JP2000503639A - 分枝ヒドラゾンのリンカー類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 抗体のような標的指向リガンドを、治療上有効な薬物に連結するのに用いる分枝ヒドラゾンのリンカ一類。その分枝点は多価の原子であり、そして薬物の数は、分枝が生成する毎に２倍に増大する。好ましい薬物はドキソルビシンである。

Description

【発明の詳細な説明】 分枝ヒドラゾンのリンカー類 細胞毒性試薬を抗体に結合する二官能化合物（すなわち“リンカー”）は当該 技術分野で知られている。これらの化合物は、腫瘍関連抗原に対抗するイムノコ ンジュゲートを製造するのに特に有用になってきている。このようなイムノコン ジュゲートは、腫瘍細胞に対して毒性薬物を選択的に送達することができる（例 えば、Hermentin およびSeiler“Investigations With Monoclonal Antibody Dr ug Conjugates”，Behringer Insti．Mitl.，82巻、197〜215 頁、1988年；Gall ego ら、“Preparation of Four Daunomycin-Monoclonal Antibody 791T/36 Con jugates With Anti-Tumour Activity”，Int．J．Cancer，33巻、7737〜7744頁 、1984年；Arnon ら、“In Vitro and In Vivo Efficacy of Conjugates of Dau nomycin With Anti-Tumor Antibodies”， Immunological Rev.，62巻、５〜27 頁、1982年参照）。 Greentieldらは、アントラサイクリン分子の13ケト位に、アシルヒドラゾン結 合を通じてコンジュゲートされたアシルヒドラジン化合物すなわち３−（２−ピ リジル−ジチオ）プロピオニルヒドラジドを含する酸感受性イムノコンジュゲー ト類の生成、およびこのアントラサイクリン誘導体の抗体分子へのコンジュゲー ションを報告している（Greenfieldらの1989年８月16日に公告されたヨーロッパ 特許公告第EP 0 328 147号。これは1988年11月16日付けで出願され、係属中の米 国特許願第07/270,509号および1988年２月11日付けで出願され現在放棄されてい る米国特許願第07/155,181号に対応する特許である）。上記の後者の引用文献は 、特定のチオエーテル含有 リンカー類、およびヒドラゾンチオエーテルを含有するイムノコンジュゲート類 を含むコンジュゲート類も開示している。 Kanekoら（1990年５月14日付けで出願された米国特許願第07/522,996号。これ は1991年11月21日付けで公開されたヨーロッパ特許願公開第EP A 0 457 250号に 相当する）も、アントラサイリン分子のＣ−13位にアシルヒドラゾン結合で二官 能リンカーに結合されたアントラサイクリン抗生物質を含有するコンジュゲート 類の生成を報告している。Kanekoらの発明において、上記リンカー類は反応性の ピリジニルジチオ基またはオルト−ニトロフェニルジチオ基を含有し、この反応 性基によって、リンカーは、細胞反応性リガンドに結合した適切な基と反応して 、完全コンジュゲート(completed conjugate)を生成する。イムノコンジュゲー トについて考慮すべき重要なことは、薬物の効力と抗原の発現の間の関係が、広 範囲の悪性細胞に対して細胞毒性をもたらすために適切でなければならないとい うことである。各種イムノコンジュゲートの効力の変更は、利用されるモノクロ ーナル抗体(MAb)および／またはコンジュゲートされていない薬物の効力が変え ることによって行うことができる。また、リンカーは、循環中の安定性および薬 物／MAb のモル比の両者を変化させることによって、イムノコンジュゲートの効 力を達成することができる。上記循環中の安定性についての文献としては次のも のがある。すなわちKoizumi，M．K.，Kunimatsu，M.，Sakahara，H.，Nakashima ，T.，Kawamura，Y.，Watanabe，Y.，Ohmomo，Y.，Arano，Y．Yokoyama，A.およ びTorizuka，K．“Preparation of ⁶⁷Ga-labeled antibodies using deferoxami ne as a bifunctional ehelate，“J．Immunol Methods，104 巻、93〜102 頁、 1987年；Thorpe，P．E.，Wallace，P．M.，Knowless，P．P.，Relf，M．G.，Bro wn，A．N．F.，Watson，G．J.，Knyba，R．E.，Wawrzynczak，E．J. およびBlackey，D．C.，“New coupling agents for the synthesis of immuno toxins containing a hindered disulfide bond withimproved stability in vi vo”，Cancer Res.，47 巻、5924〜5931頁、1987年；Trail，P．A.，Wilner，D. ，Lasch，S．J.，Henderson，A．J.，Greenfield，R．S.，King，D.，Zoekler， M．E．およびBraslawsky，G．R.，“Antigen Specific activity of carcinoma reactive BR64-adriamycin conjugates evaluated in vitro and inhuman tumor Xenograft modelsk”，Cancer Research，52 巻、5693〜5700頁、1992年；Trai l，P．A．Willner，D.，Lasch，S．J.，Henderson，A．J.，Hofstead，S．J．Ca sazza，A．M.，Firestone, omas by BR96-Doxorubicin Immuno conjugates”，Science，261巻、212〜215頁 、1993年；Trail，P．A.，Willner，D．およびHellstrom，K．E.，“site-direc ted delivery of anthracyclines forcancer therapy”，Drug Development Res earch，34 巻、196〜209 頁、1995年がある。また、上記薬物／MAb のモル比に 関する文献としては次のものがある。すなわち、Shih，L．B.，Goldenberg,D．M .，Xuan，H.，Lu，H.，Sharkey，R．M.およびHall，T．C.，“Anthrcycline imm unoconjugates prepared by a site specific linkage via an aminodextran in termediate carrier”， International Journal of cancer，41 巻、8320839 ，1991年；Trail らの1992年の報告；Trail らの1995年の報告である。 特に、取込み抗癌MAb BR64（internalizing anticarcinoma MAbBR64）と酸に 不安定なヒドラゾン結合で製造されたドキソルビシンコンジュゲート類の生体外 効力は、薬物／MAb のモル比が１から８へ増えると増大することが報告された（ Trail らの1992年の報告；Trail らの1995年の報告）。しかし、これらの研究で は、薬物／MA b のモル比の増大がMAb のコンジュゲーション部位の数の増大に基づいているの で、そのMAb は自己制限的であり抗体結合親和性が低下するなどの欠点がある。 上記のことからみて、従来技術のイムノコンジュゲートの問題点の一つは、達 成可能な、薬物：標的指向リガンド（例えば免疫グロブリン）の比率が比較的低 いことであることは明らかである。薬物：標的指向リガンドの比率が一層高いイ ムノコンジュゲートを得ることは非常に望ましい。 本発明は新規な分枝ヒドラゾンのリンカー類を提供するものである。これら新 規なリンカー類を用いて、新規な薬物／リンカー分子、ならびに標的指向リガン ド、治療上有効な薬物および選択された標的細胞集団（例えば腫瘍細胞類）を標 的指向リガンドによって認識することができる分枝リンカーで構成された生物学 的に有効なコンジュゲートが製造される。 用語“薬物／リンカー”または“リンカー／薬物”の分子は、本明細書で用い る場合、二つ以上の治療面で有効な薬物分子に連結されたリンカー分子を意味し 、その用語“コンジュゲート”は標的指向リガンドに連結された薬物リンカー分 子を意味する。これらのリンカーは分枝しており、一つのリンカー当り二つ以上 の薬物分子がリガンドに連結される。各リンカーに連結される薬物の数は、分枝 が生成する毎に２倍になる。したがって、リンカー１分子当りの薬物の数は、２ ，４，８，16，32，64などとすることができる。分枝のファクターは数学的に２ⁿ で表され、ｎは正の整数である。つまり一回分枝したリンカーは最初の分枝が 生成しすなわち２¹ の分枝を有し、つまり１リンカー当り２個の薬物分子を含有 している。二回分枝したリンカーは第二の分枝が生成しすなわち２² の分枝を有 し、つまり１リンカー当り４個の薬物分子を含有している。 したがって、本発明は、標的指向リガンド由来のチオール基を、二つ以上の薬 物部分に連結する分枝リンカーに関し、その分枝リンカーは、標的指向リガンド 由来のチオール基（スルフヒドリル基とも呼ばれる）に結合するチオール受容体 を有する一方の末端、２ⁿ（ｎは正の整数）の分枝レベルが可能な多価原子であ る少なくとも一つの分枝点、および薬物部分由来のアルデヒド基またはケト基と アシルヒドラゾン結合を形成することができるアシルヒドラジド基を有する少な くとも二つの他方の末端を有する化合物で構成されている。ｎは、好ましくは１ ，２，３または４であり、より好ましくは１，２または３であり、もっとも好ま しくは１または２である。 また、上記の多価原子は炭素または窒素が好ましく、そして標的指向リガンドは 抗体またはそのフラグメントである。 語句“標的指向リガンド由来のチオール基”は、以後のパラグラフで使用され る場合、そのチオール基が標的指向リガンドにすでに存在しているか、または標 的指向リガンドが化学的に修飾されて、その標的指向リガンドとチオール基の間 にチオールスペーサー基を任意に含有していることを意味する。同様に語句“薬 物部分由来のアルデヒド基またはケト基”は、アルデヒド基またはケト基が薬物 にすでに存在しているか、または薬物が化学的に修飾されてアルデヒド基または ケト基を有していることを意味する。 また本発明は、これらのリンカー類、薬物／リンカー類および／またはコンジ ュゲート類を製造するのに用いる中間体、ならびに本発明のコンジュゲートを患 者に投与することからなる選択された症状を治療または予防する方法を提供する ものである。 図１は、BR96−直鎖ヒドラゾンおよびBR96−分枝ヒドラゾンのコンジュゲート の実施例62に記載されているような各種の暴露時間に はBR96 MB-Glu-(DOX)₂を示す。 図２は、 IgG−直鎖ヒドラゾンおよび IgG−分枝ヒドラゾンのコンジュゲート の実施例62に記載されているような各種の暴露時間に 本発明によって、薬物分子は、本発明のリンカーを通じて標的指向リガンドに 連結される。その薬物はアシルヒドラゾン結合を通じて本発明のリンカーに結合 される。標的指向リガンドはチオエーテル結合を通じて本発明のリンカーに結合 される。そのチオエーテル結合は、上記リガンドまたは上記リガンドに結合され た短い“チオールスペーサー”部分のスルッヒドリル（チオール）基とチオール 受容体との反応によって創製される。このチオール受容体は、反応後、マイケル 付加反応付加物になるマイケル付加反応受容体でもよい。好ましい実施態様で、 標的指向リガンドは、チオールスペーサーなしで共有チオエーテル結合を通じて リンカーに直接、結合されている。 好ましい実施態様で、本発明の新規なリンカー分子は下記式Ｉ： （式中、Ａはチオール受容体であり； Ｑは架橋基であり； ｂは０または１の整数であり； Ｗはスペーサーの部分であり； ｍは０または１の整数であり； ａは２，３または４の整数であり；および 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および で表される。 他の好ましい実施態様で、本発明の新規な分枝リンカーは下記式II： （式中、ｎは１〜６の整数であり； ａは０または１の整数であり； ｊは２〜６の整数であり； ｃは０または１の整数であり、但しａが０の場合ｃも０でなければならず； Ａはチオール受容体であり； Ｔは下記式： で表され、上記式中、ｄは２〜６の整数であり； ｍは１または２の整数であり； ｆは０または１の整数であり； ｂは０または１の整数であり； ｇは１または２の整数であり；および で表される。 式IIで表される好ましい分枝リンカーは、ｄが２、ｆが０、ｇが１および／ま たはｂが０の分枝リンカーである。 式IIで表される特に好ましい化合物は下記式で表される化合物である。 本発明の好ましい薬物／リンカー分子（あるいは、本明細書では“リンカー／ 薬物分子”と呼ぶ）は、式ＩまたはIIで表される化合 ある分子である。 式Ｉの範囲内にある本発明の好ましいリンカー／薬物分子は、下記式： （式中、ａは０，１，２または３の整数であり； ｎは１〜６の整数であり； ｍは０または１の整数であり；および Ｘ⁵ はアントラサイクリンの抗生物質である）； （式中、ｎは１〜６の整数であり； ａは０，１，２または３の整数であり； ｍは０または１の整数であり；および Ｘ⁵ はアントラサイクリンの抗生物質である） で表される分子である。 本発明の薬物／リンカー分子で製造される好ましい新規なコンジュゲートは下 記式IIIで表され、 式中、Ａはチオール付加物であり、 Ｗはスペーサー部分であり、 Ｑは架橋基であり、 ｍは０または１の整数であり、 ａは２，３または４の整数であり、 ｂは０または１の整数であり、 ｐは１〜６の整数であり、 ＹはＯまたは NH₂ ⁺ Cl^- であり、 Ｚは０または１の整数であり、 ｑは１〜10の整数であり、 Ｇは標的指向リガンドであり、および 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および 上記式中、Ｗ，ａおよびｍは前記定義と同じであり、およびＸ³ 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および る。 本発明の他の好ましい新規なコンジュゲートは下記式IVで表され、 式中、Ａはチオール付加物であり、 ｎは１〜６の整数であり、 ａは０または１の整数であり、 ｊは２〜６の整数であり、 ｃは０または１の整数であり、 ｐは１〜６の整数であり、 ＹはＯまたは NH₂ ⁺ Cl^- であり、 Ｚは０または１の整数であり、 ｑは１〜10の整数であり、 Ｇは標的指向リガンドであり、および Ｔは下記式で表され、 式中、ｄは２〜６の整数であり、 ｍは１または２の整数であり、 ｆは０または１の整数であり、 ｂは０または１の整数であり、 ｇは１または２の整数であり、および る。 一実施態様において、薬物の部分はアントラサイクリンの抗生物質でありそし てリガンドは抗体である。 好ましい実施態様で、アントラサイクリンは、そのアントラサイクリン化合物 の13−ケト位で、アシルヒドラゾン結合を通じてリンカーに結合されている。標 的指向リガンド、好ましくは抗体またはそのフラグメントは、前記リンカーを通 じてアントラサイクリン化合物に結合されている。特に好ましい実施態様で、こ の結合は、還元されたジスルフィド基〔すなわち、抗体の遊離のスルフヒドリル 基またはチオール基（−SH）〕を通じて生成する。 最も好ましい実施態様で、アントラサイクリンの薬物部分はアドリアマイシン であり、チオール受容体はマイケル付加反応受容体であり、この受容体からマイ ケル付加反応付加物、特にマレイミド基が誘導され、そして抗体部分はキメラ抗 体またはヒト化抗体である。 本発明のコンジュゲート類は、選択された標的細胞集団を治療するための特異 性と治療薬物の効力の両者を保持している。本発明のコンジュゲート類は、例え ば式IIIまたはIVで表される化合物の医薬としての有効量を、医薬として許容さ れる担体、希釈剤または賦形剤とともに含んでなる医薬組成物のごとき医薬組成 物に使用することができる。 本発明は、薬物、および少なくとも二つの薬物分子を有し、かつ選択された細 胞集団に対して標的指向することができるリガンドに結合できるチオエーテル含 有リンカーで構成された新規な分枝リンカー／薬物分子を提供するものである。 これら薬物は、アシルヒドラゾン結合を通じて前記リンカーに結合される。リン カーの分枝点は多価原子であり、好ましくは炭素原子または窒素原子である。好 ましい実施態様で、リガンドは、チオエーテル結合を通じてリンカーに直接連結 される。通常、この結合は、リガンドの反応性スルフヒドリル（−SH）基または スペーサー部分（例えば以下に説明する SPDPまたはイミノチオランの化学反応由来の部分）とマイケル付加反応受容体の ようなチオール受容体との反応で創製される。 また、本発明は、これらの薬物のコンジュゲートおよび医薬組成物の製造方法 、および癌、ウィルスもしくは他の病原感染症、自己免疫障害または他の症状を 治療する場合のように、生物学的プロセスでの変化が望ましい場合の、コンジュ ゲートの標的細胞への送達方法を提供するものである。 本発明のコンジュゲートは、所望の標的細胞集団と反応性の標的指向リガンド 分子に、本発明のリンカーによって持続された少なくとも二つの薬物分子を含有 している。その標的指向リガンド分子は、抗体もしくはそのフラグメントのよう な免疫反応性タンパク質、ボンベシンのような非免疫反応性のタンパク質もしく はペプチドのリガンド、またはレシチンもしくはステロイドの分子のような細胞 関連受容体を認識する結合リガンドである。 本発明を一層よく理解するため、薬物類、リガンド類およびヒドラゾンリンカ ーの各種成分を個々に考察する。スペーサー（“Ｗ”） 用語“スペーサー”は、本明細書で使用する場合、二つの隔てられた化学部分 を共有結合で連結して安定な三部分分子とすることができる二官能化学部分を意 味する。具体的に述べると、“Ｗ”スペーサーはケト基を窒素原子に連結する。 スペーサー分子の実例は、S．S．Wong著“Chemistry of Protein Conjugation a nd Crosslinking”、米国フロリダ州所在 CRC Press社、1991年；およびG．E.Me ans およびR．E．Feeney著“Bioconjugate Chemistry”、１巻、2〜12頁、1990 年に記載されている。なおこれら文献の開示事項は本願に援用するものである。 好ましいスペーサーは、式： は２〜４、さらに好ましくは２の整数である）で表されるスペーサーである。 スペーサーである。架橋基（“Ｏ”） 架橋基は、二つの隔てられた化学部分を共有結合で連結して安定した三部分分 子にすることができる二官能化学部分である。架橋基の実例は、S．S．Wong著“ Chemistry of Protein Conjugation andCrosslinking”、米国フロリダ州所在 C RC Press社、1991年；およびG．E．Means およびR．E．Feeney著“Bioconjugate Chemistry”、１巻、２〜12頁、1990年に記載されている。これらの文献の開示 事項は本願に援用するものである。具体的に述べると、架橋基“Ｑ”は、チオー ル受容体をケト部分に共有結合で連結する。架橋基の一例は式：−(CH₂)_f −（ Ｚ）_g −(CH₂)_h −で表され、式中、 ｆは０〜10の整数であり、 ｈは０〜10の整数であり、 ｇは０または１の整数であり、但しｇが０の場合、ｆ＋ｈは１〜10であり、 ＺはＳ，Ｏ，NH，SO₂ フェニル、ナフチル、３〜10個の炭素原子を含有する脂 環式炭化水素リング、または３〜６個の炭素原子を含有しかつＯ，ＮもしくはＳ から選択される１個もしくは２個のヘテロ原子を含有するヘテロ芳香族炭化水素 である。 好ましい脂環式部分としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチ ル、シクロヘキシルなどがある。好ましいヘテロ芳香族部分としては、ピリジル 、フラニル、ピラニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、オキサジニ ル、ピロリル、チアゾリル、モルホリニルなどがある。 架橋基において、ｇが０の場合、ｆ＋ｈは２〜６の整数であり、好ましくは２ 〜４であり、そしてより好ましくは２である。ｇが１の場合、ｆが０，１または ２でありそしてｈが０，１または２であることが好ましい。チオール受容体 式Ｉ，II，IIIおよびIVで表される分子において、チオール受容体“Ａ”は、 リガンド由来の硫黄を通じてリガンドに連結されている。そのチオール受容体は 、チオール基を通じてチオエステル結合によってリガンドに結合した後チオール 付加物になる。チオール受容体は、例えば、α置換アセチル基でもよい。このよ うな基は式： 例としては、Cl，Br，Ｉ，meaylate，トシレートなどがある。チオール受容体が α−置換アセチル基の場合、リガンドに結合した後、チオール付加物は−Ｓ−CH₂ −結合を形成する。 好ましくは、チオール受容体はマイケル付加反応受容体である。 される受容体である。 リガンドに結合した後、そのマイケル付加反応受容体は、例えば る。薬物 本発明の薬物／リンカー分子およびコンジュゲートの薬物は、薬物が特に有益 である所望の細胞に薬物を輸送するリガンド固有の性能があるため、対応する薬 物が有効でありかつ優れた効力を有する通常の目的に対して有効である。さらに 、本発明のコンジュゲートは、与えられた生物学的応答を改変するのに使用でき るので、薬物の部分は、古典的な化学療法剤に限定されると解すべきではない。 本発明に用いるのに好ましい薬物は、細胞毒性薬物、特に癌の治療に用いられ る薬物である。このような薬物としては一般に、DNA障害剤、代謝拮抗薬、天然 産物およびその類似体がある。好ましいクラスの細胞毒性薬物としてはアントラ サイクリンファミリーの薬物である。そのクラスの特に有用なメンバーとしては 、例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、カルミノマイシン、モルホリノド キソルビシン、ジアセチルノエニルドキソルビシンおよびそれらの類似体が挙げ られる。 先に述べたように、当該技術分野の当業者は、本発明のコンジュゲートを製造 するのを目的として所望の化合物の反応を一層便利にするためその化合物を化学 的に修飾できる。 式IIで表されるコンジュゲートにおいて、Ｄは、その骨格に化学的に反応性の 官能側基を有する薬物部分であり、その官能側基によって薬物の骨格はリンカー に結合し、前記官能側基はアルデヒドまたはケトンからなる群から選択される。 本発明の薬物として使用する非常に好ましい細胞毒性剤の群としては下記式で 表される薬物がある。 すなわち、下記式（Ｖ）で表されるアントラサイクリンの抗生物質であり、 式中、Ｒ¹ は−CH₃ ，−CH₂OH ，−CH₂OCO(CH₂)₃CH₃ または−CH₂OCOCH(OC₂H₅)₂ であり、 Ｒ² は−OCH₃，−OHまたは−Ｈであり、 Ｒ³ は−NH₂ ，−NHCOCF₃ ，４−モルホリニル、３−シアノ−４−モルホリニ ル、１−ピペリジニル、４−メトキシ−１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジ ベンジルアミン、シアノメチルアミン、１−シアノ−２−メトキシエチルアミン またはNH−(CH₂)₄−CH(OAc)₂であり、 Ｒ⁴ は−OH，−OTHPまたは−Ｈであり、および Ｒ⁵ は−OHまたは−Ｈであり、但しＲ⁴ が−OHまたは−OTHPの場合Ｒ⁵ は−OH ではない。 当該技術分野の当業者は、構造式（Ｖ）が、当該技術分野で異なる一般名また は慣用名をつけられている薬物またはその誘導体である化合物を含んでいると解 している。次に示す表１は、本発明に用いるのに特に好ましいいくつものアント ラサイクリン薬物とその一 般名または慣用名を示す。 表Ｉに示す化合物のうち、最も好ましい薬物はドキソルビシンである。ドキソ ルビシン（本明細書では“DOX”とも呼称している）は、表Ｉに、Ｒ¹ が−CH₂OH であり、Ｒ³ が−OCH₃ であり、Ｒ⁴ が−NH₄ であり、Ｒ⁵ が−OHでありそして Ｒ⁶ が−Ｈであると示されているアントラサイクリンである。 標的指向リガンド “リガンド”には、その範囲内に、与えられた標的細胞集団に関連する受容体 または他の受容部分と、特異的に結合するかまたは反応して結合するかまたは複 合体を形成する分子が含まれている。コンジュゲート内で、この細胞反応性分子 には薬剤がリンカーを通じて結合しているが、この細胞反応性分子は、治療によ ってまたは他の方法で生物学的に修飾することを求められている細胞集団であっ て、遊離の反応性スルフヒドリル基（−SH）をもっているかまたは修飾してかよ うなスルフヒドリル基を含有させることができる細胞集団と結合し、複合体を形 成しまたは反応する分子であればよい。その細胞反応性分子は、リガンドが反応 する特定の標的細胞集団に、治療上有効な薬物部分を送達する働きをする。かよ うな分子としては、限定されないが、大分子量のタンパク質の例えば抗体類、小 分子量のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドのリガンド類、および非ペ プチドのリガンド類が挙げられる。 本発明のコンジュゲートを製造するのに使用できる非免疫反応性のタンパク質 、ポリペプチドまたはペプチドのリガンドとしては、限定されないが、トランス フェリン、上皮増殖因子（“EGF”）、ボンベシン、ガストリン、ガストリン放 出ペプチド、血小板由来増殖因子、IL−２、IL−６、腫瘍増殖因子（“TGF”） 例えばTGF−ａと TGF−ｂ、ワクシニア増殖因子（“VGF”）、インスリンおよび インスリン様増殖因子ＩとIIがある。非ペプチドのリガンドとしては、例えば炭 水化物類、レクチン類、および低密度リポタンパク質由来のアポタンパク質が挙 げられる。 免疫反応性リガンドとしては、抗原認識免疫グロブリン（“抗体”とも呼称さ れる）またはその抗原認識フラグメントがある。特に好ましい免疫グロブリンは 、腫瘍関連抗原を認識できる免疫グロブ リンである。用語“免疫グロブリン”は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリ ンの承認されているクラスまたはサブクラス例えばIgG，IgA，IgM，IgDまたはIg E を意味する。IgG クラス内の免疫グロブリンが好ましい。免疫グロブリンはあ らゆる種から誘導することができる。しかし好ましいのは、ヒト、マウスまたは ウサギが起源の免疫グロブリンである。さらに、免疫グロブリンは、ポリクロー ナルまたはモノクローナルでもよいが、モノクローナルが好ましい。 先に述べたように、当該技術分野の当業者は、本発明が抗原を認識する免疫グ ロブリンのフラグメントの使用を含んでいると理解しているであろう。このよう な免疫グロブリンのフラグメントとしては、例えばFab'，F(ab')₂，FvもしくはF ab の諸フラグメントまたは他の抗原認識免疫グロブリンのフラグメントがある 。このような免疫グロブリンのフラグメントは、例えば、ペプシンもしくはパパ インのようなタンパク質分解酵素による消化、還元的アルキル化反応または組換 え技術で製造することができる。このような免疫グロブリンのフラグメントを製 造するための材料と方法は当該技術分野の当業者にとって公知である（一般に、 Parham，J．Immunology，131巻、2895頁、1983年；Lamoyiら、J．Immunological Methods，56巻、235頁、1983年；Parham，J．Immunological Methods，53巻、1 33頁、1982年；および Matthewら、J．Immunological Methods,50巻、239頁、19 82年参照）。 免疫グロブリンは、その用語が当該技術分野で認められているように“キメラ 抗体”であってもよい。また、免疫グロブリンは“二官能”抗体または“ハイブ リッド”抗体であってもよい。すなわち、例えば腫瘍関連抗原のような一つの抗 原部位に対する特異性を有する一方のアームを有し、そして他方のアームが異な る標的、例え ば抗原保有腫瘍細胞にとって致命的な薬剤であるか、またはかような薬剤が結合 されているハプテンを認識する抗体である。あるいは、その二官能抗体は、各ア ームが細胞の腫瘍関連抗原の異なるエピトープに対する特異性を有する抗体であ り、この特異性は治療面または生物学的に改変される。いずれにしろ、これらハ イブリッド抗体は、二重の特異性を有し、好ましくは、選択されたハプテンに対 して特異的な一つ以上の結合部位、または標的抗原、例えば腫瘍、感染性生物ま たは他の病状に関連する抗原に対して特異的なさらに多くの結合部位をもってい る。 生物学的な二官能抗体は、例えばヨーロッパ特許願公開第A0105360号に記載さ れている。なおこの文献は当該技術分野の当業者が参照している。このようなハ イブリッド抗体または二官能抗体は、さきに述べたように、生物学的に細胞融合 法によってまたは化学的に特に架橋剤すなわちジスルフィドのブリッジ形成剤を 用いて誘導することができ、そして全抗体および／またはそのフラグメントで構 成されていてもよい。かようなハイブリッド抗体を得る方法は、例えば、1983年 10月27日付けで公開されたPCT 特許願公開第WO83/03679号および1987年４月８日 付けで公開されたヨーロッパ特許願公開第A0217577号に開示されている。なおこ れらの開示は本願に援用するものである。特に好ましい二官能抗体は、“ポリド ーマ（polydoma）”もしくは“クワドローマ（quadroma）”で生物学的に製造さ れる抗体、またはビス−（マレイミド）−メチルエーテル（“BMME”）などの架 橋剤もしくは当該技術分野の当業者が精通している他の架橋剤で合成される抗体 である。 さらに、免疫グロブリンは一本鎖抗体（“SCA ”）でもよい。これらは、可変 軽（“Ｖ_L ”）領域と可変重（“Ｖ_H ”）領域がペプチドのブリッジまたはジス ルフィド結合によって結合されている一 本鎖のFvフラグメント（“scFv”）で構成されている。また免疫グロブリンは抗 原結合活性を有する単一Ｖ_H 領域(dAb)で構成されていることもある（例えば、G ．Winter およびC．Milstein，Nature,349巻、295頁、1991年；R．Glockshuber ら、Biochemistry，29巻、1362頁、1990年；およびE．S．Wardら、Nature， 34 1巻、544頁、1989年参照）。 本発明に用いるのに特に好ましいのはキメラモノクローナル抗体であり、好ま しくは腫瘍関連抗原に対して特異性を有するキメラ抗体である。用語“キメラ抗 体”は、本明細書で使用する場合、可変領域すなわち一つの起源または種由来の 結合領域および異なる起源の種由来の少なくとも一部分の不変領域からなり、通 常、組換えDNA 法で製造されるモノクローナル抗体を意味する。マウスの可変領 域とヒトの不変領域からなるキメラ抗体は、本発明の特定の用途、特にヒトの治 療の用途に特に好ましい。というのは、このような抗体は、容易に製造されかつ 純粋なマウスモノクローナル抗体より免疫原性が低いからである。かようなマウ ス／ヒトキメラ抗体は、マウスの免疫グロブリンの不変領域をコードするDNA セ グメントを含んでなる免疫グロブリン遺伝子が発現して生成した産物である。本 発明に含まれる他の形態のキメラ抗体は、そのクラスまたはサブクラスが元の抗 体のクラスまたはサブクラスを修飾したりまたは変化させた抗体である。また、 このような“キメラ”抗体は“クラススイッチ抗体”とも呼称される。キメラ抗 体の製造方法には、当該技術分野で現在よく知られている通常の組換えDNA 法お よび遺伝子トランスフェクション法がある（例えば、Morrison，S．L．ら、Proc ．Nat'l．Acad．Sci.，81 巻、6851頁、1984年参照）。 用語“キメラ抗体”は、“ヒト化抗体”の概念を含み、枠組み構造または“相 補性決定部位(CDR)”が修飾されて、親の免疫グロブ リンのCDR と比べて異なる特異性を有する免疫グロブリンのCDR を含有する抗体 である。好ましい実施態様で、マウスのCDR がヒトの抗体の枠組み領域中にグラ フトされて“ヒト化抗体”が製造される（例えば、L．Riechmannら、Nature，33 2巻、323頁、1988年；M.S．Neuberger ら、Nature，314巻、268頁、1985年参照 ）。特に好ましいCDR は、キメラ抗体や二官能抗体に対する先に述べた抗原を認 識する配列を示すCDR に相当する。リーダーは、1987年９月30日付け公開のヨー ロッパ特許願公開第A0239400号の教示を参照する。なおCDR で修飾された抗体に ついてのこの文献の教示は本願に援用する。 当該技術分野の当業者は、前記二官能抗体の特に治療処置時のフレキシビリテ ィーのみならずキメラ抗体またはヒト化抗体の低い免疫原性の利点を有する二官 能−キメラ抗体を製造できることが分かるであろう。このような二官能−キメラ 抗体は、例えば、架橋剤を使用する化学合成法および／または先に述べた種類の 組換え法によって合成することができる。いずれにしても、本発明は、二官能、 キメラ、二官能−キメラ、ヒト化または抗原を認識するフラグメントまたはその 誘導体のいかんをとわず、抗体の特定の製造方法によって範囲を限定されないと 解すべきである。 さらに、本発明の範囲には、活性タンパク質、例えば1986年３月13日に公開さ れたNeuberger らのPCT 特許願公開第WO86/01533号に開示されている種類の酵素 を融合された免疫グロブリン（前記定義のような）または免疫グロブリンのフラ グメントが含まれている。なおこのような産物の上記文献の開示事項は本願に援 用するものである。 さきに述べたように“二官能”の、“融合された”、“キメラの”（ヒト化さ れたを含む）および“二官能−キメラの”（ヒト化さ れたを含む）抗体の構造体には、その個々の場合に、抗原を認識するフラグメン トを含み構造体が含まれている。当該技術分野の当業者が認識しているように、 このようなフラグメントは、無傷の二官能の、キメラの、ヒト化されたまたはキ メラ−二官能の抗体を酵素で開裂する伝統的な方法で製造できる。しかし、無傷 の抗体が、その構造の性質のため、このような開裂を受けにくい場合、前記構造 体は、免疫グロブリンのフラグメントを出発原料として用いて製造するか、また は組換え法を使用する場合、発現されたときに生体内または生体外で化学的また は生物学的手段で結合させて最終の望ましい無傷の免疫グロブリン“フラグメン ト”を製造することができる所望の“フラグメント”をコードするように、DNA 配列自体を調製することができる。したがって、この意味で、用語“フラグメン ト”が使用される。 さらに、さきに述べたように、本発明で使用される免疫グロブリン（抗体）ま たはそのフラグメントは、事実上、ポリクローナルまたはモノクローナルでもよ い。しかし、モノクローナル抗体が好ましい免疫グロブリンである。このような ポリクローナルまたはモノクローナルの抗体の製造法は、現在、当該技術分野の 当業者にとって公知であり、これら当業者は勿論、本発明に使用できる有用な免 疫グロブリンを十分に製造することができる（例えば、G．KohlerおよびC．Mils tein，Nature，256巻、495頁、1975年参照）。さらに、本発明を実施するのに有 用な、ハイブリドーマおよび／またはそのハイブリドーマで製造されるモノクロ ーナル抗体は、米国メリーランド州 20852、ロックビル、パークローン・ドライ ブ 12301所在のAmerican Type Culture Collection（“ATCC”）のような供給源 から公けに入手可能であり、または例えば米国インディアナ州 46250インディア ナポリス私書籍50816 のBoehringer-Mannheim Bioc hemicals社から商業的に入手できる。 本発明に用いるのに特に好ましいモノクローナル抗体は、腫瘍関連抗原を認識 するモノクローナル抗体である。このようなモノクローナル抗体は、限定されな いが、例えば下記のものが含まれる。（なおその開示事項は本明細書に援用する ものである）。 好ましい実施態様のリガンド含有コンジュゲートは、1991年１年10日付けで公 開されたPCT 特許願公開第WO91/00295号に相当する1990年６月26日付け出願の米 国特許第07/544,246号に開示されているキメラ抗体BR96“ChiBR96 ”から誘導さ れる。なおこれら特許願は本願に援用する。ChiBR96 は、インターナライジング マウス／ヒトキメラ抗体であり、先に述べたように、例えば、乳癌、肺癌、結腸 癌および卵巣癌由来のヒト癌細胞によって発現されるフコシル化ルイスＹ抗原と 反応性である。修飾されたおよび／またはヒト化されたBR96抗体も本発明に使用 することができ、このような抗体の実例は、1994年８月４日出願の米国特許願第 08/285,936号および1995年６月７日付け出願の米国特許願第08/487,860号に開示 されている。なおこれらの開示は本願に援用するものである。キメラBR96を発現 しChiBR96 と確認されているハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に基づい て、1990年５月23日付けで、American Type CultureCollection（“ATCC”）（ 米国メリーランド州 20852，ロックビル，パークローン・ドライブ 12301所在） に寄託した。このハイブリ ドーマの試料は、受託番号ATCC 10460に基づいて入手することができる。ChiBR9 6 は一部分、その起源の親のBR96から誘導される。BR96を発現するハイブリドー マは、ブダペスト条約の規定に基づいて、1989年２月21日付けでATCCに寄託した 。そのハイブリドーマは受託番号HB10036 に基づいて入手することができる。所 望のハイブリドーマを培養し、生成した抗体を、当該技術分野で現在公知の標準 の方法を用いて細胞培養物の上澄み液から単離する〔例えば、Hurell編“Monocl onal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications”（CRC Press 社、 1982年）参照〕。 したがって、用語“免疫グロブリン”または“抗体”には、本明細書で使用す る場合、その意味の中に、上記の免疫グロブリン／抗体の形態もしくは構造体の すべてが含まれている。 本発明のコンジュゲートは、線状コンジュゲートに比べて活性が改善されてい る。また、本発明には、癌および他の腫瘍、非細胞破壊性のウィルスまたは他の 病原感染症および自己免疫疾患のごとき疾患を治療するための医薬組成物、混合 物および方法も含まれる。さらに詳しく述べると、本発明には、本発明の少なく とも１種のコンジュゲートの医薬として有効な量を、医薬として許容される方式 で、宿主の哺乳類、好ましくはヒトに投与することからなる哺乳類の疾患の治療 方法が含まれる。 本発明の方法の別の実施態様としては、多剤併用化学療法に用いるため、異な る医薬または異なる標的指向リガンドを含有するいくつもの異なるコンジュゲー トを、同時にまたは順に投与する方法がある。例えば、本発明の実施態様では、 いくつものコンジュゲートが使用される。すなわち、コンジュゲートの抗体成分 の特異性が変化し、すなわち何種類ものコンジュゲートが使用されて、各コンジ ュゲートが、異なる抗原または同じ抗原の異なる部位またはエピト ープ、または対象の細胞集団に存在する同じ抗原の異なる部位またはエピトープ に特異的に結合する抗体をもっている。これらコンジュゲートの薬物成分は、同 じでも変わってもよい。例えば、この実施態様は、腫瘍の表面の各種の抗原の量 が未知であるかまたは腫瘍細胞の集団の抗原発現が不均質なので、十分な量の薬 物に、腫瘍部位のすべての腫瘍細胞を確実に標的として指向させたい、特定の腫 瘍を治療するのに特に有用である。腫瘍に対し異なる抗原特異性またはエピトー プ特異性を有するコンジュゲートをいくつも使用すると、腫瘍部位に十分な薬物 が到達する可能性が増大する。さらにこの実施態様は、正常な組織が同じ腫瘍関 連抗原をすべてもっている可能性は小さいので、腫瘍に対し高度の特異性を達成 するのに重要である（例えば、J．Immunol.，127(1)巻、157〜160頁、1981年参 照）。 あるいは、いくつもの異なるコンジュゲートを使用してもよい。この場合、コ ンジュゲートの薬物の成分だけを変える。例えば特定の抗体に二つ以上のドキソ ルビシンを結合させて一つのコンジュゲートを製造し、そして二つ以上のダウノ マイシンを結合させて第二のコンジュゲートを製造することができる。次に両方 のコンジュゲートを、治療される宿主に投与して、抗体の特異性によって、除去 することが求められている選択された細胞集団の部位に局在させることができる 。次に両方の薬物がその部位で放出される。この実施態様は、この方法が、標的 細胞の部位または標的細胞内にいくつもの異なる薬物を放出できるので、腫瘍の ような特定の細胞集団の薬剤耐性が予測できない場合に重要である。追加の実施 態様では、２種以上の薬物を、特別の抗体にコンジュゲートして、各種の薬物を その表面に有するコンジュゲートが製造され、それら薬物はすべてアシルヒドラ ゾン結合を通じて抗体に連結されている。この実施態 様のコンジュゲートを投与すると、いくつもの異なる薬物が標的細胞の部位にま たは標的細胞の中に放出される。さらに、複数の薬物−標的指向リガンドコンジ ュゲートを併用して、薬物を、表面に特定のリガンドに対する受容体をもってい るだけでなく特定の抗原をもっている細胞集団を標的として指向させることがで きる。やはり、この多剤併用療法では、１種類の薬物またはいくつもの異なる薬 物を使用することができる。 本発明のコンジュゲート類は、医薬組成物の形態で、通常の投与法で投与する ことができ、投与法としては制限はないが、静脈内、腹腔内、経口もしくはリン パ管内の投与、または腫瘍などの選択された細胞集団の部位への直接投与がある 。静脈内投与が好ましい。コンジュゲートの場合、生体内治療を行うとき、Fab もしくはＦ(ab'')₂ のような抗体フラグメントまたはキメラ抗体もしくはヒト化 抗体を含んでなるコンジュゲートを使用することが有効である。 コンジュゲートを含んでなる本発明の医薬組成物には各種の剤形のものがあり 、制限はないが、固体、半固体および液体の剤形の例えば錠剤、丸剤、粉末薬、 液体の水剤もしくは懸濁剤、坐剤、ポリマーのマイクロカプセル剤、微細小胞剤 、リポソーム類、および注射用もしくは注入用液剤がある。好ましい剤形は、投 与法と治療用途によって決まる。 また、本発明の医薬組成物は、当該技術分野で公知の通常の医薬担体を含有し ていてもよく、これら担体としては、例えば、ヒト血清アルブミンのような血清 タンパク質；リン酸塩類、水もしくは塩類のような緩衝性物質；または電解質類 がある。 本発明のコンジュゲートの、最も有効な投与法と投与処方は、疾患の重症度と 経過、患者の健康状態と治療に対する反応および治療する医師の判断によって決 まる。したがってコンジュゲートと添加 される化合物の投与量は、個々の患者ごとに決定すべきである。しかし、コンジ ュゲートの有効投与量は、約１〜約100mg／ｍ² 薬物または約 500〜5000mg／ｍ² 抗体の範囲内である。抗体ではなくてリガンドを含有するコンジュゲートの有 効投与量は約１〜約100mg／ｍ² 薬物または約１〜約100mg／ｍ² リガンドの範囲 内である。本発明の分子の製造 炭素−分枝リンカーは、保護されたアミン官能性を含有しているビス−カルボ ン酸から誘導される。多数のステップの工程を経て、前記カルボン酸基が末端の ヒドラジド基に転化され、アミノ基が生成して末端のチオール受容体が得られる 。マルチプルヒドラジド（multiple hydvazide）と、アルデヒド基またはケトン 基を含有する薬物とが縮合すると、その薬物のマルチプルアシルヒドラゾンが得 られる。 窒素−分枝リンカーはオリゴアミンから誘導され、そのオリゴアミンは１個の アミノ基以外はすべて生成して末端のＮ，Ｎ−ジアルカノイルヒドラジド基が生 成するという方式で差別して保護されている。残りのアミノ基が生成して末端の チオール受容体が生成する。マルチプルヒドラジドが、アルデヒド基またはケト ン基を含有する薬物と縮合して、薬物のマルチプルアシルヒドラゾンが得られる 。 標的指向リガンドへのリンカーのコンジュゲーションは、制御された大気条件 下で生成させたリガンドの遊離チオール基を、リンカーの末端チオール受容体と 反応させることによって行われる。 本発明の化合物類を製造する代表的な反応図式を以下に示す。その化合物の番 号は本明細書の実施例の章と相互参照される。 代表的なビス−およびテトラ−DOX ヒドラゾン類 図式Ｉ．２の合成 図式II．３の合成 図式III．18の合成 図式IV．26の合成 図式Ｖ．32の合成 図式VI．38の合成 図式VII．46の合成上記反応図式中の略語の定義は次のとおりである。Ｚはカルボベンゾキシ、DCC はジシクヘキシルカルボジイミド、BOC はｔ−ブトキシカルボニル、TFA はトリ フルオロ酢酸、そしてDOX はドキソルビシンである。 以下の実施例は本発明を説明する実施例であるが、本発明を限定 すると解すべきではない。実施例１ Ｚ−グルタミルジ(Boc)ヒドラジド（化合物番号４） Ｚ−グルタミン酸(42.20ｇ，150mmole)およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド( 34.53ｇ，300mmole)を、乾燥Ｎ₂ 雰囲気下０℃の150mlのDMF に溶解した。ジシ クロヘキシルカルボジイミドを塩化メチレン(600ml，300mmole)に溶解して得た 0.5Ｍ溶液を、撹拌しながら、１hrかけて滴下して添加した。その反応液を、冷 蔵庫内に４℃で18hr貯蔵した。ジシクロヘキシル尿素の沈澱(65.48ｇ，98％)を 濾過し、次に濾液を、固体のｔ−ブチルカルバゼート(39.65ｇ，300mmole)に直 接加えた。室温で48hr撹拌した後、その反応液をロータリーエバポレーターで蒸 発させて油状物とし、その油状物を、300ml酢酸エチル／200ml エーテルに再び 溶解した。有機層を、200mlの10％クエン酸溶液で３回、200mlの重炭酸ナトリウ ムの飽和水溶液で３回および100mlのブラインで１回抽出した。得られた有機層 を硫酸ナトリウムで乾燥し次にロータリーエバポレーターで蒸発させて泡状物を 得た。シリカゲル（４インチ×19インチ）のフラッシュクロマトグラフィーを、 12Ｌの酢酸エチル−ヘキサン２：１を使用して実施した。生成物（４）を含有す る純粋画分をプールし、ロータリーエバポレーターで濃縮して泡状物を得て、こ れを高減圧下で乾燥して 55.24ｇ（72％）の標題化合物（４）を得た。その物性 は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR（CDCl₃）：δ1.44および1.47（２ｓ，18Ｈ）， 1.9−2.4 （bm， ４Ｈ），4.32（bm，１Ｈ），5.06（dd，２Ｈ），5.55（ｄ，１Ｈ）， 6.5（bd ，２Ｈ），7.31（bm，５Ｈ）， 9.6（ｓ，１Ｈ）、および 9.9（ｓ，１Ｈ）。 TLC ： R_f 0.64，CH₂Cl₂／MeOH（９：１）。 マススペクトル： FAB 510（Ｍ＋Ｈ⁺ ） 532（Ｍ＋Na⁺ )，548.1（Ｍ＋Ｋ⁺ ）。 C₂₃H₃₅N₅O₈としての元素分析結果：理論値Ｃ，54.21 ；Ｈ，6.92；Ｎ，13.74 。実測値Ｃ，53.96；Ｈ，6.91；Ｎ，13.41。実施例２ Ｚ−（Ｄ）−グルタミルジ(Boc)ヒドラジド（化合物番号Ｄ−４） Ｚ−（Ｄ）−グルタミン酸(42.20ｇ，150mmole)およびＮ−ヒドロキシスクシ ンイミド(34.53ｇ，300mmole)を、乾燥Ｎ₂ 雰囲気下０℃のDMF 150ml に溶解し た。塩化メチレン(600ml，300mmole)にジシクロヘキシルカルボジイミドを溶解 して得たその 0.5Ｍ溶液を、撹拌しながら、１hrかけて滴下して添加した。その 反応液を、冷蔵庫内に４℃で18hr貯蔵した。ジシクロヘキシル尿素の沈澱(64.97 ｇ，97％)を濾過し、次に濾液を、固体のｔ−ブチルカルバゼート（39.65ｇ，30 0mmole）に直接加えた。室温で48hr撹拌した後、その反応液をロータリーエバポ レーターで蒸発させて油状物とし、その油状物を 300ml酢酸エチル／200ml エー テルに再び溶解した。有機層を、200mlの10％クエン酸溶液で３回、200mlの重炭 酸ナトリウムの飽和水溶液で３回および 100mlのブラインで１回抽出した。得ら れた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し次にロータリーエバポレーターで蒸発させ て泡状物を得た。シリカゲル（４インチ×18インチ）のフラッシュクロマトグラ フィーを以下の勾配液：（１）CH₂Cl₂，２Ｌ，（２）CH₂Cl₂−メタノール25：１ ，４Ｌおよび（３）CH₂Cl₂−メタノール９：１，６Ｌを用いて実施した。CH₂Cl₂ −メタノール９：１で溶出した生成物（１）を含有する純粋な画分をプールし、 次にロータリーエバポレーターで蒸発させることによって濃縮し て泡状物にし、これを高減圧下で乾燥して標題の化合物（Ｄ−４）59.11ｇ（77 ％）を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR（CDCl₃）：δ1.44および1.47（２ｓ，18Ｈ）， 1.9−2.4 （bm， ４Ｈ），4.32（bm，１Ｈ），5.06（dd，２Ｈ），5.57（ｄ，１Ｈ）， 6.6（ｍ ，２Ｈ），7.31（bm，５Ｈ），9.60（ｓ，１Ｈ）、および9.87（ｓ，１Ｈ）。 TLC ： R_f 0.64，CH₂Cl₂／MeOH（９：１）。 マススペクトル： FAB 532（Ｍ＋Na⁺ ）， 549（Ｍ＋Ｋ⁺ ）。 C₂₃H₃₅N₅O₈としての元素分析結果：理論値Ｃ，54.21 ；Ｈ，6.92；Ｎ，13.74 。測値Ｃ，53.99；Ｈ，6.92；Ｎ，13.50 。実施例３ グルタミルジ(Boc)ヒドラジド（化合物番号５） Ｚ−グルタミルジ(Boc)ヒドラジド（４）（19.59ｇ，38.44mmole）に、200ml MeOH中10％のPd−Ｃ（２ｇ）を加えて、50psi の圧力下、３hr水素化した。得ら れた反応液をセライドで濾過し、ロータリーエバポレーターで蒸発させた。生成 した泡状物を高減圧下で乾燥して５（14.40ｇ， 100％）を得た。その物性は下 記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.42および1.45（２ｓ，18Ｈ）， 1.9（bm ，２Ｈ），2.35（ｔ，２Ｈ），3.34（ｔ，１Ｈ）。 TLC ： R_f 0.34，CH₂Cl₂／MeOH（９：１）。 マススペクトル： DCI 376（Ｍ＋Ｈ）⁺。 C₁₅H₂₉N₅O₆・0.5H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，46.87 ；Ｈ，7.87； Ｎ，18.22。実測値Ｃ，46.96；Ｈ，7.74；Ｎ，18.02。実施例４ （Ｄ）−グルタミルジ(Boc)ヒドラジド（化合物番号Ｄ−５） Ｚ−（Ｄ）−グルタミルジ(Boc)ヒドラジド（Ｄ−４）(23.05ｇ，45.2mmole) に、200ml MeOH中10％のPd−Ｃ（２ｇ）を加えて、50psi の圧力下、４hr水素化 した。セライトによって濾過してロータリーエバポレーターで蒸発させた後、泡 状物を得た。シリカゲル（２インチ×20インチ）のフラッシュクロマトグラフィ ーを、以下の勾配液：（１）CH₂Cl₂−メタノール25：１， 600ml， （２）CH₂C l₂−メタノール９：１，６Ｌ、および（３）CH₂Cl₂−メタノール８：２，４Ｌを 用いて行った。純粋な画分をプールし次にロータリーエバポレーターで蒸発させ た。高減圧下で乾燥してＤ−５（13.51ｇ，80％）を得た。その物性は下記のと おりであった。 ¹Ｈ−NMR(d₄ −メタノール)：δ1.46および1.47（２ｓ，18Ｈ），1.94（bm， ２Ｈ），2.33（ｔ，２Ｈ），3.34（ｔ，１Ｈ）。 TLC ： R_f 0.34，CH₂Cl₂／MeOH（９：１）。 マススペクトル： FAB 376（Ｍ＋Ｈ）⁺ ， 398（Ｍ＋Na）⁺ ， 414（Ｍ＋Ｋ ）⁺ 。 C₁₅H₂₉N₅O₆・0.5H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，46.87；Ｈ，7.87；Ｎ ，18.22。実測値Ｃ，46.85；Ｈ，7.63；Ｎ，17.98。実施例５ マレイミドプロピオニルグルタミルジ(Boc)ヒドラジド（化合物番号６ａ） マレイミドプロピオン酸（636mg，3.76mmole）およびＮ−ヒドロキシスクシン イミド（476mg，4.14mmole）を０℃のDMF 10mlに溶解した。CH₂Cl₂を(7.6ml，3. 8mmole)にDCC を溶解して得たその 0.5Ｍ溶液を添加し、その反応溶液を、４℃ で20hr静置した。生成したDCU の沈澱を濾過した後、濾液を５(l.27ｇ，3.38mmo le)に添加し、室温で 2.5日間撹拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させ て溶媒を一部除去した。得られた油状物を 100mlの酢酸エチルに溶解し、次に 1 00mlの10％クエン酸溶液で３回、 100ml の重炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回 および 100mlのH₂O で３回抽出した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し 次にロータリーエバポレーターで蒸発させて泡状物を得た。これを、CH₂Cl₂−酢 酸−メタノール93：２：５を用いるシリカゲル（２インチ×11インチ）のフラッ シュクロマトグラフィーで精製した。純粋な画分をプールし、ロータリーエバポ レーターで蒸発させ、次いで高減圧下で乾燥して、６ａを泡状物（1.22ｇ，69％ ）として得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.46（ｓ，18Ｈ），2.01（ｍ，２Ｈ），2.3 3（ｔ，２Ｈ），2.51（ｔ，２Ｈ），3.76（ｔ，２Ｈ），4.34（ｔ，１Ｈ），6.8 0（ｓ，２Ｈ）。 TLC ： R_f 0.54，CH₂Cl₂−酢酸−メタノール90：２：８。 マススペクトル： FAB 549.4（Ｍ＋Na）⁺ ， 565.3（Ｍ＋Ｋ）⁺。 C₂₂H₃₄N₆O₉・２HOAcとしての元素分析結果：理論値Ｃ，48.29 ；Ｈ，6.55； Ｎ，13.00。実測値Ｃ，48.15；Ｈ，6.48；Ｎ，13.28。実施例６ マレイミドブチリルグルタミルジ(Boc)ヒドラジド（化合物番号６ｂ マレイミド酪酸(1.9ｇ，10.3mmole)およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド(2.7 g，23.5mmole)を０℃のDMF 25mlに溶解した。CH₂Cl₂(45ml，22.5mmole)にDCC を 溶解して得たその 0.5Ｍ溶液を添加し、その反応溶液を４℃で16hr静置した。生 成したDCU の沈澱を濾過した後、濾液を５(7.7ｇ，20.5mmole)に添加し、次にそ の反応液を ４℃で４日間貯蔵した。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を除いた。 得られた油状物を 100mlの酢酸エチルに溶解し、次に、 100mlの10％クエン酸溶 液で３回、100mlの重炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回および100mlのH₂O で３回 抽出した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し次にロータリーエバポレー ターで蒸発させて泡状物を得た。この泡状物を、シリカゲルのプラグにより、CH₂ Cl₂−酢酸−メタノール93：２：５を用いて精製し、次いでロータリーエバポレ ーターで蒸発させ、次に高減圧下で乾燥して６ｂを泡状物として（3.50ｇ，63％ ）得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.36および1.37（２ｓ，18Ｈ），1.77（ｐ ，２Ｈ），2.00（bm，２Ｈ），2.14（ｔ，２Ｈ），2.26（ｔ，２Ｈ），3.43（ｔ ，２Ｈ），4.26（ｔ，１Ｈ），6.71（ｓ，２Ｈ）。 TLC ： R_f 0.58，CH₂Cl₂−酢酸−メタノール90：２：８。 マススペクトル： 541（Ｍ＋Ｈ）⁺ ， 563（Ｍ＋Na）⁺ ， 579（Ｍ＋Ｋ）⁺ 。 C₂₃H₃₆N₆O₉・0.75H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，49.86；Ｈ，6.82；Ｎ ，15.17。実測値Ｃ，50.21；Ｈ，6.72；Ｎ，14.79。実施例７ マレイミドブチリル−（Ｄ）−グルタミルジ(Boc)ヒドラジド（化合物番号Ｄ −６ｂ） マレイミド酪酸(1.832g，10.0mmole)を、０℃でＮ₂ 雰囲気下、Ｎ−メチルモ ルホリン(1.21ml，11.0mmole)含有の60ml乾燥THF で溶解した。クロロギ酸イソ ブチル(1.30ml，10.0mmole)を滴下して添加し、続いて10分後、（Ｄ）−グルタ ミルジ(Boc)ヒドラジド（ Ｄ−５）(3.754ｇ，10.0mmole)を添加した。撹拌を０℃で１hr続けた。反応液を ロータリーエバポレーターで蒸発させて泡状物を得て、次にこれを150mlのEtoAC に溶解した。得られた有機層を 100mlの10％クエン酸溶液で２回および 100ml のNaHCO₃飽和水溶液で２回洗浄した。その有機層を濃縮して泡状物を得て、これ を、シリカゲル（２インチ×11インチ）のフラッシュクロマトグラフィーにより 、CH₂Cl₂−酢酸−メタノール95：２：３（２Ｌ）続いてCH₂Cl₂−酢酸−メタノー ル93：２：５（１Ｌ）を用いて精製した。純粋の画分をプールし、ロータリーエ バポレーターで蒸発させて泡状物を得た。その泡状物を高減圧下で乾燥して３（ 3.25ｇ，60％）を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.45および1.46（２ｓ，18Ｈ），1.86（ｍ ，２Ｈ），2.09（bm，２Ｈ），2.24（ｔ，２Ｈ），2.35（ｔ，２Ｈ），3.52（ｔ ，２Ｈ），4.35（ｔ，１Ｈ），6.81（ｓ，２Ｈ）。 TLC ： R_f 0.51，CH₂Cl₂−酢酸−メタノール90：５：５。 マススペクトル： 563（Ｍ＋Na）⁺ ，579．（Ｍ＋Ｋ）⁺ 。 C₂₃H₃₆N₆O₉・0.75H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，49.86；Ｈ，6.82；Ｎ ，15.17。実測値Ｃ，50.25；Ｈ，6.65；Ｎ，14.80。実施例８ マレイミドカプロイルグルタミルジ(Boc)ヒドラジド（化合物番号６ｃ） マレイミドカプロン酸(4.22ｇ，20mmole)およびＮ−ヒドロキシスクシンイミ ド(2.53ｇ，22mmole)を０℃のDMF 25mlに溶解した。CH₂Cl₂(40ml，20mmole)にDC C を溶解して得たその 0.5Ｍ溶液を添加し、次にその反応液を４℃で20hr静置し た。生成したDCU の沈澱 を濾過した後、濾液を５(7.88ｇ，2lmmole)に添加し、得られた反応液を室温で ６hr撹拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を除去した。得られ た油状物を 100mlの酢酸エチルに溶解し、次に 100mlの10％クエン酸溶液で３回 、 100mlの重炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回、次に 100mlのH₂Oで３回抽出し た。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、次にロータリーエバポレーター で蒸発させて泡状物を得た。これを、シリカゲル（２インチ×10インチ）のフラ ッシュクロマトグラフィーにより、CH₂Cl₂−酢酸−メタノール97：１：２を用い て精製した。純粋の画分をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発させそし て高減圧下で乾燥させて６ｃを泡状物（6.40ｇ，56％）として得た。その物性は 下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ 1.2（ｐ，２Ｈ），1.40（ｓ，18Ｈ）， 1. 5（ｍ，４Ｈ）， 2.0（bm，２Ｈ），2.14（ｔ，２Ｈ），2.28（ｔ，２Ｈ），3.4 1（ｔ，２Ｈ），4.29（ｔ，１Ｈ），6.72（ｓ，２Ｈ）。 TLC ：R_f 0.30，CH₂Cl₂−CH₂Cl₂−酢酸−メタノール93：２：５。 マススペクトル： FAB 569（Ｍ＋Ｈ）⁺ ， 591（Ｍ＋Na）⁺ ，６07（Ｍ＋Ｋ）⁺ 。 C₂₅H₄₀N₆O₉・0.5H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，51.98 ；Ｈ，7.15； Ｎ，14.55。実測値Ｃ，51.79；Ｈ，6.96；Ｎ，14.39。実施例９ マレイミドプロピオニルグルタミルジヒドラジドジトリフルオロアセテート（ 化合物番号：７ａ） マレイミドプロピオニルグルタミルジ(Boc)ヒドラジド（６ａ） (1.50ｇ，2.85mmole)を、15mlのCH₂Cl₂／トリフルオロ酢酸（１：１）中で、 Ｎ₂ 雰囲気下、1.5hr撹拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を 除いた。エーテルを添加して３回、共蒸発させ(co−evaporate)、生成した固体 をエーテルを用いて研和した。固体を濾過し、高減圧下で乾燥して７ａ(1.6ｇ， 100％)を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.99および2.16（２ｍ，２Ｈ），2.41（ｔ ，２Ｈ），2.5３（ｔ，２Ｈ），3.80（ｔ，２Ｈ），4.38（dd，１Ｈ），6.81（ ｓ，２Ｈ）。 マススペクトル：FAB 349.2 （Ｍ＋Na）⁺ ， 365.1（Ｍ＋Ｋ）⁺ 。 C₁₂H₁₈N₆O₅・2.8TFAとしての元素分析結果：理論値Ｃ，32.75 ；Ｈ，3.25； Ｎ，13.02。実測値Ｃ，33.04；Ｈ，3.37；Ｎ，12.72。実施例10 マレイミドブチリルグルタミルジヒドラジドジトリフルオロアセテート（化合 物番号７ｂ） マレイミドブチリルグルタミルジ(Boc)ヒドラジド（６ｂ）(3.50ｇ，6.47mmol e)を、40mlのCH₂Cl₂／トリフルオロ酢酸（１：１）中で、Ｎ₂ 雰囲気下、２hr撹 拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を除去した。エーテルを添 加して３回、共蒸発させ、得られた固体をエーテルを用いて研和した。固体を濾 過し、高減圧下で乾燥して７ｂ(3.8ｇ， 100％)を得た。その物性は下記のとお りであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.87（ｐ，２Ｈ），2.0および2.2（２ｍ， ２Ｈ），2.27（ｔ，２Ｈ），2.44（ｍ，２Ｈ），3.53（ｔ，２Ｈ），4.42（dd， １Ｈ），6.82（ｓ，２Ｈ）。 マススペクトル： FAB 341（Ｍ＋Ｈ）⁺ ， 363（Ｍ＋Na）⁺ ，379（Ｍ＋Ｋ）⁺ 。 C₁₃H₂₀N₆O₅・3.15TFA としての元素分析結果：理論値Ｃ，33.14；Ｈ，3.34； Ｎ，12.01。実測値Ｃ，33.49；Ｈ，3.52；Ｎ，11.6４。実施例11 マレイミドブチリル−（Ｄ）−グルタミルジヒドラジドジトリフルオロアセテ ート（化合物番号Ｄ−７ｂ） マレイミドブチリル−（Ｄ）−グルタミルジ(Boc)ヒドラジド（Ｄ−６ｂ）(2. 06ｇ，3.81mmole)を、40mlのCH₂Cl₂／40mlのトリフルオロ酢酸中でＮ₂ 雰囲気下 、１hr撹拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を除去した。エー テルを添加して３回、共蒸発させ、得られた固体をエーテルで研和した。固体を 濾過し、高減圧下で乾燥してＤ−７ｂ(2.2ｇ， 100％)を得た。その物性は下記 のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.79（ｐ，２Ｈ），1.9および2.1（２ｍ， ２Ｈ），2.18（ｔ，２Ｈ），2.37（ｍ，２Ｈ），3.45（ｔ，２Ｈ），4.35（dd， １Ｈ），6.73（ｓ，２Ｈ）。実施例12 マレイミドカプロイルグルタミルジヒドラジドジトリフルオロアセテート（化 合物番号：７ｃ） マレイミドカプロイルグルタミルジ(Boc)ヒドラジド（６ｃ）(5.96ｇ，10.5mm ole)を、 100mlのCH₂Cl₂／トリフルオロ酢酸（１：１）中でＮ₂ 雰囲気下、１hr 撹拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を除去した。エーテルを 添加して３回、共蒸発させ、得られた固体をエーテルで研和した。固体を濾過し 、高減圧下で乾燥して７ｅ(6.3ｇ， 100％)を得た。その物性は下記のとおり であった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.22（ｐ，２Ｈ），1.52（ｓ，４Ｈ），1.9 2および2.09（２ｍ，２Ｈ），2.18（ｔ，２Ｈ），2.35（ｍ，２Ｈ），3.41（ｔ ，２Ｈ），4.35（dd，１Ｈ），6.72（ｓ，２Ｈ）。 マススペクトル：FAB 369 （Ｍ＋Ｈ）⁺ ，391 （Ｍ＋Na）⁺ ， 407（Ｍ＋Ｋ）⁺ 。 C₁₅H₂₄N₆O₅・2.5TFAとしての元素分析結果：理論値Ｃ，36.76；Ｈ，4.09；Ｎ ，12.86。実測値Ｃ，36.66；Ｈ，4.22；Ｎ，12.72。実施例13 ドキソルビシンのマレイミドプロピオニルグルタミルジヒドラゾン（化合物番 号２ａ“MP−Glu(DOX)₂ ”） マレイミドプロピオニルグルタミルジヒドラジドジトリフルオロアセテート（７ａ ）(600mg，1.07mmole)およびDOX・HCl (1.24ｇ，2.14mmole)を、３hrかけ て600mlのメタノールに溶解した。その反応液を、ロータリーエバポレーターで 蒸発させて、100mlまで濃縮し、次に３日間撹拌した。反応液をさらに12mlまで 濃縮し、次にLH−20カラム（２”×10”）を用いてメタノールで溶出させた。混 合した画分については、同じシステムでクロマトグラフィーを繰り返した。得ら れた精製生成物をロータリーエバポレーターで蒸発させて赤色被膜を得、それを 高減圧下で乾燥して２ａ(776mg，50％)を得た。その物性は下記のとおりであっ た。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：（選択されたピーク）δ1.34（２ｄ，６Ｈ） ，4.07（２ｓ，６Ｈ），6.79（ｓ，２Ｈ）， 7.5−8.0（ｍ，６Ｈ）。 マススペクトル：FAB 1375.4（Ｍ−Ｈ）⁺ ：イオンスプレー137 7.2 MH⁺ C₆₆H₇₂N₈O₂₅・2HCl・3.OH₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，52.70 ；Ｈ， 5.36；Ｎ，7.45。実測値Ｃ，52.57；Ｈ，5.25；Ｎ，7.33。実施例14 ドキソルビシンのマレイミドブチリルグルタミルジヒドラゾン（化合物番号２ ｂ “MBGlu(DOX)₂ ”） マレイミドブチリルグルタミルジヒドラジドジトリフルオロアセテート（７ｂ ）(1.00ｇ，1.76mmole)およびDOX・HCl (2.05ｇ,3.53mmole)を、３hrかけて800 mlのメタノールに溶解した。その反応液を、ロータリーエバポレーターで蒸発さ せて150mlまで濃縮し、次に1.5日間撹拌した。反応液をさらに20mlまで濃縮し、 次にLH−20カラム（２”×12”）を用いてメタノールで溶出させた。混合した画 分については、同じシステムでクロマトグラフィーを繰り返した。精製生成物を ロータリーエバポレーターで蒸発させて赤色被膜を得、それを高減圧下で乾燥し て２ｂ（1.32mg，51％）を得た。 その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール）：（選択されたピーク）δ1.33（２ｄ，６Ｈ） ，4.06（２ｓ，６Ｈ），6.80（ｓ，２Ｈ）， 7.0−8.0 （ｍ，６Ｈ）。 マススペクトル： FAB 1392 MH⁺ ；1413.4（Ｍ＋Na）⁺ ，1429（Ｍ＋Ｋ）⁺ 。 イオンスプレー1392.5（Ｍ＋Ｈ）⁺ ，1414.4（Ｍ＋Na）⁺ 。 C₆₇H₇₄N₈O₂₅・２HCl ・4.OH₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，52.38 ；Ｈ ，5.51；Ｎ，7.29。実測値Ｃ，52.38；Ｈ，5.58；Ｎ，7.50。実施例15 ドキソルビシンのマレイミドブチリル−（Ｄ）−グルタミルジヒドラゾン（化 合物番号Ｄ−２ｂ“MB−Ｄ−Glu(DOX)₂ ”） マレイミドブチリル−（Ｄ）−グルタミルジヒドラジドジトリフルオロアセテ ート（Ｄ−７ｂ）(570mg，1.00mmole)およびDOX・HCl (1.34ｇ，2.30mmole)を、 ３hrかけて600mlのメタノールに溶解した。その反応液を、ロータリーエバポレ ーターで蒸発させて100mlまで濃縮し、次に2.5日間撹拌した。反応液をさらに50 mlまで濃縮し、次にLH−20カラム（２”×10”）を用いてメタノールで溶出させ た。混合した画分の場合、同じシステムでクロマトグラフィーを繰り返した。精 製生成物をロータリーエバポレーターで蒸発させて赤色の被膜を得、それを高減 圧下で乾燥してＤ−２ｂ(420mg，30％)を得た。その物性は下記のとおりであっ た。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：（選択されたピーク）δ1.30（２ｄ，６Ｈ） ，4.07（２ｓ，６Ｈ），6.80（ｓ，２Ｈ）， 7.5−8.0 （ｍ，６Ｈ）。 マススペクトル： FAB 1392.0 MH⁺ ；1414.9（Ｍ＋Na）⁺ ，1429.7（Ｍ＋Ｋ ）⁺ 。 C₆₇H₇₄N₈O₂₅ ・２HCl ・3.5H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，52.69；Ｈ ，5.48；Ｎ，7.34；Cl，4.64。実測値Ｃ，52.74；Ｈ，5.57；Ｎ，7.47；Cl，5.2 8。実施例16 ドキソルビシンのマレイミドカプロイルグルタミルジヒドラゾン（化合物番号２ｃ “MCGlu(DOX)₂ ”） マレイミドカプロイルグルタミルジヒドラジドジトリフルオロ酢酸（７ｃ）(2 98mg，0.50mmole)およびDOX・HCl(580mg，1.00mmole)を、３hrかけて 350mlのメ タノールに溶解した。その反応液を、ロータリーエバポレーターで蒸発させて50 mlまで濃縮し、次に３日 間撹拌した。反応液をさらに５mlまで濃縮し、次にLH−20カラム（２”×10”） を用いてメタノールで溶出させた。精製した生成物をロータリーエバポレーター で蒸発させて赤色被膜を得、それを高減圧下で乾燥して２ｃ(510mg，68％)を得 た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール）：（選択されたピーク）δ1.34（２ｄ，６Ｈ） ，4.08（２ｓ，６Ｈ），6.76（ｓ，２Ｈ）， 7.5−8.0 （ｍ，６Ｈ）。 マススペクトル： FAB 1420 MH⁺ ；1442.3（Ｍ＋Na）⁺ 。イオンスプレー141 9.6（Ｍ＋Ｈ）⁺ 。 HRMS：計算値 1419.5156；実測値 1419.5191。 C₆₉H₇₈N₈O₂₅ ・２HCl ・４H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，52.98；Ｈ， 5.67；Ｎ，7.16。実測値Ｃ，52.96；Ｈ，5.39；Ｎ，7.45。実施例17 ｚ−β−アラニル(Boc)ヒドラジド（化合物番号８） ｚ−β−アラニン(8.39ｇ，40mmole)、ｔ−ブチルカルバゼート(5.29ｇ，40mm ole)およびEDCI(8.00ｇ，42mmole)を、200mlのCH₂Cl₂中、室温で1.5hr撹拌した 。得られた反応液を、200mlの0.1Ｍ酢酸で３回、 200mlの重炭酸ナトリウム飽和 水溶液で２回、および 200mlの水で１回抽出した。得られた有機層を硫酸ナトリ ウムで乾燥し、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、次に高減圧下で乾燥して８ を泡状物(12.42ｇ，92％)として得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₆ −DMSO)：δ1.38（ｓ，９Ｈ），2.25（ｔ，２Ｈ），3.19（ｑ ，２Ｈ）， 4.99（ｓ，２Ｈ）， 7.3（ｍ，６Ｈ），8.21（ｓ，１Ｈ），9.56（ ｓ，１Ｈ）。 TLC ： R_f 0.58，CH₂Cl₂／MeOH（９：１）。 マススペクトル： FAB 338（Ｍ＋Ｈ）⁺ 。 C₁₆H₂₃N₃O₅としての元素分析結果：理論値Ｃ，56.96 ；Ｈ，6.87；Ｎ，12.45 。実測値Ｃ，57.19；Ｈ，7.05；Ｎ，12.57。実施例18 β−アラニル(Boc)ヒドラジド（化合物番号９） ８(15.25ｇ，45.2mmole)を、 200mlメタノール中、10％ Pd−ｃ（３ｇ）を用 い、50psiの圧力下、４hr水素化した。得られた反応液をセライトで濾過し、ロ ータリーエバポレーターで蒸発させ、次いで高減圧下で乾燥させて９を吸湿性の 泡状物(9.2ｇ， 100％)として得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.40（ｓ，９Ｈ），2.32（ｔ，２Ｈ），2.8 8（ｔ，２Ｈ）。 マススペクトル： FAB 204.0（Ｍ＋Ｈ）⁺ 。 C₈H₁₇N₃O₃ ・0.5H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，45.27；Ｈ，8.55；Ｎ ，19.80。実測値Ｃ，45.51；Ｈ，8.17；Ｎ，19.49。実施例19 Ｚ−グルタミルジ〔β−アラニル(Boc)ヒドラジド〕（化合物番号10） Ｚ−グルタミン酸(3.86ｇ，13.7mmole)およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド( 3.17ｇ，27.5mmole)を、乾燥Ｎ₂ の雰囲気下、０℃のDMF 80mlに溶解した。塩化 メチレン(55ml，27.5mmole)にジシクロヘキシルカルボジイミドを溶解して得た その 0.5Ｍ溶液を添加し、得られた反応液を４℃で24hr貯蔵した。ジシクロヘキ シル尿素の沈澱を濾過し、濾液を９(6.00ｇ，29.5mmole)に添加した。室温で15h r撹拌した後、その反応液をロータリーエバポレーターで蒸発し て油状物を得、その油状物を 150mlの酢酸エチルに再び溶解した。得られた有機 層を、 100mlの10％クエン酸溶液で３回、 100mlの重炭酸ナトリウム飽和水溶液 で３回、次いで 100mlのブラインで３回抽出した。その有機層を硫酸ナトリウム で乾燥し、ロータリーエバポレーターで蒸発させて泡状物を得た。シリカゲル（ ２インチ×11インチ）のフラッシュクロマトグラフィーを、CH₂Cl₂／メタノール 25：１（１Ｌ）続いてCH₂Cl₂／メタノール９：１（３Ｌ）を用いて実施した。生 成物（10）を含有する純粋な画分をプールし、次にロータリーエバポレーターで 蒸発させて濃縮して泡状物を得、それを高減圧下で乾燥した後、10（6.7Oｇ，75 ％）を得た。その物性は次のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR（CDCl₃）：δ1.42（ｓ，18Ｈ），2.03および2.32（２ｍ，８Ｈ）， 3.5（ｍ，４Ｈ），4.35（ｔ，１Ｈ），5.05（dd，２Ｈ），6.22（ｄ，１Ｈ）， 6.49（ｄ，２Ｈ），7.30（ｓ，５Ｈ），7.42（ｍ， １Ｈ），7.58（ｍ， １Ｈ） 。 TLC ： R_f 0.40，CH₂Cl₂／MeOH ９：１。 マススペクトル： DCI 652（Ｍ＋Ｈ）⁺ ， 674（Ｍ＋Na）⁺ ， 690（Ｍ＋Ｋ）⁺ 。 C₂₉H₄₅N₇O₁₀としての元素分析結果：理論値Ｃ，53.45 ；Ｈ，6.96；Ｎ，15.0 4。実測値Ｃ，53.10；Ｈ，6.90；Ｎ，14.91。実施例20 グルタミルジ〔β−アラニル(Boc)ヒドラジド〕（化合物番号11） Ｚ−グルタミルジ〔β−アラニル(Boc)ヒドラジド〕（10）(3.52ｇ，5.40mmol e)に、75mlのMeOH中10％のPd−ｃ（１ｇ）を加え、50psi の圧力下、２hr水素化 した。その反応液をセライトで濾過し、ロータリーエバポレーターで蒸発させた 。生成した泡状物を高減 圧下で乾燥して11（2.77ｇ，99％）を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール）：δ1.46（ｓ，18Ｈ），1.91（ｍ，２Ｈ），2. 25（ｔ，２Ｈ），2.42（ｑ，４Ｈ），3.35（ｔ，１Ｈ），3.44（ｍ，４Ｈ）。 マススペクトル： FAB 518（Ｍ＋Ｈ）⁺ ， 540（Ｍ＋Na）⁺ ， 556（Ｍ＋Ｋ ）⁺ 。 C₂₁H₃₉N₇O₈・1.5H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，46.31 ；Ｈ，7.77； Ｎ，18.00。実測値Ｃ，46.34；Ｈ，7.42；Ｎ，17.90。実施例21 マレイミドプロピオニルグルタミルジ〔β−アラニル(Boc)ヒドラジド〕（化 合物番号12a） マレイミドプロピオン酸（0.399mg，2.36mmole）およびＮ−ヒドロキシスクシ ンイミド（272mg，2.36mmole）を、０℃の30ml CH₂Cl₂／3ml DMFに溶解した。C H₂Cl₂（4.7ml，2.36mmole）にDCC を溶解して得たその 0.5Ｍ溶液を添加し、得 られた反応液を室温で３hr撹拌した。生成したDCU の沈澱を濾過した後、濾液を11 (1.10ｇ，2.13mmole)に添加し、その反応液を室温でｌ日間撹拌した。ロータ リーエバポレーターで蒸発させて溶媒を除去した。得られた油状物を、シリカゲ ル（２インチ×10インチ）のフラッシュクロマトグラフィーにより、500mlのCH₂ Cl₂，２ＬのCH₂Cl₂／メタノール95：５および２ＬのCH₂Cl₂／メタノール９：１ を用いて精製した。純粋な画分をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発さ せ、次いで高減圧下で乾燥して、12 ａを泡状物(850mg，60％）として得た。その 物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.46（ｓ，18Ｈ），1.82およ び2.04（２ｍ，２Ｈ），2.23（ｔ，２Ｈ），2.40（ｍ，４Ｈ），2.52（ｔ，２Ｈ ），3.45（ｍ，４Ｈ），3.78（ｔ，２Ｈ），4.20(dd，１Ｈ），6.81（ｓ，２Ｈ ）。 TLC：R_f 0.22，CH₂Cl₂／MeOH ９：１。 マススペクトル： FAB 669（Ｍ＋Ｈ）⁺ ， 691（Ｍ＋Na）⁺ ，707（Ｍ＋Ｋ）⁺ 。 C₂₈H₄₄N₈O₁₁ ・2H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，47.72；Ｈ，6.87；Ｎ ，15.90。実測値Ｃ，47.70；Ｈ，6.57；Ｎ，15.83。実施例22 マレイミドブチリルグルタミルジ〔β−アラニル(Boc)ヒドラジド〕（化合物 番号12 ｂ） マレイミド酪酸（432mg，2.36mmole）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ 272mg，2.36mmole）を、０℃の30ml CH₂Cl₂／3ml DMFに溶解した。CH₂Cl₂（4.7 ml，2.36mmole）にDCC を溶解して得たその 0.5Ｍ溶液を添加し、得られた反応 液を室温で３hr撹拌した。生成したDCU の沈澱を濾過した後、濾液を11（1.10ｇ ，2.13mmole）に添加し、その反応液を室温で１日間撹拌した。ロータリーエバ ポレーターで蒸発させて溶媒を除去した。得られた油状物を、シリカゲル（２イ ンチ×10インチ）のフラッシュクロマトグラフィーにより、500mlのCH₂Cl₂，２ ＬのCH₂Cl₂／メタノール95：５、および２ＬのCH₂Cl₂／メタノール９：１を用い て精製した。純粋な画分をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、次 に高減圧下で乾燥して12 ｂを泡状物(800mg，55％)として得た。その物性は下記 のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.46（ｓ，18Ｈ），1.87（ｍ，３Ｈ），2.0 8（ｍ，１Ｈ），2.24（ｍ，４Ｈ），2.41（ｍ，４Ｈ ），3.45（ｍ，６Ｈ），4.23（dd，１Ｈ），6.82（ｓ，２Ｈ）。 TLC ： R_f 0.20，CH₂Cl₂／MeOH ９：１。 マススペクトル： FAB 683（Ｍ＋Ｈ）⁺ ， 705（Ｍ＋Na）⁺ ， 721（Ｍ＋Ｋ）⁺ 。 C₂₉H₄₆N₈O₁₁ ・1.5H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，49.08；Ｈ，6.96； Ｎ，15.79。実測値Ｃ，48.85；Ｈ，6.65；Ｎ，15.73。実施例23 マレイミドカプロイルグルタミルジ〔β−アラニル(Boc)ヒドラジド〕（化合 物番号12 ｃ） マレイミドカプロン酸（453mg，2.14mmole）およびＮ−メチルモルホリン（23 9mg，2.36mmole）を、アルゴン雰囲気下、−５℃の乾燥THF 25mlに溶解した。ク ロロギ酸イソブチル（263mg，1.93mmole）を添加した。５分後、11(1.Og，1.93m mole)をTHF 溶液として添加し、得られた反応液を、３hr撹拌し、室温まで昇温 させた。酢酸エチル(150ml)を添加し、その溶液を、75mlの10％クエン酸溶液で ３回、75mlの重炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回、および75mlの水で３回抽出し た。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、次いでシリカゲルのプラグを通 過させCH₂Cl₂／メタノール９：１で溶出させた。得られた精製生成物をロータリ ーエバポレーターで蒸発させ、次に高減圧下で乾燥して12 ｃ(800mg，58％)を得 た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.30（ｍ，２Ｈ），1.46（ｓ，18Ｈ），1.6 0（ｍ，４Ｈ），1.88および2.06(２ｍ，２Ｈ），2.22（ｔ，４Ｈ），2.41（ｔ， ４Ｈ），3.44（ｍ，６Ｈ），4.24（dd，１Ｈ），6.80（ｓ，２Ｈ）。 TLC ： R_f 0.24，CH₂Cl₂／MeOH ９：１。 マススペクトル： FAB 711.4（Ｍ＋Ｈ）⁺ ， 733.2（Ｍ＋Na）⁺ ， 749.3（Ｍ ＋Ｋ）⁺ 。 C₃₁H₅₀N₈O₁₁ ・1.0H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，51.09；Ｈ，7.19； Ｎ，15.38。実測値Ｃ，51.43；Ｈ，7.00；Ｎ，15.08。実施例24 マレイミドプロピオニルグルタミルジ〔β−アラニルヒドラジド〕（化合物番 号13 ａ） マレイミドプロピオニルグルタミルジ〔β−アラニル(Boc)ヒドラジド〕（12 ａ ）(850mg，1.27mmole)を、15ml CH₂Cl₂／トリフルオロ酢酸（１：１）中で、 Ｎ₂ 雰囲気下、1.5hr撹拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を 除去した。エーテルを添加して３回、共蒸発させ、生成した固体をエーテルで研 和した。固体を濾過し、高減圧下で乾燥して13 ａ（890mg，100％）を得た。その 物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.83および2.02（２ｍ，２Ｈ），2.23（ｔ ，２Ｈ），2.52（ｑ，６Ｈ），3.47（ｍ，４Ｈ），3.78（ｍ，２Ｈ），4.13（dd ，１Ｈ），6.82（ｓ，２Ｈ）。 マススペクトル： FAB 469.0（Ｍ＋Ｈ）⁺ ， 491.1（Ｍ＋Na）⁺ ， 507.1（Ｍ ＋Ｋ）⁺ 。 C₁₈H₂₈N₈O₇・ 3.75TFA・0.25Et₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，34.80； Ｈ，3.77；Ｎ，12.25。実測値Ｃ，34.63 ；Ｈ，4.04；Ｎ，12.20。実施例25 マレイミドブチリルグルタミルジ〔β−アラニルヒドラジド〕（化合物番号13 ｂ ） マレイミドブチリルグルタミルジ〔β−アラニル(Boc)ヒドラジ ド〕（12 ｂ）(80Omg，1.17mmole)を、15ml CH₂Cl₂／トリフルオロ酢酸（１：１ ）中で、Ｎ₂ 雰囲気下、1.5hr撹拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させ て溶媒を除去した。エーテルを添加して３回、共蒸発させ、生成した固体をエー テルで研和した。固体を濾過し、次に高減圧下で乾燥して13 ｂ（840mg，100％） を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.83（ｍ，３Ｈ），2.06（ｍ，１Ｈ），2.2 6（ｔ，４Ｈ），2.51（ｔ，４Ｈ），3.50（ｍ，６Ｈ），4.18（dd，１Ｈ），6.8 2（ｓ，２Ｈ）。 マススペクトル： FAB 483.2（Ｍ＋Ｈ）⁺ ， 505.1（Ｍ＋Na）⁺ ， 521.1（Ｍ ＋Ｋ）⁺ 。 C₁₉H₃₀N₈O₇・3.5TFA・0.25Et₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，36.03；Ｈ ，4.03；Ｎ，12.45。実測値Ｃ，36.00；Ｈ，4.29；Ｎ，12.26。実施例26 マレイミドカプロイルグルタミルジ〔β−アラニルヒドラジド〕（化合物番号13 ｃ ） マレイミドカプロイルグルタミルジ〔β−アラニル(Boc)−ヒドラジド〕（12 ｃ ）(800mg，1.13mmole)を、15ml CH₂Cl₂／トリフルオロ酢酸（１：１）中で、 Ｎ₂ 雰囲気下、1.5hr撹拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を 除去した。エーテルを添加して３回、共蒸発させ、生成した固体をエーテルで研 和した。固体を濾過し、次に高減圧下で乾燥して13 ｃ（870mg，100％）を得た。 その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.31（ｐ，２Ｈ），1.61（ｓ，４Ｈ），1.8 5および2.03（２ｍ，２Ｈ），2.24（ｔ，４Ｈ），2.50（ｔ，４Ｈ），3.47（ｍ ，６Ｈ），4.19（dd，１Ｈ），6.80（ｓ ，２Ｈ）。 マススペクトル：イオンスプレー 511.1（Ｍ＋Ｈ）⁺ ， 533.0（Ｍ＋Na）⁺ 。 C₂₁H₃N₈O₇・ 2.75TFA・0.25Et₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，39.20；Ｈ ，4.70；Ｎ，13.30。実測値Ｃ，39.32；Ｈ，4.58；Ｎ，13.06。実施例27 ドキソルビシンのマレイミドプロピオニルグルタミルジ〔β−アラニル−ヒド ラゾン〕（化合物番号３ａ“MP−Glu−(β−Ala−DOX)₂ ”） マレイミドプロピオニルグルタミルジ〔β−アラニル−ヒドラジド〕ジトリフ ルオロアセテート（13 ａ）(1.Og，1.44mmole)およびDOX・HCl （1.68g，2.88mmo le)を、３hrかけて600mlのメタノールに溶解した。得られた反応液を、ロータリ ーエバポレーターで蒸発させて100mlまで濃縮し、次に１日間撹拌した。さらに1 0mlまで濃縮した後、LH−20カラム（２”×12”）によりメタノール／DMF(１： １)を用いて溶出させた。精製された生成物をロータリーエバポレーターで蒸発 させて濃縮し、次にアセトニトリルを添加して沈澱させた。赤色の固体を遠心分 離によって単離し、次に高減圧下で乾燥して３ａ(450mg，20％)を得た。その物 性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.29（２bd， ６Ｈ），4.04（ｓ，６Ｈ）， 6.80（ｓ，２Ｈ）， 7.5−8.0 （ｍ， ６Ｈ）。 マススペクトル：イオンスプレー1519.6（Ｍ＋Ｈ）⁺ ，1541.2（Ｍ＋Na）⁺ 。 C₇₂H₈₂N₁₀O₂₇・2HCl・7H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，50.32；Ｈ，5.7 5；Ｎ，8.15。実測値Ｃ，50.20；Ｈ，5.49；Ｎ，8. 44。実施例28 ドキソルビシンのマレイミドブチリルグルタミルジ〔β−アラニルヒドラゾン 〕（化合物番号３ｂ”MB−Glu−(β−Ala−DOX)₂”） マレイミドブチリルグルタミルジ〔β−アラニルヒドラジド〕ジトリフルオロ アセテート（13 ｂ）（280mg，0.395mmole）およびDOX・HCl（458mg，0.790mmole ）を、３hrかけて250mlのメタノールに溶解した。その反応液をロータリーエバ ポレーターで蒸発させて50mlまで濃縮し、次に２日間撹拌した。さらに５mlまで 濃縮した後、LH−20カラム（１”×15”）を用いメタノール／DMF（１：１）に よって溶出させた。精製された生成物を、ロータリーエバポレーターで蒸発させ て濃縮し、次にアセトニトリルを添加して沈澱させた。赤色の固体を遠心分離に よって単離し、次に高減圧下で乾燥して３ｂ（325mg，51％）を得た。その物性 は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.30（ｍ，６Ｈ），4.04（ｓ，６Ｈ），6.7 8（ｓ，２Ｈ）， 7.4−8.0 （ｍ，６Ｈ）。 マススペクトル：FAB 1533.7（Ｍ＋Ｈ）⁺ ，1555.5（Ｍ＋Na）⁺ ，1572.4（Ｍ ＋Ｋ）⁺ 。 C₇₃H₈₄N₁₀O₂₇・2HCl・7H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，50.61 ；Ｈ，5. 82；Ｎ，8.08。実測値Ｃ，50.83；Ｈ，5.60；Ｎ，7.41。実施例29 ドキソルビシンのマレイミドカプロイルグルタミルジ〔β−アラニルヒドラゾ ン〕（化合物番号３ｃ“MC−Glu−（β−Ala−DOX）₂”） マレイミドカプロイルグルタミルジ〔β−アラニルヒドラジド〕 ジトリフルオロアセテート（13 ｃ）(148mg，0.20mmole）およびDOX・HCl(232mg ，0.40mmole)を、３hrかけて150mlのメタノールに溶解した。得られた反応液を ロータリーエバポレーターで蒸発させて10mlまで濃縮し、次に２日間撹拌した。 さらに２mlまで濃縮した後、LH−20カラム（１”×10”）を用いメタノール／DM F（１：１）で溶出させた。精製された生成物をロータリーエバポレーターで蒸 発させて濃縮し次にアセトニトリルを添加することによって沈澱させた。赤色の 固体を遠心分離によって単離し次に高減圧下で乾燥して３ｃ（162mg，50％）を 得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₆ −DMSO)：δ1.20（ｍ，６Ｈ），4.0（ppm）６Ｈ，6.95（ｓ， ２Ｈ）， 7.5−8.1（ｍ，６Ｈ）。 マススペクトル：FAB 1561（Ｍ＋Ｈ）⁺ ，1583.4（Ｍ＋Na）⁺ ，1599.9（Ｍ＋ Ｋ）⁺ 。 C₇₅H₈₈N₁₀O₇ ・2HCl・7H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，51.17；Ｈ，5.9 5；Ｎ，7.96。実測値Ｃ，51.04；Ｈ，5.41；Ｎ，10.23。実施例30 Ｚ−グルタミルジ〔グルタミルジ(Boc)ヒドラジド〕（化合物番号14） Ｚ−グルタミン酸（844mg，3.0mmole）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド( 691mg，6.0mmole)を、Ｎ₂ 雰囲気下０℃のDMF ６mlに溶解した。塩化メチレン（ 12.0ml，6.0mmole）にジシクロヘキシルカルボジイミドを溶解して得たその 0.5 Ｍ溶液を添加した。得られた反応溶液を４hr撹拌した。ジシクロヘキシル尿素の 沈澱を濾過し、濾液を５（2.253g，6.0mmole）に添加した。室温で60hr撹拌した 後、その反応溶液をロータリーエバポレーターで蒸発させて油状物を得、その油 状物を 200mlの酢酸エチルに再び溶解した。得られた 有機層を、125mlの10％クエン酸溶液で３回、125mlの重炭酸ナトリウム飽和水溶 液で３回、および125mlのブラインで１回抽出した。その有機層を硫酸ナトリウ ムで乾燥し、次にロータリーエバポレーターで蒸発させて泡状物を得た。シリカ ゲル（２”×12”）のフラッシュクロマトグラフィーを、CH₂Cl₂／メタノール／ 酢酸93：５：２を用いて実施した。生成物（14）を含有する純粋の画分をプール し、ロータリーエバポレーターで蒸発させて濃縮して泡状物を得、それを高減圧 下で乾燥して14（2.30g，77％）を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.35（ｓ，36Ｈ）， 1.7−2.4 （ｍ，12Ｈ ），3.90（bt，１Ｈ），4.35（ｍ，２Ｈ），4.98（ｑ〔AB〕，２Ｈ），7.25（ｍ ，５Ｈ）。 TLC ： R_f 0.61，CH₂Cl₂／MeOH ９：１。 マススペクトル：FAB 1018.5（Ｍ＋Na）⁺ ，1034.4（Ｍ＋Ｋ）⁺。 C₄₃H₆₉N₁₁O₁₆・2H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，50.04；Ｈ，7.13；Ｎ ，14.93。実測値Ｃ，50.20；Ｈ，6.85；Ｎ，14.90。実施例31 グルタミルジ〔グルタミルジ(Boc)ヒドラジド〕（化合物番号15） Ｚ−グルタミルジ〔グルタミルジ(Boc)ヒドラジド〕（１４）(1.86ｇ，1.87mm ole)に、10％ Pd−Ｃ（１ｇ）含有の75ml MeOH を加えて50psi の圧力下、３hr 水素化を行った。得られた反応液をセライトで濾過し、次にロータリーエバポレ ーターで蒸発させた。生成した泡状物を高減圧下で乾燥して15（1.59g，99％） を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール）：δ1.46（ｓ，36Ｈ）， 1.6−2.4 （ｍ，12Ｈ ），3.23（ｍ，１Ｈ），4.40（２ｔ，２Ｈ）。 マススペクトル： FAB 862（Ｍ＋Ｈ）⁺ ， 884（Ｍ＋Na）⁺ ， 900（Ｍ＋Ｋ ）⁺ 。 C₃₅H₆₃N₁₁O₁₄・１H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，47.77；Ｈ，7.45；Ｎ ，17.51。実測値Ｃ，47.67；Ｈ，7.28；Ｎ，17.33。実施例32 マレイミドプロピオニルグルタミルジ〔グルタミルジ(Boc)ヒドラジド〕（化 合物番号16 ａ） マレイミドプロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（300mg，1 .13mmole）を６ａの合成と同様にして製造し、次に、室温のDMF 25ml中で、グル タミルジ〔グルタミルジ(Boc)ヒドラジド〕（15）(883mg，1.02mmole)およびト リエチルアミン(143μl,1.02mmole)とともに16hr撹拌した。ロータリーエバポレ ーターで蒸発させて溶媒を除き、残留物を、シリカゲル（１インチ×10インチ） のフラッシュクロマトグラフィーでCH₂Cl₂−酢酸−メタノール93：２：５を用い て精製した。純粋の画分をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、次 に高減圧下で乾燥して16 ａ（400mg，39％）を得た。その物性は下記のとおりで あった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.46（ｓ，36Ｈ）， 1.8−2.4 （ｍ，12Ｈ ），2.50（ｔ，２Ｈ），3.76（ｔ，２Ｈ），4.11（ｍ，１Ｈ），4.39（２ｔ，２ Ｈ），6.81（ｓ，２Ｈ）。 マススペクトル：FAB 1035.6（Ｍ＋Na）⁺ ，1051（Ｍ＋Ｋ）⁺ 。実施例33 マレイミドブチリルグルタミルジ〔グルタミルジ(Boc)ヒドラジド〕（化合物 番号16 ｂ） マレイミド酪酸（227mg，1.24mmole）を、Ｎ−メチルモルホリン(178μｌ，1. 61mmole)とともに、Ｎ₂ 雰囲気下、０℃の乾燥THF 10mlに溶解した。クロロギ酸 イソブチル(144μｌ，1.11mmole)を添加し、５分後に、15mlのDMF にグルタミル ジ〔グルタミルジ(Boc)ヒドラジド〕（15）(960mg，1.11mmole)を溶解して得た 溶液を添加した。その反応液を４℃で16hr貯蔵した。反応溶液をロータリーエバ ポレーターで蒸発させて濃縮し、次に 200mlのEtoAcに溶解した。得られた有機 層を、50mlの10％クエン酸溶液で３回、50mlのNaHCO₃飽和水溶液で３回、および 50mlのH₂Oで３回洗浄した。その有機層を濃縮して泡状物を得、それを、シリカ ゲル（１”×12”）のフラッシュクロマトグラフィーにより、CH₂Cl₂−酢酸−メ タノール93：２：５を用いて精製した。純粋な画分をプールし、ロータリーエバ ポレーターで蒸発させて泡状物を得、それを高減圧下で乾燥して16 ｂ（900mg，7 9％）を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール）：δ1.46（ｓ，36Ｈ）、重複シグナル1.86（ｔ ），2.22（ｔ）、および1.9−2.4 （ｍ）16Ｈ、トータル3.50（ｔ，２Ｈ），4.1 1（ｍ， １Ｈ），4.40（２ｔ，２Ｈ），6.82（ｓ，２Ｈ）。 マススペクトル：FAB 1049.5（Ｍ＋Na）⁺ ，1065.4（Ｍ＋Ｋ）⁺ 。 C₄₃H₇₀N₁₂O₁₇・３H₂O・3HOAcとしての元素分析結果：理論値Ｃ，46.33；Ｈ，7 .06；Ｎ，13.23。実測値Ｃ，46.24；Ｈ，6.52;Ｎ，13.37。実施例34 マレイミドカプロイルグルタミルジ〔グルタミルジ(Boc)ヒドラジド〕（化合 物番号16 ｃ） この化合物は、16 ｂに対して使用した方法にしたがって合成した 。16 ｃ（330mg，54％）を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.28（ｍ，２Ｈ），1.46（ｓ，36Ｈ），1.5 6（ｍ，４Ｈ）、重複シグナル 1.9−2.5 （ｍ）および2.20（ｔ）14Ｈ、トータ ル3.48（ｔ，２Ｈ），4.10（ｍ，１Ｈ），4.40（ｍ，２Ｈ），6.80（ｓ，２Ｈ） 。 マススペクトル：FAB 1078.8（Ｍ＋Na）⁺ ，1093.5（Ｍ＋Ｋ）⁺ 。 C₄₅H₇₄N₁₂O₁₇・３H₂O・３HOAcとしての元素分析結果：理論値Ｃ，47.51；Ｈ， 7.19；Ｎ，13.04。実測値Ｃ，47.44；Ｈ，6.48;Ｎ，13.14。実施例35 マレイミドプロピオニルグルタミルジ〔グルタミルジ−ヒドラジド〕（化合物 番号17 ａ） マレイミドプロピオニルグルタミルジ〔グルタミルジ(Boc)ヒドラジド〕（16 ａ ）（400mg，0.395mmole）を15ml CH₂Cl₂／トリフルオロ酢酸（１：１）中で 、Ｎ₂ 雰囲気下、1.5hr撹拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒 を除去した。エーテルを添加して３回、共蒸発させ、生成した固体をエーテルで 研和した。その固体を濾過し、次に高減圧下で乾燥して17 ａ（250mg，59％）を 得た。その粗製品の ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)は、BOC 基が完全に除去され ていることを証明した。その粗製品をそれ以上精製することなく18 ａを合成する のに使用した。実施例36 マレイミドブチリルグルタミルジ〔グルタミル−ジヒドラジド〕（化合物番号17 ｂ ） マレイミドブチリルグルタミルジ〔グルタミルジ(Boc)ヒドラジド〕（16 ｂ） （900mg，0.877mmole）を15ml CH₂Cl₂／トリフルオロ 酢酸（１：１）中で、Ｎ₂ 雰囲気下、1.5hr撹拌した。ロータリーエバポレータ ーで蒸発させて溶媒を除去した。エーテルを加えて３回、共蒸発させ、生成した 固体をエーテルで研和した。固体を濾過し、次に高減圧下で乾燥して17 ｂ（817m g，86％）を得た。その物性は下記のとおりであった。実施例37 マレイミドカプロイルグルタミルジ〔グルタミル−ジヒドラジド〕（化合物番 号17 ｃ） マレイミドカプロイルグルタミルジ〔グルタミルジ(Boc)ヒドラジド〕（16 ｃ ）（330mg，0.313mmole）を、15mlのCH₂Cl₂／トリフルオロ酢酸（１：１）中で 、Ｎ₂ 雰囲気下、1.5hr撹拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒 を除去した。エーテルを添加して３回、共蒸発させ、生成した固体をエーテルで 研和した。その固体を濾過し、次に高減圧下で乾燥して17 ｃ（350mg，100％）を 得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール）：δ1.30（ｍ，２Ｈ），1.60（２ｔ，４Ｈ）、 重複シグナル1.9−2.5 （ｍ）および2.22（ｔ）トータル14Ｈ，3.47（ｔ，２Ｈ ），4.09（ｔ，１Ｈ），4.43（２ｔ，２Ｈ），6.80（ｓ，２Ｈ）。 C₂₅H₄₂N₁₂O₉・6.2TFAとしての元素分析結果：理論値Ｃ，32.99；Ｈ，3.57；Ｎ ，12.34。実測値Ｃ，32.76；Ｈ，3.73；Ｎ，12.7２。実施例38 ドキソルビシンのマレイミドプロピオニルグルタミルジ〔グルタミル−ジヒド ラゾン〕（化合物番号18 ａ） マレイミドプロピオニルグルタミルジ〔グルタミル−ジヒドラジド〕（17 ａ） （250mg，0.230mmole）およびDOX・HCl(588mg，1.01 mmole)を、100mlのメタノールに溶解し、次にロータリーエバポレーターで蒸発 して25mlまで濃縮し、次いで２日間撹拌した。その反応液をさらに15mlまで濃縮 し、次にLH−20カラム（１”×10”）を用いメタノールで溶出させた。精製生成 物をロータリーエバポレーターで蒸発させて赤色被膜を得た、次にそれを高減圧 下で乾燥して18 ｃ（180mg，27％）を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：（選択されたピーク）δ1.33（ｍ，12Ｈ），4 .04および4.06（２ｄ，12Ｈ），6.72（ｓ，２Ｈ），7.4−8.0 （ｍ，12Ｈ）。 マススペクトル：FAB イオンスプレー 2713.5（Ｍ＋Ｈ）⁺ 。 C₁₃₀H₁₄₄N₁₆O₄₉・４HCl ・４H₂O・４TFAとしての元素分析結果：理論値Ｃ，48 .91；Ｈ，4.76；Ｎ，6.61。測値Ｃ，48.49；Ｈ，5.28；Ｎ，7.06。実施例39 ドキソルビシンのマレイミドブチリルグルタミルジ〔グルタミル−ジヒドラゾ ン〕（化合物番号18 ｂ） マレイミドブチリルグルタミルジ〔グルタミル−ジヒドラジド〕（l7 ｂ）（30 0mg，0.273mmole）およびDOX・HCl(697mg，1.20mmole)を、100mlのメタノールに 溶解し、次にロータリーエバポレーターで蒸発させて25mlまで濃縮し、２日間撹 拌した。その反応液をさらに15mlまで濃縮し、次にLH−20カラム（１”×10”） によりメタノールを用いて溶出させた。精製生成物をロータリーエバポレーター で蒸発させて赤色の被膜を得、それを高減圧下で乾燥して18 ｂ（500mg，64％） を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：（選択されたピーク）δ1.36（ｍ，12Ｈ），4 .04および4.10（２ｄ，12Ｈ），6.69（ｓ，２Ｈ），7.5−8.0 （ｍ，12Ｈ）。 マススペクトル：FAB イオンスプレー 2728（Ｍ＋Ｈ）⁺ 。 C₁₃₁H₁₄₆N₁₆O₄₉・４HCl ・２TFA・４H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，51 .08；Ｈ，5.08；Ｎ，7.06。実測値Ｃ，51.02；Ｈ，5.05；Ｎ，7.16。実施例40 ドキソルビシンのマレイミドカプロイルグルタミルジ〔グルタミル−ジヒドラ ゾン〕（化合物番号18 ｃ“MC−Glu(DOX)₄ ”） マレイミドカプロイルグルタミルジ〔グルタミル−ジヒドラジド〕（17 ｃ）（ 233mg，0.210mmole）およびDOX・HCl（489mg，0.843mmole）を、100mlのメタノ ールに溶解し、次にロータリーエバポレーターで蒸発させて25mlまで濃縮し、２ 日間撹拌した。その反応液をさらに1mlまで濃縮し、次にLH・20カラム（１”×1 0”）によりメタノールを用いて溶出させた。精製生成物をロータリーエバポレ ーターで蒸発させて赤色の被膜を得、それを高減圧下で乾燥して18 ｃ（430mg，7 1％）を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：（選択されたピーク）δ1.36（ｍ，12Ｈ），4 .04および4.10（２ｄ，12Ｈ），6.69（ｓ，２Ｈ），7.5−8.0（ｍ，12Ｈ）。 マススペクトル：FAB イオンスプレー1379（Ｍ＋Ｈ）²⁺。 C₁₃₃H₁₅₀N₁₆O₄₉・４HCl ・４TFA・４H₂0としての元素分析結果：理論値Ｃ，49 .36；Ｈ，4.88；Ｎ，6.53。実測値Ｃ，49.34；Ｈ，4.79；Ｎ，6.66。実施例41 （化合物番号19） Ｚ−NHCH₂CH₂−Br(3.16g，12.3mmole)および(BOC−NHCH₂CH₂)₂−NH(3.72g，12 .3mmole)を、55℃の60ml ACN／40mlリン酸緩衝液（0.1Ｍ，pH９）中で２日間撹 拌した。冷却した後、反応液を200ml のH₂Oで希釈し、次に200mlのEt₂Oで２回抽出した。有機層を合し、Na₂SO₄で乾燥 し、次に減圧下で蒸発させた。油状残留物を、Mercｋシリカゲル60（２”×11” ）を用い、（１）CH₂Cl₂（２Ｌ）、（２）CH₂Cl₂／MeOH 97.5：2.5（1.5Ｌ）お よび（３）CH₂Cl₂／MeOH95：５（２Ｌ）で溶出するクロマトグラフィーに付した 。上記（２）〜（３）で溶出する所望の生成物19をプールし、減圧下で蒸発させ 、次に高減圧下で乾燥して19（1.93g，33％）を得た。その物性は下記のとおり であった。 ¹Ｈ−NMR（CDCl₃）：δ1.37（ｓ，18Ｈ），2.47（ｍ，６Ｈ），3.15（ｍ，６ Ｈ），5.07（ｓ，２Ｈ），7.28（ｍ，５Ｈ）。 ¹³Ｃ−NMR（CDCl₃）：δ28.38，38.55，39.01，53.90，54.27，65.18，66.60 ，79.29，126.94，127.50，127.96，128.14，128.41,128.47，136.66，156.38， 156.78。 マススペクトル： FAB 481.2（MH⁺ ）。 C₂₄H₄₀N₄O₆としての元素分析結果：理論値Ｃ，59.98 ；Ｈ，8.39；Ｎ，11.66 。実測値Ｃ，60.26；Ｈ，8.43；Ｎ，11.60。 FTIR：3336，2976，1694，1524，1366，1252，1170，736，698cm^-1。実施例42 （化合物番号20） 19(1.92g，3.99mmole)を、50％ TFA／CH₂Cl₂（60ml）中で３hr撹拌した。ロー タリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を除き、次にEt₂Oによる共蒸発を繰り返 した。油状の生成物を50mlのEt₂Oで３回研和し、次いで高減圧下で乾燥して20を 泡状物（2.29ｇ， 100％）として得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −MeOH)：δ2.64（ｔ，２Ｈ），2.78（ｔ，４Ｈ），3.01（ｔ ，４Ｈ），3.21（ｔ，２Ｈ），5.08（ｓ，２Ｈ），7. 34（ｍ，５Ｈ）。 ¹³Ｃ−NMR(ｄ₄ −MeOH)：δ38.36，39.53，52.61，54.95，67.69，128.91，12 9.12，129.51，138.2，159.2。 マススペクトル： FAB 281.1（MH⁺ ）。 高分解能マススペクトル：理論値，281.1977；実験値，281.1984（MH⁺ ）。 C₁₄H₂₄N₄O₂・2.6TFAとしての元素分析結果：理論値Ｃ，39.98；Ｈ，4.65；Ｎ ，9.71；Ｆ，25.69。実測値Ｃ，39.85；Ｈ，4.60;Ｎ，9.68；Ｆ，25.38。 FTIR：3036，1680，1532，1260，1204，1136，838，800，722cm^-1。実施例43 化合物番号21 20(6.22g，10.0mmole)とKHCO₃(8.01ｇ，80mmole)を０℃のDMF100ml中に懸濁さ せた液に、これを撹拌しながら、BrCH₂CONHNH-BOC(10.12ｇ，40.0mmole)をいく つもの部分に分けて５分間かけて添加した。その反応液を次に室温で60hr撹拌し た。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を除去して油状残留物を得た。 この残留物を500mlのEt₂O／EtOAc 1：１に溶解し、次いで150mlのNaHCO₃飽和水 溶液で５回、次に水で２回抽出した。得られた有機層をNa₂SO₄で乾燥し次にロー タリーエバポレーターで蒸発させて油状物を得た。さらに、高減圧下で乾燥して21 （9.67g， 100％）を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −Me0H)：δ1.45（ｓ，36Ｈ），2.69（ｍ，10Ｈ），3.23（ｔ ，２Ｈ），3.37（ｓ，８Ｈ），5.06（ｓ，２Ｈ），7.33（ｍ，５Ｈ）。¹³Ｃ−NMR(ｄ₄ −MeOH)：δ28.64，53.28，53.88，54.56，58.5 9，66.92，67.54，81.94，129.07，129.51，138.35，157.63，158.89，173.20。 マススペクトル：イオンスプレー 969.6（MH⁺ ）。 C₄₂H₇₂N₁₂O₁₄・0.5H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，51.57；Ｈ，7.52； Ｎ，17.18。実測値Ｃ，51.73；Ｈ，7.52；Ｎ，16.84。 FTIR：3296，2980，1728，1696，1518，1394，1368，1248，1162，1048，1016 ，874，756，698cm^-1。実施例44 化合物番号22 21（2.11g，2.18mmole）を、50ml MeOH中、35psi の圧力下、２hr水素化した 。得られた反応液をセライトで濾過し、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、 次に高減圧下で乾燥して22を泡状物（1.65ｇ，91％）として得た。その物性は下 記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −MeOH)：δ1.46（ｓ，36Ｈ），2.71（ｍ，12Ｈ），3.34（ｓ ，８Ｈ）。 ¹³Ｃ−NMR(ｄ₄ −MeOH)：δ28.64，34.77，53.11，53.91，58.12，81.90，157 .64，172.88。 マススペクトル：イオンスプレー 835.5（MH⁺ ）。 C₃₄H₆₆N₁₂O₁₂・1.0H₂O・1.0MeOH としての元素分析結果：理論値Ｃ，47.50 ；Ｈ，8.20；Ｎ，18.99。実測値Ｃ，47.41；Ｈ，7.88；Ｎ，18.74。 FTIR：3292，2980，1720，1690，1484，1368，1248，1162，1048，1016，880 ，773，574cm^-1。実施例45 （化合物番号23） 22(1.03ｇ，1.23mmole)と無水マレイン酸（121mg，1.23mmole） のを25mlのCH₂Cl₂に溶解した溶液を2.5hr撹拌した。ロータリーエバポレーター で蒸発させて溶媒を除いて23（1.16g， 100％）を得た。その物性は下記のとお りであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −MeOH)：δ1.45（ｓ，36Ｈ），3.13（ｍ，４Ｈ），3.45（ｍ およびｓ，16Ｈ），3.68（ｍ，２Ｈ），6.17（dd，２Ｈ）。 マススペクトル：イオンスプレー 933.6（MH⁺ ），955.5 （Ｍ＋Na⁺ ）。実施例46 化合物番号24 23(603mg，0.646mmole)およびEDCI(149mg，0.775mmole)を、25mlの乾燥CH₂Cl₂ 中で、Ｎ₂ 雰囲気下、室温にて2.5hr撹拌した。得られた反応液を、25mlのNaHCO₃ 飽和水溶液で３回、次に25mlの水で一回抽出した。得られた有機層をNa₂SO₄で 乾燥し、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、次いで高減圧下で乾燥してイソ マレイミドの中間体(494mg，84％）を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR（CDCl₃）：δ1.45（ｓ，36Ｈ），2.8（ｍ，10Ｈ），3.31（ｓ，８ Ｈ），3.7 （ｍ，２Ｈ），6.57および7.40（dd，２Ｈ）。 この生成物と、８mlのDMF 中のHOBt（35mg，0.259mmole）とともに、室温で７ hr撹拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を除去した。油状の残 留物を、60mlのEt₂O／EtOAc１：１に溶解し、次いで25mlのNaHCO₃飽和水溶液で ５回次に25mlの水で１回抽出した。有機層をNa₂SO₄で乾燥し、ロータリーエバポ レーターで蒸発させ、次に高減圧下で乾燥させてマレイミドの生成物24(463mg,9 4％)を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR（CDCl₃）：δ1.45（ｓ，36Ｈ），2.7 （ｍ，10Ｈ），3.32（ｓ，８ Ｈ），3.57（ｍ，２Ｈ），6.68（ｓ，２Ｈ）。 ¹³Ｃ−NMR（CDCl₃）：δ28.16，81.73，134.25，155.5，170.79。 マススペクトル：エレクトロスプレー 915.5（MH⁺ ），937.5 （Ｍ＋Na⁺ ）。 FTIR：3300，2982，1738，1708，1680(sh)，1498，1394，1368,1248，1162，1 048，1016，72，696cm^-1。実施例47 化合物番号25 24(214mg，0.234mmole)を、25mlの乾燥CH₂Cl₂中のｐ−トルエンスルホン酸と ともに、Ｎ₂ 雰囲気下、３hr撹拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させて 溶媒を除去した。残留物を、125mlのEt₂Oで４回、研和し、次に高減圧下で乾燥 して25(378mg，94％)を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ ，−MeOH)：δ2.36（ｓ，21Ｈ），3.22（ｔ，２Ｈ），3.52（ ｍ，８Ｈ），3.71（ｓ，８Ｈ），3.94（ｔ，２Ｈ），6.85（ｓ，２Ｈ），7.23（ ｄ，14Ｈ），7.70（ｄ，14Ｈ）。 マススペクトル： FAB 515.1（MH⁺ ）。実施例48 化合物番号26 25(100mg，58μmole)およびドキソルビシンHCl(177mg，305μmole)を、25mlの 乾燥メタノール中で24hr撹拌した。得られた反応液を、ロータリーエバポレータ ーで蒸発させて４mlまで濃縮し、次にメタノールを用いてSephadex LH-20（ｌ” ×18”）で精製した。純粋生成物を含有する画分をプールし、ロータリーエバポ レーターで蒸発させ、次に高減圧下で乾燥して26(113mg，59％)を得た。その 物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ₄ −メタノール)：δ1.2 （ｍ，12Ｈ），3.9 （ｓ，12Ｈ），6.8 （ｓ，２Ｈ），7.2 （ｄ）と7.7 （ｄ）がスーパーインポーズした7.2〜8.0 （ ｍ）トータル24Ｈ。実施例49 化合物番号27 モノ−Ｚ−エチレンジアミンHCl(3.46g，15mmole)、BrCH₂CONHNH-BOC(7.59g， 30mmole)およびKHCO₃(5.26g，52.5mmole)を、60mlDMF中、Ｎ₂ 雰囲気下、室温で 24hr撹拌した。得られた反応液を、25mlEt₂Oと150mlのNaHCO₃飽和水溶液に分配 した。得られたEt₂O層を、100mlのNaHCO₃飽和水溶液で洗浄した。全水性層を100 mlのEt₂Oで抽出した。Et₂O層を合して、ブラインで洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、次 にロータリーエバポレーターで蒸発させて6.5ｇの粗生成物を得た。この物質を 、２”×20”のシリカゲル60（Merck 社）カラムを用いて（１）CH₂Cl₂／MeOH95 ：５（２Ｌ）、（２）CH₂Cl₂／MeOH 92.5：7.5 （１Ｌ）および（３）CH₂Cl₂／M eOH 90：10（２Ｌ）で溶離するフラッシュクロマトグラフィーに付した。所望の 生成物を含有する画分をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、次に 高減圧下で乾燥して27を泡状物（4.64g，57％）として得た。その物性は下記の とおりであった。 ¹Ｈ−NMR（CDCl₃）：δ1.36（ｓ，18Ｈ），2.70（ｍ，２Ｈ），3.22（ｓ，４ Ｈ），3.28（ｍ，２Ｈ），5.01（ｓ，２Ｈ），7.25（ｍ，５Ｈ）。 ¹³Ｃ−NMR（CDCl₃）：δ28.08，38.75，55.67，57.19，66.77，81.85，128.02 ，128.41，136.47，155.95，158.10，170.79。 マススペクトル：イオンスプレー 539.3（MH⁺ ），561.2 （Ｍ＋Na⁺ ），577. 1 （Ｍ＋Ｋ⁺ ）。 C₂₄H₃₈N₆O₈・0.5H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，52.64；Ｈ，7.18；Ｎ ，15.35。実測値Ｃ，52.53；Ｈ，7.05；Ｎ，15.30。 FTIR：3300，2980，1724，1694，1528，1368，1250，1160，1016，880，754， 698cm^-1。実施例50 化合物番号28 27を、100mlのEtOH中、10％ Pd−Ｃ（２ｇ）を加えて、45psiの圧力下、4.5h r水素化した。セライトで前記触媒を濾過した後、ロータリーエバポレーターで 蒸発させて溶媒を除き、次に高減圧下で乾燥して28を泡状物（3.06g，92％）と して得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR（CDCl₃）：δ1.43および1.44（２ｓ，18Ｈ），2.80（ｔ，２Ｈ）， 3.23（ｄ，４Ｈ），3.39（ｍ，２Ｈ）。（ｄ⁴ −MeOH）：1.24および1.26（２ｓ ，18Ｈ），2.59（ｔ，２Ｈ），3.02（ｄ，４Ｈ），3.15（ｔ，２Ｈ）。 マススペクトル：イオンスプレー 405.3（MH⁺ ）。 C₁₆H₃₂N₆0₆・0.5H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，46.48 ；Ｈ，8.04； Ｎ，20.33。実測値Ｃ，46.57；Ｈ，8.04；Ｎ，20.37。 FTIR：3328，2980，1698，1672，1500，1368，1300，1252，1162，778，692cm^-1 。実施例51 化合物番号29 無水マレイン酸（98mg，1.0mmole）および28（405mg，1.0mmole）を、15mlのC H₂Cl₂中で、室温にて２hr撹拌した。得られた反応液をロータリーエバポレータ ーで蒸発させ、得られた生成物をEt₂Oで研 和した。残留物を高減圧下で乾燥して29(400mg，80％)を得た。その物性は以下 のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR（CDCl₃）：δ1.47および1.48（２ｓ，18Ｈ），2.89（ｔ，２Ｈ）， 3.32（ｄ，４Ｈ），3.46（ｍ，２Ｈ），6.42（dd，２Ｈ）。実施例52 化合物番号30 29(503mg，1.0mmole)およびEDCl(230mg，1.2mmole)を、25ml乾燥CH₂Cl₂中で、 Ｎ₂ 雰囲気下、室温にて2.5hr撹拌する。得られた反応液を、25mlのNaHCO₃飽和 水溶液で３回、次に25mlの水で１回抽出する。得られた有機層をNa₂SO₄で乾燥し 、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、次に高減圧下で乾燥してイソマレイミ ドの中間体を得る。 この生成物を、８mlのDMF 中のHOBt(54mg，0.40mmole)とともに、室温で７hr 撹拌する。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を除去する。生成した油 状残留物を、60mlのEt₂O／Et0Ac１：１に溶解し、次いで25mlのNaHCO₃飽和水溶 液で５回、次に25mlの水で１回抽出する。得られた有機層をNa₂SO₄で乾燥し、ロ ータリー一エバポレーターで蒸発させ、次に高減圧下で乾燥して30(455mg，94％ )を得る。実施例53 化合物番号31 30(485mg，1.0mmole)を、50mlの乾燥CH₂Cl₂中で、ｐ−トルエンスルホン酸(1. 70ｇ，10mmole)とともに、Ｎ₂ 雰囲気下３hr撹拌する。ロータリーエバポレータ ーで蒸発させて溶媒を除く。残留物を125mlのEt₂Oで５回研和し、次に高減圧下 で乾燥して31(800mg，94％)を得る。実施例54 化合物番号32 31（200mg，0.25mmole）とドキソルビシンHCl(377mg，0.65mmole)を、25mlの 乾燥メタノール中で24hr撹拌する。得られた反応液を、ロータリーエバポレータ ーで蒸発させて４mlまで濃縮し、次に、メタノールを用いるSephadex LH-20(1” ×18”）によって、二つの等量の部分で精製する。純粋の生成物を含有する画分 をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、次に高減圧下で乾燥して32 (200mg，50％)を得る。実施例55 化合物番号33 ｔ−ブチルカルバゼート(396mg，３mmole)を、10mlの乾燥CH₂Cl₂中で、Ｎ₂雰 囲気下にて撹拌し、次にトリエチルアミン(0.6g，6mmole)を添加し、続いてトリ ホスゲン(296mg，lmmole)を一度に添加する。上記初期反応が終了したとき、20m lのCH₂Cl₂中の20(934mg，1.5mmole)を、追加のトリエチルアミン(0.45g，4.5mmo le)とともに添加する。その混合物を、室温で1.5hr撹拌し、CH₂Cl₂で希釈し、次 に水(100ml)で分配する。得られる有機層をNa₂SO₄で乾燥し、次にロータリーエ バポレーターで蒸発させる。シリカゲル60のフラッシュクロマトグラフィーで、 純粋な生成物33(684mg，50％)を得る。実施例56 化合物番号34 33（650mg，0.71mmole）を、50ml EtOHで、10％ Pd−Ｃ（1ｇ）を加えて、45 psiの圧力下4.5hr水素化を行う。セライドで上記触媒を濾過した後、ロータリー エバポレーターで蒸発させて溶媒を除き、次に高減圧下で乾燥して34を泡状物（ 550mg，100％）として 得る。実施例57 化合物番号35 無水マレイン酸(63mg，0.64mmole)と34(500mg，0.64mmole)を、15mlのCH₂CH₂ 中で、室温にて２hr撹拌する。その反応液をロータリーエバポレーターで蒸発さ せ、得られた粗生成物をEt₂Oで研和する。残留物を高減圧下で乾燥して35(448mg ，80％)を得る。実施例58 化合物番号36 35(438mg，0.5mmole)およびEDCl（115mg，0.6mmole)を、25mlの乾燥CH₂Cl₂中 で、Ｎ₂雰囲気下室温にて2.5hr撹拌する。その反応液を、25mlのNaHCO₃飽和水溶 液で３回、次に25mlの水で1回抽出する。得られた有機層をNa₂SO₄で乾燥し、ロ ータリーエバポレーターで蒸発させ、次に高減圧下で乾燥してイソマレイミドの 中間体を得る。 その生成物を、８ml DMF中のHOBt(27mg，0.20mmole)とともに、室温で７hr撹 拌する。ロータリーエバポレーターで蒸発して溶媒を除去する。油状残留物を、 60mlのEt₂O／EtOAc1：１に溶解し、次いで25mlのNaHCO₃飽和水溶液で５回、次に 25mlの水で１回抽出する。得られた有機層をNa₂SO₄で乾燥し、ロータリーエバポ レーターで蒸発させ、次に高減圧下で乾燥してマレイミド生成物36(400mg，94％ )を得る。実施例59 化合物番号37 36（400mg，0.47mmole）を、50mlの乾燥CH₂Cl₂中で、ｐ−トルエンスルホン酸 (894mg，4.7mmole)とともに、Ｎ₂雰囲気下３hr撹拌する。ロータリーエバポレー ターで蒸発させて溶媒を除く。残留物 を、125mlのEt₂Oで４回研和し、次に高減圧下で乾燥して37(455mg，94％）を得 る。実施例60 化合物番号38 37(257mg，0.25mmole)とドキソルビシンHCl(377mg，0.65mmole)を、25mlの乾 燥メタノール中で24hr撹拌する。その反応液を、ロータリーエバポレーターで蒸 発させて４mlまで濃縮し、次に、二つの等部分で、メタノールを用いるSephadex LH-20（１”×18”）により精製する。純粋生成物を含有する画分をプールし、 ロータリーエバポレーターで蒸発させ、次いで高減圧下で乾燥して38(222mg,50 ％)を得る。実施例61 化合物番号39 Ｚ−NHCH₂CH₂−Br(3.16g，12.3mmole)および(BOC−NHCH₂CH₂)₂−NH(3.72g，12 .3mmole)を、60ml ACN/40mlリン酸緩衝液(0.1M，pH9)中で55℃にて２日間撹拌し た。冷却後、反応液を、200mlのH₂Oで希釈し、次に200mlのEt₂Oで２回抽出した 。得られた有機層を合し、Na₂SO₄で乾燥し、次に減圧下で蒸発させた。油状残留 物を、（１）CH₂Cl₂，２Ｌ、（２）CH₂Cl₂／MeOH 97.5：2.5，l.5LおよびのCH₂C l₂/MeOH 95：5，2Lを使用するMerckシリカゲル60（２”×11”）のクロマトグラ フィーに付した。所望の生成物102が、上記（２）−（３）で溶出するが、それ をプールし、減圧下で蒸発させ、次いで高減圧下で乾燥して１.39g（33％）を得 た。その物性は下記のとおりであった。 _IH−NMR(CDCl₂）：δ1.37（ｓ，18H），2.47（ｍ，６Ｈ），3.15（ｍ，６Ｈ ），5.07（ｓ，２Ｈ），7.28（ｍ，５Ｈ）。 ¹³Ｃ−NMR(CDCl₃)：δ28.38，38.55，39.01，53.90，54.27，6 5．18，66．60，79．29，126．94，127．50，127．96，128．14，128．41,128． 47，136．66，156．38，156．78。 マススペクトル：FAB 481.2 （MH⁺）。 C₂₄H₄₀N₄O₆としての元素分析結果：理論値Ｃ，59.98 ；Ｈ，8.39；Ｎ，11.66 。実測値Ｃ，60.26；Ｈ，8.43；Ｎ，11.60。 FTIR：3336，2976，1694，1524，1366，1252，1170，736，698cm^-l。実施例62 化合物番号40 102(1.92g，3.99mmole)を、50％TFA／CH₂Cl₂(60ml)中で３hr撹拌した。ロータ リーエバポレーターで蒸発させて溶媒を除去し、次にEt₂Oを使って共蒸発を繰り 返した。油状生成物を50mlのEt₂Oで３回研和し、次に高減圧下で乾燥して103を 泡状物(2.29g，100％）として得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ⁴−MeOH)：δ2.64（ｔ，２Ｈ），2.78（ｔ，４Ｈ），3.01（ｔ， ４Ｈ），3.21（ｔ，２Ｈ），5.08（ｓ，２Ｈ），7.34（ｍ，５Ｈ）。 ¹³Ｃ−NMR(ｄ⁴−MeOH)：δ38.36，39.53，52.61，54.95，67.69，128.91，129 .12，129.51，138.2，159.2。 マススペクトル：FAB 281.1 （MH⁺）。 高分解能マススペクトル：理論値Ｃ，281.1977；実験値，281.1984（MH⁺）。 C₁₄H₂₄N₄O₂・2.6TFAとしての元素分析結果：理論値Ｃ，39.98;Ｈ，4.65；Ｎ， 9.71；Ｆ，25.69。実測値Ｃ，39.85 ；Ｈ，4.60；Ｎ，9.68；Ｆ，25.38。 FTIR：3036，1680，1532，1260，1204，1136，838，800，722cm^-1。実施例63 化合物番号41 0℃のDMF 100ml中に103(6.22g，10.0mmole)とKHCO₃(8.01g，80mmole)を懸濁さ せた懸濁液に、これを撹拌しながらBrCH₂CONHNH-BOC(10.12g，40.0mmole)を、い くつもの部分に分けて５分間かけて添加した。その反応液を室温で60hr撹拌した 。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を除いて油状残留物を得た。その 残留物を500mlのEt₂O／EtOAc１：１に溶解し、次に150mlのNaHCO₃飽和水溶液で ５回、続いて水で２回抽出した。得られた有機層を、Na₂SO₄で乾燥し、次にロー タリーエバポレーターで蒸発させて油状物を得た。さらに高減圧下で乾燥して10 4 (9.67g，100％）を得た。 その物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(d⁴−MeOH)：δ1.45（ｓ，36Ｈ），2.69（ｍ，10Ｈ），3.23（ｔ，２ Ｈ），3.37（ｓ，８Ｈ），5.06（ｓ，２Ｈ），7.33（ｍ，５Ｈ）。 ¹³Ｃ−NMR(ｄ⁴−MeOH)：δ28.64，53.28，53.88，54.56，58.59，66.92，67.5 4，81.94，129.07，129.51，138.35，157.63，158.89，173.20。 マススペクトル：イオンスプレ−969.6（MH⁺）。 C₄₂H₇₂N₁₂O₁₄・0.5H₂Oとしての元素分析結果：理論値Ｃ，51.57；Ｈ，7.52； Ｎ，17.18。実測値Ｃ，51.73；Ｈ，7.52；Ｎ，16.8４。 FTIR：3296，2980，1728，1696，1518，1394，1368，1248，1162，1048，1016 ，874，756，698cm^-1。実施例64 化合物番号42 104(2.11g，2.18mmole)を、50mlnoMeOH中で、35psiの圧力下、 ２hr水素化した。その反応液をセライドで濾過し、ロータリ-エバポレーターで 蒸発させ、次に高減圧下で乾燥して105を泡状物(1.65g，91％）として得た。そ の物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ⁴−MeOH)：δ1.46(s，36H)，2.71(m，12Ｈ）），3.34（ｓ，８Ｈ ）。 ¹³Ｃ−NMR(ｄ⁴−MeOH)：δ28.64，34.77，53.11，53.91，58.12，81.90，157. 64，172.88。 マススペクトル：イオンスプレー835.5（MH⁺）。 Ｃ₃₄H₆₆N₁₂O₁₂・l.0H₂O・1.0MeOHとしての元素分析結果：理論値Ｃ，47.50； Ｈ，8.20；Ｎ，18.99。実測値Ｃ，47.41；Ｈ，7.88；Ｎ，18.74。 FTIR：3292，2980，1720，1690，1484，1368，1248，1162，1048，1016，880 ，773，574cm^-1。実施例65 化合物番号43 105(1.03g，1.23mmole)と無水マレイン酸（121mg，1.23mmole)を25mlのCH₂Cl₂ に溶解して得た溶液を、2.5hr撹拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させ て溶媒を除去して106(l.16g，100％)を得た。その物性は以下のとおりであった 。 ¹Ｈ−NMR(ｄ⁴−MeOH)：δ1.45（ｓ，36Ｈ），3.13（ｍ，４Ｈ），3.45（ｍお よびｓ，16Ｈ），3.68（ｍ， ２Ｈ），6.17(dd，２Ｈ）。 マススペクトル：イオンスプレー933.6（MH⁺），955.5 （Ｍ＋Na⁺）。実施例66 化合物番号44 106(603mg，0.646mmole)およびEDCl(149mg，0.775mmole)を、 25mlの乾燥CH₂Cl₂中で、Ｎ₂雰囲気下室温にて2.5hr撹拌した。その反応液を、25 mlのNaHCO₃飽和水溶液で３回、次に25mlの水で１回抽出した。得られた有機層を Na₂SO₄で乾燥し、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、次に高減圧下で乾燥し てイソマレイミドの中間体(494mg，84％）を得た。その物性は下記のとおりであ った。 ¹Ｈ−NMR（CDCI₃）：δ１.45（ｓ，36Ｈ），2.8 （ｍ，10Ｈ）,3.31（ｓ，８ Ｈ），3.7 （ｍ，２Ｈ），6.57および7.40(dd，２Ｈ）。 この生成物を、HOBt(35mg，0.259mmole)とともに、８mlのDMF中で、室温にて ７hr撹拌した。ロータリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を除去した。油状残 留物を、60mlのEt₂O／EtOAc1：1に溶解し、次いで、25mlのNaHCO₃飽和水溶液で ５回、次に25mlの水で1回抽出した。得られた有機層を、Na₂SO₄で乾燥し、ロー タリーエバポレーターで蒸発させ、次に高減圧下で乾燥してマレイミドの生成物107 （463mg，94％）を得た。その物性は下記のとおりであった。 ¹H−NMR（CDCI₃）：δ1.45（ｓ，36Ｈ），2.7 （ｍ，10Ｈ）,3.32（ｓ，８Ｈ ），3.57（ｍ，２Ｈ），6.68（ｓ，２Ｈ）。 ¹³Ｃ−NMR(CDCl₃)：δ28.16，81.73，134.25，155.5，170.79。 マススペクトル：エレクトロスプレー915.5（MH⁺），937.5 （Ｍ＋Na⁺)。 FTIR：3300，2982，1738，1708，1680(sh)，1498，1394，1368，1248，1162， 1048，1016，72，696cm^-1。実施例67 化合物番号45 107(214mg，0.234mmole)を、25ml乾燥CH₂Cl₂中で、ｐ−トルエ ンスルホン酸（450mg，2.37mmole）とともに、Ｎ₂雰囲気下３hr撹拌した。ロー タリーエバポレーターで蒸発させて溶媒を除去した。残留物を、125mlのEt₂Oで ４回研和し、次に高減圧下で乾燥して108（378mg，94％）を得た。その物性は下 記のとおりであった。¹IH−NMR(ｄ⁴−MeOH)：δ2.36（ｓ，21Ｈ），3.22（ｔ，２Ｈ），3.52（ｍ， ８Ｈ），3.71（ｓ，８Ｈ），3.94（ｔ，２Ｈ），6.85（ｓ，２Ｈ），7.23（ｄ， 14Ｈ），7.70（ｄ，14Ｈ）。 マススペクトル： FAB 515.1（MH⁺）。実施例68 化合物番号46 108(100mg，58μmole)とドキソルビシンHCl（177mg，305μmole）を、25mlの 乾燥メタノール中で24hr撹拌した。その反応液を、ロータリーエバポレータ−で 蒸発させて４mlまで濃縮し、次に、メタノールを使用するSephadex LH-20(１” ×18”）で精製した。純粋生成物を含有する画分をプールし、ロータリーエバポ レーターで蒸発させ、次に高減圧下で乾燥して109（113mg，59％）を得た。その 物性は下記のとおりであった。 ¹Ｈ−NMR(ｄ⁴−MeOH)：δ1.2 （ｍ，12Ｈ），3.9 （ｓ，12Ｈ），6.8 （ｓ ，２Ｈ），7.2（ｄ）と7.7（ｄ）がスーパーインポーズした7.2〜8.0 （ｍ）、 トータル24Ｈ。実施例69 コンジュゲートの合成 チオール化法： 方法Ａ。３ｇ以下の規模の場合(Willner，D.，Trail P．A.，Hofstead，S．J. ，King，H．D.，Lasch，Braslawsky，G．R.，Greenfied，R．S.，Kaneko，T.，F irestone，R．A.,(6−Maleimidocaproyl)−hydrazone of Doxorubicin：A new d erivative for the pr eparation of immunoconjugates of Doxorubicin”，BioconjugateChem.， ４巻 、521頁、1993年参照）。代表的な実施例で、1.54gのBR96（53.4μＭで180ml，9 .6μmole）を、減圧とAr雰囲気を交互に行うサイクルを数サイクル行って脱酸素 を実施した。次に、これを、34mMのDTT（2.0ml、ArをバブリングさせたPBS，pH7 .0中68.0μmole）で処理し、次に37℃でAr雰囲気下３hr撹拌した。Amicon撹拌セ ル内で４℃にてPBS（pH7.0）に対して限外濾過を行うことによって低分子量の化 合物を除去した。400mlのAmiconセルにAmicon YM30フィルター（分子量カットオ フ30,000）を取り付け、Arで40psiにした。412nmでのベースライン読取りが達成 されるまで、セル流出液のチオール含量をエルマン試薬で監視した。タンパク質 とチオール基の濃度はすでに報告された方法にしたがって測定された。この実施 例で、１.49gの還元されたBR96(48.57μＭ MAbで190ml，412.7μＭのチオール） が得られた。この場合、収率が95％で、チオールの力価が8.5moleチオール基／m ole BR96である。 方法Ｂ。３ｇを超える規模の場合、Arをバブリングさせることによって、MAb 溶液の脱酸素を行ったことを除いて、DTT反応について同じ方法を利用した。DTT による還元の後の精製は、Filtron Minisette装置で限外濾過を行うことによっ て実施した。前記Minisette装置に、二つのFiltron 30Kカセットを取り付け、Bi opreneの管で、Watson Marlow 604Sポンプに接続した。MAb溶液を、0℃でAr雰囲 気下、ArをバブリングされたPBS（pH7.0）に対して限外濾過を行いながら（流出 液流量100〜150ml／min、背圧25psi）、引続き、上記のように流出液のチオール 含量を監視した。代表的な実施例において、6.6gバッチのBR96（75.3μＭで550m l）によって、6.1gの還元BR96(47.6μＭ MAbで800ml，398μＭのチオール）が得 られた（収率92％、チオールの力価は8.4moleチオール基／mo le BR96)。コンジュゲーション： BR96と２ｂをコンジュゲートする下記の方法は、本願で挙げられる全リンカー に用いられる代表的な方法である(Riddles，P．W.,Blakeley，R．L.，Zerner，B .，”Ellman's reagent：５， ５’ −Dithiobis （２−ニトロ安息香酸）−Ar eexamination”，Anal．Biochem.，94巻、75頁、1979年参照）。方法Ａ由来の還 元BR96（125ml，6.07μmole MAb，51.5μmoleのチオール）に、Arをバブリング させたH₂O5mlに、２ｂ（93mg，67.2μmole）を溶解して得た溶液を、Ar雰囲気下 ０℃で滴下して加えた。30分間撹拌した後、得られた反応液を、0.22μの滅菌フ ィルターで濾過した。コンジュゲートは、1”×36”のBio−Beadsカラム（最初 メタノール中で膨潤させてパッキングを行って調製し次に、H₂Oで平衡化し最後 にPBS（pH7.0）で平衡化させる）を用いてパーコレーションを行う（約２ml／mi n)ことによって４℃で精製した。その精製されたコンジュゲートを、0.22μの滅 菌フィルターで再び濾過して155mlのBR96−２ｂを得た(BR96，39.13μＭ；DOX， 589.0μＭ；MR，15.1mole DOX／mole BR96；収率100％)。コンジュゲートは液体 Ｎ₂で凍結させて−80℃で貯蔵した。実施例70 生物学的試験 材料と方法： モノクローナル抗体類とイムノコンジュゲート類。 MAb BR64（マウスIgG1）とMAb BR96（マウス／ヒトキメラの；ヒトIgG1)は、 肺、結腸、***および卵巣の癌で発現されるLey関連腫瘍に関連する抗原を識別 する。これらのMAbは、抗原特異的結合 or−reactive， internalizing，mouse monoclonalantibodies to Ｌey-relate d tell surface antigen”，Cancer Research，50巻、2183〜2190頁、1990年；T railらの1992年の報告；Trailらの1993年の報告；Willner，D.，Trail，P．A.， Hofstead，S．J.，King,H．D．，Lasch，S．J．，Braslawsky，G．R．，Greenti eld，R．S．，Kaneko，T．およびFirestone，R．A.，“（６−Maleimidocaproyl ）−hydrazone of doxorubicin− a new derivative for the preparation of immunoconjugates of doxorubicin”，Bioconjugate Chem，４巻、521〜527頁 、1993年）。各種のDOX／MAbモル比のドキソルビシンイムノコンジュゲートを、 キメラBR96と対照のヒトIgGの両方で製造した。 腫瘍細胞系。Ｌ2987はBR64とBR96の抗原を発現するヒト肺細胞系 のBristol−Myers squibb社）から入手した。 生体外細胞毒性検定。生体外細胞毒性検定はすでに報告されている（Trailら の1992年の報告）ようにして実施した。概略を述べると次のとおりである。Ｌ29 87ヒト癌細胞の単層培養物を、トリプシン−EDTA（米国ニューヨーク州グランド ・アイランド所在のGIBCO社）を用いて収穫し、次いでその細胞を計数し、次い で、加熱不活性化ウシ胎仔血清を10％含有するRPMI−1040（RPMI−10％FCS）中 に、再び懸濁させた(1×10⁵／ml)。細胞(0.1ml／ウェル）を、96ウェルの微量滴 定プレートの各ウェルに添加し、５％CO₂の湿潤雰囲気内で37℃にて一夜インキ ュベートした。該プレートから培地を除き、次にDOXまたはMAb−DOXコンジュゲ ートの段階希釈液をウェルに添加した。全希釈液について４組ずつ実施した。細 胞は、５％CO₅の潤滑雰囲気内で37℃にて各種の時間（試験結果に示すように２ ｈ〜48ｈ）、DOXまたはMAb−DOXコンジュゲートに暴露さ れた。次にプレートを遠心離にかけて(200×ｇ，5min)薬物またはコンジュゲー トを除き、次にその細胞をRPMI−10％ FCSで３回洗浄した。これら細胞を、RPMI −10％ FCS中で（37℃，５％ C0₂）さらに48hr培養した。この時点で、〔³Ｈ〕 チミジン（米国マサチューセッツ州ボストン所在のNew England Nuclear社）を1 .0μCi／ウェル使用して、これら細胞の標識化を２hr行った。これら細胞を、ガ ラス繊維のマット（米国バージニア州スターリング所在のSkatron Instruments ，Inc．社）上に収穫し、乾燥し、次いでフィルターに結合した〔³Ｈ〕チミジン の放射能を測定した（β−Plate scintillation counter、米国ニュージャージ ー州ピスカタウェイ所在のPharmacia LKB Biotechnology社）。〔³Ｈ〕チミジン 取込みの阻害を、処理された試料の平均のCPMを、未処理の対照の平均のCPMと比 較することによって測定した。種々のリンカーの安定性を評価するため設計され た試験で、細胞は、BR96または対照IgGのコンジュゲートに各種の期間（２〜48h r）暴露され、特異性比(Specificity ratio)(IC₅₀IgG−DOX/IC₅₀ BR96−DOX)を 、各種暴露時間に対して算出した。 実験動物。Balb／ｃ系の先天的に無胸腺の雌のマウス（Balb／ｃ nu／nu；米 国インディアナ州インディアナポリス所在のHarlan Sprague−Dawley社）をこの 試験では使用した。マウスは、温度と湿度を制御された滅菌ベッディング上のTh orenケージングユニット内に収容した。動物には、滅菌された餌と水が無制限に 与えられた。 ヒト腫瘍の異種移植片のモデル。Ｌ2987ヒト腫瘍系を、すでに報告されている ように（Trailらの1992年の報告）、無胸腺マウスに腫瘍異種移植片として株化 し、連続継代で維持した。Ｌ2987腫瘍は、1週間または２週間の時間間隔をおい て、直角に交わる２方向を、カリパスを使用して測定した。腫瘍の容積は式：Ｖ ＝ｌ×Ｗ²／ ２によって算出した。なお式中、Ｖ=容積（mm³）、l=最も長い軸線の測定値（mm ）およびＷ=lに対し直交する軸線の測定値である。一般に、一つの対照群または 治療群当りのマウスの数は８〜10であった。データは、対照群または治療群につ いて、腫瘍の大きさの中央値として示す。抗腫瘍活性は、log Cell Kill（LCK） （LCK＝Ｔ−Ｃ／TVDT×3.3)の中央値で示す。Ｔ−Ｃは、治療された腫瘍の大き さが500mm³に到達した時間（日数）の中央値−対照の腫瘍の大きさが500mm³に到 達した時間（日数）の中央値と定義され、TVDTは対照の腫瘍の容積が２倍になる (250−500mm³)のにかかった時間（日数）である。腫瘍の部分的な退行は、腫瘍 の容積が初期の腫瘍の容積の50％以下まで減少したことを意味し、腫瘍の完全な 退行は、ある期間、触知できない腫瘍を意味し、そして治癒は、10TVDT以上の期 間、触知できない株化腫瘍と定義する。 治療法。治療剤は、記載しているように各種の計画でipまたはivの経路によっ て投与した。DOXは正常食塩水で希釈し、そしてMAbおよびMAb−DOXコンジュゲー ト類はPBSで希釈した。治療剤はすべて、各動物に対して算出されたmg／kgベー スで投与され、その投与量はmg／kg／注射で示してある。対照の動物は治療され なかった。イムノコンジュゲートの投与量は、薬物(当量のDOX)および抗体の含 量に基づいて報告する。治療方式に対する最大耐容量(MTD)は、20％未満の致死 率をもたらす、与えられた計画における最大投与量と定義する。 試験結果： 線状および分枝のDOXヒドラゾンコンジュゲートの薬物／MAbモル比と生体外での 効力との関係 コンジュゲートのモル比とDOXHZNコンジュゲート類の生体外効力の関係は以前 に報告された（Trailらの1992年の報告）。これらの 試験では、BR64−DOXHZN（ジスルフィドによって連結されている）コンジュゲー ト類を、１〜８の範囲のコンジュゲート比で製造した。これらイムノコンジュゲ ートの生体外効力は33倍の範囲にわたって変化し（１〜３３μＭ DOXのIC₅₀値） 、効力はコンジュゲートのモル比と相関関係があった。すなわち、モル比が高い コンジュゲート類は、低いモル比で製造されたコンジュゲート類より、DOXベー スおよびMAbベースの両者で生体外にて効力が有意に（Ｐ＜0.05）高かった。し かしMAb結合親和力が低下することなく、与えられたMAbに直接連結できるDOX分 子の数は限定される。例えば、Shihらは、直接連結されたDOXのコンジュゲート のモル比が10を超えると、MAbの結合活性と抗原特異的効力が低下することを示 した（Shih,L．B.，Sharkey，R．M.，Primus，F．J.およびGoldenber，D．M.,“ Site−specific linkage of methotrexate to monoclonal antibodies using an intermediate carrier”，International Journal of cancer，41巻、8320839 ，1988年；Shihらの1991年の報告）。したがって、MAb分子のコンジュゲーショ ン部位の数を増やすことなしに、薬物／MAbモル比を２ⁿの係数で増大する分枝リ ンカーを使用した。 表1に示すように、各種の一回分枝したコンジュゲート類（すなわちｎ＝１の 場合の２ⁿ）のコンジュゲートモル比は11〜16の範囲内であったが、２回分枝し たコンジュゲート類（すなわちｎ＝２の場合の２ⁿ）のコンジュゲートモル比は2 4であった。個々のロットベース（表１）で、直鎖DOXHZNコンジュゲートのBMS− 182248（２μＭ DOX）に比べて、一回分枝DOXHZNコンジュゲートの効力は２〜20 倍であり、（0.1〜1.0μＭ当量DOXのIC₅₀値）、二回分枝のコンジュゲートは効 力は10倍であった(0.2μMのIC₅₀)。用語“BMS−182248”は、本明細書で使用す る場合、Trail，P．A.，Willner，D .，Lasch，S．J.，Henderson，A．J.，Hofstead，S．J.，Casazza， afted human carsinoma by BR96−Doxorubicin Immuno−conjugates”，Scienc e，261巻、212〜215頁、1993年に開示されている直鎖コンジュゲートを意味する 。したがって、コンジュゲートのモル比(M．R.)を増大することによって、一つ のBR96 MAbが送達するDOXの濃度を増やすと、これらコンジュゲートの生体外効 力が有意に増大した。表２に示すように、各種の一回分枝コンジュゲートと二回 分枝コンジュゲートの生体外効力の平均値は類似しており（0.2〜0.5μＭ DOX） 、そして各々、DOXベースとMAbベースの両者でBMS−182248を超える生体外効力 の利点を提供をした。 表１． BMS−182248と比べた、個々のロットの分枝DOXヒドラゾン コンジュゲート類の細胞毒性 表２．分枝鎖コンジュゲート類の生体外での効力と特異性 ^a特異性比はIC₅₀IgG−DOX/IC₅₀BR96−DOXと定義する。 ^b測定せず。 一回分枝DOXコンジュゲート類の生体外での安定性。 特性のなかで、有効なMAb−薬物コンジュゲートに対して望ましいのは、細胞 外の環境では極めて安定であるが、抗原発現細胞中にインターナライズすると薬 物を有効に放出するリンカーの化学的特性である。細胞外での安定性およびいく らか、細胞内加水分解速度 を評価する一方法は、各種の暴露時間において、非結合性コンジュゲートに対し て結合性コンジュゲートの抗原特異的細胞毒性を評価する方法である。この種の 実験では、細胞外の安定性は、非結合性イムノコンジュゲートが効力を欠いてい ることによって表される。抗原特異的インターナライゼーションに続いて迅速な 細胞内加水分解が起こると、高レベルの効力が得られ、これは暴露時間を長くし ても有意に変化することがない。線状のまたは分枝したリンカーで製造したBR96 −DOXコンジュゲート類でいくつもの実験を行った。以下の実験では、Ｌ2987細 胞を、各種の薬物コンジュゲートに、２，８，24または48hr暴露して、BR96（結 合）コンジュゲートとIgG（非結合）コンジュゲートの両者のIC₅₀値を測定した 。その試験結果を図１と２に示す。図１に示すように、MCDOXHZN（BMS−182248 ）コンジュゲートは、暴露の最初の24hrで、分枝ヒドラゾン、MB−Glu−(DOX)₂ ； BMS−187852コンジュゲートより効力が低かった。MCDOXHZNコンジュゲート の効力は、時間が経過するにつれて増大したが、一方、分枝DOXHZNの効力は、48 hrの暴露期間全体でほとんど変化しなかった。これらのデータは、分枝DOXHZNコ ンジュゲートの細胞内での加水分解速度が、DOXHZNより高かったことを示唆して いる。 細胞外での安定性の特性は、異なるリンカーの化学特性を有する非結合性IgG コンジュゲートが細胞を殺す動力学を試験することによって評価した。図２に示 すように、直鎖MCDOXHZNとして製造したIgGコンジュゲートおよび分枝鎖のMB−G lu−(DOX)₂のヒドラゾンコンジュゲートの両者の効力は暴露時間が長くなると増 大した。非結合性コンジュゲートの効力の増大は、時間が経過するにつれてコン ジュゲートからDOXが放出されることによるDOX自体の細胞毒性を反映していると 考えられる。線状と分枝鎖のヒドラゾンコンジ ュゲートの両者の効力は平行して増大していることは、これらコンジュゲートの 細胞外での安定性が全く類似していることを示唆している。要約すると、BR96の 分枝ヒドラゾンコンジュゲート類は、MCDOXHZN（BMS−182248）コンジュゲート 類より、短かい暴露時間で生体外で効力が高かったのである。しかし、これら分 枝コンジュゲートの細胞外安定性は、直鎖MCDOXHZNコンジュゲートの細胞外安定 性と異なっていなかった。全体的に見て、これらのデータは、分枝ヒドラゾンが 、DOXの細胞内放出の速度について利点を提供する可能性があるが、細胞外安定 性は増大しないことを示唆している。分枝鎖DOXヒドラゾンコンジュゲート類の 生体内生物学。 コンジュゲートのMRをほぼ２倍に増大することの抗腫瘍活性に対する効果を評 価するため、BR96とIgGのコンジュゲートを６種類の分枝リンカーを用いて製造 し、それらコンジュゲートを、Ｌ2987ヒト腫瘍異種移植片に対する、生体内での 抗原特異的活性について評価した。 各コンジュゲートについて、構造と、実質的に純品であること（特にコンジュ ゲートしていない薬物が存在していないこと）を確認したが、未確認の不純物が 存在していた。特に高MWの集合体（恐らくコンジュゲートの二量体であろう）が 存在していた。したがって、これら分枝鎖コンジュゲートの抗腫瘍活性は、研究 グレードのBMS−182248〔BMS−182248（RG）〕の抗腫瘍活性と比較した。 抗腫瘍活性が記載されている諸表における、BR96−DOXコンジュゲートの最適 投与量は、４以上のlog cell Killと70％以上の腫瘍退行を起こす最低の投与量 と定義する。最大の試験投与量でのIgG−DOXコンジュゲートの抗腫瘍活性は抗原 特異的活性の説明に含めてある。 １． BMS−187852；MB−Glu−(DOX)₂ BMS−187852コンジュゲートのモル比は、13.7から15まで変化させた。表３ に示すように、３ロットのBMS−187852を試験した。EMS−187852とEMS−182248 の両者の最適投与量は2.5mg／kg DOXであった。しかし、BMS−187852のモル比は ２倍であるから、分枝コンジュゲートの効力は、MAbベースで、BMS−182248（RG ）の約２倍であった。BMS−187852の抗腫瘍活性は抗原特異的であった。 表３． BMS−187852；MB−Glu−(DOX)₂コンジュゲート類の、株化 Ｌ2987腫瘍に対する抗腫瘍活性 ２． BMS−187853；MB−Glu−（β-Ala−DOX)₂ ２ロットのBMS−187853コンジュゲート（モル比：約11.5）を株化Ｌ2987肺腫 瘍異種移植片に対して評価した。これら２ロットの抗腫瘍活性は類似しており、 両者は、約2.0mg／kg DOX，45mg／kg ＢR96の投与量で最適の抗原特異的抗腫瘍 活性を発揮した。全体的に見て、これらのコンジュゲートの効力は、DOXベース ではBMS−182248（RG）と類似していたが、MAbベースではBMS−182248（RG）の ２倍であった。 表４． BMS−187853；MB−Glu−(β-Ala-DOX)₂コンジュゲート類 の株化Ｌ2987腫瘍に対する抗腫瘍活性 ３． BMS−188077；MC−Glu(DOX)₂ BMS−188077コンジュゲートのDOX／BR96モル比は14.6〜16.1の範囲内であっ た。表５に示すように、抗原特異的抗腫瘍活性が、BMS−188077に観察された。B MS−188077の効力は、DOX当量ベースでBMS−182248（RG）と類似していたが、モ ル比が増大しているのでMAbベースでは効力は２倍であった。 表５． BMS−188077；MC−Glu(DOX)₂コンジュゲートの株化Ｌ2987 腫瘍に対する抗腫瘍活性４． BMS−189099；MP−Glu−(DOX)₂ ３ロットのBMS−189099コンジュゲートを、同じリンカーの化学構造で製造さ れた非結合性IgGコンジュゲート(BMS−188078)と平行して評価した。BR96コンジ ュゲート類のモル比は14.5〜15.5の範囲内であった。BMS−189099コンジュゲー トと非結合性コンジュゲートの抗腫瘍活性を表６に示す。抗原特異的抗腫瘍活性 を生体内で観察した。BMS−189099コンジュゲートは、DOXベースでは効力がBMS −182248（RG）と類似していたが、MAbベースでは効力が約２倍であった。 表６． BMS−189099(MP−Glu−(DOX)₂)コンジュゲートの株化Ｌ 2987腫瘍に対する抗腫瘍活性 ５． BMS−189812；MB− 〔Ｄ〕 −Glu(DOX)₂ BMS−189812コンジュゲー ト類のモル比は、11〜15モルDOX／モルBR96の範囲であった。BMS−189812の抗腫 瘍活性のデータを表７に要約して示す。BMS−189812の最適投与量は約2mg／kg D OX，50mg／kgBR96であった。このコンジュゲートのDOXベースの効力はBMS−1822 48（RG）と類似していたが、MAbベースでは効力は２倍であった。 表７． BMS−189812；MB−〔Ｄ〕−Glu−(DOX)₂コンジュゲートの 株化Ｌ2987腫瘍に対する抗腫瘍活性 ６． BMS−190385；MB−Glu−(β−Ala−DOX)₂コンジュゲート類 BMS−190385コンジュゲートは、生体内で抗原特異的活性を示した。BMS−19 0385コンジュゲートの抗腫瘍活性を表８に示す。表８に示すように、２ロットの BR96−DOXコンジュゲートが、現在株化Ｌ2987肺異種移植片に対して評価されて いる。抗原特異的抗腫瘍活性が観察された。データがさらに明らかになりつつあ るが、これらコンジュゲートの最適投与量は、２mg／kg DOX，60mg／kg BR96の ようである。BMS−190385の効力は、DOX ベースではBMS−182248と類似している が、MAbベースではわずかに大きい。 表８． BMS−190385；MB−Glu−(β−Ala−DOX)₂コンジュゲー トの株化L2987腫瘍に対する抗腫瘍活性 分枝鎖DOXHZNコンジュゲート類の要約 本願で評価した分枝鎖DOKHZNコンジュゲート類は一般に、モル比が11〜15の範 囲内であった。これは、BMS−182248に一般に観察されるモル比の1.5〜1.8倍で ある。評価されたコンジュゲート類はすべて、生体外と生体内の両方で抗原特異 的活性を示した。各種の分枝鎖コンジュゲート類において、生体外（表２）およ び生体内（表９）の効力に有意差がなかった。生体外で評価した場合、分枝コン ジュゲート、DOXとMAbの両ベースで効力が増大した。このことは、コンジュゲー トが、２hrの暴露を利用して検定したことを反映しているようであり、そして図 1示すように、分枝コンジュゲートは、抗原特異的インターナライゼーションの 後、直鎖MCDOXHZNコンジュゲートより迅速にDOXを放出するようである。４以上 のlog cell Ki11と70％以上の腫瘍退行を起こす当量DOXの投与量は、分枝鎖DOXH ZNと一本鎖DOXHZN(EMS−182248)のコンジュゲートの両者の場合、同じであった （表９に要約）。しかし、分枝鎖コンジュゲートのモル比はBMS−182248の1.5〜 1.8倍であるから、これらコンジュゲートの効力は、MAbベースでBMS−182248の 効力の約２倍であった。 表９．分枝鎖DOXHZNコンジュゲートの最適投与量の、株化Ｌ2987肺 腫瘍異種移植片に対する抗腫瘍活性 ^a平均値

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/4015 Ａ６１Ｋ 31/40 ６０２ 31/704 31/70 ６１１ 47/48 47/48 Ｃ０７Ｈ 15/252 Ｃ０７Ｈ 15/252 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ (72)発明者 ファイヤーストーン，レイモンド アメリカ合衆国，コネティカット 06511, ニュー ヘイブン，テンプル ストリート 387 (72)発明者 トレイル，パメラ アメリカ合衆国，ペンシルバニア 19067, ヤードレイ 19067，サイロ ロード 1419

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．標的指向リガンド由来のチオール基を、２又はそれ超の薬物部分に連結す るための分枝リンカーであって、標的指向リガンド由来のチオール基に結合する ためのチオール受容体を含む一方の末端と、２ⁿ（ｎは正の整数である）の分枝 のレベルを可能にする多価原子である少なくとも一つの分枝点と、薬物部分由来 のアルデヒド基またはケト基とアシルヒドラゾン結合を形成することができるア シルヒドラジド基を含む少なくとも二つの他方の末端と、を有する化合物を含む 分枝リンカー。 ２．ｎが１，２，３または４である請求の範囲１記載の分枝リンカー。 ３．ｎが１，２または３である請求の範囲１記載の分枝リンカー。 ４．ｎが１または２である請求の範囲１記載の分枝リンカー。 ５．前記多価原子が炭素である請求の範囲１記載の分枝リンカー。 ６．前記多価原子が窒素である請求の範囲１記載の分枝リンカー。 ７．抗体またはそのフラグメントである標的指向リガンドに連結された請求の 範囲１記載の分枝リンカー。 ８．アントラサイクリン類である薬物部分に連結された請求の範囲１記載の分 枝リンカー。 ９．ｎが１または２であり、前記多価原子が炭素または窒素であり、前記標的 指向リガンドが抗体またはそのフラグメントであり、そして前記薬物部分がアン トラサイクリン類である請求の範囲１記載の分枝リンカー。 10．下記式：Ｉで表され、 式中、Ａはチオール受容体であり、 Ｑは架橋基であり、 ｂは０または１の整数であり、 Ｗはスペーサー部分であり、 ｍは０または１の整数であり、 ａは２，３または４の整数であり、および 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および 請求の範囲１記載の分枝リンカー。 10記載の分枝リンカー。 囲10記載の分枝リンカー。 13．Ａがミカエル付加反応の受容体である請求の範囲10記載の分 枝リンカー。 ６の整数である請求の範囲10記載の分枝リンカー。載の分枝リンカー。 16．ｂが０でありおよびａが２である請求の範囲10記載の分枝リンカー。 17．ｂが０でありおよびａが２である請求の範囲15記載の分枝リンカー。 18．Ｑが式：−(CH₂)_f −（Ｚ）_g −(CH₂)_h −で表され、式中、ｆは１〜10の 整数であり、 ｈは１〜10の整数であり、 ｇは０または１であり、但しｇが０の場合、ｆ＋ｈは１〜10であり、 ＺはＳ，Ｏ，NH，SO₂ フェニル、ナフチル、３〜10個の炭素原子を含有する脂 環式炭化水素環、または３〜６個の炭素原子およびＯ，ＮもしくはＳから選択さ れる１〜２個のヘテロ原子を含有するヘテロ芳香族炭化水素環である、請求の範 囲10記載の分枝リンカー。 19．ｆが１または２であり、ｈが１または２であり、ｇが１であり、およびＺ がフェニル、ピリジル、または３〜６個の炭素原子を有する脂環式炭化水素環で ある請求の範囲18記載の分枝リンカー。 20．Ｚがフェニルまたはシクロヘキシルである請求の範囲19記載の分枝リンカ ー。 21．ｇが０であり、そしてｆ＋ｈが１〜４の整数である請求の範囲18記載の分 枝リンカー。 22．ｇが０であり、そしてｆ＋ｈが２の整数である請求の範囲18記載の分枝リ ンカー。 請求の範囲10記載の式で表されるリンカー／薬物。 24．前記薬物がアントラサイクリンの抗生物質である請求の範囲23記載のリン カー／薬物。 25．前記アントラサイクリンの抗生物質が下記式で表され、 式中、Ｒ₁ は−CH₃ ，−CH₂OH ，−CH₂OCO(CH₂)₃CH₃または−CH₂OCOCH(OC₂H₅)₂ であり、 Ｒ₃は−OCH₃，−OHまたは水素であり、 Ｒ₄ は−NH₂ ，−NHCOCF₃ ，４−モルホリニル、３−シアノ−４−モルホリニ ル、１−ピペリジニル、４−メトキシ−１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジ ベンジルアミン、シアノメチルアミンまたは１−シアノ−２−メトキシエチルア ミンであり、 Ｒ₅は−OH，−OTHPまたは水素であり、および Ｒ₆は−OHまたは水素であり、但しＲ₅が−OHまたは−OTHPの場 合、Ｒ₆ は−OHではない、 請求の範囲24記載のリンカー／薬物。 26．下記式で表され、 式中、ａは０，１，２または３の整数であり、 ｎは１〜６の整数であり、 ｍは０または１の整数であり、および Ｘ⁵ はアントラサイクリンの抗生物質である、 リンカー／薬物。 27．Ｘ⁵ が下記式で表され、 式中、Ｒ₃ が−OCH₃，−OHまたは水素である、請求の範囲26記載のリンカー／薬 物。 28．ｍが０でありおよびｎが２または３である請求の範囲27記載のリンカー／ 薬物。 29．下記式で表され、 式中、ｎは１〜６の整数であり、 ａは０，１，２または３の整数であり、 ｍは０または１の整数であり、および Ｘ⁵ はアントラサイクリンの抗生物質である、 リンカー／薬物。 30．Ｘ⁵ が下記式で表され、 式中、Ｒ₃ が−OCH₃，−OHまたは水素である、請求の範囲29記載のリンカー／薬 物。 31．ｍが０でありおよびｎが２または３である請求の範囲30記載のリンカー／ 薬物。 32．下記式IIで表され、 式中、ｎは１〜６の整数であり、 ａは０または１の整数であり、 ｊは２〜６の整数であり、 ｃは０または１の整数であり、但しａが０の場合、ｃも０でなければならず、 Ａはチオール受容体であり、で表され、 上記式中、ｄは２〜６の整数であり、 ｍは１または２の整数であり、 ｂは０または１の整数であり、 ｆは０または１の整数であり、 ｇは１または２の整数であり、および 求の範囲１記載の分枝リンカー。 33．Ａがミカエル付加反応の受容体である請求の範囲32記載の分枝リンカー。 範囲32記載の分枝リンカー。 35．Ｔが下記式： で表される請求の範囲32記載の分枝リンカー。 36．ｄが２であり、ｆが０であり、およびｇが１である請求の範囲32記載の分 枝リンカー。囲32記載の分枝リンカー。 請求の範囲32記載の分枝リンカー。 請求の範囲32記載の分枝リンカー。 表される請求の範囲32記載の分枝リンカー。請求の範囲32記載の分枝リンカー。 42．下記式IIIで表されるコンジュゲートであって、 式中、Ａはチオール付加物であり、 Ｗはスペーサー部分であり、 Ｑは架橋基であり、 ｍは０または１の整数であり、 ａは２，３または４の整数であり、 ｂは０または１の整数であり、 ｐは１〜６の整数であり、 ＹはＯまたは NH₂ ⁺ Cl^- であり、 Ｚは０または１の整数であり、 ｑは1〜10の整数であり、 Ｇは標的指向リガンドであり、および 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および 上記式中、Ｗ，ａ，ｂおよびｍは前記定義と同じであり、および るコンジュゲート。 の範囲42記載のコンジュゲート。 求の範囲42記載のコンジュゲート。 45．Ａがミカエル付加反応付加物である請求の範囲42記載のコンジュゲート。 の整数である請求の範囲42記載のコンジュゲート。 のコンジュゲート。 48．ｂが０であり、およびａが２である請求の範囲42記載のコンジュゲート。 49．Ｑが式：−(CH₂)_f −（Ｚ）_g −(CH₂)_h −で表され、式中、ｆは１〜10の 整数であり、 ｈは１〜10の整数であり、 ｇは０または１の整数であり、但しｇが０の場合、ｆ＋ｈは１〜10であり、 ＺはＳ，Ｏ，NH，SO₂ フェニル、ナフチル、３〜10個の炭素原子を含有する脂 環式炭化水素環、または３〜６個の炭素原子を有しかつＯ，ＮまたはＳから選択 される１個または２個のヘテロ原子を有するヘテロ芳香族炭化水素環である、 請求の範囲42記載のコンジュゲート。 50．ｆが１または２であり、ｈが１または２であり、ｇが１であり、およびＺ がフェニル、ピリジルまたは３〜６個の炭素原子を有する脂環式炭化水素リング である請求の範囲49記載のコンジュゲート。 51．Ｚがフェニルまたはシクロヘキシルである請求の範囲50記載のコンジュゲ ート。 52．ｇが０であり、およびｆ＋ｈが１〜４の整数である請求の範囲49記載のコ ンジュゲート。 53．ｇが０であり、およびｆ＋ｈが２の整数である請求の範囲49記載のコンジ ュゲート。 54．前記薬物がアントラサイクリンの抗生物質である請求の範囲42記載のコン ジュゲート。 55．前記アントラサイクリンの抗生物質が下記式で表され、 式中、Ｒ₁ は−CH₃ ，−CH₂OH ，−CH₂OCO(CH₂)₃CH₃ または−CH₂OCOCH(OC₂H₅)₂ であり、 Ｒ₃ は−OCH₃，−OHまたは水素であり、 Ｒ₄ は−NH₂ ，−NHCOCF₃ ，４−モルホリニル、３−シアノ−４−モルホリニ ル、１−ピペリジニル、４−メトキシ−１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジ ベンジルアミン、シアノメチルアミンまたは１−シアノ−２−メトキシエチルア ミンであり、 Ｒ₅ は−OH，−OTHPまたは水素であり、および Ｒ₆ は−OHまたは水素であり、但しＲ₅ が−OHまたは−OTHPの場合、Ｒ₆ は− OHではない、 請求の範囲54記載のコンジュゲート。 56．Ｇが免疫グロブリンまたはそのフラグメントである請求の範囲42記載のコ ンジュゲート。 57．Ｇが、BR96，BR64，Ｌ６、緩和BR96、緩和BR64、緩和Ｌ６、 キメラBR96、キメラBR64、キメラＬ６、緩和キメラBR96、緩和キメラBR64、緩和 キメラＬ６およびそれらのフラグメントからなる群から選択される免疫グロブリ ンである請求の範囲56記載のコンジュゲート。 58．Ｇが、キメラBR96、緩和キメラBR96またはそれらのフラグメントである請 求の範囲57記載のコンジュゲート。 59．Ｇが、ボンベシン、EGF 、トランスフェリン、ガストリン、ガストリン放 出ペプチド、血小板由来増殖因子、IL−２，IL−６,TGF−α， TGF−β，VGF 、インスリンおよびインスリン様成長因子ＩとIIからなる群から選択されるリガ ンドである請求の範囲42記載のコンジュゲート。 60．Ｇがボンベシンである請求の範囲59記載のコンジュゲート。 61．Ｇが、炭水化物類、ステロイド類およびレクチン類からなる群から選択さ れるリガンドである請求の範囲42記載のコンジュゲート。 62．下記式IVで表されるコンジュゲートであって、式中、Ａはチオール付加物であり、 ｎは１〜６の整数であり、 ａは０または１の整数であり、 ｊは２〜６の整数であり、 ｃは０または１の整数であり、 ｐは１〜６の整数であり、 ＹはＯまたはNH₂ ⁺ Cl^- であり、 Ｚは０または１の整数であり、 ｑは１〜10の整数であり、 Ｇは標的指向リガンドであり、および で表され、 上記式中、ｄは２〜６の整数であり、 ｍは１または２の整数であり、 ｆは０または１の整数であり、 ｂは０または１の整数であり、 ｇは１または２の整数であり、および る、コンジュゲート。 63．Ａがミカエル付加反応の付加物である請求の範囲62記載のコンジュゲート 。 範囲62記載のコンジュゲート。 65．Ｔが下記式： で表される請求の範囲62記載のコンジュゲート。 66．ｄが２であり、ｆが０であり、およびｇが１である請求の範囲62記載のコ ンジュゲート。 67．前記薬物がアントラサイクリンの抗生物質である請求の範囲62記載のコン ジュゲート。 68．前記アントラサイクリンの抗生物質が下記式で表され、式中、Ｒ₁ は−CH₃ ，−CH₂OH，−CH₂OCO(CH₂)₃CH₃ または−CH₂OCOCH(OC₂H₅)₂ であり、 Ｒ₃ は−OCH₃，−OHまたは水素であり、 Ｒ₄ は−NH₂ ，−NHCOCF₃ ，４−モルホリニル、３−シアノ−４−モルホリニ ル、１−ピペリジニル、４−メトキシ−１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジ ベンジルアミン、シアノメチルアミンまたは１−シアノ−２−メトキシエチルア ミンであり、 Ｒ₅ は−OH，−OTHPまたは水素であり、および Ｒ₆ は−OHまたは水素であり、但しＲ₅ が−OHまたは−OTHPの場合、Ｒ₆ は− OHでない、 請求の範囲67記載のコンジュゲート。 69．前記アントラサイクリンの抗生物質が下記式で表され、 式中、Ｒ₃ が−OCH₃，−OHまたは水素である請求の範囲68記載のコンジュゲート 。 70．Ｇが免疫グロブリンまたはそのフラグメントである請求の範囲62記載のコ ンジュゲート。 71．Ｇが、BR96，BR64，Ｌ６、緩和BR96、緩和BR64、緩和Ｌ６、キメラBR96、 キメラBR64、キメラＬ６、緩和キメラBR96、緩和キメラBR64、緩和キメラＬ６お よびそれらのフラグメントからなる群から選択される免疫グロブリンである請求 の範囲70記載のコンジュゲート。 72．Ｇが、キメラBR96、緩和キメラBR96またはそれらのフラグメントである請 求の範囲71記載のコンジュゲート。 73．Ｇが、ボンベシン、EGF 、トランスフェリン、ガストリン、ガストリン放 出ペプチド、血小板由来増殖因子、IL−２，IL−６,TGF−α， TGF−β，VGF 、インスリン並びにインスリン様成長因 子ＩおよびIIからなる群から選択されるリガンドである請求の範囲62記載のコン ジュゲート。 74．Ｇがボンベシンである請求の範囲73記載のコンジュゲート。 75．Ｇが、炭水化物類、ステロイド類およびレクチン類からなる群から選択さ れるリガンドである請求の範囲62記載の化合物。 76．殺すために選択された細胞集団に薬物を送達する方法であって、標的指向 リガンドが前記選択された細胞集団と反応性である請求の範囲42または62に記載 の１又は複数のコンジュゲートの医薬として有効な量を投与することを含む方法 。 77．疾患を治療するのに有用な医薬として許容される組成物であって、請求の 範囲42または62に記載の少なくとも一つのコンジュゲートの医薬として有効な量 と、医薬として許容される担体と、を含んでなる組成物。 78．癌、非悪性腫瘍、非細胞破壊性のウィルスもしくは病原体の感染症および 自己免疫障害からなる群から選択される哺乳類の疾患を治療するための方法であ って、請求の範囲42または62に記載の少なくとも一つのコンジュゲートの医薬と して有効な量を、治療を必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる方法 。 79．請求の範囲42または62に記載の少なくとも一つのコンジュゲートの医薬と して有効な量を、治療を必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる哺乳 類の腫瘍を治療する方法。