CN111378018B - 一种检测新型冠状病毒抗体的试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测新型冠状病毒抗体的试纸条及其制备方法和应用，本发明公开的试纸条包括依次贴于底板上的样品垫、结合垫、分析膜和吸水滤纸，所述分析膜上设有检测线T和质控线C，所述检测线T包被如SEQ ID NO.1所示的NP抗原，所述质控线C包被抗IgG抗体，该试纸条可用于检测新冠病毒的抗体或者评价注射疫苗后的接种效果。

Description

一种检测新型冠状病毒抗体的试纸条及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种检测新型冠状病毒抗体的试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)， 属于β属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。
目前，对于新型冠状病毒感染的常规检测方法主要为实时荧光RT-PCR，但 是检测耗时长，试剂成本高，且由于多种原因可能会造成假阴性的检测结果，并 且该检测方法对仪器和设备的要求较高，只适用于实验室检测，不适用于基层医 疗机构以及现场的快速低成本检测。同时，多种其他的检测方法也都处在研究阶 段。如酶联免疫分析，化学发光，时间分辨荧光等，但是上述检测手段均需要较 为精密的实验仪器以及相当程度上对于实验人员操作经验的依赖。在最新的第七 版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》中新增血清新型冠状病毒特异性IgM抗体作 为病原学诊断标准之一，IgM被普遍认为是感染病毒后人体内产生的第一道防 线，对于IgM的快速准确检测时判断疾病急性期的重要依据和手段。尤其是对 于此次爆发的COVID-19，存在大量的无症状感染者，这使得通过PCR等方法 进行确诊的难度大幅度提高，所以开发研究针对新型冠状病毒IgM抗体的检测 方法，不仅可以弥补核酸检测的不足，提高新型冠状病毒感染的诊断效率，又可 以极大程度地避免确诊患者或疑似患者鼻咽拭子标本的采集和运输过程中给医 务人员和其他相关工作人员带来的潜在风险。
目前，免疫层析技术在众多领域得到了越来越大的重视，如食品安全、环境 监测、药物筛选和医学检测等方面。虽然有很多较为成熟的，以荧光和电化学发 光等为代表的特异性强，灵敏度高的定量或半定量的免疫检测方法，但是它们的 缺点(操作复杂，检测过程耗时长)却不能被忽视。因此，急需一种新型的操作 简单、耗时短、特异性强的快速检测技术(point-of-care,POCT)。
本发明通过获得新型冠状病毒核蛋白(NP蛋白)，将抗原抗体的特异性结合 特性与胶体金免疫层析技术相结合，采用间接法制备得到用于现场快速检测新型 冠状病毒IgM抗体的胶体金免疫层析试纸条。整个检测过程无需复杂的操作技 巧和精密的仪器设备，且成本低廉，运输方便，易于保存。因此，本发明的提出 为新型冠状病毒IgM抗体的POCT快速诊断提供了一种高效实用的现场检测方 法，对新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的综合防控具有非常重要的实践意义以 及广泛的应用前景。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种简单快速、特异性强 且满足现场快速大规模筛查新型冠状病毒IgM抗体的间接法胶体金免疫层析试 纸条及其制备方法和相关应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种检测SARS-CoV-2抗体的抗原，所述抗原的氨 基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基 酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
进一步，所述抗原通过设计引物，以核酸阳性病例样本为模板，RT-PCR扩 增N基因，并***表达载体，导入大肠杆菌***中进行可溶性表达，利用Ni亲 和层析柱进行纯化表达得到。
本发明的第二方面提供了一种检测SARS-CoV-2病毒感染/抗SARS-CoV-2 病毒的抗体的产品，所述产品包括本发明第一方面所述的抗原。
进一步，所述产品包括试剂盒、检测卡或试纸条。
进一步，所述试纸条为免疫层析试纸条。
进一步，所述免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、分析膜、吸水滤纸和底 板，其中结合垫上附着有标记物标记的SARS-CoV-2病毒抗体的特异性结合蛋白， 所述分析膜上设有检测线T和质控线C，所述检测线T包被本发明第一方面所 述的抗原；所述质控线C包被抗IgG抗体。
进一步，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚酯纤维膜或无纺布。
进一步，所述结合垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。
进一步，制备胶体金的pH为7～10，作为本发明的一种优选的实施方式，PH 为8。
进一步，SARS-CoV-2病毒抗体的特异性结合蛋白为可与SARS-CoV-2病毒 抗体IgM抗体结合的抗IgM抗体。
进一步，抗IgM抗体为鼠抗人IgM。
进一步，所述抗IgM抗体为不同的抗IgM抗体的混合抗体。在本发明的具 体实施方式中，鼠抗人IgM为两种不同规格和浓度的鼠抗人IgM。
进一步，不同的抗IgM抗体的混合比例为1:1(质量比)。
进一步，每200μL胶体金的鼠抗人IgM的标记量为0.75μg～7.5μg，作为本 发明的一种优选的实施方式，每200μL胶体金的鼠抗人IgM的标记量为1.8μg。
进一步，所述分析膜为硝酸纤维素膜；所述底板为PVC底板。
进一步，质控线C为羊抗鼠IgG。
进一步，质控线C的包被浓度为1.0mg/mL～2.0mg/mL，作为本发明的一种 优选的实施方式，质控线C的包被浓度为2.0mg/mL。
进一步，检测线T的抗原包被浓度为0.6～1.2mg/mL，作为本发明的一种优 选的实施方式，抗原包被浓度为1.2mg/mL。
使用本发明所述的的胶体金免疫层析试纸条用于新型冠状病毒IgM抗体检 测时按照以下步骤进行：
用移液枪或者一次性滴管吸取待测血清样本20μL于检测卡上样本孔内，立 即在样本孔内滴加2-3滴(约70-100μL)样本稀释液，并保证过程中没有气泡产 生，10分钟后判读结果。
结果判定：
阴性结果：仅出现质控线C，检测线T不显色，说明没有检测到新型冠状病 毒IgM抗体，结果为新型冠状病毒IgM抗体阴性。
阳性结果：质控线C和检测线T都出现，说明检测到新型冠状病毒IgM抗 体，结果为新型冠状病毒IgM抗体阳性。
无效结果：质控线C未出现，无论检测线T是否出现，均为无效结果。
本发明的第三方面提供了一种检测SARS-CoV-2病毒感染/抗SARS-CoV-2 病毒的抗体的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备免疫金体胶结合垫
用氯化金溶液和柠檬酸三钠溶液制备胶体金溶液，碳酸钾调节胶体金溶液的 pH，依次加入待标记的特异性结合蛋白、BSA溶液，离心得到沉淀，金体胶复 溶液重悬沉淀得到免疫金胶复合物溶液，将溶液滴涂经结合垫处理液处理的集合 垫上；
(2)制备分析膜
用包被缓冲液稀释本发明第一方面所述的抗原划线得到检测线T，用包被缓 冲液稀释抗IgG抗体划线作为质控线C，使用BSA的磷酸盐缓冲液封闭；
(3)试纸条的组装
在黏性底板上依次黏贴样品垫、结合垫、分析膜和吸水纸，裁剪成合适的宽 度的试纸条。
进一步，步骤(1)中的pH为7～10，作为本发明的一种优选的实施方式， PH为8。
进一步，特异性结合蛋白为抗IgM抗体，在本发明的具体实施方式中，所 述抗IgM抗体为鼠抗人IgM抗体。
进一步，每200μL胶体金的鼠抗人IgM的标记量为0.75μg～7.5μg，作为本 发明的一种优选的实施方式，每200μL胶体金的鼠抗人IgM的标记量为1.8μg。
进一步，所述抗IgM抗体为不同的抗IgM抗体的混合抗体。
进一步，不同的抗IgM抗体的混合比例为1:1。
进一步，免疫金胶复溶液为含0.1％BSA(w/v)，2％蔗糖(w/v)，0.5％吐 温-20(v/v)的Tris溶液。
进一步，结合垫处理液为0.1％吐温-20(v/v)，2.5％蔗糖(w/v)， 0.1％PEG-20000(w/v)，0.5％BSA(w/v)的PBS溶液。
本发明的结合垫可以采用本领域的常规载体，包括但不限于玻璃纤维膜或聚 酯纤维膜。作为本发明的一种优选的实施方式，所述结合垫采用玻璃纤维膜。
进一步，步骤(2)中质控线C为羊抗鼠IgG。
进一步，质控线C的包被浓度为1.0mg/mL～2.0mg/mL，作为本发明的一种 优选的实施方式，羊抗鼠IgG的包被浓度为2.0mg/mL。
进一步，检测线T的抗原包被浓度为0.6～1.2mg/ml，作为本发明的一种优选 的实施方式，抗原包被浓度为1.2mg/mL。
进一步，BSA的磷酸盐缓冲液的BSA浓度为0.5～2％，作为本发明的一种优 选的实施方式，BSA浓度为1％。
本发明的第四方面提供了一种检测SARS-CoV-2病毒感染/抗SARS-CoV-2 病毒的抗体的检测卡的制备方法，将本发明第三方面所述的制备方法制备的试纸 条置入塑料外壳中，其中，塑料外壳的加样孔在样品垫上方，塑料外壳的观察窗 在检测线和质控线上方。
本发明的第五方面提供了一种检测SARS-CoV-2病毒感染/抗SARS-CoV-2 病毒的抗体的试剂盒的制备方法，将采用本发明第四方面所述的制备方法制备的 检测卡装入铝箔袋，与采样管、样本稀释液、说明书装盒。
本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用：
1)本发明第一方面所述的抗原在制备检测SARS-CoV-2病毒感染/抗 SARS-CoV-2病毒的抗体/评价疫苗接种效果的产品中的应用；
2)本发明第二方面所述的产品在制备检测SARS-CoV-2病毒感染/抗 SARS-CoV-2病毒的抗体/评价疫苗接种效果的工具中的应用；
3)本发明第三方面所述的制备方法在制备检测SARS-CoV-2病毒感染/抗 SARS-CoV-2病毒的抗体/评价疫苗接种效果的试纸条中的应用；
4)本发明第四方面所述的制备方法在制备检测SARS-CoV-2病毒感染/抗 SARS-CoV-2病毒的抗体/评价疫苗接种效果的检测卡中的应用；
5)本发明第五方面所述的制备方法在制备检测SARS-CoV-2病毒感染/抗 SARS-CoV-2病毒的抗体/评价疫苗接种效果的试剂盒中的应用。
本发明的优点和有益效果：
本发明制备的胶体金免疫层析试纸条，具有良好的特异性和稳定性，储存方 便，运输便捷，操作简单，保质期长，检测速度快，适用于在各级医疗机构对 SARS-CoV-2-IgM的大规模快速检测，并配合PCR和CT等实验室及临床诊断标 准，更好的对COVID-19的确诊提供必要的辅助，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是SARS-CoV-2病毒NP蛋白表达SDS-PAGE鉴定结果图；
图2是不同NP蛋白作为抗原的检测情况图；
图3是胶体金的TEM形貌特征图；
图4是胶体金标记抗体最适pH的测定图；
图5是金标抗体最适标记量结果图；
图6是不同复溶液溶解沉淀结果图；
图7是不同封闭液的封闭结果图；
图8是不同结合垫处理液处理结合垫结果图；
图9是质控线上不同浓度的抗体检测情况图；
图10是检测线上不同浓度的抗原的检测情况图；
图11是胶体金免疫层析试纸条组装图；其中，a是胶体金免疫层析试纸条的 结构图，b是阳性样品层析示意图，c是阴性样品层析示意图；
图12是试纸条特异性试验检测结果图；
图13是不同批次间的试纸条的检测结果图；
图14是相同批次内不同时间点的试纸条的检测结果图；
图15是临床样本的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解 为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和 宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范 围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1 SARS-CoV-2-NP的制备和纯化
取灭活的SARS-CoV-2毒株，制备病毒RNA模板，扩增SARS-CoV-2蛋白 开放阅读框；并***细菌表达质粒pET-28(a)，得到细菌表达质粒pET-28(a)-NP。 将该质粒常规转化E.CoLi BL21菌株,用50μg/ml卡那霉素和1mM异丙基-β-D- 硫半乳吡喃糖苷在37℃的LB肉汤中诱导蛋白表达。将含有重组蛋白的培养颗粒 重新悬浮在色谱结合缓冲液中，进行超声处理。将细胞裂解液离心，用其上清液 装载镍离子亲和柱。用结合缓冲液彻底清洗柱后，用洗脱缓冲液从柱上洗脱重组 6His标记的NP蛋白，用SDS-PAGE分析纯化蛋白，用考马斯亮蓝染色法观察。
根据结构预测，2019-nCoV NP蛋白从结构上可以分为两个结构域(domain)， 分别称为NP-NT(氨基酸序列：SEQ ID NO.1)和NP-CT(氨基酸序列：SEQ ID NO.2)，这两个结构域及NP全长蛋白(氨基酸序列：SEQ ID NO.3)分别表达。 而SDS-PAGE结果(图1)也显示了表达纯化出三个蛋白(1-重组SARS-CoV-2 病毒NP，2-重组NP-CT蛋白，3-重组NP-NT蛋白)
实施例2 ELISA检测重组表达蛋白结合病毒特异性IgM的效果
分别用NP全长蛋白、NP-NT和NP-NC蛋白包被ELISA板，100ng/well， 4C过夜。洗涤后用5％脱脂奶粉封闭，4℃过夜。在每孔中加入样品稀释液100μL， 然后向其中加入1μL的待检血清，混匀后于37℃孵育30分钟洗涤5次后，加入 鼠抗人IgM-HRP(μ链特异性)检测病毒特异性IgM，于37℃孵育30分钟洗涤 5次后，加入TMB+H2O2底物，100μL/well，于室温放置5分钟，加入终止液 50μL/well。于450nm波长处测定OD值。
结果如图2所示，可见NP-NT的检测效果最好，故本发明中使用NP-NT作 为T线包被抗原。
实施例3 SARS-CoV-2的胶体金检测卡的制备
1、材料和试剂
1.1免疫层析材料
玻璃纤维素膜，硝酸纤维素膜，吸水纸，粘性底版，快速检测塑料卡，均购 自上海杰一生物技术有限公司。
1.2主要试剂的配制
HAuCl4溶液：1g HAuCl4溶于100mL超纯水中，0.22μm滤器过滤，锡纸包 裹，4℃避光保存。
柠檬酸三钠溶液：柠檬酸三钠粉末1g，加入超纯水至100mL，溶解后用 0.22μm滤器过滤，分装4℃保存备用。
BSA溶液：按照百分比称取适量BSA粉末，加入100mLpH＝7.4的磷酸盐 缓冲液，充分溶解，静置。4℃保存备用，但只适合短时间保存。最好适量配置， 现用现配。
免疫金胶复溶液：
A.含1％BSA(w/v)，5w/v％蔗糖，0.5％吐温-20(v/v)的0.01M pH＝7.4 的PBS溶液；
B.含0.1％BSA(w/v)，2％蔗糖(w/v)，0.5％吐温-20(v/v)的0.06M pH＝8.5 的Tris溶液。
金胶结合垫处理液：
A.含吐温0.2％的吐温-20(v/v)，5％蔗糖(w/v)，0.2％PEG-20000(w/v)， 1％BSA(w/v)的0.01M pH＝7.4的PBS溶液；
B.含吐温0.1％的吐温-20(v/v)，2.5％蔗糖(w/v)，0.1％PEG-20000(w/v)， 0.5％BSA(w/v)的0.01M pH＝7.4的PBS溶液。
鼠抗人IgM的准备：将鼠抗人IgM：A(货号：JYAB35，上海杰一生物技 术有限公司)和鼠抗人IgM：B(货号：JYAB38，上海杰一生物技术有限公司) 透析过夜后按照质量比1:1混合，调整浓度至3mg/ml，离心除去蛋白聚合物。 每次实验前现配现用，不可长期保存及反复冻融，实验过程中置于冰水浴中存放。
SARS-CoV-2-NP的准备：将SARS-CoV-2-NP透析过夜后调整浓度至 1.2mg/ml，离心除去蛋白聚合物。每次实验前现配现用，不可长期保存及反复冻 融，实验过程中置于冰水浴中存放。
2、胶体金免疫层析试纸条的制备和组装
2.1胶体金纳米颗粒水溶液的制备
1)玻璃器皿的清洁及硅化
首先将玻璃器皿于浓H2SO4中浸泡24h，冲洗10次洗净残留的浓H2SO4， 再用洗涤剂刷洗玻璃器皿，自来水冲洗10次，去离子水反复清洗5次，超纯水 冲洗3-4次，烘箱干燥后硅化。取适量的硅化液(含有5％(w/v)二甲基二氯硅 烷的氯仿溶液)于玻璃器皿中，然后缓慢转动玻璃器皿，使玻璃器皿内壁都能被 硅化液浸润过。
2)胶体金纳米颗粒的制备
使用柠檬酸三钠还原法制备粒径为30nm的金纳米颗粒。该方法由Frene在 1973年建立，在100mL超纯水中加入1mL 1％HAuCl4，加热至沸腾，再加入1.5ml 1％柠檬酸三钠溶液，继续加热约10分钟至溶液变为酒红色(整个过程中需要机 械搅拌并加热至溶液沸腾)，10分钟后，用水冷却至室温，再用容量瓶定容到100ml。用0.22μm滤器过滤除菌，4℃避光保存。
2.2胶体金纳米颗粒水溶液的质量鉴定
将胶体金溶液做适当倍数稀释，将铜网在稀释后的胶体金溶液轻轻沾取，置 于滤纸上自然干燥，用透射电镜检测胶体金颗粒质量。
结果如图3所示，在透射电镜下观察胶体金颗粒的大小、形态均一，颗粒形 状为圆形，无杂质或金颗粒聚集现象，说明胶体金溶液达到标准，可以用于标记 抗体。
2.3胶体金免疫复合物的制备及鉴定
1)免疫金胶最适pH的测定
取200μL上述胶体金纳米颗粒水溶液分装于清洁的玻璃瓶中，分别加入不 同体积的0.1M的K2CO3溶液，调节胶体金溶液pH值，并使用精密pH试纸进 行测试。同时设立对照组。每个玻璃瓶管中继续加入6μg鼠抗人IgMμ链，充分 混匀后室温静置10min。每管加入45μL10％NaCl溶液，充分混匀后，静置2h， 观察结果。
结果如图4所示，其中，对照组(AuNPs)的pH值为6.2，实验组(AuNPs+K2CO3+ 鼠抗人IgMμ链)2-9号的pH值分别为6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10，从图中 可以看出，反应体系的pH值对胶体金与待标记抗体的偶联效率有很大影响，一 般情况下，选取比待标记抗体等电点略高的pH较为适宜。在此条件下，免疫金 胶最为稳定，可以承受较高的离子浓度，如NaCl等，而不会发生聚沉。综上， 选取EP管颜色仍然保持红色且数值最低的pH为胶体金标记抗体最适pH值，即 pH为8.0左右。
2)最适鼠抗人IgMμ链标记量的测定
取200μL上述胶体金纳米颗粒水溶液分装于清洁的玻璃瓶中，用0.1M的 K2CO3溶液调节至上述最适pH，同时设立对照组。每个玻璃瓶中继续分别加入 0μL、0.25μL、0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL(相应的抗体量为0μg，0.75μg， 1.5μg，3.0μg，4.5μg，6.0μg，7.5μg)的鼠抗人IgMμ链，充分混匀后室温静置 10min。每管加入45μL 10％NaCl溶液，充分混匀后，静置2h，观察结果。结果 判定标准为：加入蛋白量达到或超过胶体金最低稳定量时，EP管颜色保持红色 不变；否则由于抗体量过少，在高浓度电解质，如NaCl等的环境下胶体金发生 聚沉，而使溶液呈现蓝紫色。
结果如图5所示，鼠抗人IgM加入量为1.5μg时，胶体金颜色未发现明显颜 色变化，考虑实验过程中所需抗体量应略大于最适标记抗体量，因而实验过程中 加入抗体量扩大至上述数值的1.2倍，即1.8μg。
3)胶体金标记鼠抗人IgMμ链
将胶体金纳米颗粒水溶液调节至最适pH，缓慢均匀加入鼠抗人IgMμ链， 20℃150r/min，摇床震荡20min后，室温静置10min。加入Tris-HCl缓冲液配 置的5％BSA(w/v)溶液至BSA的终浓度为0.5％，从而达到降低非特异性凝聚 的作用。继续20℃150r/min，摇床震荡20min后，室温静置10min。将反应混 合溶液2000r/min 4℃离心10min，将上清转移至新离心管中，弃去沉淀，继续 13200r/min 4℃离心20min，弃去上清，用前面所述复溶液重新溶解沉淀并浓缩 至原体积的1/4。4℃避光保存备用。
4)不同IgM抗体不同比例协同作用效果的选择及优化
单独使用鼠抗人IgM：A、鼠抗人IgM：B及两者不同比例混合，与胶体金 偶联并制备试纸条，并比较试纸条的检测效果。
结果如表1所示，综合T线和C线的显色效果，当IgM：A和IgM：B的比 例为1:1时，检测呈现协同作用，因此选择IgM：A和IgM：B的混合抗体进行 试纸条的制备。
表1不同IgM抗体的检测效果
Figure BDA0002429735810000101
5)免疫金胶复溶液的选择及优化
配制两种不同成分的免疫金胶复溶液A和B，观察胶体金偶联抗人IgM的 反应体系离心去除上清后的溶解情况。
结果如图6所示，复溶液A溶解后出现挂壁，难以重新充分溶解，含有Tris 的复溶液B对于沉淀的重新溶解效果更好，因此选择复溶液B。
6)硝酸纤维素膜封闭液的选择及优化
将划好检测T线和质控C线的硝酸纤维素膜分别用0.5％、1.0％和2.0％BSA 的磷酸盐缓冲液封闭2h，用PBST缓冲液洗涤硝酸纤维素膜5次，干燥备用。 组装成试纸条后，用阳性样品进行检测。通过层析速度、液体爬行是否均匀、层 析完成后硝酸纤维素膜的背景是否干净以及检测条带是否清晰等指标，选择最佳 封闭液的成分。
结果如图7所示，三种不同浓度的BSA作为封闭液时样品的层析时间分别 为8min，10min和15min，1％BSA的封闭液对于非特异性结合的消除效果强于 0.5％的BSA，同时显色条带的颜色深于2％的BSA，故选择1％BSA的磷酸盐缓 冲液作为硝酸纤维素膜封闭液。
7)金胶结合垫处理液的选择及优化
配制不同成分的金胶结合垫处理液，将结合垫均匀平整地浸泡在不同成分的 处理液中，室温静置30min后，37℃烘箱放置12h。彻底干燥后均匀滴加制备得 到的免疫金胶，继续37℃烘箱放置1.5h，彻底干燥后备用。在处理前后的结合 垫上分别加样100μL，观察不同结合垫对于免疫金胶的结合及释放效果。
结果如图8所示，结合垫处理液B效果更好，金标抗体的结合与释放都更 加均匀和彻底。
8)检测T线和质控C线包被浓度的选择及优化
胶体金免疫层析试纸条质控C线包被的是羊抗鼠IgG，为了确定最适浓度， 将其梯度稀释为2.0mg/mL，1.5mg/mL，1.0mg/mL和0.5mg/mL；检测T线包 被的是SARS-CoV-2-NP，将其稀释至1.2mg/mL，0.6mg/mL和0.3mg/mL。根 据加样层析后，T线和C线的着色情况，确定包被浓度。
质控C线的着色情况如图9所示，随着羊抗鼠IgG浓度的增加，质控C线 的条带越来越深，综合考虑观察结果的清晰度以及试纸条的长期保存和温度环境 等因素干扰，选择2.0mg/mL作为质控C线上羊抗鼠IgG的浓度。
检测线T的着色情况如图10所示，随着SARS-CoV-2-NP浓度的增加，检 测T线的条带越来越明显，综合考虑环境、样品、保存时间等多种因素，故选择 1.2mg/mL作为检测T线的包被浓度。
9)胶体金免疫层析试纸条的组装
将按照上述步骤处理过的各类固相材料(粘性底衬、硝酸纤维素膜(分析膜)、 样品垫、结合垫和吸水垫)按照下述次序相互重叠地粘成一体。硝酸纤维素膜(分 析膜)固定于粘性底衬托中部区域，质控C线在上，检测T线在下。处理过的 结合垫的上端压于硝酸纤维素膜(分析膜)下端，重叠1mm。处理过的样品垫 上端压于结合垫的下端，重叠2mm。吸水垫粘于粘性底衬上，上端与粘性底衬 平齐，下端压于硝酸纤维素膜(分析膜)的上端，重叠2mm；装配成形的条带 用斩切式切条机剪切成4mm宽的试纸条。制备成型的试纸条于放置于密封袋抽 真空在干燥的环境中保存备用。免疫层析试纸条组装效果如图11所示。
10)试纸条测试方法及结果判定标准
用移液枪或者一次性滴管吸取待测血清样本20μL于检测卡上样本孔内，立 即在样本孔内滴加2-3滴(约70-100μL)样本稀释液，并保证过程中没有气泡产 生。10min后判读结果。
阴性结果：仅出现质控线C，检测线T不显色，说明没有检测到SARS-CoV-2 -IgM，结果为SARS-CoV-2-IgM阴性。
阳性结果：质控线C和检测线T都出现，说明检测到SARS-CoV-2-IgM，结 果为SARS-CoV-2-IgM阳性。
无效结果：质控线C未出现，无论检测线是否出现，均为无效结果。
2.4胶体金免疫层析试纸条性能的测试
1)胶体金免疫层析试纸条特异性试验
分别用一份新型冠状病毒(SARS-CoV-2)阳性血清，两份新布尼亚病毒 (SFTSV)阳性血清，两份登革热病毒(DFV)阳性血清和一份健康人血清进行 检测。
结果如图12所示，只有SARS-CoV-2阳性血清为阳性结果，其余均为阴性 结果，表明该胶体金免疫层析试纸条特异性良好。
2)胶体金免疫层析试纸条重复性试验
使用不同批次的试纸条对SARS-CoV-2阳性血清和健康人血清同时检测进 行批次间重复检测。使用同一批次的试纸条对SARS-CoV-2阳性血清和健康人血 清在不同的时间点进行批次内重复检测。
结果如图13和图14所示，不同批次间以及相同批次内不同时间点的试纸条 具有较好的重复性。
3)临床血清样品检测
收集新型冠状病毒阳性及阴性血清共计19份(阳性判断标准为咽拭子经 PCR检测确诊阳性)，用所述胶体金免疫层析试纸条进行检测。
结果如图15和表2所示，显示该胶体金免疫层析试纸条的检测结果与PCR 结果相比，灵敏度100％，特异度93.3％，Kappa系数0.872，约登系数为0.933， 阳性预测值0.833，阴性预测值100％，符合率较高。
表2临床样品的检测结果比较
Figure BDA0002429735810000131
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对 于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明 进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院)
<120> 一种检测新型冠状病毒抗体的试纸条及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly
165 170 175
<210> 2
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala
20 25 30
Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys
35 40 45
Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys
50 55 60
Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr
65 70 75 80
Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln
85 90 95
Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp
100 105 110
Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala
115 120 125
Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr
130 135 140
Trp Leu Thr Tyr Thr Ala Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn
145 150 155 160
Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys
165 170 175
Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp
180 185 190
Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr
195 200 205
Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln
210 215 220
Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala
225 230
<210> 3
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Ala Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala

Claims (42)

1.一种检测SARS-CoV-2抗体的抗原，其特征在于，所述抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种检测SARS-CoV-2病毒感染/抗SARS-CoV-2病毒的抗体的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的抗原；所述产品包括免疫层析试纸条， 所述免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、分析膜、吸水滤纸和底板，其中结合垫上附着有标记物标记的SARS-CoV-2病毒抗体的特异性结合蛋白，所述特异性结合蛋白为抗IgM抗体，所述分析膜上设有检测线T和质控线C，所述检测线T包被权利要求1所述的抗原；质控线C包被抗IgG抗体。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚酯纤维膜或无纺布。
4.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述结合垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。
5.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述标记物为胶体金。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述胶体金纳米颗粒直径为30nm。
7.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，制备胶体金的pH为7~10。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述 pH为8。
9.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述抗IgM抗体为鼠抗人IgM。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述鼠抗人IgM的标记量为0.75μg~7.5μg。
11.根据权利要求10所述的产品，其特征在于，所述鼠抗人IgM的标记量为1.8μg。
12.根据权利要求11所述的产品，其特征在于，所述分析膜为硝酸纤维素膜；所述底板为PVC底板。
13.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述质控线C包被羊抗鼠IgG。
14.根据权利13所述的产品，其特征在于，所述质控线C中羊抗鼠IgG的包被浓度为1.0mg/mL~2.0 mg/mL。
15.根据权利要求14所述的产品，其特征在于，所述质控线C中羊抗鼠IgG的包被浓度为2.0mg/mL。
16.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述检测线T的抗原包被浓度为0.6~1.2mg/ml。
17.根据权利要求16所述的产品，其特征在于，所述检测线T的抗原包被浓度为1.2mg/mL。
18.根据权利要求17所述的产品，其特征在于，所述抗IgM抗体为不同的抗IgM抗体的混合抗体。
19.根据权利要求18所述的产品，其特征在于，所述混合抗体为IgM：A和IgM：B，混合质量比例为1:1。
20.一种检测SARS-CoV-2病毒感染/抗SARS-CoV-2病毒的抗体的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备免疫金胶结合垫
用氯化金溶液和柠檬酸三钠溶液制备胶体金溶液，碳酸钾调节胶体金溶液的pH，依次加入待标记的特异性结合蛋白、BSA溶液，离心得到沉淀，金胶复溶液重悬沉淀得到免疫金胶复合物溶液，将溶液滴涂经结合垫处理液处理的结合垫上；
（2）制备分析膜
用包被缓冲液稀释权利要求1所述的抗原划线得到检测线T，用包被缓冲液稀释抗IgG抗体划线作为质控线C，使用BSA的磷酸盐缓冲液封闭；
（3）试纸条的组装
在黏性底板上依次黏贴样品垫、结合垫、分析膜和吸水纸，裁剪成合适的宽度的试纸条。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中的pH为7~10。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述pH为8。
23.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述特异性结合蛋白为抗IgM抗体。
24.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述抗IgM抗体为鼠抗人IgM。
25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，所述鼠抗人IgM的标记量为0.75μg~7.5μg。
26.根据权利要求25所述的制备方法，其特征在于，所述标记量为1.8μg。
27.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，所述抗IgM抗体为不同的抗IgM抗体的混合抗体。
28.根据权利要求27所述的制备方法，其特征在于，所述混合抗体为IgM：A和IgM：B，混合质量比例为1:1。
29.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述金胶复溶液为0.1% BSA（w/v），2 %蔗糖（w/v），0.5%吐温-20（v/v）的Tris溶液。
30.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述结合垫处理液为0.1%吐温-20（v/v），2.5%蔗糖（w/v），0.1%PEG-20000（w/v），0.5 %BSA（w/v）的PBS溶液。
31.根据权利要求30所述的制备方法，其特征在于，所述结合垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。
32.根据权利要求31所述的制备方法，其特征在于，所述结合垫为玻璃纤维膜。
33.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中质控线C包被羊抗鼠IgG。
34.根据权利要求33所述的制备方法，其特征在于，所述质控线C中羊抗鼠IgG的包被浓度为1.0 mg/mL~2.0 mg/mL。
35.根据权利要求34所述的制备方法，其特征在于，所述质控线C中羊抗鼠IgG的包被浓度为2.0mg/mL。
36.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述检测线T的抗原包被浓度为0.6~1.2mg/mL。
37.根据权利要求36所述的制备方法，其特征在于，所述检测线T的抗原包被浓度为1.2mg/mL。
38.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述BSA的磷酸盐缓冲液的BSA浓度为0.5~2%。
39.根据权利要求38所述的制备方法，其特征在于， 所述BSA浓度为1%。
40.一种检测SARS-CoV-2病毒感染/抗SARS-CoV-2病毒的抗体的检测卡的制备方法，其特征在于，将采用权利要求20-39任一项所述的制备方法制备的试纸条置入塑料外壳中，其中，塑料外壳的加样孔在样品垫上方，塑料外壳的观察窗在检测线和质控线上方。
41.一种检测SARS-CoV-2病毒感染/抗SARS-CoV-2病毒的抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于，将采用权利要求40所述的制备方法制备的检测卡装入铝箔袋，与采样管、样本稀释液、说明书装盒。
42.如下任一项所述的应用：
1）权利要求2-19任一项所述的产品在制备检测SARS-CoV-2病毒感染/抗SARS-CoV-2病毒的抗体/评价针对SARS-CoV-2的疫苗接种效果的工具中的应用；
2）权利要求20-39任一项所述的制备方法在制备评价针对SARS-CoV-2的疫苗接种效果的试纸条中的应用；
3）权利要求40所述的制备方法在制备检测评价针对SARS-CoV-2的疫苗接种效果的检测卡中的应用；
4）权利要求41所述的制备方法在制备评价针对SARS-CoV-2的疫苗接种效果的试剂盒中的应用。
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