其中相较于无所述掩蔽剂的所述抗体或其抗原结合片段，所述一个或多个卷曲螺旋肽减小所述抗体或抗原结合片段对人类CD47蛋白质的结合亲和力。
实施方案38.如实施方案37所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8中的任一者具有至少90％序列同一性的重链可变区(HCVR)以及与SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15中的任一者具有至少90％序列同一性的轻链可变区(LCVR)。
实施方案39.如实施方案37所述的抗体或抗原结合片段，其中所述掩蔽剂经由可蛋白酶裂解的连接子连接至所述抗体或其抗原结合片段。
实施方案40.如实施方案39所述的抗体或抗原结合片段，其中所述可蛋白酶裂解的连接子具有包含IPVSLRSG(SEQ ID NO:73)或GPLGVR(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列。
实施方案41.如实施方案39所述的抗体或抗原结合片段，其中所述可蛋白酶裂解的连接子包含基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点。
实施方案42.如实施方案41所述的抗体或抗原结合片段，其中所述MMP裂解位点选自由MMP2裂解位点、MMP7裂解位点、MMP9裂解位点和MMP13裂解位点组成的组。
实施方案43.如实施方案37所述的抗体，其中所述掩蔽剂是在MMP裂解位点由MMP裂解之后从所述抗CD47抗体去除。
实施方案44.如实施方案43所述的抗体，其中所述抗CD47抗体在MMP裂解位点由MMP裂解之后具有所述MMP裂解位点的短氨基酸残基。
实施方案45.如实施方案44所述的抗体，其中所述短氨基酸残基包含在所述抗体的N端的LRSG、SG或VR序列。
实施方案46.如实施方案37所述的抗体或抗原结合片段，其中相较于无所述掩蔽剂的所述抗体或其抗原结合片段，结合减少至少约100倍。
实施方案47.如实施方案37所述的抗体或抗原结合片段，其中相较于无所述掩蔽剂的所述抗体或其抗原结合片段，所述结合减少约200倍与约1500倍之间。
实施方案48.如实施方案37所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:42的重链序列和SEQ ID NO:43的轻链序列。
实施方案49.如实施方案37至48中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含变体Fc区，所述变体Fc区赋予选自ADCC和/或CDC活性的增强的效应功能。
实施方案50.如实施方案49所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段经去岩藻糖基化。
实施方案51.一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG1同型物。
实施方案52.如实施方案51所述的抗体，所述抗体包含增强的ADCC、增强的ADCP和/或增强的CDC活性。
实施方案53.一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将所述受试者鉴定为具有所述癌症相对于周围非癌组织升高的MMP水平；以及
b)向所述受试者施用治疗有效量的包含掩蔽剂的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述掩蔽剂包含卷曲螺旋肽，如果所述受试者具有所述癌症相对于周围非癌组织升高的MMP水平，那么相较于无所述掩蔽剂的所述抗体或其抗原结合片段，所述卷曲螺旋肽减小所述抗体或抗原结合片段对人类CD47的结合亲和力。
实施方案54.如实施方案53所述的方法，其中所述MMP选自由以下组成的组：MMP2、MMP7、MMP9和MMP13。
实施方案55.如实施方案53所述的方法，其中步骤a)包括：
i)从所述受试者分离癌组织和非癌组织；
ii)检测所分离的癌组织和非癌组织中的MMP；以及
iii)比较所述癌组织相对于所述非癌组织中的染色量。
实施方案56.一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将所述受试者鉴定为具有所述癌症相对于周围非癌组织升高的CD47水平；以及
b)向所述受试者施用治疗有效量的包含掩蔽剂的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述掩蔽剂包含卷曲螺旋肽，如果所述受试者具有所述癌症相对于周围非癌组织升高的CD47水平，那么相较于无所述掩蔽剂的所述抗体或其抗原结合片段，所述卷曲螺旋肽减小所述抗体或抗原结合片段对人类CD47的结合亲和力。
实施方案57.如实施方案56所述的方法，其中步骤a)包括：
i)从所述受试者分离癌组织和周围非癌组织；
ii)检测所分离的癌组织和周围非癌组织中的CD47；以及
iii)相对于所述非癌组织中的CD47染色来比较所述癌组织中的CD47染色量。
实施方案58.一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将所述受试者鉴定为具有癌组织相对于非癌组织升高的巨噬细胞浸润水平；以及
b)向所述受试者施用治疗有效量的包含掩蔽剂的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述掩蔽剂包含一个或多个卷曲螺旋肽，如果所述受试者具有所述癌症相对于所述非癌组织升高的巨噬细胞浸润水平，那么相较于无所述掩蔽剂的所述抗体或其抗原结合片段，所述一个或多个卷曲螺旋肽减小所述抗体或抗原结合片段对人类CD47的结合亲和力。
实施方案59.如实施方案58所述的方法，其中步骤a)包括：
i)从所述受试者分离癌组织和周围非癌组织；
ii)检测所分离的癌组织和非癌组织中的巨噬细胞；以及
iii)比较所述癌组织相对于所述非癌组织中的染色量。
实施方案60.如实施方案58所述的方法，其中所述巨噬细胞染色是利用抗CD163抗体进行。
实施方案61.一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8中的任一者具有至少90％序列同一性的重链可变区(HCVR)以及与SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15中的任一者具有至少90％序列同一性的轻链可变区(LCVR)，其中所述抗体还包含在HCVR和/或LCVR的N端的序列LRSG、SG或VR。
实施方案62.一种通过施用如实施方案37所述的经掩蔽的CD47抗体与激动性CD40抗体的组合来治疗癌症的方法。
实施方案63.如实施方案62所述的方法，其中所述激动性CD40抗体具有低的岩藻糖基化水平，例如，SEA-CD40抗体。
实施方案64.一种通过施用如实施方案37所述的经掩蔽的CD47抗体与抗体药物缀合物(ADC)的组合来治疗癌症的方法，其中所述ADC的所述抗体特异性结合至癌细胞的细胞外表面上表达的蛋白质并且所述抗体缀合至包含细胞毒性剂的药物-连接子。
实施方案65.如实施方案64所述的方法，其中所述细胞毒性剂是奥瑞司他汀。
实施方案66.如实施方案64所述的方法，其中所述ADC的所述抗体缀合至选自由vcMMAE和mcMMAF组成的组的药物连接子。
序列表
<110> 西雅图基因公司(Seattle Genetics, Inc.)
<120> CD47抗体及其用于治疗癌症的用途
<130> 01218-0002-00PCT
<150> US 62/593,712
<151> 2017-12-01
<160> 95
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 未知(unknown)
<220>
<223> 鼠类
<400> 1
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1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
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115
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化重链可变区
<400> 2
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1 5 10 15
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20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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50 55 60
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化重链可变区
<400> 3
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化重链可变区
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化重链可变区
<400> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化重链可变区
<400> 6
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化重链可变区
<400> 7
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化重链可变区
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 108
<212> PRT
<213> 未知(unknown)
<220>
<223> 鼠类
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化轻链可变区
<400> 10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 11
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化轻链可变区
<400> 11
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 12
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化轻链可变区
<400> 12
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 13
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化轻链可变区
<400> 13
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 14
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化轻链可变区
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 15
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化轻链可变区
<400> 15
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala His Gly Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 16
Gly Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 17
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 18
Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 19
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 20
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 21
Ser Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 22
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 23
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 24
Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 25
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 26
Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr
1 5
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 27
Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 28
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 29
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链CDR序列
<400> 30
Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Ile
1 5
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链CDR序列
<400> 31
Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His
1 5 10
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链CDR序列
<400> 32
Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链CDR序列
<400> 33
Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链CDR序列
<400> 34
Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链CDR序列
<400> 35
Phe Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链CDR序列
<400> 36
Gln Asn Ala His Gly Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链CDR序列
<400> 37
Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
1 5
<210> 38
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链CDR序列
<400> 38
Phe Ala Ser
1
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链CDR序列
<400> 39
Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链CDR序列
<400> 40
Gln Thr Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链CDR序列
<400> 41
Gln Asn Ala His Gly Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 42
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 经掩蔽的重链
<400> 42
Gln Gly Ala Ser Thr Ser Val Asp Glu Leu Gln Ala Glu Val Asp Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asp Glu Asn Tyr Ala Leu Lys Thr Lys Val Ala Gln Leu Arg
20 25 30
Lys Lys Val Glu Lys Leu Gly Ser Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly
35 40 45
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
50 55 60
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
65 70 75 80
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
85 90 95
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
100 105 110
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
115 120 125
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
130 135 140
Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
145 150 155 160
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
165 170 175
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
180 185 190
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
195 200 205
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
210 215 220
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
225 230 235 240
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
245 250 255
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
260 265 270
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
275 280 285
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
290 295 300
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
305 310 315 320
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
325 330 335
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
340 345 350
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
355 360 365
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
370 375 380
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
385 390 395 400
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
405 410 415
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
420 425 430
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
435 440 445
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
450 455 460
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
465 470 475 480
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
485
<210> 43
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 经掩蔽的轻链
<400> 43
Gln Gly Ala Ser Thr Thr Val Ala Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Ala Glu Asn Tyr Glu Leu Lys Ser Glu Val Gln Arg Leu Glu
20 25 30
Glu Gln Val Ala Gln Leu Gly Ser Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly
35 40 45
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
50 55 60
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
65 70 75 80
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
85 90 95
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
115 120 125
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg
130 135 140
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
145 150 155 160
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
165 170 175
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
180 185 190
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
195 200 205
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
210 215 220
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
225 230 235 240
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
245 250 255
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
260
<210> 44
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 44
Gly Ala Ser Thr Ser Val Asp Glu Leu Gln Ala Glu Val Asp Gln Leu
1 5 10 15
Gln Asp Glu Asn Tyr Ala Leu Lys Thr Lys Val Ala Gln Leu Arg Lys
20 25 30
Lys Val Glu Lys Leu Ser Glu Gly Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Val
35 40 45
Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50
<210> 45
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 45
Gly Ala Ser Thr Thr Val Ala Gln Leu Arg Glu Arg Val Lys Thr Leu
1 5 10 15
Arg Ala Gln Asn Tyr Glu Leu Glu Ser Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu
20 25 30
Gln Val Ala Gln Leu Ala Ser Gly Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Val
35 40 45
Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50
<210> 46
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 46
Leu Glu Ile Glu Ala Ala Phe Leu Glu Arg Glu Asn Thr Ala Leu Glu
1 5 10 15
Thr Arg Val Ala Glu Leu Arg Gln Arg Val Gln Arg Ala Arg Asn Arg
20 25 30
Val Ser Gln Tyr Arg Thr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly
35 40 45
Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50 55
<210> 47
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 47
Leu Glu Ile Arg Ala Ala Phe Leu Arg Gln Arg Asn Thr Ala Leu Arg
1 5 10 15
Thr Glu Val Ala Glu Leu Glu Gln Glu Val Gln Arg Leu Glu Asn Glu
20 25 30
Val Ser Gln Tyr Glu Thr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly
35 40 45
Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50 55
<210> 48
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 48
Leu Glu Ile Arg Ala Ala Phe Leu Arg Arg Arg Asn Thr Ala Leu Arg
1 5 10 15
Thr Arg Val Ala Glu Leu Arg Gln Arg Val Gln Arg Leu Arg Asn Ile
20 25 30
Val Ser Gln Tyr Glu Thr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Leu
35 40 45
Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50 55
<210> 49
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 49
Leu Glu Ile Glu Ala Ala Phe Leu Glu Gln Glu Asn Thr Ala Leu Glu
1 5 10 15
Thr Glu Val Ala Glu Leu Glu Gln Glu Val Gln Arg Leu Glu Asn Ile
20 25 30
Val Ser Gln Tyr Glu Thr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Leu
35 40 45
Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50 55
<210> 50
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 50
Gly Ala Ser Thr Ser Val Asp Glu Leu Gln Ala Glu Val Asp Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asp Glu Asn Tyr Ala Leu Lys Thr Lys Val Ala Gln Leu Arg Lys
20 25 30
Lys Val Glu Lys Leu Gly Ser Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly
35 40 45
<210> 51
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 51
Gly Ala Ser Thr Thr Val Ala Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu
1 5 10 15
Arg Ala Glu Asn Tyr Glu Leu Lys Ser Glu Val Gln Arg Leu Glu Glu
20 25 30
Gln Val Ala Gln Leu Gly Ser Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly
35 40 45
<210> 52
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 52
Gly Ala Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp
1 5 10 15
Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys
20 25 30
Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50 55
<210> 53
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 53
Gly Ala Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala
1 5 10 15
Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val
20 25 30
Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50 55
<210> 54
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 54
Gly Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gln Lys Ile Ala Ala Leu Lys Tyr Lys
1 5 10 15
Asn Ala Ala Leu Lys Lys Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gln Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 55
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 55
Gly Glu Ile Ala Ala Leu Glu Gln Glu Ile Ala Ala Leu Glu Lys Glu
1 5 10 15
Asn Ala Ala Leu Glu Trp Glu Ile Ala Ala Leu Glu Gln Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 56
<400> 56
000
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶裂解序列
<400> 57
Gly Pro Leu Gly Val Arg
1 5
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛋白酶裂解序列
<400> 58
Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly
1 5
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性连接子
<400> 59
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 60
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性连接子
<400> 60
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性连接子
<400> 61
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 62
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性连接子
<400> 62
Gly Gly Ala Ala
1
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性连接子
<400> 63
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性连接子
<400> 64
Leu Ala Ala Ala Ala
1 5
<210> 65
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性连接子
<400> 65
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性连接子
<400> 66
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性连接子
<400> 67
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 68
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性连接子
<400> 68
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性连接子
<400> 69
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性连接子
<400> 70
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性蛋白酶位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> Xaa可为任何天然产生的氨基酸
<400> 71
Pro Leu Gly Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 72
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性蛋白酶位点
<400> 72
Pro Leu Gly Val Arg
1 5
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性蛋白酶位点
<400> 73
Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly
1 5
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 例示性蛋白酶位点
<400> 74
Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn Tyr
1 5
<210> 75
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 75
Glu Ala Cys Gly Ala Ser Thr Ser Val Asp Glu Leu Gln Ala Glu Val
1 5 10 15
Asp Gln Leu Gln Asp Glu Asn Tyr Ala Leu Lys Thr Lys Val Ala Gln
20 25 30
Leu Arg Lys Lys Val Glu Lys Leu Ser Glu Gly Gly Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50 55
<210> 76
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 76
Glu Ala Cys Gly Ala Ser Thr Thr Val Ala Gln Leu Arg Glu Arg Val
1 5 10 15
Lys Thr Leu Arg Ala Gln Asn Tyr Glu Leu Glu Ser Glu Val Gln Arg
20 25 30
Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Ala Ser Gly Gly Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50 55
<210> 77
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 77
Glu Ala Cys Leu Glu Ile Glu Ala Ala Phe Leu Glu Arg Glu Asn Thr
1 5 10 15
Ala Leu Glu Thr Arg Val Ala Glu Leu Arg Gln Arg Val Gln Arg Ala
20 25 30
Arg Asn Arg Val Ser Gln Tyr Arg Thr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Pro Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50 55
<210> 78
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 78
Glu Ala Cys Leu Glu Ile Arg Ala Ala Phe Leu Arg Gln Arg Asn Thr
1 5 10 15
Ala Leu Arg Thr Glu Val Ala Glu Leu Glu Gln Glu Val Gln Arg Leu
20 25 30
Glu Asn Glu Val Ser Gln Tyr Glu Thr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Pro Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50 55
<210> 79
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 79
Glu Ala Cys Leu Glu Ile Arg Ala Ala Phe Leu Arg Arg Arg Asn Thr
1 5 10 15
Ala Leu Arg Thr Arg Val Ala Glu Leu Arg Gln Arg Val Gln Arg Leu
20 25 30
Arg Asn Ile Val Ser Gln Tyr Glu Thr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50 55
<210> 80
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 80
Glu Ala Cys Leu Glu Ile Glu Ala Ala Phe Leu Glu Gln Glu Asn Thr
1 5 10 15
Ala Leu Glu Thr Glu Val Ala Glu Leu Glu Gln Glu Val Gln Arg Leu
20 25 30
Glu Asn Ile Val Ser Gln Tyr Glu Thr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50 55
<210> 81
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 81
Glu Ala Cys Gly Ala Ser Thr Ser Val Asp Glu Leu Gln Ala Glu Val
1 5 10 15
Asp Gln Leu Glu Asp Glu Asn Tyr Ala Leu Lys Thr Lys Val Ala Gln
20 25 30
Leu Arg Lys Lys Val Glu Lys Leu Gly Ser Ile Pro Val Ser Leu Arg
35 40 45
Ser Gly
50
<210> 82
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 82
Glu Ala Cys Gly Ala Ser Thr Thr Val Ala Gln Leu Glu Glu Lys Val
1 5 10 15
Lys Thr Leu Arg Ala Glu Asn Tyr Glu Leu Lys Ser Glu Val Gln Arg
20 25 30
Leu Glu Glu Gln Val Ala Gln Leu Gly Ser Ile Pro Val Ser Leu Arg
35 40 45
Ser Gly
50
<210> 83
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 83
Glu Ala Cys Gly Ala Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu
20 25 30
Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50 55 60
<210> 84
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 84
Glu Ala Cys Gly Ala Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg
20 25 30
Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
50 55 60
<210> 85
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 85
Glu Ala Cys Gly Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gln Lys Ile Ala Ala Leu
1 5 10 15
Lys Tyr Lys Asn Ala Ala Leu Lys Lys Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gln
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 86
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 86
Glu Ala Cys Gly Glu Ile Ala Ala Leu Glu Gln Glu Ile Ala Ala Leu
1 5 10 15
Glu Lys Glu Asn Ala Ala Leu Glu Trp Glu Ile Ala Ala Leu Glu Gln
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 87
<400> 87
000
<210> 88
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 88
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 89
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 90
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 91
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 92
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 92
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 93
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 94
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 94
Gln Gly Ala Ser Thr Ser Val Asp Glu Leu Gln Ala Glu Val Asp Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asp Glu Asn Tyr Ala Leu Lys Thr Lys Val Ala Gln Leu Arg
20 25 30
Lys Lys Val Glu Lys Leu Gly Ser
35 40
<210> 95
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 掩蔽结构域序列
<400> 95
Gln Gly Ala Ser Thr Thr Val Ala Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Ala Glu Asn Tyr Glu Leu Lys Ser Glu Val Gln Arg Leu Glu
20 25 30
Glu Gln Val Ala Gln Leu Gly Ser
35 40

Claims (125)

1.一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:16、19、21和23的HCDR1；选自SEQ ID NO:17、20、22和24的HCDR2；以及SEQ ID NO:18的HCDR3；其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:31和34的LCDR1；选自SEQ ID NO:32和35的LCDR2；以及选自SEQ ID NO:33和36的LCDR3；其中所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
2.一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:16、19、21和23的HCDR1；选自SEQ ID NO:17、20、22和24的HCDR2；以及SEQ ID NO:18的HCDR3；其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:31和34的LCDR1；选自SEQ ID NO:32和35的LCDR2；以及选自SEQ ID NO:33和36的LCDR3；其中所述重链可变区包含：
a)以SEQ ID NO:88所列的人类IGHV3-23/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H44、H49、H82、H89、H91和H94是供体残基；或
b)以SEQ ID NO:89所列的人类IGHV3-48/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基；或
c)以SEQ ID NO:90所列的人类IGHV3-66/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H29、H49和H82是供体残基；或
d)以SEQ ID NO:91所列的人类IGHV3-74/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基；并且
其中所述轻链可变区包含：
c)以SEQ ID NO:92所列的人类IGKV6-21/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L4、L21、L69和L85是供体残基；或
d)以SEQ ID NO:93所列的人类IGKV1-27/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L21、L49和L69是供体残基。
3.如权利要求1或权利要求2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含选自以下的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:16、17和18；SEQ ID NO:19、20和18；SEQ ID NO:21、22和18；SEQ ID NO:16、20和18；以及SEQ ID NO:23、24和18。
4.如权利要求1至3中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含选自以下的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:31、32和33；SEQ ID NO:31、32和36；以及SEQ ID NO:34、35和33。
5.如权利要求1至4中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:16、17、18、31、32和33；SEQ ID NO:16、17、18、34、35和33；SEQ ID NO:19、20、18、31、32和33；SEQID NO:19、20、18、34、35和33；SEQ ID NO:21、22、18、31、32和33；SEQ ID NO:21、22、18、34、35和33；SEQ ID NO:16、20、18、31、32和33；SEQ ID NO:16、20、18、34、35和33；SEQ ID NO:23、24、18、31、32和33；SEQ ID NO:23、24、18、34、35和33；SEQ ID NO:16、17、18、31、32和36；SEQ ID NO:19、20、18、31、32和36；SEQ ID NO:21、22、18、31、32和36；16、20、18、31、32和36；以及SEQ ID NO:23、24、18、31、32和36。
6.一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:25、28和29的HCDR1；选自SEQ ID NO:26和30的HCDR2；以及SEQ ID NO:27的HCDR3；并且其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:37和40的LCDR1；SEQ ID NO:38的LCDR2；以及选自SEQ ID NO:39和41的LCDR3；其中所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
7.一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:25、28和29的HCDR1；选自SEQ ID NO:26和30的HCDR2；以及SEQ ID NO:27的HCDR3；并且其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:37和40的LCDR1；SEQ ID NO:38的LCDR2；以及选自SEQ ID NO:39和41的LCDR3；其中所述重链可变区包含：
a)以SEQ ID NO:88所列的人类IGHV3-23/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H44、H49、H82、H89、H91和H94是供体残基；或
b)以SEQ ID NO:89所列的人类IGHV3-48/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基；或
c)以SEQ ID NO:90所列的人类IGHV3-66/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H29、H49和H82是供体残基；或
d)以SEQ ID NO:91所列的人类IGHV3-74/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基；并且
其中所述轻链可变区包含：
c)以SEQ ID NO:92所列的人类IGKV6-21/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L4、L21、L69和L85是供体残基；或
d)以SEQ ID NO:93所列的人类IGKV1-27/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L21、L49和L69是供体残基。
8.如权利要求6或权利要求7所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含选自以下的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:25、26和27；SEQ ID NO:28、26和27；SEQ ID NO:29、30和27；以及SEQ ID NO:29、26和27。
9.如权利要求6至8中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含选自以下的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:37、38和39；SEQ ID NO:40、38和39；以及SEQ ID NO:37、38和41。
10.如权利要求6至9中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:25、26、27、37、38和39；SEQ ID NO:25、26、27、40、38和39；SEQ ID NO:25、26、27、37、38和41；SEQ ID NO:28、26、27、37、38和39；SEQ ID NO:28、26、27、40、38和39；SEQ ID NO:28、26、27、37、38和41；SEQ ID NO:29、30、27、37、38和39；SEQ ID NO:29、30、27、40、38和39；SEQ IDNO:29、30、27、37、38和41；SEQ ID NO:29、26、27、37、38和39；SEQ ID NO:29、26、27、40、38和39；以及SEQ ID NO:29、26、27、37、38和41。
11.如权利要求1至10中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8。
12.如权利要求1至11中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15。
13.如权利要求1至12中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区和轻链可变区包含SEQ ID NO:2和10；SEQ ID NO:3和11；SEQ ID NO:3和12；SEQ IDNO:3和13；SEQ ID NO:3和14；SEQ ID NO:4和11；SEQ ID NO:4和12；SEQ ID NO:4和13；SEQID NO:4和14；SEQ ID NO:5和11；SEQ ID NO:5和12；SEQ ID NO:5和13；SEQ ID NO:5和14；SEQ ID NO:6和11；SEQ ID NO:6和12；SEQ ID NO:6和13；SEQ ID NO:6和14；SEQ ID NO:7和11；SEQ ID NO:7和12；SEQ ID NO:7和13；SEQ ID NO:7和14；SEQ ID NO:8和11；SEQ ID NO:8和12；SEQ ID NO:8和13；SEQ ID NO:8和14；SEQ ID NO:3和15。
14.一种特异性结合人类CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:16的HCDR1、SEQID NO:17的HCDR2和SEQ ID NO:18的HCDR3；并且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:31的LCDR1、SEQ ID NO:32的LCDR2和SEQ ID NO:33的LCDR3；并且其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；并且其中所述抗体相较于Ab47具有减少的红血球凝集。
15.如权利要求14所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQID NO:3的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
16.如权利要求1至15中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重量可变区包含：
a)以SEQ ID NO:88所列的人类IGHV3-23/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H44、H49、H82、H89、H91和H94是供体残基；或
b)以SEQ ID NO:89所列的人类IGHV3-48/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基；或
c)以SEQ ID NO:90所列的人类IGHV3-66/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H29、H49和H82是供体残基；或
d)以SEQ ID NO:91所列的人类IGHV3-74/HJ4构架，其中根据Kabat编号，构架位置H49是供体残基。
17.如权利要求16所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中根据Kabat编号，H29是F，H44是R或G，H49是A，H82是M或I，H89是I或V，H91是F或Y，并且H94是R。
18.如权利要求1至17中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含：
a)以SEQ ID NO:92所列的人类IGKV6-21/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L4、L21、L69和L85是供体残基；或
b)以SEQ ID NO:93所列的人类IGKV1-27/KJ2构架，其中根据Kabat编号，构架位置L21、L49和L69是供体残基。
19.如权利要求18所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中根据Kabat编号，L4是M，L21是L，L49是K，L69是T或S，并且L85是V或T。
20.如权利要求1至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是IgG1同型物。
21.如权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段相较于其亲本抗体具有增强的抗体依赖型细胞毒性(ADCC)。
22.如权利要求1至21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段相较于其亲本抗体具有增强的抗体依赖型细胞吞噬作用(ADCP)。
23.如权利要求1至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段相较于其亲本抗体具有增强的补体依赖型细胞毒性(CDC)。
24.如权利要求1至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、双功能抗体、单链抗体、scFv片段或scFv-Fc。
25.如权利要求1至24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在体外和/或体内诱导CD47表达细胞凋亡。
26.如权利要求1至25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段相较于其亲本抗体具有减少的核心岩藻糖基化。
27.如权利要求1至26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段经去岩藻糖基化。
28.如权利要求1至27中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段阻断CD47与SIRPα之间的相互作用。
29.如权利要求1至28中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段相较于Ab47具有减少的红血球凝集。
30.一种核酸序列，所述核酸序列编码如权利要求1至29中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
31.一种表达载体，所述表达载体包含如权利要求29所述的核酸。
32.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求30所述的核酸或如权利要求28所述的表达载体。
33.一种宿主细胞，所述宿主细胞表达如权利要求1至29中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
34.一种生产如权利要求1至23中任一项所述的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括培养如权利要求32或权利要求33所述的宿主细胞。
35.如权利要求34所述的方法，所述方法还包括分离所述抗体或其抗原结合片段。
36.一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至29中任一项所述的抗CD47抗体或抗原结合片段。
37.一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括：
a)将受试者鉴定为患有CD47表达癌症；以及
b)向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至29中任一项所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段。
38.如权利要求37所述的方法，其中步骤a)包括：
i)分离癌组织；以及
ii)检测所分离的癌组织中的CD47。
39.一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括：
a)将受试者鉴定为具有癌组织相对于非癌组织升高的巨噬细胞浸润水平；以及
b)向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至26中任一项所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段。
40.如权利要求39所述的方法，其中步骤a)包括：
i)从所述受试者分离癌组织和周围非癌组织；
ii)检测所分离的癌组织和非癌组织中的巨噬细胞；以及
iii)比较所述癌组织相对于所述非癌组织中的染色量。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述巨噬细胞染色是利用抗CD163抗体进行。
42.如权利要求36至41中任一项所述的方法，其中所述CD47表达癌症是血液癌症或实体癌症。
43.如权利要求36至42中任一项所述的方法，其中所述CD47表达癌症选自非霍奇金淋巴瘤、B淋巴母细胞性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤、瑞特氏综合征、滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓纤维化、真性红血球增多症、皮肤T细胞淋巴瘤、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、脊髓发育不良综合征(MDS)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)和间变性大细胞淋巴瘤。
44.如权利要求36至42中任一项所述的方法，其中所述CD47表达癌症选自肺癌、胰脏癌、乳癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、脊椎癌、脑癌、子***、子宫内膜癌、结肠直肠癌、***癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠癌、胃癌、癌瘤、头颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、***癌、垂体癌、胃部癌、子宫癌、***癌和甲状腺癌。
45.如权利要求36至42中任一项所述的方法，其中所述CD47表达癌症选自肺癌、肉瘤、结肠直肠癌、头颈癌、卵巢癌、胰脏癌、胃癌、黑色素瘤和乳癌。
46.如权利要求36至45中任一项所述的方法，其中所述抗CD47抗体或其抗原结合片段与选自以下一者或多者的免疫检查点分子的抑制剂组合施用：程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序化死亡配体1(PD-L1)、PD-L2、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM-1)、CEACAM-5、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白血球相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、CD160、2B4或TGFR。
47.如权利要求36至46中任一项所述的方法，其中所述抗CD47抗体或其抗原结合片段与激动性抗CD40抗体组合施用。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述激动性抗CD40抗体具有低的岩藻糖基化水平或经去岩藻糖基化。
49.如权利要求36至48中任一项所述的方法，其中所述抗CD47抗体或其抗原结合片段与抗体药物缀合物(ADC)组合施用，其中所述ADC的所述抗体特异性结合至癌细胞的细胞外表面上表达的蛋白质并且所述抗体缀合至包含细胞毒性剂的药物-连接子。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述细胞毒性剂是奥瑞司他汀。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述ADC的所述抗体缀合至选自由vcMMAE和mcMMAF组成的组的药物-连接子。
52.一种诱导CD47表达细胞凋亡的方法，所述方法包括使所述细胞与如权利要求1至29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述细胞是在体外。
54.如权利要求52所述的方法，其中所述细胞是在体内。
55.一种经掩蔽的抗体，所述经掩蔽的抗体包含特异性结合至人类CD47蛋白的抗体或其抗原结合片段和至少一个掩蔽结构域，其中至少一个掩蔽结构域包含选自SEQ ID NO:44-55、75-86、94和95的氨基酸序列。
56.如权利要求55所述的经掩蔽的抗体，其中相较于无所述至少一个掩蔽结构域的所述抗体或其抗原结合片段，所述至少一个掩蔽结构域减小所述抗体或抗原结合片段对人类CD47蛋白的结合亲和力。
57.如权利要求56所述的经掩蔽的抗体，其中相较于无所述至少一个掩蔽结构域的所述抗体或其抗原结合片段，所述结合亲和力减小至少约100倍。
58.如权利要求56所述的经掩蔽的抗体，其中相较于无所述至少一个掩蔽结构域的所述抗体或其抗原结合片段，所述结合亲和力减小约200倍与约1500倍之间。
59.如权利要求55至58中任一项所述的经掩蔽的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中所述重链连接至第一掩蔽结构域；或其中所述轻链连接至第二掩蔽结构域；或其中所述重链连接至第一掩蔽结构域并且所述轻链连接至第二掩蔽结构域。
60.如权利要求59所述的经掩蔽的抗体，其中所述第一掩蔽结构域包含选自SEQ IDNO:44、46、48、50、52、54、75、77、79、81、83、85和94的氨基酸序列；并且所述第二掩蔽结构域包含选自SEQ ID NO:45、47、49、51、53、55、76、78、80、82、84、86和95的氨基酸序列。
61.如权利要求60所述的经掩蔽的抗体，其中所述第一掩蔽结构域和所述第二掩蔽结构域是选自以下的一对掩蔽结构域：SEQ ID NO:44和45；SEQ ID NO:46和47；SEQ ID NO:48和49；SEQ ID NO:50和51；SEQ ID NO:52和53；SEQ ID NO:54和55；SEQ ID NO:75和76；SEQID NO:77和78；SEQ ID NO:79和80；SEQ ID NO:81和82；SEQ ID NO:83和84；SEQ ID NO:85和86；以及SEQ ID NO:94和95。
62.如权利要求59至61中任一项所述的经掩蔽的抗体，其中所述第一掩蔽结构域连接至所述重链的N端并且所述第二掩蔽结构域连接至所述轻链的N端。
63.如权利要求59至62中任一项所述的经掩蔽的抗体，其中每个掩蔽结构域包含可蛋白酶裂解的连接子并且经由所述可蛋白酶裂解的连接子连接至所述重链或轻链。
64.如权利要求63所述的经掩蔽的抗体，其中所述可蛋白酶裂解的连接子包含基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点。
65.如权利要求64所述的经掩蔽的抗体，其中所述MMP裂解位点选自MMP2裂解位点、MMP7裂解位点、MMP9裂解位点和MMP13裂解位点。
66.如权利要求64或权利要求65所述的经掩蔽的抗体，其中在由MMP裂解之后，所述抗体或其抗原结合片段的所述重链和/或轻链包含所述MMP裂解位点的短氨基酸残基。
67.如权利要求66所述的经掩蔽的抗体，其中所述短氨基酸残基包含在所述抗体的N端的序列LRSG、SG或VR。
68.如权利要求55至67中任一项所述的经掩蔽的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段是如权利要求1至29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
69.如权利要求55至68中任一项所述的经掩蔽的抗体，所述经掩蔽的抗体包含连接至第一掩蔽结构域并且具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链和连接至第二掩蔽结构域并且具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链。
70.一种经掩蔽的抗体，所述经掩蔽的抗体包含如权利要求1至29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和至少一个掩蔽结构域。
71.如权利要求70所述的经掩蔽的抗体，其中至少一个掩蔽结构域包含选自SEQ IDNO:44-55、75-86、94和95的氨基酸序列。
72.如权利要求70所述的经掩蔽的抗体，其中每个掩蔽结构域包含选自SEQ ID NO:44-55、75-86、94和95的氨基酸序列。
73.如权利要求70至72中任一项所述的经掩蔽的抗体，其中相较于无所述至少一个掩蔽结构域的所述抗体或其抗原结合片段，所述至少一个掩蔽结构域减小所述抗体或抗原结合片段对人类CD47蛋白的结合亲和力。
74.如权利要求73所述的经掩蔽的抗体，其中相较于无所述至少一个掩蔽结构域的所述抗体或其抗原结合片段，所述结合亲和力减小至少约100倍。
75.如权利要求73所述的经掩蔽的抗体，其中相较于无所述至少一个掩蔽结构域的所述抗体或其抗原结合片段，所述结合亲和力减小约200倍与约1500倍之间。
76.如权利要求70至75中任一项所述的经掩蔽的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中所述重链连接至第一掩蔽结构域；或其中所述轻链连接至第二掩蔽结构域；或其中所述重链连接至第一掩蔽结构域并且所述轻链连接至第二掩蔽结构域。
77.如权利要求76所述的经掩蔽的抗体，其中所述第一掩蔽结构域包含选自SEQ IDNO:44、46、48、50、52、54、75、77、79、81、83、85和94的氨基酸序列；并且所述第二掩蔽结构域包含选自SEQ ID NO:45、47、49、51、53、55、76、78、80、82、84、86和95的氨基酸序列。
78.如权利要求77所述的经掩蔽的抗体，其中所述第一掩蔽结构域和所述第二掩蔽结构域是选自以下的一对掩蔽结构域：SEQ ID NO:44和45；SEQ ID NO:46和47；SEQ ID NO:48和49；SEQ ID NO:50和51；SEQ ID NO:52和53；SEQ ID NO:54和55；SEQ ID NO:75和76；SEQID NO:77和78；SEQ ID NO:79和80；SEQ ID NO:81和82；SEQ ID NO:83和84；SEQ ID NO:85和86；以及SEQ ID NO:94和95。
79.如权利要求76至78中任一项所述的经掩蔽的抗体，其中所述第一掩蔽结构域连接至所述重链的N端并且所述第二掩蔽结构域连接至所述轻链的N端。
80.如权利要求76至79中任一项所述的经掩蔽的抗体，其中每个掩蔽结构域包含可蛋白酶裂解的连接子并且经由所述可蛋白酶裂解的连接子连接至所述重链或轻链。
81.如权利要求80所述的经掩蔽的抗体，其中所述可蛋白酶裂解的连接子包含基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点。
82.如权利要求81所述的经掩蔽的抗体，其中所述MMP裂解位点选自MMP2裂解位点、MMP7裂解位点、MMP9裂解位点和MMP13裂解位点。
83.如权利要求81或权利要求82所述的经掩蔽的抗体，其中在由MMP裂解之后，所述抗体或其抗原结合片段的所述重链和/或轻链包含所述MMP裂解位点的短氨基酸残基。
84.如权利要求83所述的经掩蔽的抗体，其中所述短氨基酸残基包含在所述抗体的N端的序列LRSG、SG或VR。
85.一种核酸序列，所述核酸序列编码如权利要求55至84中任一项所述的经掩蔽的抗体。
86.一种表达载体，所述表达载体包含如权利要求85所述的核酸。
87.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求86所述的核酸或如权利要求78所述的表达载体。
88.一种宿主细胞，所述宿主细胞表达如权利要求55至84中任一项所述的经掩蔽的抗体。
89.一种生产如权利要求49至76中任一项所述的经掩蔽的抗体的方法，所述方法包括培养如权利要求87或权利要求88所述的宿主细胞。
90.如权利要求89所述的方法，所述方法还包括分离所述经掩蔽的抗体。
91.一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求55至84中任一项所述的经掩蔽的抗体。
92.一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将受试者鉴定为具有癌症相对于周围非癌组织升高的MMP水平；以及
b)向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求55至84中任一项所述的经掩蔽的抗体，其中所述经掩蔽的抗体的每个掩蔽结构域包含可蛋白酶裂解的连接子并且其中所述可蛋白酶裂解的连接子包含基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述MMP裂解位点选自MMP2裂解位点、MMP7裂解位点、MMP9裂解位点和MMP13裂解位点。
94.如权利要求92或权利要求93所述的方法，其中所述MMP选自由以下组成的组：MMP2、MMP7、MMP9和MMP13。
95.如权利要求92至94中任一项所述的方法，其中步骤a)包括：
i)从所述受试者分离癌组织和非癌组织；
ii)检测所分离的癌组织和非癌组织中的MMP；以及
iii)比较所述癌组织相对于所述非癌组织中的染色量。
96.一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括：
a)将受试者鉴定为患有CD47表达癌症；以及
b)向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求55至84中任一项所述的经掩蔽的抗体。
97.如权利要求96所述的方法，其中步骤a)包括：
i)分离癌组织；以及
ii)检测所分离的癌组织中的CD47。
98.一种用于治疗受试者的CD47表达癌症的方法，所述方法包括：
a)将受试者鉴定为具有癌组织相对于非癌组织升高的巨噬细胞浸润水平；以及
b)向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求55至84中任一项所述的经掩蔽的抗体。
99.如权利要求98所述的方法，其中步骤a)包括：
i)从所述受试者分离癌组织和周围非癌组织；
ii)检测所分离的癌组织和非癌组织中的巨噬细胞；以及
iii)比较所述癌组织相对于所述非癌组织中的染色量。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述巨噬细胞染色是利用抗CD163抗体进行。
101.如权利要求91至100中任一项所述的方法，其中所述CD47表达癌症是血液癌症或实体癌症。
102.如权利要求91至101中任一项所述的方法，其中所述CD47表达癌症选自非霍奇金淋巴瘤、B淋巴母细胞性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤、瑞特氏综合征、滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓纤维化、真性红血球增多症、皮肤T细胞淋巴瘤、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、脊髓发育不良综合征(MDS)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)和间变性大细胞淋巴瘤。
103.如权利要求91至101中任一项所述的方法，其中所述CD47表达癌症选自肺癌、胰脏癌、乳癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、脊椎癌、脑癌、子***、子宫内膜癌、结肠直肠癌、***癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠癌、胃癌、肉瘤、头颈癌、黑色素瘤、皮肤癌、***癌、垂体癌、胃部癌、子宫癌、***癌和甲状腺癌。
104.如权利要求91至101中任一项所述的方法，其中所述CD47表达癌症选自肺癌、肉瘤、结肠直肠癌、头颈癌、卵巢癌、胰脏癌、胃癌、黑色素瘤和乳癌。
105.如权利要求91至104中任一项所述的方法，其中所述抗CD47抗体与选自以下一者或多者的免疫检查点分子的抑制剂组合施用：程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序化死亡配体1(PD-L1)、PD-L2、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM-1)、CEACAM-5、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白血球相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、CD160、2B4或TGFR。
106.如权利要求91至105中任一项所述的方法，其中所述抗CD47抗体或其抗原结合片段与激动性抗CD40抗体组合施用。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述激动性抗CD40抗体具有低的岩藻糖基化水平或经去岩藻糖基化。
108.如权利要求91至107中任一项所述的方法，其中所述抗CD47抗体或其抗原结合片段与抗体药物缀合物(ADC)组合施用，其中所述ADC的所述抗体特异性结合至癌细胞的细胞外表面上表达的蛋白质并且所述抗体缀合至包含细胞毒性剂的药物-连接子。
109.如权利要求108所述的方法，其中所述细胞毒性剂是奥瑞司他汀。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述ADC的所述抗体缀合至选自由vcMMAE和mcMMAF组成的组的药物-连接子。
111.如权利要求91至110中任一项所述的方法，其中所述经掩蔽的抗体包括包含可蛋白酶裂解的连接子的至少一个掩蔽结构域，并且其中所述可蛋白酶裂解的连接子在肿瘤微环境中裂解。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述可蛋白酶裂解的连接子在所述肿瘤微环境中裂解之后，所述掩蔽结构域从所述抗CD47抗体或其抗原结合片段释放。
113.如权利要求111或权利要求112所述的方法，其中所述可蛋白酶裂解的连接子包含氨基酸序列IPVSLRSG(SEQ ID NO:73)或GPLGVR(SEQ ID NO:57)。
114.如权利要求111至113中任一项所述的方法，其中所述可蛋白酶裂解的连接子包含MMP裂解位点。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述MMP裂解位点选自由MMP2裂解位点、MMP7裂解位点、MMP9裂解位点和MMP13裂解位点组成的组。
116.如权利要求111至115中任一项所述的方法，其中在释放所述抗CD47抗体或其抗原结合片段之后，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段具有可蛋白酶裂解的连接子的短氨基酸残基。
117.如权利要求116所述的方法，其中所述短氨基酸残基包含在所述抗体的N端的LRSG、SG或VR序列。
118.如权利要求111至117中任一项所述的方法，其中在所述肿瘤微环境中裂解之后，所释放的抗CD47抗体或其抗原结合片段以比所述经掩蔽的抗体对CD47的亲和力强至少约100倍的亲和力结合至CD47。
119.如权利要求111至117中任一项所述的方法，其中在所述肿瘤微环境中裂解之后，所释放的抗CD47抗体或其抗原结合片段以比所述经掩蔽的抗体对CD47的亲和力强200倍至1500倍的亲和力结合至CD47。
120.如权利要求36至51和91至119中任一项所述的方法，其中所述抗CD47抗体或其抗原结合片段或所述经掩蔽的抗体的抗CD47抗体或其抗原结合片段相较于其亲本抗CD47抗体在体外展现减少的血球凝集。
121.如权利要求120所述的方法，其中所述亲本抗体是Ab47。
122.如权利要求36至51和91至121中任一项所述的方法，其中所述抗CD47抗体或经掩蔽的抗体的施用并不诱导所述受试者的血球凝集。
123.如权利要求36至51和91至122中任一项所述的方法，其中所述抗CD47抗体或经掩蔽的抗体在体外和/或体内诱导CD47表达细胞凋亡。
124.如权利要求123所述的方法，其中所述抗CD47抗体或经掩蔽的抗体在体内诱导CD47表达细胞凋亡。
125.如权利要求124所述的方法，其中所述CD47表达细胞是癌细胞。
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