CN105277693A - 人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡及其制备方法和应用 - Google Patents
人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105277693A CN105277693A CN201410405742.2A CN201410405742A CN105277693A CN 105277693 A CN105277693 A CN 105277693A CN 201410405742 A CN201410405742 A CN 201410405742A CN 105277693 A CN105277693 A CN 105277693A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- quantum dot
- restructuring
- pad
- detection
- human parainfluenza
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 162
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 113
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 title claims abstract description 109
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 title claims abstract description 106
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 title abstract description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims abstract description 41
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims abstract description 41
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 11
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 107
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 97
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 51
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 51
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 44
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 36
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 36
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 27
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 claims description 24
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 22
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 22
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 22
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 22
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 22
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 22
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 22
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 20
- 206010013786 Dry skin Diseases 0.000 claims description 18
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 18
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 18
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 238000007667 floating Methods 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 12
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 10
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 claims description 10
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims description 9
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 8
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 8
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 7
- 229920004934 Dacron® Polymers 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 claims description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 6
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 5
- UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+);selenium(2-) Chemical compound [Se-2].[Cd+2] UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 5
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 5
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 4
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 claims description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 4
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 4
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 claims description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxybutanediamide Chemical compound NC(=O)CCC(=O)NO HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 abstract 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 58
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 4
- RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M sodium;1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].ON1C(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C1=O RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 3
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000003667 anti-reflective effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 2
- 230000001894 hemadsorption Effects 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 208000034657 Convalescence Diseases 0.000 description 1
- 206010011416 Croup infectious Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 1
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004820 Pressure-sensitive adhesive Substances 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 201000010549 croup Diseases 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004370 retrospective diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供了一种人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡及其制备方法和应用，该检测卡包括底板、样品垫、吸水垫、结合垫和检测层；结合垫包被有量子点分别标记的兔抗I型、II型以及III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗体的混合物；检测层是由带有三条检测线以及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；三条检测线分别包被有鼠抗I型、II型以及III型人副流感病毒多克隆抗体；质控线包被有抗兔IgG；检测层粘贴在底板上；结合垫和吸水垫分别设置在检测层两端部上方且与检测层部分重叠后分别与检测层和底板粘贴；样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴。本发明具有操作简便、检测快速、可定量及高灵敏度等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡及其制备方法和应用。
背景技术
人副流感病毒(humanparainfluenzavirus，HPIV)是儿童急性呼吸道感染的重要病原体，主要经飞沫传染，亦可通过眼、口或鼻的粘膜接触进行传播，发病率以婴幼儿最高。HPIV感染呈全球性分布，是常见的社区获得性呼吸道感染的病原，HPIV感染在小儿儿童急性呼吸道感染的发生率高达30-40％，其是导致小儿下呼吸道严重感染的、仅次于呼吸道合胞病毒的病原体。该病原体首先发现于上世纪50年代末，原名仙台病毒，最初从日本仙台市一例死于肺炎的患儿肺液中分离出来。根据遗传学和血清学人副流感病毒可分为4型，其中1-3型在临床中最为常见，每种亚型主要的结构和生物学特征相似，但流行病学和所引发疾病的临床特征有差异。人副流感病毒1型以及2型所导致的相关疾病主要有义膜性喉炎、上呼吸道和下呼吸道感染；人副流感病毒3型主要导致细支气管炎及肺炎；人副流感病毒4型在临床上不多见，一般仅导致轻微感染。
临床病人由于不同的呼吸道病原体(如人副流感病毒、流感嗜血杆菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等)感染引起疾病症状可以十分相似，这导致了流行诊断比较困难，确诊往往依赖于实验室诊断。快速及有效的诊断方法应该是在疾病的发病初期就可以得到明确的诊断，便于实施针对性的治疗，阻止病情的发展迁延。
尽管人副流感病毒在全球范围内传播，婴幼儿的感染尤其普遍，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种类极少。目前，人副流感病毒的检测主要有以下几种方法：
1、常规实验室检测
1.1)病毒分离
实验室诊断人副流感病毒的金标准是分离人副流感病毒毒株。采用鼻咽分泌物作为病毒分离的标本，可以用LCC-MK2细胞培养的方法分离病毒。但是该方法费时费力，通常需要一周才能得到最终结果，在临床方面对病人的治疗就有一定的局限性。
1.2)血清学检测
即采用酶联免疫法、胶体金免疫法、微量免疫荧光法和间接血凝试验等，检测被检者血清中HPIV抗体水平，可间接提示HPIV感染的存在。然而，血清学试验只能提供一种回顾性的诊断，需要同时检测患者急性期和恢复期的双份血清，如果恢复期中抗人副流感病毒抗体效价比急性期高4倍或4倍以上才有诊断意义。另外，抗体出现的时机不易掌握，儿童、青少年与成人之间又存在HPIV特异性抗体的差异，并且，据报道患儿IgM的检出率大约只有50％，故现有血清学方法的检测质量受到一定限制。
2、快速诊断
直接检查人副流感病毒蛋白抗原和病毒核酸可达到快速诊断的目的，目前主要有免疫荧光法、免疫酶法和PCR法等。免疫荧光法和免疫酶法均不能进行一步检测，均存在操作步骤复杂，需要专业人员操作，检测时间长(2h以上)，成本较高等缺点。PCR法具有快速、灵敏以及特异的优点，是目前研究HPIV感染的重要手段，但由于PCR对实验设备以及操作要求较高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。因此，建立“一步法”HPIV特异性抗原快速分型诊断法十分必要。
发明内容
本发明针对背景技术中现存的几种人副流感病毒在检测方式中遇到的技术瓶颈，提出了一种具有操作简便、检测快速、可定量及高灵敏度等优点的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡及其制备方法和应用。
本发明的目的是通过以下技术手段来实现的：
一种人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡，其特征在于：所述人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有量子点分别标记的兔抗I型、II型以及III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗体的混合物；所述检测层是由带有第一检测线、第二检测线、第三检测线以及质控线的固相硝酸纤维素膜构成；所述第一检测线、第二检测线以及第三检测线分别包被有鼠抗I型、II型以及III型人副流感病毒多克隆抗体；所述质控线包被有抗兔IgG；所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起。
作为优选，本发明所采用的量子点是羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点。
作为优选，本发明所采用的抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。
作为优选，本发明所采用的所述检测层长4cm，所述检测层粘贴在长度是8.6-9.5cm的底板表面中间段；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2.5-3cm的吸水垫重叠0.2-0.4cm；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0.5-0.8cm的结合垫重叠0.2-0.4cm；所述结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2.5cm的样品垫重叠0.2—0.4cm；所述第一检测线、第二检测线、第三检测线以及质控线中相邻两线之间的间距均是0.5-0.8cm；所述底板的宽度是0.3-0.5cm。
作为优选，本发明所采用的吸水垫是吸水滤纸；所述底板是PVC板。
一种基于上述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
1)结合垫的制备：
1.1)重组HN1-His、HN2-His以及HN3-His融合蛋白的制备、纯化以及复性：
1.1.1)对I、II以及III型人副流感病毒HN蛋白进行生物信息学分析，分别获取I、II以及III型人副流感病毒HN蛋白的胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段；
1.1.2)找到步骤1.1.1)中所得到肽段对应的基因编码序列，根据大肠杆菌中密码子的偏好性，对步骤1.1.1)中所得到基因编码序列进行密码子优化；
1.1.3)在步骤1.1.2)中所得到的基因序列的5’端及3’端分别引入酶切位点并分别化学合成全基因序列，同时标记记为hn1、hn2以及hn3；其基因序列如序列表所示；
1.1.4)将步骤1.1.3)中所得到的hn1、hn2以及hn3按分子生物学方法分别克隆入表达载体pET-28a(+)后表达重组融合蛋白HN1-His、HN2-His及HN3-His；所述重组融合蛋白HN1-His、HN2-His及HN3-His均以包涵体形式存在于基因工程菌菌体内；
1.1.5)用镍柱分别纯化步骤1.1.4)所得到的包涵体蛋白，再分别对包涵体蛋白进行复性即得到所需重组蛋白；
1.2)重组HN1-His、HN2-His以及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备：
1.2.1)以步骤1.1.5)中所得到的复性的重组HN1-His、HN2-His以及HN3-His融合蛋白为完全抗原，免疫新西兰大白兔及豚鼠，分别制备兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清；所述兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于1×105；
1.2.2)采用用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG；
1.2.3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1.2.2)所得到的抗体浓度，同时将该浓度调整至2mg/mL后备用；
1.3)量子点分别标记的兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备与纯化：
1.3.1)向微量离心管中依次加入2nmol量子点、300nmolN-羟基琥珀酰亚胺和300nmol碳二亚胺，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，于旋转混合仪中，以15rpm/min，37℃反应30min后，透析去除过量的N-羟基琥珀酰亚胺以及碳二亚胺；所述磷酸盐缓冲液是由2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠配置而成，所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.3；
1.3.2)在活化的量子点中，加入4-8nmol的步骤1.2)所制备的兔抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入端氨基化聚乙二醇至终浓度为1.5％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；用0.2μmPES滤器过滤除去抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物；收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于1ml磷酸盐保存液中；
所述磷酸盐洗涤液是由2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、5ml/L吐温-20以及1g/L叠氮钠配置而成；所述磷酸盐洗涤液的pH＝7.3；所述磷酸盐保存液是由2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、10g/LBSA以及1g/L叠氮钠配置而成；所述磷酸盐保存液的pH＝7.3；
1.3.3)按照与步骤1.3.1)以及步骤1.3.2)相同的方法，分别利用步骤1.2)所制备的兔抗重组HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG分别制得量子点标记的兔抗重组HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG；
1.3.4)将量子点标记的兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG按体积比1：1：1混合后备用；
1.4)量子点标记抗体的负载：
将聚酯纤维膜浸入步骤1.3.4)所得到的量子点分别标记的兔抗重组HN1-His、HN2-His以及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合液中1h，取出，25℃干燥后4℃密封保存备用，至此制得结合垫；
2)样品垫的制备：
取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h以上，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，25℃密封干燥保存；至此制得样品垫；
所述样品垫处理液是由2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、20g/L牛血清白蛋白(BSA)、10ml/L吐温-20、20g/L蔗糖以及5g/L聚乙烯吡咯烷酮配置而成，所述样品垫处理液的pH＝7.3；
3)检测层的制备：
3.1)将步骤1)中制备的鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG和抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度为0.5-2.5mg/mL，所述磷酸盐缓冲液是由2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠配置而成，所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.3；
3.2)将稀释好的鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG分别装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5μl/cm的量按照一定间隔依次喷于硝酸纤维素膜上，形成第一检测线、第二检测线以及第三检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线；
3.3)将喷有第一检测线、第二检测线、第三检测线以及质控线的硝酸纤维素膜在37℃干燥2h，4℃密封干燥保存；至此制得检测层；
4)底板的制备
将PVC材质的底板按实际要求裁剪后备用；
5)吸水垫的制备
将吸水滤纸按实际要求裁剪后备用；
6)人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡的组装：
6.1)将步骤4)所制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉；
6.2)将步骤3)所制备得到的检测层粘贴到底板的中部区域，并抹平膜面；
6.3)将步骤5)所制备得到的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层有部分重叠，同时将其右边缘与底板的右边缘对齐粘好并抹平；
6.4)将步骤1)所制备得到的结合垫按部分重叠的方式重叠于硝酸纤维素膜的左边缘处，同时将结合垫粘于底板上；
6.5)将步骤2)所制备得到样品垫则按部分重叠的方式重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并抹平；
6.6)将组装好的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡进行裁剪，4℃密封干燥避光保存；
所述步骤6.1)至步骤6.6)均是在生物安全柜内进行操作。
作为优选，本发明所采用的步骤1.3.2)中加入6nmol的步骤1.2)所制备的兔抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG；
作为优选，本发明所采用的步骤3.1)中将步骤1)中制备的鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG和抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别是0.5-1.0mg/mL以及0.5-1.5mg/mL；
作为优选，本发明所采用的步骤3.2)中，将稀释好的鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG分别装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0-2.0μl/cm的量按照一定间隔依次喷于硝酸纤维素膜上，形成第一检测线、第二检测线以及第三检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0-2.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线。
一种基于上述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡作为非诊断性检测人副流感病毒的应用。
一种基于上述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡的非诊断性检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
1)将待检样品用500μl的样品处理液充分溶解后，取出120μL滴于检测卡的样品垫上，15分钟后于紫外灯下观察检测结果；所述样品处理液中各组分含量分别为磷酸氢二钠2.9g/L、磷酸二氢钠0.295g/L、Tritonx-10010mL/L以及氯化钠2g/L，所述样品处理液的pH＝7.3；
2)若待检样品中含有I型人副流感病毒抗原，则与结合垫中的量子点标记的兔抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下在第一检测线处会形成肉眼可见的一条荧光检测线，未结合完的量子点标记抗体继续层析与抗兔IgG结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的第二条荧光质控线；
若待检样品中有II型人副流感病毒抗原，则与结合垫中的量子点标记的兔抗重组HN2-His融合蛋白多克隆抗体IgG结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组HN2-His融合蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下在第二检测线处会形成肉眼可见的一条荧光检测线，未结合完的量子点标记抗体继续层析与抗兔IgG结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的第二条荧光质控线；
若待检样品中有III型人副流感病毒抗原，则与结合垫中的量子点标记的兔抗重组HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组HN3-His融合蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下在第三检测线处会形成肉眼可见的一条荧光检测线，未结合完的荧光标记抗体继续层析与抗兔IgG结合形成肉眼可见的第二条荧光质控线；
若待检样品中无I型人副流感病毒抗原、II型人副流感病毒抗原以及III型人副流感病毒抗原，则仅出现一条荧光质控线；若荧光质控线未出现，则该检测卡失效。
作为优选，本发明所采用的待检样品是包括但不限于咽拭子。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明的检测人副流感病毒抗原的方法是将免疫层析与量子点标记技术综合起来，利用本发明制备的高效价、高特异性多克隆抗体，通过激发荧光来对样品进行检测，具有灵敏度高的特点，其对I、II、III型人副流感病毒的检测底线分别为5ng/mL，5ng/mL及3ng/mL。
2、本发明所用的抗体均是识别人副流感病毒HN抗原胞外保守区的多克隆抗体，其特异性高，同时其较目前最广泛使用的单克隆抗体而言制备成本低廉，因此，本发明检测成本较低。
3、本发明检测方法简单，检测快速，易于判定，结果判定在20分钟内完成，既可以用紫外检测仪进行定性检测，亦可结合CCD扫描等技术进行定量检测，检测成本低廉，克服了现有技术(如ELISA)检测成本高、操作复杂繁琐、耗时长、且必需专业人员才能操作的不足。
4、由于检测卡检测的是人副流感病毒抗原而非抗体(抗体的出现需要感染几天至几周以后)，且本检测卡可以三型病毒共检，故该方法在人副流感病毒的早期临床诊断和防治、病原体亚型鉴别、流行病学调查等方面具有很高的实用价值。
5、本发明检测方法所用的临床样本为呼吸道分泌物如痰液等，而非血液，可免除婴幼儿患者抽血检查的痛苦与家长的心理负担，故较易于推广。
附图说明
图1是本发明所提供检测卡的纵向剖面结构示意图；
图2是本发明所提供检测卡的在完成组装后的结构示意图；
其中：
1-样品垫；2-结合垫；3-检测层；4-检测线；5-检测线；6-检测线；7-质控线；8-吸水垫；9-底板。
具体实施方式
本发明的工作原理是：本发明是在免疫层析测定法(双抗体夹心)的前提下，以多克隆抗体为基础，采用量子点标记探针技术，通过量子点标记技术研制分型检测人副流感病毒抗原的量子点免疫层析检测卡。首先是兔抗I、II、III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗体和鼠抗I、II、III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗体的制备、纯化以及量子点标记，其次为喷膜，然后将检测卡各组成成分进行组装，最后制备分型检测人副流感病毒的检测卡。本发明所提供的检测卡具有敏感、快速和特异性好等特点，并且可定量分型检测，能进行样品的高通量筛查，具有较好的市场应用前景。
如附图1所示，本发明所提供了一种人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡，包括样品垫1、结合垫2、检测层3、吸水垫8及底板9组成。结合垫2上包被有量子点分别标记的兔抗I、II、III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗体的混合物；检测层3是喷有检测线4、检测线5、检测线6以及质控线7的固相硝酸纤维素膜简称NC膜；检测线4、检测线5以及检测线6分别包被有鼠抗I型、II型以及III型人副流感病毒多克隆抗体；质控线7包被有抗兔IgG；量子点为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点；吸水垫8材质为吸水滤纸；底板9材质为PVC。
其具体结构是：检测层长4cm，检测层粘贴在长度是8.6-9.5cm的底板表面中间段；检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2.5-3cm的吸水垫重叠0.2-0.4cm；检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0.5-0.8cm的结合垫重叠0.2-0.4cm；结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2.5cm的样品垫重叠0.2—0.4cm；检测线4、检测线5、检测线6以及质控线7间距均是0.5-0.8cm；底板的宽度是0.3-0.5cm。
其中，上述参数优选方案是：检测层3长4cm，粘贴在底板9长9.3cm表面中间段，此检测层右端与粘贴在底板9右末端的吸水垫8长3cm重叠0.2cm，其另一端与结合垫2长0.6cm重叠0.3cm；结合垫2则与粘贴在底板9左端的样品垫(1)长2.5cm重叠0.3cm；检测层3上的检测线4、5、6及质控线7间距0.7cm。整条检测卡的宽度为0.4cm。
制备上述分型检测人副流感病毒抗原的量子点免疫层析检测卡的方法，其主要步骤包括：
一、结合垫的制备
(1)重组HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白的制备、纯化与复性
对I、II、III型人副流感病毒HN蛋白进行生物信息学分析，分别获取其胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到其对应的基因编码序列，再根据大肠杆菌中密码子的偏好性，对其进行密码子优化后，在其序列5’及3’端分别引入酶切位点后分别化学合成全基因序列，记为hn1,hn2,hn3。其基因序列分别参见序列表。将该三段基因序列按常规方法分别克隆入表达载体pET-28a(+)后表达重组融合蛋白HN1-His、HN2-His及HN3-His。此三种重组蛋白在大肠杆菌中均以包涵体形式存在。用镍柱分别纯化包涵体蛋白，再分别对包涵体蛋白进行复性即得到所需重组蛋白。
(2)重组HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备
以复性的重组蛋白为完全抗原，按常规方法免疫新西兰大白兔及豚鼠，分别制备兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清。该六种抗血清的间接ELISA效价均大于1×105，用ProteinG亲和层析柱分别纯化六种抗血清中的多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并均调整为3mg/mL后备用。其中兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG用作量子点标记试验；鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG用作检测线的包被。
(3)量子点分别标记的兔抗重组HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备与纯化
其操作步骤如下：向微量离心管中依次加入2nmol量子点、300nmolN-羟基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)和300nmol碳二亚胺(EDC)，以磷酸盐缓冲液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠,2g/L氯化钠，pH7.3)定容为2ml，于旋转混合仪中，以15rpm/min，37℃反应30min后，透析去除过量的活化剂(sulfo-NHS与EDC)。在活化的量子点中，加入4-8nmol(优选为6nmol)的步骤(2)所制备的兔抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入端氨基化聚乙二醇(PEG2000-NH2)至终浓度为1.5％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h。用0.2μmPES滤器过滤除去抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物。收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠,2g/L氯化钠，5ml/L吐温-20，1g/L叠氮钠，pH7.3)中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于1ml磷酸盐保存液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠,2g/L氯化钠，10g/LBSA，1g/L叠氮钠，pH7.3)中。
按照上述相同方法，分别用步骤(2)所制备的兔抗重组HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG制得量子点标记的兔抗重组HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG。将三种量子点标记的抗体按体积比1：1：1混合后备用。
(4)量子点标记抗体的负载
将聚酯纤维膜浸入步骤(3)所得到的量子点分别标记的兔抗重组HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合液中1h，取出，25℃干燥后裁成4cm*0.6cm的规格后4℃密封保存备用，至此制得结合垫。
二、样品垫的制备
取玻璃纤维素膜一张，将其在样品垫处理液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠,2g/L氯化钠,20g/L牛血清白蛋白(BSA),10ml/L吐温-20，20g/L蔗糖，5g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP-10)，pH7.3)中浸泡至少3h以上，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，剪裁成4cm*2.5cm的规格，25℃密封干燥保存。至此制得样品垫。经试验证实玻璃纤维素膜经该种方法处理后，显著地提高了量子点标记抗体的释放率。
三、检测层的制备
检测层的制备，是通过分别将由步骤一中所制备的鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG和抗兔IgG用专用的喷膜机在硝酸纤维素膜上形成检测线和控制线；其具体制备方法包括如下步骤：
分别将上述步骤一中制备的鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG和抗兔IgG用磷酸盐缓冲液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠,2g/L氯化钠，pH7.3)调整至终浓度为0.5-2.5mg/mL，其中鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG优选的稀释终浓度为0.5-1.0mg/mL，抗兔IgG优选的稀释终浓度为0.5-1.5mg/mL。将稀释好的鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG分别装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5μl/cm，优选为1.0-2.0μl/cm的量按照0.7cm的间隔依次喷于硝酸纤维素膜上，形成三条检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5μl/cm，优选为1.0-2.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，其与最近的一条检测线间距亦为0.7cm。将喷好的硝酸纤维素膜37℃干燥2h，剪裁成4cm*4cm的规格，4℃密封干燥保存。至此制得检测层。
四、底板的加工
将PVC材质的底板裁剪成4cm*9.3cm的规格后备用。
五、吸水垫的制备
将吸水滤纸裁剪成4cm*3cm的规格，即制成吸水垫，备用。
六、检测卡的组装
组装工作于生物安全柜内操作，首先将步骤四所述的底板上的粘性保护膜揭掉，将上文步骤三所述的检测层(即带有1条质控线和3条检测线的硝酸纤维素膜)粘贴到底板的中部区域，并小心抹平膜面。其次，将上文步骤五所述的吸水垫组装到底板上，使其左边与检测层有0.2cm的重叠，同时将其右边缘与底板的右边缘对齐粘好并小心抹平。再将上文步骤一所述的结合垫按0.3cm重叠于硝酸纤维素膜的左边缘处，0.3cm粘于底板上。最后将上文步骤二所述的样品垫则按一边0.3cm重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并小心抹平。将组装好的检测板于切条机下裁成4.0mm宽的检测卡，4℃密封干燥避光保存。至此制得能分型检测人副流感病毒抗原的量子点免疫层析检测卡。
上述分型检测人副流感病毒抗原的量子点免疫层析检测卡的使用方法，步骤如下：
将待检样品(如咽拭子等)用500μl的样品处理液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠,10mL/LTritonx-100，2g/L氯化钠，pH7.3)充分溶解后，取出120μL滴于检测卡的样品垫上，15分钟后于紫外灯下观察检测结果。若样品中含有I型人副流感病毒抗原，则与结合垫中的量子点标记的兔抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的荧光检测线1，未结合完的量子点标记抗体继续层析与抗兔IgG结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的第二条荧光质控线；若样品中有II型人副流感病毒抗原，则与结合垫中的相应的量子点标记抗体结合后，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组HN2-His融合蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的荧光检测线2，未结合完的量子点标记抗体继续层析与抗兔IgG结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的第二条荧光质控线；若样品中有III型人副流感病毒抗原，则亦与结合垫中相应的量子点标记抗体结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组HN3-His融合蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的荧光检测线3，未结合完的荧光标记抗体继续层析与抗兔IgG结合形成肉眼可见的第二条荧光质控线；若样品中无相关抗原，则仅出现一条荧光质控线。如果荧光质控线未出现，则该检测卡失效。
本发明所需的羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点可到例如武汉珈源量子点技术开发有限公司等专业性公司购买；所需的PVC材质底板、吸水滤纸、硝酸纤维素膜、聚酯纤维膜、玻璃纤维素膜等可到Millipore及上海金标生物科技有限公司等专业性公司购买，所需的其他常规仪器、设备、生化药品均有市售。
本发明通过以下实施例作进一步具体描述。
本发明使用或采用的各种材料的来源及相关试剂的配制
1、样品垫处理液：称取0.29g磷酸氢二钠，0.0295g磷酸二氢钠，0.2g氯化钠，2g牛血清白蛋白(BSA)，1ml吐温-20，2g蔗糖，0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-10)，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml。
2、磷酸盐洗涤液：称取0.29g磷酸氢二钠，0.0295g磷酸二氢钠,0.2g氯化钠，0.5ml吐温-20，0.1g叠氮化钠，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml。
3、磷酸盐保存液：称取0.29g磷酸氢二钠，0.0295g磷酸二氢钠,0.2g氯化钠，1g牛血清白蛋白(BSA)，0.1gNaN3，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml。
4、磷酸盐缓冲液(PBS)：称取0.29g磷酸氢二钠，0.0295g磷酸二氢钠,0.2g氯化钠，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml。
5、兔抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG：为本发明自制，用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体浓度为2mg/ml。
6、兔抗重组HN2-His融合蛋白多克隆抗体IgG：为本发明自制，用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体浓度为2mg/ml。
7、兔抗重组HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG：为本发明自制，用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体浓度为2mg/ml。
8、鼠抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG：为本发明自制，用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体浓度为1mg/ml。
9、鼠抗重组HN2-His融合蛋白多克隆抗体IgG：为本发明自制，用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体浓度为1mg/ml。
10、鼠抗重组HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG：为本发明自制，用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体浓度为1mg/ml。
11、羊抗兔IgG：为博士德公司产品，用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体浓度为1mg/ml。
12、量子点：本发明中所用量子点为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点，其发射波长为565nm，购买自武汉珈源量子点技术开发有限公司，产品名称为羧基水溶性量子点-565。
13、玻璃纤维素膜：厚度为0.4mm，吸水量为42mg/cm2，玻璃纤维直径为0.6-3μm，具有良好的亲水性，购买于上海金标生物科技有限公司(型号为BT40)。
14、聚酯纤维膜：厚度为0.48mm，吸水速度为18s/4cm，具有极好的亲水性，用于结合垫的制备，购买于上海金标生物科技有限公司(型号为DL42)。
15、硝酸纤维素膜：型号为MilliporeCorpSHF135，有衬板，购买于Millipore公司。
16、吸水滤纸：厚度为0.95mm，吸水速度为60s/4cm，吸水量为700mg/cm2，具有良好的吸水性，作为制作吸水垫的材料。购买于上海金标生物科技有限公司(型号为CH37K)。
17、底板：为高白度PVC材质，表面涂布单层高聚合物压敏胶SM31，购买于上海金标生物科技有限公司。
18、I型人副流感病毒：为ATCC标准株C35，购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCCVR-94。
19、II型人副流感病毒：为ATCC标准株Greer,购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCCVR-92。
20、III型人副流感病毒：为ATCC标准株C243,购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCCVR-93。
21、本发明所用到的微生物样品均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
下面结合实施例对本发明所提供的技术方案进行详细说明：
实施例1(制备实施例)
结合垫的制备
(一)重组HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白的制备、纯化与复性
(1)相关基因的克隆
对I、II、III型人副流感病毒HN蛋白(其NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber分别为AAC23946.1、BAA00739.1及ACF28540.1)进行生物信息学分析，分别获取其胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到其对应的DNA编码序列，再根据大肠杆菌密码子偏好性，对其进行密码子优化，同时在其5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点XhoI后分别化学合成全基因序列(全序列合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交货时人工合成的基因片段均分别连于载体pUC57上)，记为hn1,hn2,hn3。其基因全序列如序列表所示。其中，hn1基因编码的蛋白质序列为天然I型人副流感病毒HN蛋白(accessionnumber:AAC23946.1)的214-508aa。hn2基因编码的蛋白质序列为天然II型人副流感病毒HN蛋白(accessionnumber:BAA00739.1)的312-552aa。hn3基因编码的蛋白质序列为天然III型人副流感病毒HN蛋白(accessionnumber:ACF28540.1)的243-512aa。将分别含有该三段人工合成的DNA片段的载体pUC57分别用NdeI及XhoI进行双酶切后按常规方法分别回收目的片段，备用。同时采用NdeI及XhoI对载体pET-28a(+)进行双酶切，并按常规方法分别将经双酶切后获得的hn1,hn2及hn3基因连入pET-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌TOP10，构建pET-HN1、pET-HN2、pET-HN3表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体分别表达重组HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白。
(2)HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白的表达与纯化
将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coliBL21(DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株。分别挑取pET-HN1、pET-HN2、pET-HN3转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并分别接种入100mLLB培养基中，于37℃培养过夜。分别取出菌液后，按1：100分别接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃培养至OD600＝0.6时，加入1mol/LIPTG至终浓度为1mmol/L，于37℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达。诱导4h后分别于8000r/min下离心10min收集菌体。将此三份菌体分别用20mL磷酸盐缓冲液洗涤3次并再次重悬后进行超声破碎，操作条件为：50HZ，200W，超声3S，间歇5S，工作100次。超声完成后，12000g离心15min分别收集沉淀，即为包涵体。分别将此三份包涵体用洗涤缓冲液(20mMNa3PO4，0.5MNaCl；3M尿素，30mM咪唑，pH7.4)洗涤两次后，12000g离心15min收集沉淀。将三份沉淀分别用Bindingbuffer(20mMNa3PO4,0.5MNaCl；8M尿素，30mM咪唑，pH7.4)于室温下溶解后，12000g离心15min，上清用0.45μm的滤膜进行过滤。此三份溶解液均用HisTrapaffinitycolumns(GEhealthcare公司产品)，按照说明书用同样的方法进行纯化。具体方法如下：
1)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上，以1mL/min流速洗柱。
2)用10mLBindingbuffer平衡，1mL/min流速。
3)将融合蛋白上样，1mL/min流速。
4)用10mLBindingbuffer，以1mL/min流速洗柱。
5)用10mLElutionbuffer(20mMNa3PO4，0.5MNaCl；8M尿素，500mM咪唑，pH7.4)，以1mL/min流速洗脱，分管收集，每管1ml，12％SDS-PAGE检测，合并洗脱组分中含有目的蛋白的样品。
(3)HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白的复性
将上述经HisTrapaffinitycolumns纯化的重组HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白，先各分别用含4mol/L尿素的磷酸盐缓冲液透析过夜，然后再各分别用含2、1、0.6、0.2mol/L尿素的磷酸盐缓冲液梯度透析各4h，最后用磷酸盐缓冲液透析4h。将透析液各用12000rpm离心15min，各上清即为复性的重组HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白。经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整其浓度均为0.2mg/mL。
(二)重组HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备
(1)兔抗重组HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备
用上述纯化的重组HN1-His融合蛋白按照200μg(1mL)与1mL弗氏完全佐剂混匀乳化后免疫雄性新西兰大白兔(由湖北省疾病预防控制中心提供)，于背部皮下多点注射，间隔7d后再免疫一次，再过14d后用上述纯化的重组HN1-His融合蛋白按照200μg(1mL)与1mL弗氏不完全佐剂混匀乳化后进行加强免疫，加强免疫7d后再按上述同样方法再加强免疫一次。7d后取血分析抗体滴度。若不满意，可重复进行一到两次加强免疫，至抗体滴度满意(用间接ELISA法测定抗体效价大于1×105)。若满意则心脏采血，分离血清，以ProteinG亲和层析柱(GEhealthcare公司产品)，严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液调整为2mg/mL，-20℃保藏备用，至此制得兔抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG。
用上述同样的方法，分别用上述纯化的重组HN2-His、HN3-His融合蛋白分别制备兔抗重组HN2-His、HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG。此三种抗体作为量子点标记用。Westenblot试验表明，此三种多克隆抗体IgG均能对应性的特异性识别I、II、III型人副流感病毒全长HN蛋白。
(2)鼠抗重组HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备
用上述纯化的重组HN1-His融合蛋白作为完全抗原免疫豚鼠(由湖北省疾病预防控制中心提供)，肩胛下注射抗原200μg/只。基础免疫为等体积的抗原与弗氏完全佐剂进行乳化，每隔2周进行一次加强免疫，加强免疫用等体积抗原与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，总共免疫4次。末次免疫10d后取血分析抗体滴度。若不满意，可重复进行一到两次加强免疫，至抗体滴度满意(用ELISA法测定抗体效价大于1×105)。若满意则处死豚鼠取血清，以ProteinG亲和层析柱(GEhealthcare公司产品)，严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液调整为1mg/mL，备用，至此制得鼠抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG。
用上述同样的方法，分别用上述纯化的重组HN2-His、HN3-His融合蛋白分别制备鼠抗重组HN2-His、HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG。此三种抗体作为包被检测线用。Westenblot试验表明，此三种多克隆抗体IgG均能对应性的特异性识别I、II、III型人副流感病毒全长HN蛋白。
(三)量子点分别标记的兔抗重组HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备与纯化
a.量子点标记抗人副流感病毒多克隆抗体反应条件的优化：
1)量子点标记抗体探针最佳标记pH的确定
将标记反应中磷酸缓冲液pH分别设为5，6，7，8，9，对标记产物利用全光谱仪进行荧光强度测定，观察不同pH值对偶联反应的影响，确定了量子点标记多抗反应的最佳pH为7.0-8.0。本实验选择pH7.3。
2)量子点标记抗体探针最佳标记量的确定
将量子点摩尔浓度与多抗浓度之比分别设置为1:1，1:2，1:3及1:4，进行标记反应后，对标记产物利用全光谱仪进行荧光强度测定，观察二者不同浓度比对偶联反应的影响，确定量子点标记多抗反应的最佳摩尔浓度比为量子点与抗体摩尔比为1:3。本实验选择该最优浓度比来确定标记量。
3)量子点标记抗体探针最佳封闭剂种类的确定
以乙醇胺、Tris、PEG2000-NH2或者BSA作为封闭剂，进行标记反应后，对标记产物利用全光谱仪进行荧光强度测定，观察不同的封闭剂对于标记反应的影响，结果发现，PEG2000-NH2为最佳封闭剂，其可显著提高复合物的胶体稳定性及免疫活性。
b.标记过程：
向微量离心管中依次加入2nmol量子点、300nmolN-羟基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)和300nmol碳二亚胺(EDC)，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，于旋转混合仪中，以15rpm/min，37℃反应30min后，透析去除过量的活化剂(sulfo-NHS与EDC)。在活化的量子点中，加入6nmol的兔抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入端氨基化聚乙二醇(PEG2000-NH2)至终浓度为1.5％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h。用0.2μmPES滤器过滤除去抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物。收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于1ml磷酸盐保存液中。
按照上述相同方法，分别利用兔抗重组HN2-His融合蛋白多克隆抗体IgG及兔抗重组HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG分别制得量子点标记的兔抗重组HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG。将三种量子点标记的抗体按1：1：1的体积比混合后备用。
(四)量子点分别标记的兔抗重组HN1-His、HN2-His、HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG的负载
将聚酯纤维膜浸入步骤(三)所得到的量子点标记的多抗IgG混合液中1h，取出，25℃干燥后裁成后规格为4cm*0.6cm/条后,4℃密封保存备用，至此制得结合垫。
实施例2(制备实施例)
样品垫的制备
配制不同配方的样品垫处理液，观察量子点标记抗体的释放效果，通过多次正交试验优化，得到最优的样品垫处理液配方(即本发明所述)。取玻璃纤维素膜一张，将其在样品垫处理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，剪裁成规格为4cm*2.5cm/条后，即制得样品垫，25℃密封干燥保存。经试验证实该样品垫的使用，大大提高了结合垫上量子点标记抗体的释放率，达到了较好的应用效果。
实施例3(制备实施例)
检测层的制备
将硝酸纤维素膜剪成4cm*4cm大小。将实施例1中所制备的鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG分别装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1μl/cm的喷速依次喷于硝酸纤维素膜上，作为三条检测线，检测线间距0.7cm。同样，将羊抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1μl/cm的喷速喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，其与最近的一条检测线间距亦为0.7cm。将喷好的硝酸纤维素膜37℃干燥2h，4℃密封干燥保存。
实施例4(制备实施例)
检测卡的组装
下面结合附图1及附图2对检测卡的组装作进一步说明。
将底板裁剪成4cm*9.3cm大小，备用。
将吸水滤纸裁剪成4cm*3cm大小，作为吸水垫，备用。
组装工作于生物安全柜内操作，首先将底板9上的粘性保护膜揭掉，将实施例3所述的检测层3即带有质控线7和检测线4、5、6的硝酸纤维素膜粘贴到底板9上附图1所指的具体区域，并小心抹平膜面。其次，将事先裁好的吸水垫8组装到底板9上，使其左边与检测层右末端有0.2cm的重叠，其右边缘则与底板9的右边缘对齐粘好并小心抹平。再将实施例1所描述的结合垫2按0.3cm重叠于检测层3的左边缘处，0.3cm粘于底板9上。最后将实施例2所描述的的样品垫1则按一边0.3cm重叠于结合垫2的左边缘处，另一边与底板9的左边缘对齐，粘于底板9上并小心抹平。将组装好的检测板于切条机下裁成4.0mm宽的检测卡，4℃密封干燥避光保存。
实施例5(应用实施例)
检测卡的使用方法
按常规方法获得待检者的咽拭子，将其***装有500μl的添加了1％Tritonx-100(体积百分比)的磷酸盐缓冲液(PBST)的软质塑料管中，挤压塑料管壁，使拭子上的样品充分溶解后，取出120μL滴于检测卡的样品垫上，15分钟后于紫外分析仪下(型号为WD-9403A，北京六一仪器厂生产，紫外激发波长365nm)观察检测结果。若样品中含有I型人副流感病毒抗原，则与结合垫中的量子点标记的兔抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的荧光检测线1，未结合完的量子点标记抗体继续层析与抗兔IgG结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的第二条荧光质控线；若样品中有II型人副流感病毒抗原，则与结合垫中的相应的量子点标记抗体结合后，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组HN2-His融合蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的荧光检测线2，未结合完的量子点标记抗体继续层析与抗兔IgG结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的第二条荧光质控线；若样品中有III型人副流感病毒抗原，则亦与结合垫中相应的量子点标记抗体结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组HN3-His融合蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的荧光检测线3，未结合完的荧光标记抗体继续层析与抗兔IgG结合形成肉眼可见的第二条荧光质控线；若样品中无相关抗原，则仅出现一条荧光质控线。如果荧光质控线未出现，则该检测卡失效。
实施例6(应用实施例)
本发明的应用效果举例
本实施例中所指的分型检测人副流感病毒的量子点标记免疫层析检测卡的检测方法参照实施例5所述的操作步骤。
1)特异性试验
用呼吸道常见病原体如人呼吸道合胞病毒(Long株，ATCC编号VR26)、人肺炎支原体(ATCC编号15531)、人肺炎衣原体(AR-39株，ATCC编号53592)、人腺病毒3型(GB株，ATCC编号VR-3)、人腺病毒7型(Gomen株，ATCC编号VR-7)、人甲型流感病毒(H1N1，ATCC编号VR-1743)、人乙型流感病毒(ATCC编号VR-790)、肺炎链球菌(ATCC编号49619)、流感嗜血杆菌(ATCC编号53781)、卡他莫拉菌(ATCC编号25238)、等代替人副流感病毒进行检测，检测卡检测含这些微生物的PBST稀释液都为阴性。同时，检测I、II、III型人副流感病毒样品时，亦未发现三种病毒之间的交叉反应。
2)敏感性试验
将I型人副流感病毒抗原用磷酸盐缓冲液调整为浓度分别为100，10，1，0.1，0.01，0.005，0.003，0.001μg/mL的浓度后，取出120μl滴于滴于检测卡的样品垫上，15分钟后于紫外分析仪下(型号为WD-9403A，北京六一仪器厂生产，紫外波长365nm)观察检测结果。在对照线出现荧光的前提下，若相应的检测线上有肉眼可见的荧光，则判断为阳性，否则为阴性。结果表明，该检测卡检测I型人副流感病毒的检测下限为0.005μg/mL，即5ng/mL。按同样的方法对II、III型人副流感病毒进行检测，确定其检测下限分别为5ng/mL及3ng/mL。
3)重复性试验
3.1)检测卡的批内重复性测试
选取在4℃保存的同一批组装好好的检测卡，每天检测一次三个不同浓度含I型人副流感病毒的样品。通过观察检测卡上相应检测线上的荧光强度变化来确定检测卡的重复性。实验结果显示，批内重复的变异系数为2.3％。以同样方法用同一批检测卡对含有II型人副流感病毒、III型人副流感病毒的样品进行检测，发现批内重复的变异系数分别为2.6％和2.4％。
3.2)检测卡的批间重复性测定
选取在4℃保存的3个不同批次组装好好的检测卡，选定在相一时间，测定同一含I型人副流感病毒的样品。通过观察检测卡上相应检测线上的荧光强度变化来确定检测卡的重复性。实验结果显示，批间重复的变异系数为4.3％。以同样方法用同一批检测卡对含有II型人副流感病毒、III型人副流感病毒的样品进行检测，发现批内重复的变异系数分别为3.5％和3.8％。
3.3)再现性试验
将同一批次的检测卡由不同的人员在同一实验室和同一人员在不同的实验室进行操作，通过检测卡检测线上的荧光效果来确定检测卡的再现性，结果显示，该检测卡对I，II，III型人副流感病毒的检测结果均具有再现性。
3.4)稳定性试验
将同一批次的检测卡分别用塑料袋及铝箔密封，加干燥剂于4℃、-20℃、室温保存和在37℃做加速破坏试验，在不同的保存期与新制备的检测卡时对分别含有I型人副流感病毒的样品(10ng/mL的病毒)进行测定，通过检测卡检测线上荧光强度的变化来确定检测卡的稳定性。
实验结果显示，同一批次的检测卡于4℃保存6个月的期间，每周测定的结果表明，荧光条带条均清晰可见，强度未见明显变化，说明检测卡在4℃可保存6个月以上，还在继续检测；同一批次的检测卡于-20℃保存6个月的期间，分别每半个月检测一次，迄今为止检测卡还没出现荧光强度有所下降的变化，还在继续检测；同一批次的检测卡于37℃破坏试验期间，每天都进行检测，在第12天时检测卡的荧光强度有所降低。对II、III型人副流感病毒的实验结果与上述II型人副流感病毒的实验结果相同。说明检测卡在37℃可保存11天半，相当于2～8℃存放17个月左右，稳定性符合国家所规定的指标。
需要指出的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明精神和原则之内所做的任何修改、等同替换等均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡，其特征在于：所述人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有量子点分别标记的兔抗I型、II型以及III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗体的混合物；所述检测层是由带有第一检测线、第二检测线、第三检测线以及质控线的固相硝酸纤维素膜构成；所述第一检测线、第二检测线以及第三检测线分别包被有鼠抗I型、II型以及III型人副流感病毒多克隆抗体；所述质控线包被有抗兔IgG；所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起。
2.根据权利要求1所述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡，其特征在于：所述量子点是羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点。
3.根据权利要求1或2所述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡，其特征在于：所述检测层长4cm，所述检测层粘贴在长度是8.6-9.5cm的底板表面中间段；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2.5-3cm的吸水垫重叠0.2-0.4cm；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0.5-0.8cm的结合垫重叠0.2-0.4cm；所述结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2.5cm的样品垫重叠0.2—0.4cm；所述第一检测线、第二检测线、第三检测线以及质控线中相邻两线之间的间距均是0.5-0.8cm；所述底板的宽度是0.3-0.5cm。
4.根据权利要求3所述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡，其特征在于：所述吸水垫是吸水滤纸；所述底板是PVC板。
5.根据权利要求4所述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡，其特征在于：所述抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。
6.一种基于如权利要求1-5任一权利要求所述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
1)结合垫的制备：
1.1)重组HN1-His、HN2-His以及HN3-His融合蛋白的制备、纯化以及复性：
1.1.1)对I、II以及III型人副流感病毒HN蛋白进行生物信息学分析，分别获取I、II以及III型人副流感病毒HN蛋白的胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段；
1.1.2)找到步骤1.1.1)中所得到肽段对应的基因编码序列，根据大肠杆菌中密码子的偏好性，对步骤1.1.1)中所得到基因编码序列进行密码子优化；
1.1.3)在步骤1.1.2)中所得到的基因序列的5’端及3’端分别引入酶切位点并分别化学合成全基因序列，同时标记记为hn1、hn2以及hn3；
1.1.4)将步骤1.1.3)中所得到的hn1、hn2以及hn3按分子生物学方法分别克隆入表达载体pET-28a(+)后表达重组融合蛋白HN1-His、HN2-His及HN3-His；所述重组融合蛋白HN1-His、HN2-His及HN3-His均以包涵体形式存在于基因工程菌菌体内；
1.1.5)用镍柱分别纯化步骤1.1.4)所得到的包涵体蛋白，再分别对包涵体蛋白进行复性即得到所需重组蛋白；
1.2)重组HN1-His、HN2-His以及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备：
1.2.1)以步骤1.1.5)中所得到的复性的重组HN1-His、HN2-His以及HN3-His融合蛋白为完全抗原，免疫新西兰大白兔及豚鼠，分别制备兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清；所述兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于1×105；
1.2.2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG；
1.2.3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1.2.2)所得到的抗体浓度，同时将该浓度调整至3mg/mL后备用；
1.3)量子点分别标记的兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备与纯化：
1.3.1)向微量离心管中依次加入2nmol量子点、300nmolN-羟基琥珀酰亚胺和300nmol碳二亚胺，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，于旋转混合仪中，以15rpm/min，37℃反应30min后，透析去除过量的N-羟基琥珀酰亚胺以及碳二亚胺；所述磷酸盐缓冲液中各组分含量分别为磷酸氢二钠2.9g/L、磷酸二氢钠0.295g/L以及氯化钠2g/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.3；
1.3.2)在活化的量子点中，加入4-8nmol的步骤1.2)所制备的兔抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入端氨基化聚乙二醇至终浓度为1.5％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；用0.2μmPES滤器过滤除去抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物；收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于1ml磷酸盐保存液中；
所述磷酸盐洗涤液中各组分含量分别为磷酸氢二钠2.9g/L、磷酸二氢钠0.295g/L、氯化钠2g/L、吐温-205ml/L以及叠氮钠1g/L，所述磷酸盐洗涤液的pH＝7.3；所述磷酸盐保存液中各组分含量分别为磷酸氢二钠2.9g/L、磷酸二氢钠0.295g/L、氯化钠2g/L、BSA10g/L以及叠氮钠1g/L，所述磷酸盐保存液的pH＝7.3；
1.3.3)按照与步骤1.3.1)以及步骤1.3.2)相同的方法，分别利用步骤1.2)所制备的兔抗重组HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG分别制得量子点标记的兔抗重组HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG；
1.3.4)将量子点标记的兔抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG按体积比1：1：1混合后备用；
1.4)量子点标记抗体的负载：
将聚酯纤维膜浸入步骤1.3.4)所得到的量子点分别标记的兔抗重组HN1-His、HN2-His以及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG混合液中1h，取出，25℃干燥后4℃密封保存备用，至此制得结合垫；
2)样品垫的制备：
取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h以上，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，25℃密封干燥保存；至此制得样品垫；
所述样品垫处理液中各组分含量分别为磷酸氢二钠2.9g/L、磷酸二氢钠0.295g/L、氯化钠2g/L、牛血清白蛋白20g/L、吐温-2010mL/L、蔗糖20g/L以及聚乙烯吡咯烷酮5g/L，所述样品垫处理液的pH＝7.3；
3)检测层的制备：
3.1)将步骤1.2.2)中制备的鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG和抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度为0.5-2.5mg/mL，所述磷酸盐缓冲液中各组分含量分别为磷酸氢二钠2.9g/L、磷酸二氢钠0.295g/L以及氯化钠2g/L，所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.3；
3.2)将稀释好的鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG分别装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5μl/cm的量按照一定间隔依次喷于硝酸纤维素膜上，形成第一检测线、第二检测线以及第三检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线；
3.3)将喷有第一检测线、第二检测线、第三检测线以及质控线的硝酸纤维素膜在37℃干燥2h，4℃密封干燥保存；至此制得检测层；
4)底板的制备
将PVC材质的底板按实际要求裁剪后备用；
5)吸水垫的制备
将吸水滤纸按实际要求裁剪后备用；
6)人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡的组装：
6.1)将步骤4)所制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉；
6.2)将步骤3)所制备得到的检测层粘贴到底板的中部区域，并抹平膜面；
6.3)将步骤5)所制备得到的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层有部分重叠，同时将其右边缘与底板的右边缘对齐粘好并抹平；
6.4)将步骤1)所制备得到的结合垫按部分重叠的方式重叠于硝酸纤维素膜的左边缘处，同时将结合垫粘于底板上；
6.5)将步骤2)所制备得到样品垫则按部分重叠的方式重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并抹平；
6.6)将组装好的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡进行裁剪，4℃密封干燥避光保存；
所述步骤6.1)至步骤6.6)均是在生物安全柜内进行操作。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤1.3.2)中加入6nmol的步骤1.2)所制备的兔抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG；
所述步骤3.1)中将步骤1)中制备的鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG和抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别是0.5-1.0mg/mL以及0.5-1.5mg/mL；
所述步骤3.2)中，将稀释好的鼠抗重组HN1-His、HN2-His及HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG分别装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0-2.0μl/cm的量按照一定间隔依次喷于硝酸纤维素膜上，形成第一检测线、第二检测线以及第三检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0-2.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线。
8.一种基于如权利要求1-5任一权利要求所述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡作为非诊断性检测人副流感病毒的应用。
9.一种基于如权利要求1-5任一权利要求所述的人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡的非诊断性检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
1)将待检样品用500μl的样品处理液充分溶解后，取出120μL滴于检测卡的样品垫上，15分钟后于紫外灯下观察检测结果；所述样品处理液中各组分含量分别为磷酸氢二钠2.9g/L、磷酸二氢钠0.295g/L、Tritonx-10010mL/L以及氯化钠2g/L，所述样品处理液的pH＝7.3；
2)若待检样品中含有I型人副流感病毒抗原，则与结合垫中的量子点标记的兔抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体IgG结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组HN1-His融合蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下在第一检测线处会形成肉眼可见的一条荧光检测线，未结合完的量子点标记抗体继续层析与抗兔IgG结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的第二条荧光质控线；
若待检样品中有II型人副流感病毒抗原，则与结合垫中的量子点标记的兔抗重组HN2-His融合蛋白多克隆抗体IgG结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组HN2-His融合蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下在第二检测线处会形成肉眼可见的一条荧光检测线，未结合完的量子点标记抗体继续层析与抗兔IgG结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的第二条荧光质控线；
若待检样品中有III型人副流感病毒抗原，则与结合垫中的量子点标记的兔抗重组HN3-His融合蛋白多克隆抗体IgG结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗重组HN3-His融合蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下在第三检测线处会形成肉眼可见的一条荧光检测线，未结合完的荧光标记抗体继续层析与抗兔IgG结合形成肉眼可见的第二条荧光质控线；
若待检样品中无I型人副流感病毒抗原、II型人副流感病毒抗原以及III型人副流感病毒抗原，则仅出现一条荧光质控线；若荧光质控线未出现，则该检测卡失效。
10.根据权利要求9所述的非诊断性检测方法，其特征在于：所述待检样品是包括但不限于咽拭子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410405742.2A CN105277693B (zh) | 2014-08-18 | 2014-08-18 | 人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410405742.2A CN105277693B (zh) | 2014-08-18 | 2014-08-18 | 人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105277693A true CN105277693A (zh) | 2016-01-27 |
| CN105277693B CN105277693B (zh) | 2017-02-01 |
Family
ID=55147061
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410405742.2A Active CN105277693B (zh) | 2014-08-18 | 2014-08-18 | 人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105277693B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105968197A (zh) * | 2016-05-13 | 2016-09-28 | 湖北工业大学 | 一种抗3型解脲支原体mb蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒 |
| CN106248972A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-12-21 | 李俊香 | 一种快速检测载脂蛋白b48r的量子点免疫层析试纸条及其制备方法 |
| CN109085349A (zh) * | 2018-08-22 | 2018-12-25 | 宁波奥丞生物科技有限公司 | 一种多项联合检测的免疫层析试剂盒 |
| CN110058012A (zh) * | 2019-04-08 | 2019-07-26 | 石家庄洹众生物科技有限公司 | 同步检测二乙酰***、甲基***、***和***的荧光免疫试纸组及其制备和使用方法 |
| CN111879946A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-11-03 | 江苏扬新生物医药有限公司 | 一种多指标快速检测荧光免疫层析试剂盒 |
| CN113804882A (zh) * | 2021-08-25 | 2021-12-17 | 广东省实验动物监测所 | 一种检测仙台病毒抗体的免疫荧光层析试纸条及其应用 |
| CN114264820A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-04-01 | 广东医科大学附属医院 | 一种流感病毒a型和b型量子点联检试纸条及其制备方法和应用 |
| CN114965761A (zh) * | 2022-05-17 | 2022-08-30 | 深圳赛保尔生物药业有限公司 | 聚乙二醇化蛋白药物中n-羟基琥珀酰亚胺的检测方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101550455B (zh) * | 2008-03-31 | 2011-08-24 | 广州达安临床检验中心有限公司 | 人副流感病毒分型及定量检测试剂盒 |
| CA2679750A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-03-23 | Nexus Dx, Inc. | Methods for detecting nucleic acids in a sample |
| EP2657704A1 (en) * | 2009-01-07 | 2013-10-30 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for detecting all Haemophilus influenzae |
| CN102520192B (zh) * | 2011-12-29 | 2014-08-13 | 深圳康美生物科技股份有限公司 | 一种定量检测肌钙蛋白i/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白的荧光免疫层析试剂盒 |
| CN103983776A (zh) * | 2014-05-27 | 2014-08-13 | 国家纳米科学中心 | 一种同时检测病毒抗原和抗体的胶体金免疫层析试纸条 |
-
2014
- 2014-08-18 CN CN201410405742.2A patent/CN105277693B/zh active Active
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105968197A (zh) * | 2016-05-13 | 2016-09-28 | 湖北工业大学 | 一种抗3型解脲支原体mb蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒 |
| CN105968197B (zh) * | 2016-05-13 | 2019-08-16 | 湖北工业大学 | 一种抗3型解脲支原体mb蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒 |
| CN106248972A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-12-21 | 李俊香 | 一种快速检测载脂蛋白b48r的量子点免疫层析试纸条及其制备方法 |
| CN109085349A (zh) * | 2018-08-22 | 2018-12-25 | 宁波奥丞生物科技有限公司 | 一种多项联合检测的免疫层析试剂盒 |
| CN110058012A (zh) * | 2019-04-08 | 2019-07-26 | 石家庄洹众生物科技有限公司 | 同步检测二乙酰***、甲基***、***和***的荧光免疫试纸组及其制备和使用方法 |
| CN110058012B (zh) * | 2019-04-08 | 2022-03-01 | 石家庄洹众生物科技有限公司 | 同步检测二乙酰***、甲基***、***和***的荧光免疫试纸组及其制备和使用方法 |
| CN111879946A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-11-03 | 江苏扬新生物医药有限公司 | 一种多指标快速检测荧光免疫层析试剂盒 |
| CN113804882A (zh) * | 2021-08-25 | 2021-12-17 | 广东省实验动物监测所 | 一种检测仙台病毒抗体的免疫荧光层析试纸条及其应用 |
| CN114264820A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-04-01 | 广东医科大学附属医院 | 一种流感病毒a型和b型量子点联检试纸条及其制备方法和应用 |
| CN114965761A (zh) * | 2022-05-17 | 2022-08-30 | 深圳赛保尔生物药业有限公司 | 聚乙二醇化蛋白药物中n-羟基琥珀酰亚胺的检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105277693B (zh) | 2017-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104198703B (zh) | 人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN105277693A (zh) | 人副流感病毒量子点免疫层析分型检测卡及其制备方法和应用 | |
| CN111233985A (zh) | 一种新型冠状病毒IgA抗体快速检测试纸条的制备方法 | |
| CN211148669U (zh) | 一种基于S抗原的新型冠状病毒2019-nCoV抗体快速检测试剂盒 | |
| CN105319359B (zh) | 人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用 | |
| CN105319373B (zh) | 基于磁性分离和量子点标记的人呼吸道合胞病毒快速检测方法和试剂盒 | |
| CN111999492B (zh) | 一种联合检验covid-19n抗原和s蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡 | |
| CN105859843A (zh) | 呼吸道合胞病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的呼吸道合胞病毒抗体的快速检测试剂盒 | |
| CN101377493A (zh) | 肾综合征出血热诊断试纸条、制备方法及检测试剂盒 | |
| CN105753981B (zh) | 抗人呼吸道合胞病毒n蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒 | |
| CN204028084U (zh) | 人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡 | |
| CN101666800B (zh) | 水泡性口炎病毒快速检测试纸条及其制作方法 | |
| CN106188248A (zh) | 一种eb病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的检测eb病毒抗体的快速检测试剂盒 | |
| CN103995136B (zh) | 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金快速检测试纸条 | |
| CN105277694B (zh) | 人a群链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用 | |
| CN105319360B (zh) | 人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用 | |
| CN113388039A (zh) | Sars-cov-2冠状病毒的抗原模拟表位和免疫层析试纸条 | |
| CN105242040B (zh) | 人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用 | |
| CN105585633B (zh) | 抗人流感嗜血杆菌p6蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒 | |
| CN105585635B (zh) | 抗人肺炎支原体p1蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒 | |
| CN105753982B (zh) | 抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒 | |
| CN204028083U (zh) | 人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡 | |
| CN204028085U (zh) | 卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡 | |
| CN113671178A (zh) | 基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸及制备方法 | |
| CN101598729A (zh) | 蓝舌病病毒快速检测试纸条及制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20180428 Address after: 432500 8 Heping Road, Yunmeng Economic Development Zone, Xiaogan, Hubei Patentee after: Hubei numeihua antibody drug Technology Co., Ltd. Address before: 432800 Hubei Hualong bio Pharmaceutical Co., Ltd. 8, Changzheng Road, Chengguan Town, Dawu County, Xiaogan, Hubei Patentee before: Dong Jun |
|
| TR01 | Transfer of patent right |